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Bioengineering

Fabricación y caracterización de la nanomatriz base Janus capa por capa para promover la regeneración del cartílago

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe el ensamblaje de un andamio de nanomatriz de base Janus (JBNm) capa por capa agregando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) secuencialmente. El JBNm fue fabricado y caracterizado; Además, mostró una excelente bioactividad, fomentando funciones celulares como la adhesión, proliferación y diferenciación.

Abstract

Se han desarrollado varios andamios de biomateriales para guiar la adhesión y proliferación celular con la esperanza de promover funciones específicas para usos in vitro e in vivo . La adición de factores de crecimiento en estos andamios de biomateriales generalmente se realiza para proporcionar un entorno óptimo de cultivo celular, mediando la diferenciación celular y sus funciones posteriores. Sin embargo, los factores de crecimiento en un andamio de biomaterial convencional generalmente están diseñados para ser liberados después de la implantación, lo que podría provocar efectos secundarios no deseados en el tejido o las células circundantes. Aquí, la nanomatriz base Janus (JBNm) inspirada en el ADN ha logrado con éxito un microambiente altamente localizado con una estructura capa por capa para construcciones autosostenibles de tejido de cartílago. Los JBNms se autoensamblan a partir de nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) a través de la bioafinidad. El JBNm se ensambló en una relación TGF-β1:matrilin-3:JBNt de 1:4:10, ya que esta ha sido la relación determinada en la que podría ocurrir el ensamblaje adecuado en la estructura capa por capa. Primero, se agregó la solución de TGF-β1 a la solución de matrilina-3. Luego, esta mezcla se pipeteó varias veces para garantizar una homogeneidad suficiente antes de la adición de la solución JBNt. Esto formó el JBNm capa por capa, después de pipetear varias veces nuevamente. Se realizaron una variedad de experimentos para caracterizar la estructura JBNm capa por capa, JBNts solo, matrilina-3 sola y TGF-β1 sola. La formación de JBNm se estudió con espectros de absorción UV-Vis, y la estructura del JBNm se observó con microscopía electrónica de transmisión (TEM). A medida que el innovador andamio JBNm capa por capa se forma a escala molecular, se pudo observar el JBNm marcado con colorante fluorescente. El TGF-β1 está confinado dentro de la capa interna del JBNm inyectable, que puede prevenir la liberación de factores de crecimiento a las áreas circundantes, promover la condrogénesis localizada y promover un microambiente antihipertrófico.

Introduction

Los andamios en la ingeniería de tejidos desempeñan un papel vital en la prestación de soporte estructural para la unión celular y el posterior desarrollo de tejidos1. Por lo general, las construcciones de tejido convencionales sin ningún andamiaje dependen del entorno de cultivo celular y de factores de crecimiento agregados para mediar la diferenciación celular. Además, esta adición de moléculas bioactivas en andamios es a menudo el enfoque preferido para guiar la diferenciación y función celular 2,3. Algunos andamios pueden imitar el microambiente bioquímico de los tejidos nativos de forma independiente, mientras que otros pueden influir directamente en las funciones celulares a través de factores de crecimiento. Sin embargo, los investigadores a menudo encuentran desafíos en la selección de andamios que podrían afectar positivamente la adhesión, el crecimiento y la diferenciación celular, al tiempo que proporcionan un soporte estructural óptimo y estabilidad durante un largo período 4,5. Las moléculas bioactivas a menudo se unen libremente al andamio, lo que lleva a una rápida liberación de estas proteínas tras la implantación, lo que resulta en su liberación en lugares no deseados. Esto culmina en efectos secundarios en tejidos o células que no fueron dirigidos intencionalmente 6,7.

Los andamios suelen estar hechos de materiales poliméricos. La nanomatriz base Janus (JBNm) es una plataforma de andamio biomimético creada con un novedoso método capa por capa para la construcción autosostenible de tejido de cartílago8. Estos nuevos nanotubos inspirados en el ADN han sido nombrados nanotubos de base Janus (JBNts), ya que imitan adecuadamente la estructura y la química de la superficie del colágeno que se encuentra en la matriz extracelular (ECM). Con la adición de moléculas bioactivas, como la matrilina-3 y el factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1), el JBNm puede crear un microambiente óptimo que luego puede estimular la funcionalidad celular y tisular deseada9.

Los JBNt son nuevos nanotubos derivados de versiones sintéticas de la nucleobase adenina y timina. Los JBNts se forman a través del autoensamblaje10; Seis nucleobases sintéticas se unen para formar un anillo, y estos anillos se someten a interacciones de apilamiento de π-π para crear un nanotubo de 200-300 μm de longitud11. Estos nanotubos son estructuralmente similares a las proteínas de colágeno; al imitar un aspecto del microambiente nativo del cartílago, se ha demostrado que los JBNts proporcionan un sitio de unión favorable para los condrocitos y las células madre mesenquimales humanas (hMSCs)11,12,13,14. Debido a que los nanotubos se someten a autoensamblaje y no requieren ningún tipo de iniciador (como la luz UV), muestran un potencial emocionante como un andamio inyectable para áreas defectuosas difíciles de alcanzar15.

