Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabricage en karakterisering van laag-voor-laag Janus Base Nano-Matrix om kraakbeenregeneratie te bevorderen

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft de assemblage van een laag-voor-laag Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold door janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3 en Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sequentieel toe te voegen. De JBNm werd gefabriceerd en gekarakteriseerd; bovendien vertoonde het een uitstekende bioactiviteit, waardoor celfuncties zoals adhesie, proliferatie en differentiatie werden aangemoedigd.

Abstract

Verschillende biomateriaalsteigers zijn ontwikkeld om celhechting en proliferatie te begeleiden in de hoop specifieke functies voor in vitro en in vivo gebruik te bevorderen. De toevoeging van groeifactoren aan deze biomateriaalsteigers wordt over het algemeen gedaan om een optimale celkweekomgeving te bieden, celdifferentiatie en de daaropvolgende functies te bemiddelen. De groeifactoren in een conventionele biomateriaalsteiger zijn echter meestal ontworpen om vrij te komen bij implantatie, wat kan leiden tot onbedoelde bijwerkingen op het omliggende weefsel of de omliggende cellen. Hier heeft de op DNA geïnspireerde Janus base nano-matrix (JBNm) met succes een zeer gelokaliseerde micro-omgeving bereikt met een laag-voor-laag structuur voor zelfvoorzienende kraakbeenweefselconstructies. JBNms zijn zelf geassembleerd uit Janus base nanobuisjes (JBNts), matriline-3, en transformerende groeifactor beta-1 (TGF-β1) via bioaffiniteit. De JBNm werd geassembleerd in een TGF-β1:matrilin-3:JBNt-verhouding van 1:4:10, omdat dit de bepaalde verhouding was waarbij een goede montage in de laag-voor-laag structuur kon plaatsvinden. Eerst werd de TGF-β1-oplossing toegevoegd aan de matriline-3-oplossing. Vervolgens werd dit mengsel meerdere keren gepipetteerd om voldoende homogeniteit te garanderen voordat de JBNt-oplossing werd toegevoegd. Deze vormde de laag-voor-laag JBNm, na meerdere malen opnieuw pipetteren. Een verscheidenheid aan experimenten werd uitgevoerd om de laag-voor-laag JBNm-structuur te karakteriseren, JBNts alleen, matrilin-3 alleen en TGF-β1 alleen. De vorming van JBNm werd bestudeerd met UV-Vis absorptiespectra en de structuur van de JBNm werd waargenomen met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Omdat de innovatieve laag-voor-laag JBNm-steiger op moleculaire schaal wordt gevormd, kan de fluorescerende kleurstof-gelabelde JBNm worden waargenomen. De TGF-β1 is beperkt tot de binnenste laag van de injecteerbare JBNm, die de afgifte van groeifactoren naar omliggende gebieden kan voorkomen, gelokaliseerde chondrogenese kan bevorderen en een anti-hypertrofische micro-omgeving kan bevorderen.

Introduction

Steigers in tissue engineering spelen een vitale rol bij het bieden van structurele ondersteuning voor celaanhechting en daaropvolgende weefselontwikkeling1. Doorgaans zijn conventionele weefselconstructies zonder steigers afhankelijk van de celkweekomgeving en toegevoegde groeifactoren om celdifferentiatie te bemiddelen. Bovendien is deze toevoeging van bioactieve moleculen aan steigers vaak de voorkeursbenadering bij het begeleiden van celdifferentiatie en functie 2,3. Sommige steigers kunnen de biochemische micro-omgeving van inheemse weefsels onafhankelijk nabootsen, terwijl andere de celfuncties rechtstreeks kunnen beïnvloeden via groeifactoren. Onderzoekers komen echter vaak uitdagingen tegen bij het selecteren van steigers die de celhechting, groei en differentiatie positief kunnen beïnvloeden, terwijl ze optimale structurele ondersteuning en stabiliteit bieden gedurende een lange periode 4,5. De bioactieve moleculen zijn vaak losjes gebonden aan de steiger, wat leidt tot een snelle afgifte van deze eiwitten bij implantatie, wat resulteert in hun afgifte op ongewenste locaties. Dit culmineert in bijwerkingen op weefsels of cellen die niet opzettelijk zijn gericht 6,7.

Steigers zijn meestal gemaakt van polymere materialen. De Janus base nano-matrix (JBNm) is een biomimetisch steigerplatform gemaakt met een nieuwe laag-voor-laag methode voor zelfvoorzienend kraakbeenweefsel construct8. Deze nieuwe DNA-geïnspireerde nanobuisjes hebben de naam Janus base nanotubes (JBNts) gekregen, omdat ze de structuur en oppervlaktechemie van collageen in de extracellulaire matrix (ECM) goed nabootsen. Met de toevoeging van bioactieve moleculen, zoals matriline-3 en Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan de JBNm een optimale micro-omgeving creëren die vervolgens de gewenste cel- en weefselfunctionaliteit kan stimuleren9.

JBNts zijn nieuwe nanobuisjes afgeleid van synthetische versies van de nucleobase adenine en thymine. De JBNts worden gevormd door zelfassemblage10; zes synthetische nucleobasen binden zich om een ring te vormen, en deze ringen ondergaan π-π stapelingsinteracties om een nanobuisje van 200-300 μm in lengte11 te creëren. Deze nanobuisjes zijn structureel vergelijkbaar met collageeneiwitten; door een aspect van de inheemse kraakbeenmicro-omgeving na te bootsen, is aangetoond dat JBNts een gunstige hechtingsplaats bieden voor chondrocyten en menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs)11,12,13,14. Omdat de nanobuisjes zelfassemblage ondergaan en geen enkele vorm van initiator nodig hebben (zoals UV-licht), vertonen ze een opwindend potentieel als een injecteerbare steiger voor moeilijk bereikbare defectgebieden15.