La matrilina-3 es una proteína estructural de la matriz extracelular que se encuentra en el cartílago. Esta proteína juega un papel significativo en la condrogénesis y la función adecuada del cartílago16,17. Recientemente, ha sido incluido en andamios de biomateriales, fomentando la condrogénesis sin hipertrofia 9,18,19. Al incluir esta proteína en el JBNm, las células del cartílago son atraídas por un andamio que contiene componentes similares a los de su microambiente nativo. Además, se ha demostrado que la matrilina-3 es necesaria para la señalización adecuada de TGF-β1 dentro de los condrocitos20. Los factores de crecimiento funcionan como moléculas de señalización, causando el crecimiento específico de una determinada célula o tejido. Por lo tanto, para lograr una regeneración óptima del cartílago, la matrilina-3 y el TGF-β1 son componentes esenciales dentro del JBNm. La adición de TGF-β1 en el andamio capa por capa puede promover aún más la regeneración del cartílago en una construcción de tejido. El TGF-β1 es un factor de crecimiento empleado para estimular el proceso de cicatrización de defectos osteocondrales, favoreciendo la proliferación y diferenciación de condrocitos y hMSC21,22. Así, el TGF-β1 juega un papel clave en la regeneración del cartílago JBNm (J/T/M JBNm)23, favoreciendo un crecimiento adecuado, especialmente cuando se localiza dentro de las capas de JBNm.

Como se mencionó anteriormente, los factores de crecimiento generalmente se ensamblan en el exterior de los andamios sin métodos específicos de incorporación. Aquí, con la nanoarquitectura diseñada con precisión de los biomateriales, el JBNm se desarrolló para la orientación específica de las células y tejidos previstos. El JBNm está compuesto por TGF-β1 adherido sobre superficies JBNt en la capa interna y matrilina-3 adherida sobre superficies JBNt en la capa externa24,25. La incorporación de TGF-β1 en la capa interna de la estructura capa por capa permite un microambiente altamente localizado a lo largo de las fibras JBNm, creando una construcción de tejido homeostático con una liberación mucho más lenta de la proteína12. La inyectabilidad del JBNm lo convierte en una construcción de tejido de cartílago ideal para diversas aplicaciones futuras de biomateriales26.

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Protocol

1. Síntesis de JBNts

  1. Preparar el monómero JBNt utilizando métodos previamente publicados, que involucran la síntesis de una variedad de compuestos12.
  2. Purifique el monómero JBNt crudo después de que se haya sintetizado con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando una columna de fase inversa. Use el solvente A: 100% agua, el solvente B: 100% acetonitrilo y el solvente C: solución de agua HCl con pH = 1. Utilice un caudal de 3 ml/min. Recoger el pico más grande obtenido en el HPLC a los 7,2 min.

2. Fabricación para JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

NOTA: El video 1 muestra que el JBNm es un sólido inyectable formado en un entorno fisiológico (solución de agua, sin luz UV, sin aditivos químicos y sin calentamiento), que también está inspirado biológicamente.

  1. Añadir 8 μL de 1 mg/ml de TGF-β1 suspendido en H2O a32μL de 1 mg/ml de matrilina-3 suspendida enH2O. Pipeta para asegurar la mezcla adecuada de estas proteínas.
  2. Añadir 80 μL de JBNts de 1 mg/ml suspendidos enH2Oa la solución de TGF-β1/matrilina-3. Pipetear repetidamente para asegurar una mezcla adecuada. La presencia de flóculos blancos se puede observar inmediatamente después de la adición de JBNts, lo que indica la formación del JBNm (Video 1).

3. Observación de especímenes con absorción ultravioleta-visible (UV-Vis)

NOTA: Los espectros de absorción UV-Vis fueron estudiados para caracterizar el ensamblaje del JBNm. Esta medida se analizó para cuatro categorías: JBNts solo, matrilina-3 solo, TGF-β1 solo y el JBNm completo capa por capa, compuesto por las tres partes. Todas las concentraciones iniciales están suspendidas enH2O.

  1. Para el grupo JBNt, agregue 5 μL de JBNts de 1 mg/ml a 50 μL deH2Opara formar una solución de 90.9 μg/ml.
  2. Para el grupo matrilina-3, añadir 40 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 15 μL deH2Opara obtener una solución de 7,3 μg/ml.
  3. Para el grupo TGF-β1, añadir 10 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 a 45 μL deH2Opara formar una solución de 1,8 μg/ml.
  4. Para el grupo JBNm, añadir 40 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 10 μL de 10 μg/mL TGF-β1. Agitar para asegurar una mezcla adecuada, y luego añadir 5 μL de 1 mg/ml de JBNts a la solución, pipeteando repetidamente para mezclar la muestra.
  5. Usando un espectrofotómetro, medir el espectro de absorción de cada grupo.

4. Medición del potencial zeta de las muestras

NOTA: El potencial zeta se analizó para predecir mejor cómo interactuaría el JBNm con el tejido in vivo . Se midieron tres grupos: matrilina-3 sola, matrilina-3 con TGF-β1 y el JBNm completo capa por capa.

  1. Para el grupo de matrilina-3, añadir 160 μL de 10 mg/ml de matrilina-3 a 640 μL deH2Opara obtener una solución de 800 μL.
  2. Para el compuesto matrilina-3/TGF-β1, añadir 160 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 40 μL de 10 μg/ml TGF-β1. Pipetear repetidamente para garantizar una homogeneidad adecuada. Luego, agréguelo a 600 μL deH2Odando como resultado una solución de 800 μL.
  3. Para el grupo JBNm, añadir 160 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 40 μL de 10 μg/ml de TGF-β1. Pipetear varias veces para mezclar las proteínas. A continuación, añadir 20 μL de 1 mg/ml de JBNts a la solución y pipetear para garantizar la homogeneidad. Finalmente, agregue la solución JBNm a 580 μL deH2Opara producir una solución de 800 μL.
  4. Mida los valores de potencial zeta para los tres grupos.

5. Preparación de la nanomatriz JBNt/matrilina-3 para microscopía electrónica de transmisión (TEM)

NOTA: La caracterización TEM se realiza para caracterizar la morfología de JBNts y JBNm.

  1. Insertar dos rejillas en un limpiador de plasma para limpiar adecuadamente las rejillas antes de la tinción negativa de los JBNts y JBNm de acuerdo con los protocolos publicados y los protocolos del fabricante12.
  2. Cree una solución de JBNt de 200 μg/ml mezclando 10 μL de JBNts de 1 mg/ml con 40 μL de agua destilada.
  3. Mezclar 30 μL de 100 μg/ml de matrilina-3 con 20 μL de 100 μg/ml de TGF-β1 y pipetear varias veces. Añadir 10 μL de 1 mg/ml de JBNts a la mezcla de matrilina-3/TGF-β1 para preparar la muestra de JBNm. De nuevo, pipetear repetidamente.
  4. Añadir 3 μL de la solución de JBNt (200 μg/ml) y 3 μL de la solución de JBNm en rejillas separadas, y dejarlos durante 2 min.
  5. Enjuagar cada rejilla con 100 μL de solución de acetato de uranilo (0,5%). Use papeles de filtro para eliminar el exceso de solución y permita que las rejillas se sequen al aire.
  6. Operar un microscopio electrónico de transmisión para observar y caracterizar adecuadamente las muestras, como se publicó anteriormente11,12.

6. Medición de espectros de absorción de proteínas marcadas con fluorescencia

NOTA: La estructura de JBNm se verifica observando las estructuras del JBNm con análisis espectral de absorción.

  1. Etiquete el TGF-β1 utilizando un kit de etiquetado de proteínas siguiendo las instrucciones del fabricante. Agregue 20 μL de 20 μg/ml marcados con TGF-β1 a 25 μL deH2Opara obtener una solución de prueba de 8,9 μg/ml.
  2. Etiquete la matrilina-3 usando un kit de etiquetado separado. Añadir 20 μL de 80 μg/ml de matrilina-3 marcada con la etiqueta a 25 μL deH2Opara formar una solución de ensayo de 36 μg/ml.
    NOTA: El marcado del colorante fluorescente del TGF-β1 resultó en una concentración final de 20 μg/mL, mientras que el marcaje de la matrilina-3 resultó en una concentración final de 80 μg/mL.
  3. Mezclar 20 μL de 80 μg/ml de matrilina-3 marcada con 20 μL de 20 μg/ml marcados con TGF-β1 y 5 μL deH2O, dando como resultado un compuesto marcado TGF-β1/matrilina-3. Pipetear la mezcla varias veces para mezclar.
  4. Añadir 5 μL de 1 mg/ml de JBNts a 40 μL deH2O, dando como resultado una solución de 111 μg/ml.
  5. Añadir 20 μL de 20 μg/ml de TGF-β1 marcado con 20 μL de 80 μg/ml de matrilina-3 marcada y pipeta varias veces. Agregue 5 μL de JBNts de 1 mg/ml a la solución marcada de TGF-β1/ matrilina-3 y pipetear repetidamente para mezclar correctamente el compuesto.
    NOTA: Las concentraciones finales de las muestras JBNt, marcadas como TGF-β1, y de matrilina-3 marcadas fueron 111 μg/mL, 8.9 μg/mL y 36 μg/mL, respectivamente.
  6. Transfiera cada grupo de muestra (es decir, TGF-β1 marcado (paso 6.1), matrilina-3 (paso 6.2), TGF-β1/matrilina-3 etiquetado (paso 6.3), JBNts (paso 6.4), JBNm (paso 6.5)) a su propio pocillo de una placa negra de 384 pocillos.
  7. Cargue la placa negra de 384 pocillos en un lector de microplacas multimodo y tome medidas en longitudes de onda de excitación de 488 nm y 555 nm siguiendo el protocolo del fabricante.