Matrilin-3 is een structureel extracellulair matrixeiwit dat voorkomt in kraakbeen. Dit eiwit speelt een belangrijke rol bij chondrogenese en een goede kraakbeenfunctie16,17. Onlangs is het opgenomen in biomateriaalsteigers, wat chondrogenese zonder hypertrofie bevordert 9,18,19. Door dit eiwit in het JBNm op te nemen, worden kraakbeencellen aangetrokken door een stellage die vergelijkbare componenten bevat als die van de oorspronkelijke micro-omgeving. Bovendien is aangetoond dat matriline-3 nodig is voor een goede TGF-β1-signalering binnen chondrocyten20. Groeifactoren functioneren als signaalmoleculen, die specifieke groei van een bepaalde cel of weefsel veroorzaken. Om een optimale kraakbeenregeneratie te bereiken, zijn matriline-3 en TGF-β1 dus essentiële componenten binnen de JBNm. De toevoeging van TGF-β1 aan de laag-voor-laag steiger kan de kraakbeenregeneratie in een weefselconstructie verder bevorderen. TGF-β1 is een groeifactor die wordt gebruikt om het genezingsproces van osteochondrale defecten aan te moedigen, chondrocyten en hMSC-proliferatie en differentiatiete stimuleren 21,22. TGF-β1 speelt dus een sleutelrol in de kraakbeenregeneratie JBNm (J/T/M JBNm)23 en stimuleert een goede groei, vooral wanneer deze gelokaliseerd is in de JBNm-lagen.

Zoals eerder vermeld, worden groeifactoren meestal aan de buitenkant van steigers geassembleerd zonder specifieke inbouwmethoden. Hier, met de nauwkeurig ontworpen nano-architectuur van de biomaterialen, werd de JBNm ontwikkeld voor specifieke targeting van beoogde cellen en weefsels. De JBNm bestaat uit TGF-β1 geplakt op JBNt oppervlakken in de binnenste laag en matrilin-3 geplakt op JBNt oppervlakken in de buitenste laag24,25. De opname van TGF-β1 in de binnenste laag van de laag-voor-laag structuur zorgt voor een sterk gelokaliseerde micro-omgeving langs de JBNm-vezels, waardoor een homeostatisch weefselconstruct ontstaat met een veel langzamere afgifte van het eiwit12. De injecteerbaarheid van de JBNm maakt het een ideaal kraakbeenweefselconstruct voor verschillende toekomstige biomateriaaltoepassingen26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synthese van JBNts

  1. Bereid het JBNt-monomeer voor met behulp van eerder gepubliceerde methoden, waarbij de synthese van een verscheidenheid aan verbindingenbetrokken is 12.
  2. Zuiver ruw JBNt monomeer nadat het is gesynthetiseerd met high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) met behulp van een omgekeerde fasekolom. Gebruik oplosmiddel A: 100% water, oplosmiddel B: 100% acetonitril en oplosmiddel C: HCl wateroplossing met pH = 1. Gebruik een debiet van 3 ml/min. Verzamel de grootste piek verkregen in de HPLC op 7,2 min.

2. Fabricage voor JBNt /Matn1 / TGF-β1 (Video 1)

OPMERKING: Video 1 laat zien dat de JBNm een injecteerbare vaste stof is die wordt gevormd in een fysiologische omgeving (wateroplossing, geen UV-licht, geen chemische additieven en geen verwarming), die ook biologisch geïnspireerd is.

  1. Voeg 8 μL 1 mg/ml TGF-β1 gesuspendeerd in H2O toe aan 32 μL van 1 mg/ml matriline-3 gesuspendeerd in H2O. Pipet om een goede menging van deze eiwitten te garanderen.
  2. Voeg 80 μL 1 mg/ml JBNts gesuspendeerd in H2O toe aan de TGF-β1/matriline-3 oplossing. Pipetteer herhaaldelijk om een goede menging te garanderen. De aanwezigheid van witte vlokjes kan onmiddellijk na de toevoeging van JBNts worden waargenomen, wat wijst op de vorming van de JBNm (video 1).

3. Observatie van monsters met ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) absorptie

OPMERKING: De UV-Vis absorptiespectra werden bestudeerd om de assemblage van de JBNm te karakteriseren. Deze meting werd geanalyseerd voor vier categorieën: JBNts alleen, matrilin-3 alleen, TGF-β1 alleen en de volledige laag-voor-laag JBNm, bestaande uit alle drie de delen. Alle aanvangsconcentraties worden gesuspendeerd in H2O.

  1. Voeg voor de JBNt-groep 5 μL van 1 mg/ml JBNts toe aan 50 μL H2O om een oplossing van 90,9 μg/ml te maken.
  2. Voeg voor de matriline-3-groep 40 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 15 μL H2O om een oplossing van 7,3 μg/ml te maken.
  3. Voeg voor de TGF-β1-groep 10 μL van 10 μg/ml TGF-β1 toe aan 45 μL H2O om een oplossing van 1,8 μg/ml te maken.
  4. Voeg voor de JBNm-groep 40 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 10 μL van 10 μg/ml TGF-β1. Roer om een goede menging te garanderen en voeg vervolgens 5 μL 1 mg / ml JBNts toe aan de oplossing, waarbij u herhaaldelijk pipetteert om het monster te mengen.
  5. Meet met behulp van een spectrofotometer het absorptiespectrum van elke groep.

4. Zeta-potentiaalmeting van monsters

OPMERKING: Het zeta-potentieel werd geanalyseerd om beter te voorspellen hoe de JBNm zou interageren met in vivo weefsel. Drie groepen werden gemeten: matrilin-3 alleen, matrilin-3 met TGF-β1 en de volledige laag-voor-laag JBNm.