7. Ensayo de función biológica in vitro

  1. Prueba de adhesión celular en cámaras de vidrio de cubierta prerecubiertas
    1. Prepare dos cubreobjetos con cámara con cinco grupos de muestras, ya que se utiliza un vaso de cubierta para cada tipo de célula.
    2. Agregue 1.25 μL de 1 mg/ml de JBNts a 198.75 μL de agua destilada, lo que resulta en una solución de 6.25 μg/ml.
    3. Añadir 10 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 190 μL de agua destilada, dando como resultado una solución de 0,5 μg/ml.
    4. Añadir 2,5 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 a 197,5 μg/ml de agua destilada, lo que da como resultado una solución de 0,125 μg/ml.
    5. Para el grupo JBNm, añadir 10 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 2,5 μL de 10 μg/mLTGF-β1 y pipetear repetidamente. Añadir 1,25 μL de JBNts con una concentración de 1 mg/ml a la solución de mezcla y a la pipeta. Finalmente, agregue 186.25 μL de agua destilada para obtener una solución JBNm de 200 μL.
      1. Para el grupo control, utilice 200 μL de agua destilada.
    6. Agregue cada grupo de muestra en su propio pocillo de un vidrio de cubierta con cámara No. 1.5. Coloque el vidrio de cubierta en un congelador a -80 °C durante 1 h y luego liofilizarlo con un instrumento liofilizador.
    7. Sembrar células madre mesenquimales humanas (hMSCs) y células de condrocitos humanos (10.000 células por pocillo) en cada pocillo de los vasos de cubierta con cámara preparados.
    8. Incubar los dos vasos de cobertura durante 4 h en una incubadora a 37 °C. Luego, aspire el medio de cultivo celular y enjuague dos veces con PBS.
    9. Arregle las células con paraformaldehído al 4% durante 5 minutos, y luego retire y enjuague las muestras con PBS. Enjuague la muestra por segunda vez para eliminar completamente el paraformaldehído al 4%.
    10. Incubar las células con 100 μL de Triton-X al 0,1% durante 10 min y lavar con PBS. Agregue 100 μL de 0.165 μM de rodamina-faloidina a cada pocillo. Espere 30 minutos y luego lave con PBS nuevamente.
    11. Agregue 0.1 μg / ml DAPI a cada pocillo para teñir los núcleos. Espere 5 minutos y enjuague los pozos con PBS dos veces.
    12. Utilice un microscopio confocal espectral para observar la morfología celular y capturar imágenes fluorescentes.
    13. Además, analice el número de células y la morfología utilizando un software de procesamiento de imágenes. Abra el software y cargue las imágenes. Agregue una barra de escala y calibre el software. Cuente el número de celdas en un área determinada para cada muestra. Luego, use la herramienta de medición para recopilar datos sobre la morfología celular de cada muestra.
  2. Proliferación celular
    1. Prepare tres placas de 96 pocillos sin tratar, agregando cinco grupos de muestras a cada una.
      1. Para el grupo JBNt, agregue 3.75 μL de JBNts de 1 mg/ml a 596.25 μL de agua destilada, lo que resulta en una solución de JBNt de 600 μL con una concentración de 6.25 μg / ml.
      2. Para el grupo TGF-β1, añadir 7,5 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 a 592,5 μL de agua destilada, dando como resultado una solución problema de 0,125 μg/ml.
      3. Para el grupo matrilina-3, añadir 30 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 570 μL de agua destilada, lo que da como resultado una solución problema de 0,5 μg/ml.
      4. Para el grupo JBNm, mezclar 7,5 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 con 30 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 y pipetear varias veces, seguido de añadir 3,75 μL de 1 mg/ml de JBNts a la solución.
      5. Diluir la solución de JBNm con 558,75 μL de agua destilada para obtener las concentraciones finales de 6,25 μg/ml, 0,125 μg/ml y 0,5 μg/ml, respectivamente, para las muestras de JBNt, TGF-β1 y matrilina-3.
      6. Para el grupo control, utilice 600 μL de agua destilada.
    2. Divida cada grupo de muestra en seis pocillos (muestra de 100 μL por pocillo).
    3. Colocar las tres placas que contienen todas las muestras en un congelador a -80 °C durante 1 h y luego liofilizar con un instrumento liofilizador.
    4. Siembra hMSCs en estas placas, cada una recibiendo una suspensión celular de 100 μL (por pocillo) que contiene 5.000 células. Incubar las tres placas a 37 °C durante 1 día, 3 días o 5 días al 5% deCO2.
    5. Añadir 10 μL de solución de CCK-8 a cada pocillo con las células e incubar a 37 °C durante otras 2 h.
    6. Mida los valores de absorción de cada pocillo con lectores de microplacas multimodo a 450 nm.
    7. Sembrar un gradiente conocido de hMSCs en una placa de 96 pocillos e incubar durante 4 h. Utilice el ensayo CCK-8 para medir los valores de absorción del número conocido de células y generar una curva estándar.
    8. Calcular la proliferación celular utilizando la curva estándar de absorción.
  3. Prueba de estabilidad
    NOTA: Se utilizó un kit ELISA dirigido a TGF-β1 humano para determinar el porcentaje de liberación de TGF-β1 del JBNm en un hidrogel de agarosa.
    1. Prepare agarosa al 2% agregando 400 mg de agarosa en polvo a 20 ml de PBS y calentándola hasta 100 ° C para disolver completamente el polvo de agarosa.
    2. Prepare el JBNm dentro del hidrogel de agarosa al 2% enfriado.
      1. Combine 10 μL de 10 μg/mL de TGF-β1, 40 μL de 10 μg/mL de matrilina-3, 5 μL de 1 mg/mL de JBNts y 195 μL de PBS. Mezclar esta solución con 250 μL de agarosa al 2%, creando el hidrogel JBNm.
    3. Agregue 500 μL de PBS, usándolo como solución de liberación, y asegúrese de cambiarlo cada 3 días. Mantenga cada solución liberada y deje reposar la muestra durante 15 días.
    4. Utilice un kit ELISA para probar cada una de las soluciones de liberación capturadas, siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Restando la cantidad de TGF-β1 liberada en el PBS del valor de carga teórico del 100%, se puede determinar la cantidad restante de TGF-β1.
  4. Análisis de diferenciación celular con PCR26.
    1. Preparar siete grupos de muestras con cada muestra que contenga 20 μL de suspensión celular (4 x 104 células), 30 μL de la solución específica (o PBS, dependiendo del grupo de muestra) y 50 μL de 2 % en peso de agarosa.
      1. Para el grupo TGF-β1, añadir 5 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 a 25 μL de PBS, lo que da como resultado una solución de 1,6 μg/ml.
      2. Para el grupo matrilina-3, añadir 20 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 10 μL de PBS, lo que resulta en una solución de 6,7 μg/ml.
      3. Para el grupo JBNt, agregue 2.5 μL de JBNts de 1 mg/ml a 27.5 μL de PBS, lo que resulta en una solución de 83.3 μg/ml.
      4. Para el grupo J/T/M JBNm, añadir 10 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 5 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 y pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución. A continuación, añadir 2,5 μL de 1 mg/ml de JBNts y pipetear de nuevo. Finalmente, diluir con 2,5 μL de PBS.
      5. Para cada grupo control, utilice 30 μL de PBS como muestra.
    2. Agregue 0.5 ml de medio de cultivo celular a cada pocillo, asegurándose de reemplazarlo cada 3 días.
      1. Para el grupo de control positivo, utilice un medio condrogénico hMSC disponible comercialmente que contenga TGF-β1 añadido. Este TGF-β1 adicional es igual a la cantidad en los grupos TGF-β1 y J/T/M JBNm.
      2. Para uno de los grupos de control negativo, utilice un medio condrogénico hMSC comercial que no contenga TGF-β1. Para el otro grupo de control negativo, use un medio de cultivo celular DMEM que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS).
      3. Para todos los demás grupos, utilice un medio de cultivo celular condrogénico hMSC comercial sin TGF-β1.
    3. Cultivar las muestras durante 15 días.
    4. Extraer el ARN de las muestras y realizar PCR para estudiar la diferenciación de las muestras como se describió anteriormente26.
  5. Inmunotinción para el ensayo de expresión de colágeno tipo X
    1. Preparar siete muestras a base de agarosa de la misma manera que la diferenciación celular con la sección del método de PCR (paso 7.4).
    2. Cultivar las muestras durante 15 días.
    3. Fijar las muestras con formaldehído al 4% durante 1 día, remojar en solución de sacarosa al 30% durante la noche y luego congelar durante la noche a -80 °C con nitrógeno líquido. Fijar las muestras utilizando el reactivo compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), una mezcla de glicoles y resinas solubles en agua, a -10 °C.
    4. Operar un micrótomo criostato para obtener secciones congeladas de 20 μm de espesor de cada muestra.
    5. Manchar cada sección con un anticuerpo Anti-Colágeno X con dilución 1:800 y un anticuerpo secundario de marcado fluorescente diluido con PBS, de acuerdo con los protocolos del fabricante.
    6. Observe cada sección con un microscopio confocal, utilizando una excitación de 488 nm y un aumento de 40x en el ocular.

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Representative Results

Siguiendo el protocolo, los JBNts se sintetizaron con éxito y se caracterizaron con absorción UV-Vis y TEM. El JBNm es un andamio sólido inyectable que se somete a un rápido proceso biomimético. Después de agregar JBNts a una mezcla de solución de TGF-β1 / matrilina-3 en un entorno fisiológico, se formó un andamio sólido de malla blanca que indica el ensamblaje exitoso de JBNm, como se ve en la Figura 1. Esto se demostró en los métodos de caracterización.

En condiciones fisiológicas, la matrilina-3 está cargada negativamente debido a su punto isoeléctrico27 (Figura 2A). Después de la adición de la solución de TGF-β1 a la solución de matrilina-3, el potencial zeta del compuesto TGF-β1/matrilina-3 aumentó a un valor casi neutro, lo que indica que las dos proteínas se unieron a través de interacciones de carga. Como se ve en la Figura 2A, el potencial zeta de JBNm es el más alto entre los tres grupos debido a los JBNts, ya que el punto isoeléctrico de la cadena lateral de lisina es de alrededor de 9.74 en un entorno fisiológico. El aumento en los valores de potencial zeta del JBNm indica el ensamblaje exitoso de su estructura capa por capa.

Los espectros de absorción UV-Vis (Figura 2B) aclaran la formación de la estructura interior jerárquica capa por capa del JBNm. Los anillos aromáticos de las cadenas laterales de lisina y los JBNts contribuyeron a los dos picos de absorción a 220 nm y 280 nm, respectivamente. La disminución en el valor de absorción se observó después de la adición de TGF-β1, lo que indica que la unión ocurre entre TGF-β1 y JBNts. Después de la adición de JBNts a la matrilina-3, se observó una disminución más obvia en la intensidad de absorción de los picos, lo que una vez más indica una unión exitosa entre la matrilina-3 y JBNts. Del mismo modo, después de la adición de JBNts a una mezcla de TGF-β1 / matrilina-3, se formó el JBNm y los picos de absorción disminuyeron en intensidad. El pico de absorción de JBNm está más cerca de la línea de matrilina-3/JBNts que de la línea TGF-β1/JBNts, lo que indica que los JBNts prefieren unirse a la matrilina-3, formando una estructura externa capa por capa con matrilina-3 mientras que TGF-β1 reside en la capa interna. TEM se utiliza para caracterizar la morfología de los JBNts y JBNm (Figura 2C). Después de combinarse con proteínas, se observaron haces gruesos de JBNm formando una estructura de andamio.