  1. Voeg voor de matriline-3-groep 160 μL 10 mg/ml matriline-3 toe aan 640 μL H2O om een oplossing van 800 μL te maken.
  2. Voeg voor de matriline-3/TGF-β1-verbinding 160 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 40 μL van 10 μg/ml TGF-β1. Pipetteer herhaaldelijk om een goede homogeniteit te garanderen. Voeg het vervolgens toe aan 600 μL H2O, wat resulteert in een oplossing van 800 μL.
  3. Voeg voor de JBNm-groep 160 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 40 μL van 10 μg/ml TGF-β1. Pipetteer meerdere keren om de eiwitten te mengen. Voeg vervolgens 20 μL 1 mg/ml JBNts toe aan de oplossing en pipet om homogeniteit te garanderen. Voeg ten slotte de JBNm-oplossing toe aan 580 μL H2O om een oplossing van 800 μL te produceren.
  4. Meet de zeta-potentialwaarden voor de drie groepen.

5. Bereiding van JBNt/matrilin-3 nanomatrix voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

OPMERKING: TEM-karakterisering wordt uitgevoerd om de morfologie van JBNts en JBNm te karakteriseren.

  1. Plaats twee roosters in een plasmareiniger om de roosters goed te reinigen vóór de negatieve kleuring van de JBNts en JBNm volgens de gepubliceerde protocollen en protocollen van de fabrikant12.
  2. Maak een JBNt-oplossing van 200 μg/ml door 10 μL 1 mg/ml JBNts te mengen met 40 μL gedestilleerd water.
  3. Meng 30 μL van 100 μg/ml matriline-3 met 20 μL van 100 μg/ml TGF-β1 en pipet meerdere keren. Voeg 10 μL 1 mg/ml JBNts toe aan het matriline-3/TGF-β1 mengsel om het JBNm-monster te bereiden. Nogmaals, pipetteer herhaaldelijk.
  4. Voeg 3 μL jbnt-oplossing (200 μg/ml) en 3 μl JBNm-oplossing toe aan afzonderlijke roosters en laat ze 2 minuten staan.
  5. Spoel elk rooster af met 100 μL uranylacetaatoplossing (0,5%). Gebruik filterpapier om de overtollige oplossing te verwijderen en de roosters aan de lucht te laten drogen.
  6. Gebruik een transmissie-elektronenmicroscoop om de monsters goed te observeren en te karakteriseren, zoals eerder gepubliceerd11,12.

6. Absorptiespectrameting van fluorescerende eiwitten

OPMERKING: De structuur van JBNm wordt geverifieerd door de structuren van de JBNm te observeren met absorptiespectrale analyse.

  1. Label de TGF-β1 met behulp van een eiwitetiketteringskit volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 20 μL van 20 μg/ml met het label TGF-β1 toe aan 25 μL H2O om een testoplossing van 8,9 μg/ml te maken.
  2. Label de matrilin-3 met behulp van een aparte labeling kit. Voeg 20 μL van 80 μg/ml matriline-3 toe aan 25 μL H2O om een testoplossing van 36 μg/ml te maken.
    OPMERKING: De fluorescerende kleurstofetikettering van de TGF-β1 resulteerde in een eindconcentratie van 20 μg / ml, terwijl de etikettering van het matriline-3 resulteerde in een eindconcentratie van 80 μg / ml.
  3. Meng 20 μL van 80 μg/ml gelabeld matriline-3 met 20 μL van 20 μg/ml gelabeld TGF-β1 en 5 μL H2O, wat resulteert in een gelabelde TGF-β1/matrilin-3-verbinding. Pipetteer het mengsel meerdere keren om te mengen.
  4. Voeg 5 μL 1 mg/ml JBNts toe aan 40 μL H2O, wat resulteert in een oplossing van 111 μg/ml.
  5. Voeg 20 μL van 20 μg/ml met het label TGF-β1 toe aan 20 μL van 80 μg/ml met het label matriline-3 en pipet meerdere keren. Voeg 5 μL 1 mg/ml JBNts toe aan de gelabelde TGF-β1/matriline-3 oplossing en pipetteer herhaaldelijk om de verbinding goed te mengen.
    OPMERKING: De uiteindelijke concentraties van de JBNt, gelabeld TGF-β1, en gelabelde matriline-3 monsters waren respectievelijk 111 μg / ml, 8,9 μg / ml en 36 μg / ml.
  6. Breng elke monstergroep (d.w.z. gelabeld TGF-β1 (stap 6.1), gelabeld matriline-3 (stap 6.2), gelabeld TGF-β1/matrilin-3 (stap 6.3), JBNts (stap 6.4), JBNm (stap 6.5)) over naar hun eigen put van een zwarte 384-well plaat.
  7. Laad de zwarte 384-well plaat in een multi-mode microplaatlezer en voer metingen uit bij excitatiegolflengten van 488 nm en 555 nm volgens het protocol van de fabrikant.