La microscopía de fluorescencia ha confirmado la presencia de la estructura capa por capa (Figura 3A) y ha demostrado la sección transversal del JBNm. Después de etiquetar TGF-β1 y matrilina-3, se observó que la matrilina-3 fluorescente roja envuelve los haces de JBNt, formando la capa externa del JBNm. En la Figura 3B, el TGF-β1 verde-fluorescente formó una capa interna, contribuyendo a la capacidad de almacenar factores de crecimiento y permitiendo la localización de TGF-β1. La Figura 3C muestra el proceso de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre las proteínas marcadas con colorante fluorescente caracterizadas por espectros de fluorescencia, con picos de emisión a 520 nm y 570 nm para los grupos TGF-β1 y matrilina-3 marcados, respectivamente28. Después de la adición de JBNts de acuerdo con el protocolo, se forma la estructura capa por capa; se observaron picos tanto a 520 nm como a 570 nm para el grupo JBNm, lo que indica una unión y ensamblaje exitosos de las proteínas y JBNts.

Además, se exploró el efecto del JBNm sobre la adhesión de hMSCs y la proliferación celular. Como se muestra en la Figura 4, se determinó la densidad de adhesión celular del JBNm recubierto en la superficie de los vidrios de cubierta con cámara. El JBNm mostró hMSCs agrupadas a lo largo de sí mismo (Figura 4A), mientras que menos células se adhirieron a JBNts. Sin embargo, para los otros grupos, las hMSC se distribuyeron uniformemente sin alineación en comparación con el grupo JBNm. La alineación de las células, así como el tamaño de las células en el JBNm, demostraron que los JBNts desempeñaron un papel en la adhesión celular, mientras que las proteínas en el JBNm aumentaron la afinidad de la adhesión celular (Figura 4B, C).

Después del día 1 de cultivo celular con JBNm, JBNts, matrilina-3 sola, TGF-β1 sola y control negativo, los grupos JBNm y TGF-β1 mostraron una proliferación celular significativa en comparación con los otros grupos. Cuando la duración del cultivo celular se incrementó a 3 y 5 días, los grupos JBNm y TGF-β1 demostraron un aumento aún mayor de la proliferación celular, como se ve en la Figura 5. Se realizó un estudio de función a largo plazo para determinar la diferenciación de hMSCs con JBNm y sin JBNm (control negativo). Después de 15 días, se observó una tinción azul alciana mejorada, lo que indica condrogénesis de hMSCs que crecen junto con JBNm26. Por lo tanto, las células prefirieron los JBNts del JBNm. Esto probablemente se debió a su estructura que imita el ADN y su capacidad para desmontarse en unidades de moléculas pequeñas, la última de las cuales puede ser desencadenada por un pH bajo o una actividad enzimática suficiente (como la absorción por las células)14,29.

Video 1: Grabación de video del ensamblaje JBNm. Esta grabación muestra la formación de los JBNts, matrilina-3 y TGF-β1 en el JBNm. Esta figura ha sido modificada de Zhou et al. (2021)26. Haga clic aquí para descargar este video.

Figure 1
Figura 1: Ilustración esquemática de la estructura química de JBNts, el J/T/M JBNm y la capacidad condrogénica del J/T/M JBNm. (A) La estructura química de los JBNts, destacando su formación desde monómero hasta anillo de roseta a JBNt. (B) Los componentes que componen el J/T/M JBNm, así como la forma en que se ensamblan en el JBNm. (C ) Esquema del cultivo de células madre mesenquimales humanas en el J/T/M JBNm. Esta figura ha sido modificada de Zhou et al. (2021)26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Caracterización del material del J/T/M JBNm. (A) Espectros de potencial zeta de matrilina-3 sola, el compuesto TGF-β1/matrilina-3 y el J/T/M JBNm. (B) Espectros de absorción UV-Vis de JBNts solo, matrilina-3 solo, TGF-β1 solo, matrilina-3/JBNts compuesto, el compuesto TGF-β1/JBNts y el J/T/M JBNm. (C ) Imágenes de JBNts solo y del J/T/M JBNm obtenidas de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Esta figura ha sido modificada de Zhou et al. (2021)26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes confocales fluorescentes y espectros de fluorescencia de J/T/M JBNm. (A) Imagen confocal 3D del J/T/M JBNm, con matrilina-3 marcada con fluorescencia roja y TGF-β1 marcado con fluorescencia verde. (B) Imágenes confocales 2D de J/T/M JBNm, con matrilina-3 marcada con fluorescencia roja, TGF-β1 marcada con fluorescencia verde y una versión fusionada. (C) Espectros de fluorescencia de diversos compuestos para caracterizar el proceso FRET entre las proteínas marcadas. Esta figura ha sido modificada de Zhou et al. (2021)26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis del cultivo de células madre mesenquimales humanas (hMSC). (A) Imágenes de microscopía óptica de hMSCs con TGF-β1, matrilina-3 y JBNts, cultivadas en un gel de agarosa. (B) Imágenes de microscopía confocal de hMSCs cultivadas en el vidrio de la cubierta de la cámara recubierto con una variedad de componentes JBNm. (C) Gráfico del número de celdas adheridas por milímetro cuadrado para cada grupo. Las barras de error indican desviaciones estándar. (D) Gráfico de la longitud del eje principal de la célula en μm por grupo. Las barras de error indican desviaciones estándar. Nota: N ≥ 3, *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, ****P< 0.0001 (comparado con los controles negativos, NC). Esta figura ha sido modificada de Zhou et al. (2021)26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Comparación de números de células para varios grupos entre los días 1, 3 y 5. Estadísticas del número celular de hMSCs después de ser cultivadas con diferentes materiales en los días 1, 3 y 5. Las barras de error indican desviaciones estándar. Nota: N = 6, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Esta figura ha sido modificada de Zhou et al. (2021)26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El objetivo de este estudio es desarrollar una plataforma de andamio biomimético, el JBNm, para superar las limitaciones de las construcciones de tejidos convencionales que dependen de entornos de cultivo celular para mediar la diferenciación celular. El JBNm es un andamio de estructura capa por capa para una construcción autosostenible de tejido de cartílago. El diseño innovador se basa en nuevos nanomateriales inspirados en el ADN, los JBNts. El JBNm, compuesto por JBNts30, TGF-β1 y matrilina-3, se ensambla a través de una novedosa técnica capa por capa donde el autoensamblaje del andamio se controló a nivel molecular. El ensamblaje de JBNm se observó y caracterizó con medición de potencial zeta, absorción UV-Vis, TEM y análisis espectral de fluorescencia.