7. In vitro biologische functietest

  1. Celhechtingstest op voorgecoate dekglaskamers
    1. Bereid twee kamerdekglazen met vijf groepen monsters voor, omdat voor elk celtype één coverglass wordt gebruikt.
    2. Voeg 1,25 μL 1 mg/ml JBNts toe aan 198,75 μL gedestilleerd water, wat resulteert in een oplossing van 6,25 μg/ml.
    3. Voeg 10 μL matriline-3 toe aan 10 μL matriline-3 tot 190 μL gedestilleerd water, wat resulteert in een 0,5 μg/mlolution.
    4. Voeg 2,5 μL van 10 μg/ml TGF-β1 toe aan 197,5 μg/mLof gedestilleerd water, wat resulteert in een 0,125 μg/mloplossing.
    5. Voeg voor de JBNm-groep 10 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 2,5 μL van 10 μg/mLTGF-β1 en pipetteer herhaaldelijk. Voeg 1,25 μL JBNts met een concentratie van 1 mg/ml toe aan de mengseloplossing en pipet. Voeg ten slotte 186,25 μL gedestilleerd water toe om te resulteren in een JBNm-oplossing van 200 μL.
      1. Gebruik voor de controlegroep 200 μL gedestilleerd water.
    6. Voeg elke monstergroep toe aan hun eigen put van een no. 1.5 kamerzeil. Plaats het afdekglas gedurende 1 uur in een vriezer van -80 °C en vriesdroog het vervolgens met een lyofilisatorinstrument.
    7. Zaai menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) en menselijke chondrocytencellen (10.000 cellen per put) in elk putje van de voorbereide kamerdekglazen.
    8. Incubeer de twee afdekglazen gedurende 4 uur in een couveuse van 37 °C. Aspirateer vervolgens het celkweekmedium en spoel tweemaal met PBS.
    9. Fix cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 5 minuten en verwijder en spoel monsters vervolgens met PBS. Spoel het monster een tweede keer af om de 4% paraformaldehyde volledig te verwijderen.
    10. Incubeer cellen met 100 μL van 0,1% Triton-X gedurende 10 minuten en was met PBS. Voeg 100 μL van 0,165 μM rhodamine-falloidine toe aan elk putje. Wacht 30 minuten en was dan opnieuw met PBS.
    11. Voeg 0,1 μg /ml DAPI toe aan elk putje om de kernen te kleuren. Wacht 5 minuten en spoel de putjes twee keer af met PBS.
    12. Gebruik een spectrale confocale microscoop om celmorfologie te observeren en fluorescerende beelden vast te leggen.
    13. Analyseer verder het celnummer en de morfologie met behulp van beeldverwerkingssoftware. Open de software en laad de afbeeldingen. Voeg een schaalbalk toe en kalibreer de software. Tel het aantal cellen in een bepaald gebied voor elk monster. Gebruik vervolgens het meetinstrument om gegevens over celmorfologie voor elk monster te verzamelen.
  2. Celproliferatie
    1. Bereid drie onbehandelde platen met 96 putten voor en voeg vijf groepen monsters aan elk toe.
      1. Voeg voor de JBNt-groep 3,75 μL 1 mg/ml JBNts toe aan 596,25 μL gedestilleerd water, wat resulteert in een JBNt-oplossing van 600 μL met een concentratie van 6,25 μg/ml.
      2. Voeg voor de TGF-β1-groep 7,5 μL van 10 μg/ml TGF-β1 toe aan 592,5 μL gedestilleerd water, wat resulteert in een testoplossing van 0,125 μg/ml.
      3. Voeg voor de matriline-3-groep 30 μL 10 μg/ml matriline-3 toe aan 570 μL gedestilleerd water, wat resulteert in een testoplossing van 0,5 μg/ml.
      4. Meng voor de JBNm-groep 7,5 μL van 10 μg/ml TGF-β1 met 30 μL van 10 μg/ml matriline-3 en pipet meerdere keren, gevolgd door toevoeging van 3,75 μL 1 mg/ml JBNts aan de oplossing.
      5. Verdun JBNm-oplossing met 558,75 μL gedestilleerd water om de eindconcentraties van respectievelijk 6,25 μg/ml, 0,125 μg/ml en 0,5 μg/ml te verkrijgen voor JBNt-, TGF-β1- en matriline-3-monsters.
      6. Gebruik voor de controlegroep 600 μL gedestilleerd water.
    2. Verdeel elke monstergroep in zes putjes (100 μL monster per putje).
    3. Plaats de drie platen met alle monsters gedurende 1 uur in een vriezer van -80 °C en vriesdroog vervolgens met een lyofiliseerinstrument.
    4. Zaai hMSCs op deze platen en ontvang elk een celsuspensie van 100 μL (per put) met 5.000 cellen. Incubeer de drie platen bij 37 °C gedurende 1 dag, 3 dagen of 5 dagen bij 5% CO2.
    5. Voeg 10 μL CCK-8-oplossing toe aan elk putje met de cellen en incubeer bij 37 °C gedurende nog eens 2 uur.
    6. Meet de absorptiewaarden van elke put met multi-mode microplaatlezers bij 450 nm.
    7. Zaai een bekende gradiënt van hMSCs op een 96-well plaat en incubeer gedurende 4 uur. Gebruik de CCK-8-test om de absorptiewaarden van het bekende aantal cellen te meten en een standaardcurve te genereren.
    8. Bereken de celproliferatie met behulp van de absorptiestandaardcurve.
  3. Stabiliteitstest
    OPMERKING: Een humane TGF-β1 gerichte ELISA-kit werd gebruikt om het percentage afgifte van TGF-β1 uit de JBNm in een agarose hydrogel te bepalen.
    1. Bereid 2% agarose door 400 mg agarosepoeder toe te voegen aan 20 ml PBS en het te verwarmen tot 100 °C om het agarosepoeder volledig op te lossen.
    2. Bereid de JBNm in de afgekoelde 2% agarose hydrogel.
      1. Combineer 10 μL van 10 μg/ml TGF-β1, 40 μL van 10 μg/ml matriline-3, 5 μL van 1 mg/ml JBNts en 195 μL PBS. Meng deze oplossing met 250 μL van 2% agarose, waardoor de JBNm hydrogel ontstaat.
    3. Voeg 500 μL PBS toe, gebruik het als een release-oplossing en zorg ervoor dat het elke 3 dagen wordt vervangen. Bewaar elke vrijgegeven oplossing en laat het monster 15 dagen staan.
    4. Gebruik een ELISA-kit om elk van de vastgelegde release-oplossingen te testen, door de instructies van de fabrikant te volgen.
      OPMERKING: Door de hoeveelheid TGF-β1 die in de PBS vrijkomt af te trekken van de theoretische belastingswaarde van 100%, kan de resterende hoeveelheid TGF-β1 worden bepaald.
  4. Celdifferentiatie analyse met PCR26.
    1. Bereid zeven groepen monsters met elk monster dat 20 μL celsuspensie (4 x 104 cellen), 30 μL van de specifieke oplossing (of PBS, afhankelijk van de monstergroep) en 50 μL 2 wt % agarose bevat.
      1. Voeg voor de TGF-β1-groep 5 μL van 10 μg/ml TGF-β1 toe aan 25 μL PBS, wat resulteert in een oplossing van 1,6 μg/ml.
      2. Voeg voor de matriline-3-groep 20 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 10 μL PBS, wat resulteert in een oplossing van 6,7 μg/ml.
      3. Voeg voor de JBNt-groep 2,5 μL 1 mg/ml JBNts toe aan 27,5 μL PBS, wat resulteert in een oplossing van 83,3 μg/ml.
      4. Voeg voor de J/T/M JBNm-groep 10 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 5 μL van 10 μg/ml TGF-β1 en pipetteer op en neer om de oplossing te mengen. Voeg vervolgens 2,5 μL 1 mg/ml JBNts toe en pipetteer opnieuw. Verdun ten slotte met 2,5 μL PBS.
      5. Gebruik voor elke controlegroep 30 μL PBS als monster.
    2. Voeg 0,5 ml celkweekmedium toe aan elke put en zorg ervoor dat u deze om de 3 dagen vervangt.
      1. Gebruik voor de positieve controlegroep een in de handel verkrijgbaar hMSC chondrogeen medium met toegevoegde TGF-β1. Deze extra TGF-β1 is gelijk aan de hoeveelheid in zowel de TGF-β1- als de J/T/M JBNm-groep.
      2. Gebruik voor een van de negatieve controlegroepen een commercieel hMSC chondrogeen medium dat geen TGF-β1 bevat. Gebruik voor de andere negatieve controlegroep een DMEM-celkweekmedium dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat.
      3. Gebruik voor elke andere groep een commercieel hMSC chondrogene celkweekmedium zonder TGF-β1.
    3. Kweek de monsters gedurende 15 dagen.
    4. Extraheer het RNA van de monsters en voer PCR uit om de differentiatie van de monsters te bestuderen zoals eerder beschreven26.
  5. Immunostaining voor type X collageenexpressietest
    1. Bereid zeven monsters op basis van agarose op dezelfde manier als de celdifferentiatie met de sectie PCR-methode (stap 7.4).
    2. Kweek de monsters gedurende 15 dagen.
    3. Bevestig de monsters met 4% formaldehyde gedurende 1 dag, week 's nachts in 30% sucrose-oplossing en vries vervolgens een nacht in bij -80 °C met vloeibare stikstof. Bevestig de monsters met behulp van het optimale snijtemperatuurverbindingsreagens (OCT), een mengsel van in water oplosbare glycolen en harsen, bij -10 °C.
    4. Gebruik een cryostaatmicrotoom om 20 μm dikke bevroren secties van elk monster te verkrijgen.
    5. Kleur elke sectie met een Anti-Collageen X-antilichaam met 1:800 verdunning en een fluorescerend labelend secundair antilichaam verdund met PBS, volgens de protocollen van de fabrikant.
    6. Observeer elke sectie met een confocale microscoop, met behulp van een excitatie van 488 nm en een vergroting van 40x op het oculair.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Volgens het protocol werden JBNts met succes gesynthetiseerd en gekarakteriseerd met UV-Vis-absorptie en TEM. De JBNm is een injecteerbare vaste steiger die een snel biomimetisch proces ondergaat. Nadat JBNts waren toegevoegd aan een mengsel van TGF-β1/matrilin-3-oplossing in een fysiologische omgeving, werd een stevige witgaassteiger gevormd die de succesvolle assemblage van JBNm aangeeft, zoals te zien is in figuur 1. Dit werd aangetoond in de karakteriseringsmethoden.