Los espectros UV-Vis en la Figura 2B (paso 3) han demostrado la formación del interior jerárquico capa por capa del JBNm. Se puede observar una diferencia en los picos de absorbancia debido a una diferencia en la afinidad de unión. Se producen interacciones más importantes entre JBNts y matrilina-3 que entre JBNts y TGF-β1, lo que indica que JBNts imita a las proteínas de colágeno en términos de su morfología fibrosa y química superficial de lisina. Esta técnica es necesaria para observar la unión de JBNts a la matrilina-3 en lugar de TGF-β1, lo que permite la encapsulación de TGF-β1 y, por lo tanto, proporciona una liberación lenta de TGF-β1 en el tejido circundante. El paso más crítico en el desarrollo del JBNm es la combinación de proteínas con los JBNts. TGF-β1 y matrilina-3 deben agregarse antes de la adición de JBNts para observar el efecto completo del fenómeno FRET entre la matrilina-3 marcada y TGF-β1. La limitación de esta técnica se deriva de la secuencia de adición incorrecta de proteínas y nanotubos, lo que resulta en mediciones variadas. Este es un paso importante para la formación de JBNm para futuros estudios y, por lo tanto, se aplicará a futuras fabricaciones y estudios de JBNm.

La matrilina-3 es una proteína altamente negativa, mientras que TGF-β1 es una proteína ligeramente neutra, como se ve en la Figura 2A. La diferencia de carga se observó para determinar la unión de estas proteínas. Desde el estado cargado negativamente de matrilina-3, el potencial zeta aumentó a un valor casi neutro después de la adición de TGF-β1 (Figura 2A). Este paso es importante para determinar la primera capa interna del andamio biomimético, y para indicar que la combinación de ambas proteínas es a través de la interacción de carga. Después de la adición de JBNts, que es el segundo paso de la fabricación de JBNm, el potencial zeta de JBNm se midió a ~ 10 ± 5 mV (Figura 2A). Debido a que los JBNt son altamente positivos, se observó que la carga de JBNm aumentó como se esperaba. Por lo tanto, la determinación de cargas con potencial zeta es importante para observar la formación de JBNm paso a paso a través de interacciones de carga. Similar a la espectroscopia UV-Vis, la secuencia de adición es importante en este paso, y el orden de adición incorrecto puede resultar en mediciones variadas. Del mismo modo, es importante pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo antes de la medición.

A continuación, TGF-β1 y matrilina-3 se marcan para que el desarrollo de JBNm se pueda observar con microscopía confocal y análisis espectral de fluorescencia con lectores de microplacas multimodo. Las muestras fueron excitadas con un láser de 488 nm y mostraron picos de emisión a 520 nm y 570 nm (Figura 3). No se observó ningún pico de emisión solo para JBNts porque no están etiquetados. FRET ocurrió desde el donante TGF-β1 al aceptor de matrilina-3, reduciendo así el pico de emisión a 520 nm y aumentando el pico de emisión a 570 nm; los dos componentes están separados por 10 nm de distancia, lo que permite que ocurra el fenómeno FRET. Por lo tanto, el ensamblaje de JBNm se basa en procesos espaciales (es decir, distancia física) junto con interacciones de carga. El paso más crítico en el desarrollo de JBNm es la secuencia de adición; TGF-β1 y matrilina-3 deben agregarse antes de la adición de JBNts para observar el efecto completo del fenómeno FRET. Se requiere un aumento de al menos 40x en el ocular para observar el JBNm fluorescente. La limitación de esta técnica es que los JBNts no están marcados y, por lo tanto, no se pudieron observar con microscopía confocal. Sin embargo, la técnica de etiquetado de proteínas se puede aplicar para etiquetar JBNt con algunas modificaciones para futuras aplicaciones.