Onder fysiologische omstandigheden is matriline-3 negatief geladen vanwege het iso-elektrische punt27 (figuur 2A). Na de toevoeging van de TGF-β1-oplossing aan de matriline-3-oplossing steeg het zetapotentiaal van de TGF-β1/matriline-3-verbinding tot een bijna-neutrale waarde, wat aangeeft dat de twee eiwitten gebonden waren via ladingsinteracties. Zoals te zien is in figuur 2A, is het zeta-potentieel van JBNm het hoogst van de drie groepen als gevolg van de JBNts, aangezien het iso-elektrische punt van de lysine-zijketen ongeveer 9,74 is in een fysiologische omgeving. De toename van de zeta-potentialwaarden van de JBNm duidt op de succesvolle assemblage van de laag-voor-laag structuur.

UV-Vis absorptiespectra (figuur 2B) verduidelijken de vorming van de hiërarchische laag-voor-laag binnenstructuur van de JBNm. De aromatische ringen van de lysine zijketens en de JBNts droegen bij aan de twee absorptiepieken bij respectievelijk 220 nm en 280 nm. De afname van de absorptiewaarde werd waargenomen na de toevoeging van TGF-β1, wat aangeeft dat binding optreedt tussen TGF-β1 en JBNts. Na de toevoeging van JBNts aan matrilin-3 werd een meer duidelijke afname van de absorptie-intensiteit van de pieken waargenomen, wat opnieuw wijst op een succesvolle binding tussen matrilin-3 en JBNts. Evenzo werd na de toevoeging van JBNts aan een mengsel van TGF-β1 / matrilin-3 het JBNm gevormd en namen de absorptiepieken in intensiteit af. De absorptiepiek van JBNm ligt dichter bij de matrilin-3/JBNts-lijn dan de TGF-β1/JBNts-lijn, wat aangeeft dat de JBNts liever binden aan matrilin-3, waardoor een laag-voor-laag buitenstructuur met matrilin-3 wordt gevormd, terwijl TGF-β1 zich in de binnenste laag bevindt. TEM wordt gebruikt om de morfologie van de JBNts en JBNm te karakteriseren (figuur 2C). Na combinatie met eiwitten werden dikke bundels JBNm waargenomen die een steigerstructuur vormden.