JBNm puede ayudar a las funciones celulares, como la adhesión celular y la proliferación celular. En este estudio, se cultivaron hMSCs (comenzando con 5.000 células) en diferentes materiales (JBNm, JBNts, TGF-β1, matrilina-3 y controles negativos sin aditivos) para comparar el número de células después de la incubación durante 1, 3 y 5 días utilizando la solución CCK-8, siguiendo los protocolos exactos del fabricante para determinar la proliferación celular. JBNm, especialmente en presencia de TGF-β1, y TGF-β1 solo mostraron una proliferación celular significativa en comparación con los otros tres grupos. Los JBNts imitan morfológicamente el colágeno en la ECM, mientras que la matrilina-3 es una proteína específica del cartílago, lo que resulta en un aumento de la actividad de proliferación celular después de la incubación a 37 °C durante 3 y 5 días (Figura 5). El JBNm ha demostrado un gran potencial para servir como un andamio de ingeniería de tejidos inyectables y biomiméticos para superar las limitaciones de las construcciones celulares tradicionales para diversas aplicaciones futuras como biomateriales29,31. JBNm imita morfológicamente la ECM del cartílago, proporcionando sitios de adhesión y permitiendo la liberación de factores diferenciativos procondrogénicos en el microambiente, como TGF-β132,33. La capacidad del JBNm para incorporar TGF-β1 en la capa interna del andamio evita que se filtre a áreas no deseadas, mejorando así la efectividad del andamio (Figura 4 y Figura 5). Se observa que muchas hMSC se agrupan a lo largo del andamio JBNm, mientras que las células están escasamente distribuidas en matrilina-3, TGF-β1 y grupos de control negativo (Figura 4). También se observó la morfología de las células, lo que indica una excelente afinidad con las superficies JBNm. Estos biomateriales diseñados con precisión evitan la rápida liberación de moléculas bioactivas incorporadas en el entorno de cultivo celular y mejoran la autosostenibilidad de las construcciones tisulares dentro de la matriz34. Una limitación de esta técnica es que el número inicial de células es crítico para determinar la proliferación de células. Un número inicial de células de 5.000 se encontró más óptimo para este estudio. También se necesita una curva estándar para determinar el número de células trazando un número conocido de células y midiéndolas en el lector de microplacas multimodo. Esta técnica se puede aplicar en el futuro como un método estandarizado para determinar la proliferación celular en todos los estudios relacionados con los andamios JBNm.

Las hMSCs se cultivaron en pellets 3D de agarosa con y sin JBNm para determinar el estudio de función a largo plazo durante 15 días. Después de 15 días, se extrajo ARN total de las hMSCs en los gránulos de agarosa, que contenían control positivo (los pellets se suministraron con TGF-β1 fresco cada vez que se cambiaba el medio), JBNm, JBNts, matrilina-3, TGF-β1 y ningún aditivo. Se llevó a cabo qPCR en tiempo real para el análisis de genes, probando marcadores de diferenciación condrogénica, Aggrecan (ACAN) y marcador de hipertrofia tipo X colágeno (COL X). La expresión de ACAN en el grupo JBNm aumentó significativamente en comparación con otros grupos, lo que demuestra que JBNm promueve significativamente la diferenciación condrogénica de las células madre al tiempo que inhibe la COL X. Mientras tanto, el control positivo ha mejorado la condrogénesis, como se observa en el aumento de ACAN, y también la hipertrofia de la célula diferenciada26. Otra limitación de este estudio es que la extracción de ARN proviene de las células incrustadas en un hidrogel. El ARN total obtenido en este protocolo, por lo tanto, fue bajo en concentración y pureza. Para superar esta limitación, se cultivaron y extrajeron más muestras para obtener la concentración y pureza óptimas para el siguiente paso, la qPCR en tiempo real. Si bien la qPCR es importante para el estudio, es necesaria una modificación menor de esta técnica para futuros estudios para garantizar una extracción eficiente de muestras sin sacrificar una gran cantidad de muestras.

Se realizó una prueba de estabilidad con un kit ELISA TGF-β1 humano para probar la liberación de proteínas del hidrogel JBNm. En este estudio, se espera que TGF-β1 esté encapsulado en el J/T/M JBNm, y por lo tanto no se debe observar ninguna liberación de TGF-β1 (es decir, el valor de carga teórico es 100%). Una limitación de este paso es que se supone que todo TGF-β1 está encapsulado en el andamio JBNm capa por capa. Después de 15 días, las soluciones liberadas del hidrogel se recogen y se prueban con el kit, siguiendo los protocolos del fabricante. Luego, la cantidad de TGF-β1 se calculó restando la cantidad del TGF-β1 liberado en PBS del valor de carga teórico. Debido a que TGF-β1 estaba encapsulado en la capa interna del JBNm, se anticipó la liberación lenta de la proteína. El estudio demostró que el TGF-β1 está localizado dentro del andamio JBNm y no se libera rápidamente en las áreas circundantes26.

Esta innovadora construcción de tejido de cartílago JBNm capa por capa se realizó mediante un autoensamblaje altamente organizado y controlado a nivel molecular. El TGF-β1 está confinado en la capa interna de las fibras de la matriz, evitando su fuga a lugares no deseados y promoviendo la condrogénesis localizada simultáneamente. Además, la matrilina-3 se localiza en la capa externa de las fibras de la matriz, creando un microambiente antihipertrófico35. Se ha demostrado que los JBNts no solo sirven como columna vertebral de andamios estructurales, sino que también mejoran el anclaje y la adhesión de las células madre para localizar las células a lo largo de las fibras de la matriz30,36. En cuanto al trabajo futuro, el diseño capa por capa del andamio basado en JBNt se personalizará para aplicaciones en diversos tejidos37,38,39.

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Disclosures

El Dr. Yupeng Chen es cofundador de Eascra Biotech, Inc. y NanoDe Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Este trabajo cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH 7R01AR072027 y 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 y la Universidad de Connecticut. Este trabajo también es apoyado en parte por la subvención S10OD016435 de los NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

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Bioingeniería Número 185
Fabricación y caracterización de la nanomatriz base Janus capa por capa para promover la regeneración del cartílago
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Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

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