Fluorescentiemicroscopie heeft de aanwezigheid van de laag-voor-laag structuur bevestigd (figuur 3A) en de doorsnede van de JBNm aangetoond. Na het labelen van TGF-β1 en matrilin-3, werd waargenomen dat de rode fluorescerende matrilin-3 de JBNt-bundels omhult en de buitenste laag van de JBNm vormt. In figuur 3B vormde de groen-fluorescerende TGF-β1 een binnenste laag, die bijdroeg aan het vermogen om groeifactoren op te slaan en de lokalisatie van TGF-β1 mogelijk te maken. Figuur 3C toont het fluorescentieresonantie-energieoverdrachtsproces (FRET) tussen de fluorescerende kleurstof-gelabelde eiwitten zoals gekenmerkt door fluorescentiespectra, met emissiepieken bij 520 nm en 570 nm voor gelabelde TGF-β1- en matriline-3-groepen, respectievelijk28. Na de toevoeging van JBNts volgens het protocol wordt de laag-voor-laag structuur gevormd; pieken werden waargenomen bij zowel 520 nm als 570 nm voor de JBNm-groep, wat wijst op een succesvolle binding en assemblage van de eiwitten en JBNts.

Daarnaast werd het effect van de JBNm op hMSCs adhesie en celproliferatie onderzocht. Zoals te zien is in figuur 4, werd de celhechtingsdichtheid van de JBNm gecoat op het oppervlak van de kamerdekglazen bepaald. De JBNm toonde hMSCs geclusterd langs zichzelf (figuur 4A), terwijl minder cellen zich hechtten aan JBNts. Voor de andere groepen waren de hMSCs echter gelijkmatig verdeeld zonder uitlijning in vergelijking met de JBNm-groep. De uitlijning van cellen, evenals de grootte van de cellen op het JBNm, toonde aan dat JBNts een rol speelden bij celadhesie, terwijl de eiwitten in de JBNm de affiniteit van celadhesie verhoogden (figuur 4B, C).

Na dag 1 van de celkweek met de JBNm, JBNts, matriline-3 alleen, TGF-β1 alleen en negatieve controle, vertoonden de JBNm- en TGF-β1-groepen een significante celproliferatie in vergelijking met de andere groepen. Toen de duur van de celkweek werd verhoogd tot 3 en 5 dagen, vertoonden de JBNm- en TGF-β1-groepen nog meer verhoogde celproliferatie, zoals te zien is in figuur 5. Een langetermijnfunctiestudie werd uitgevoerd om de differentiatie van hMSCs met JBNm en zonder JBNm (negatieve controle) te bepalen. Na 15 dagen werd een verbeterde Alcian blauwe vlek waargenomen, wat wijst op chondrogenese van hMSCs die naast JBNm26 groeien. De cellen gaven dus de voorkeur aan de JBNts van de JBNm. Dit was waarschijnlijk te wijten aan de DNA-nabootsende structuur en het vermogen om te worden gedemonteerd in eenheden met kleine moleculen, waarvan de laatste kan worden veroorzaakt door een lage pH of voldoende enzymatische activiteit (zoals opname door cellen)14,29.

Video 1: Video-opname van JBNm assemblage. Deze opname toont de vorming van de JBNts, matrilin-3 en TGF-β1 in de JBNm. Dit cijfer is aangepast van Zhou et al. (2021)26. Klik hier om deze video te downloaden.

Figure 1
Figuur 1: Schematische illustratie van de chemische structuur van JBNts, de J/T/M JBNm en het chondrogene vermogen van de J/T/M JBNm. (A) De chemische structuur van de JBNts, waarbij hun vorming van monomeer tot rozetring tot JBNt wordt benadrukt. (B) De componenten waaruit de J/T/M JBNm bestaat, evenals hoe ze zich assembleren tot de JBNm. (C ) Schematische weergave van het kweken van menselijke mesenchymale stamcellen op het J/T/M JBNm. Dit cijfer is aangepast van Zhou et al. (2021)26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Materiaalkarakterisering van de J/T/M JBNm. (A) Zeta-potentiaalspectra van matriline-3 alleen, de TGF-β1/matrilin-3-verbinding en de J/T/M JBNm. (B) UV-Vis-absorptiespectra van JBNts alleen, matriline-3 alleen, de TGF-β1 alleen, matriline-3/JBNts-verbinding, de TGF-β1/JBNts-verbinding en de J/T/M JBNm. (C ) Beelden van JBNts alleen en de J/T/M JBNm verkregen uit transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Dit cijfer is aangepast van Zhou et al. (2021)26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Fluorescerende confocale beeldvorming en fluorescentiespectra van J/T/M JBNm. (A) 3D confocale afbeelding van de J/T/M JBNm, met rood-fluorescerend gelabeld matriline-3 en groen-fluorescerend-gelabeld TGF-β1. (B) 2D confocale beelden van J/T/M JBNm, met rood-fluorescerend gelabeld matriline-3, groen-fluorescerend-gelabeld TGF-β1, en een samengevoegde versie. (C) Fluorescentiespectra van verschillende verbindingen om het FRET-proces tussen de gelabelde eiwitten te karakteriseren. Dit cijfer is aangepast van Zhou et al. (2021)26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Analyse van de menselijke mesenchymale stamcelcultuur (hMSC). (A) Optische microscopiebeelden van hMSCs met TGF-β1, matriline-3 en JBNts, gekweekt op een agarose-gel. (B) Confocale microscopiebeelden van hMSCs gekweekt op het kamerglas bedekt met een verscheidenheid aan JBNm-componenten. (C) Grafiek van het aantal cellen dat per vierkante millimeter voor elke groep is geplakt. Foutbalken geven standaarddeviaties aan. (D) Grafiek van de lengte van de cel in de hoofdas in μm per groep. Foutbalken geven standaarddeviaties aan. Noot: N ≥ 3, *P< 0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, ****P< 0,0001 (vergeleken met negatieve controles, NC). Dit cijfer is aangepast van Zhou et al. (2021)26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Vergelijking van celnummers voor verschillende groepen tussen dag 1, 3 en 5. Celnummerstatistieken van hMSCs na te zijn gekweekt met verschillende materialen op dag 1, 3 en 5. Foutbalken geven standaarddeviaties aan. Noot: N = 6, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Dit cijfer is aangepast van Zhou et al. (2021)26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het doel van deze studie is om een biomimetisch steigerplatform te ontwikkelen, de JBNm, om de beperkingen van conventionele weefselconstructies te overwinnen die afhankelijk zijn van celkweekomgevingen om celdifferentiatie te bemiddelen. De JBNm is een laag-voor-laag structuur scaffold voor een zelfvoorzienend kraakbeenweefsel construct. Het innovatieve ontwerp is gebaseerd op nieuwe DNA-geïnspireerde nanomaterialen, de JBNts. De JBNm, samengesteld uit JBNts30, TGF-β1 en matrilin-3, wordt geassembleerd door middel van een nieuwe laag-voor-laag techniek waarbij de zelfassemblage van de steiger op moleculair niveau werd gecontroleerd. De assemblage van JBNm werd waargenomen en gekarakteriseerd met zeta-potentiaalmeting, UV-Vis-absorptie, TEM en fluorescentiespectrale analyse.

De UV-Vis spectra in figuur 2B (stap 3) hebben de vorming van het hiërarchische laag-voor-laag binnenste van de JBNm aangetoond. Een verschil in absorptiepieken kan worden waargenomen als gevolg van een verschil in bindingsaffiniteit. Er vinden meer belangrijke interacties plaats tussen JBNts en matrilin-3 dan tussen JBNts en TGF-β1, wat aangeeft dat JBNts collageeneiwitten nabootsen in termen van hun vezelige morfologie en lysine-oppervlaktechemie. Deze techniek is nodig om de binding van JBNts aan matriline-3 in plaats van TGF-β1 te observeren, waardoor de inkapseling van TGF-β1 mogelijk wordt en daarom een langzame afgifte van TGF-β1 in het omliggende weefsel ontstaat. De meest kritische stap in de ontwikkeling van het JBNm is de combinatie van eiwitten met de JBNts. TGF-β1 en matrilin-3 moeten worden toegevoegd voorafgaand aan de toevoeging van JBNts om het volledige effect van het FRET-fenomeen tussen het gelabelde matrilin-3 en TGF-β1 waar te nemen. De beperking van deze techniek komt voort uit de onjuiste optelvolgorde van eiwitten en nanobuisjes, wat resulteert in gevarieerde metingen. Dit is een belangrijke stap voor de vorming van JBNm voor toekomstige studies en zal daarom worden toegepast op toekomstige JBNm-verzinsels en studies.

Matriline-3 is een zeer negatief eiwit, terwijl TGF-β1 een enigszins neutraal eiwit is, zoals te zien is in figuur 2A. Het ladingsverschil werd waargenomen om de binding van deze eiwitten te bepalen. Van de negatief geladen toestand van matrilin-3 nam het zetapotentiaal toe tot een bijna neutrale waarde na de toevoeging van TGF-β1 (figuur 2A). Deze stap is belangrijk om de eerste binnenste laag van de biomimetische steiger te bepalen en om aan te geven dat de combinatie van beide eiwitten door ladingsinteractie verloopt. Na de toevoeging van JBNts, de tweede stap van de JBNm-fabricage, werd het zeta-potentieel van JBNm gemeten bij ~ 10 ± 5 mV (figuur 2A). Omdat JBNts zeer positief zijn, werd waargenomen dat de lading van JBNm zoals verwacht toenam. Bepaling van ladingen met zeta-potentiaal is dus belangrijk om de vorming van JBNm stap voor stap te observeren via ladingsinteracties. Net als bij UV-Vis-spectroscopie is de opeenvolging belangrijk in deze stap en kan een onjuiste optelvolgorde resulteren in gevarieerde metingen. Evenzo is het belangrijk om het mengsel op en neer te pipeten voorafgaand aan de meting.

Vervolgens worden TGF-β1 en matrilin-3 gelabeld, zodat de ontwikkeling van JBNm kan worden waargenomen met confocale microscopie en fluorescentiespectrale analyse met multimode microplaatlezers. De monsters werden opgewonden met een 488 nm laser en vertoonden emissiepieken bij 520 nm en 570 nm (figuur 3). Alleen voor JBNts werd geen emissiepiek waargenomen omdat ze niet zijn gelabeld. FRET trad op van de TGF-β1-donor tot de matriline-3-acceptor, waardoor de emissiepiek bij 520 nm werd verminderd en de emissiepiek bij 570 nm toenam; de twee componenten liggen 10 nm uit elkaar in afstand, waardoor het FRET-fenomeen kan optreden. Daarom is de assemblage van JBNm gebaseerd op ruimtelijke (d.w.z. fysieke afstand) processen samen met ladingsinteracties. De meest kritische stap in de ontwikkeling van JBNm is de optelvolgorde; TGF-β1 en matrilin-3 moeten worden toegevoegd voorafgaand aan de toevoeging van JBNts om het volledige effect van het FRET-fenomeen waar te nemen. Een vergroting van ten minste 40x op het oculair is vereist om de fluorescerende JBNm te observeren. De beperking van deze techniek is dat de JBNts niet gelabeld zijn en daarom niet konden worden waargenomen met confocale microscopie. De eiwitetiketteringstechniek kan echter worden toegepast om JBNt te labelen met enkele wijzigingen voor toekomstige toepassingen.

JBNm kan celfuncties ondersteunen, zoals celadhesie en celproliferatie. In deze studie werden hMSCs gekweekt (te beginnen met 5.000 cellen) op verschillende materialen (JBNm, JBNts, TGF-β1, matrilin-3 en negatieve controles zonder additieven) om de celnummers na incubatie gedurende 1, 3 en 5 dagen te vergelijken met behulp van CCK-8-oplossing, volgens de exacte protocollen van de fabrikant om celproliferatie te bepalen. JBNm, vooral in de aanwezigheid van TGF-β1, en TGF-β1 alleen vertoonden significante celproliferatie in vergelijking met de andere drie groepen. JBNts bootsen collageen in de ECM morfologisch na, terwijl matriline-3 een kraakbeenspecifiek eiwit is, wat resulteert in verhoogde celproliferatieactiviteit na incubatie bij 37 °C gedurende 3 en 5 dagen (figuur 5). De JBNm heeft een groot potentieel getoond om te dienen als een injecteerbare en biomimetische tissue engineering steiger om de beperkingen van traditionele celconstructies te overwinnen voor verschillende toekomstige toepassingen als biomaterialen29,31. JBNm bootst het kraakbeen-ECM morfologisch na, biedt hechtingsplaatsen en maakt de afgifte van pro-chondrogene differentiatieve factoren in de micro-omgeving mogelijk, zoals TGF-β132,33. Het vermogen van de JBNm om TGF-β1 in de binnenste laag van de steiger op te nemen, voorkomt dat deze naar ongewenste gebieden lekt, waardoor de effectiviteit van de steiger wordt verbeterd (figuur 4 en figuur 5). Veel hMSCs clusteren langs de JBNm-scaffold, terwijl de cellen schaars verdeeld zijn in matrilin-3, TGF-β1 en negatieve controlegroepen (figuur 4). De morfologie van de cellen werd ook waargenomen, wat wijst op een uitstekende affiniteit met JBNm-oppervlakken. Deze nauwkeurig ontworpen biomaterialen voorkomen de snelle afgifte van opgenomen bioactieve moleculen in de celkweekomgeving en verbeteren de zelfredzaamheid van de weefselconstructies binnen de matrix34. Een beperking van deze techniek is dat de begincelaantallen cruciaal zijn voor het bepalen van de proliferatie van cellen. Een startcelgetal van 5.000 werd voor dit onderzoek het meest optimaal bevonden. Een standaardcurve is ook nodig om het celnummer te bepalen door een bekend aantal cellen te plotten en deze te meten in de multimode microplaatlezer. Deze techniek kan in de toekomst worden toegepast als een gestandaardiseerde methode om celproliferatie te bepalen in alle studies met betrekking tot JBNm-steigers.

hMSCs werden gekweekt in 3D-agarose pellets met en zonder JBNm om de langetermijnfunctiestudie gedurende 15 dagen te bepalen. Na 15 dagen werd totaal RNA geëxtraheerd uit de hMSCs in de agarose-pellets, met positieve controle (pellets werden geleverd met verse TGF-β1 telkens wanneer het medium werd vervangen), JBNm, JBNts, matriline-3, TGF-β1 en geen additieven. Real-time qPCR werd uitgevoerd voor genanalyse, testen op chondrogene differentiatiemarkers, Aggrecan (ACAN) en hypertrofiemarker type X collageen (COL X). ACAN-expressie in de JBNm-groep nam significant toe in vergelijking met andere groepen, wat aantoont dat JBNm stamcel chondrogene differentiatie significant bevordert terwijl COL X wordt geremd. Ondertussen heeft de positieve controle de chondrogenese versterkt, zoals opgemerkt in de toename van ACAN, en ook hypertrofie van de gedifferentieerde cel26. Een andere beperking van deze studie is dat de RNA-extractie afkomstig is van de cellen die in een hydrogel zijn ingebed. Het totale RNA dat in dit protocol werd verkregen, was daarom laag in concentratie en zuiverheid. Om deze beperking te overwinnen, werden meer monsters gekweekt en geëxtraheerd om de optimale concentratie en zuiverheid te verkrijgen voor de volgende stap, real-time qPCR. Hoewel qPCR belangrijk is voor de studie, is een kleine wijziging van deze techniek noodzakelijk voor toekomstige studies om een efficiënte monsterextractie te garanderen zonder een groot aantal monsters op te offeren.

Een stabiliteitstest werd uitgevoerd met een menselijke TGF-β1 ELISA-kit om de afgifte van eiwit uit de JBNm-hydrogel te testen. In deze studie wordt verwacht dat TGF-β1 wordt ingekapseld in de J / T / M JBNm, en daarom moet geen TGF-β1-afgifte worden waargenomen (d.w.z. de theoretische belastingswaarde is 100%). Een beperking van deze stap is dat alle TGF-β1 wordt verondersteld te zijn ingekapseld in de JBNm laag-voor-laag scaffold. Na 15 dagen worden oplossingen die vrijkomen uit de hydrogel verzameld en getest met de kit, volgens de protocollen van de fabrikant. Vervolgens werd de hoeveelheid TGF-β1 berekend door de hoeveelheid van de vrijgegeven TGF-β1 in PBS af te trekken van de theoretische belastingswaarde. Omdat TGF-β1 was ingekapseld in de binnenste laag van de JBNm, werd de langzame afgifte van het eiwit verwacht. De studie toonde aan dat de TGF-β1 gelokaliseerd is in de JBNm-steiger en niet snel vrijkomt in de omliggende gebieden26.

Dit innovatieve laag-voor-laag JBNm kraakbeenweefsel construct werd gerealiseerd door sterk georganiseerde en gecontroleerde zelfassemblage op moleculair niveau. De TGF-β1 is opgesloten in de binnenste laag van de matrixvezels, waardoor het lekken naar ongewenste locaties wordt voorkomen en tegelijkertijd gelokaliseerde chondrogenese wordt bevorderd. Bovendien is matriline-3 gelokaliseerd in de buitenste laag van de matrixvezels, waardoor een anti-hypertrofische micro-omgeving ontstaat35. Van JBNts is aangetoond dat ze niet alleen dienen als een structurele steigerruggegraat, maar ook de ankerplaatsing en hechting van stamcellen verbeteren om cellen langs de matrixvezels te lokaliseren30,36. Wat toekomstig werk betreft, zal het laag-voor-laag ontwerp van de JBNt-gebaseerde steiger worden aangepast voor toepassingen in verschillende weefsels 37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Yupeng Chen is mede-oprichter van Eascra Biotech, Inc. en NanoDe Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies 7R01AR072027 en 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 en de Universiteit van Connecticut. Dit werk wordt ook gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidie S10OD016435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

Tags

Bio-engineering Nummer 185
Fabricage en karakterisering van laag-voor-laag Janus Base Nano-Matrix om kraakbeenregeneratie te bevorderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter