Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon og karakterisering av lag-for-lag Janus base nano-matrise for å fremme brusk regenerering

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver montering av en lag-for-lag Janus base nano-matrise (JBNm) stillas ved å legge Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3, og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sekvensielt. JBNm ble fabrikkert og karakterisert; I tillegg viste den utmerket bioaktivitet, oppmuntrende cellefunksjoner som vedheft, proliferasjon og differensiering.

Abstract

Ulike stillas biomateriale er utviklet for å veilede celleadhesjon og proliferasjon i håp om å fremme spesifikke funksjoner for in vitro og in vivo bruk. Tilsetningen av vekstfaktorer i disse biomaterialestillasene gjøres vanligvis for å gi et optimalt cellekulturmiljø, formidle celledifferensiering og dets påfølgende funksjoner. Imidlertid er vekstfaktorene i et konvensjonelt biomateriale stillas vanligvis designet for å frigjøres ved implantasjon, noe som kan føre til utilsiktede bivirkninger på omgivende vev eller celler. Her har den DNA-inspirerte Janus base nano-matrisen (JBNm) vellykket oppnådd et svært lokalisert mikromiljø med en lag-for-lag-struktur for selvbærekraftige bruskvevskonstruksjoner. JBNms er selvmontert fra Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3, og transformerende vekstfaktor beta-1 (TGF-β1) via bioaffinitet. JBNm ble montert i et TGF-β1: matrilin-3: JBNt-forhold på 1: 4: 10, da dette har vært det bestemte forholdet der riktig montering i lag-for-lag-strukturen kunne forekomme. Først ble TGF-β1-løsningen lagt til matrilin-3-løsningen. Deretter ble denne blandingen pipettert flere ganger for å sikre tilstrekkelig homogenitet før tilsetning av JBNt-løsningen. Dette dannet lag-for-lag JBNm, etter pipettering flere ganger igjen. En rekke eksperimenter ble utført for å karakterisere lag-for-lag JBNm-strukturen, JBNts alene, matrilin-3 alene og TGF-β1 alene. Dannelsen av JBNm ble studert med UV-Vis absorpsjonsspektra, og strukturen til JBNm ble observert med transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Når det innovative lag-for-lag JBNm-stillaset dannes på molekylær skala, kan det fluorescerende fargestoffmerkede JBNm observeres. TGF-β1 er begrenset i det indre laget av den injiserbare JBNm, som kan forhindre frigjøring av vekstfaktorer til omkringliggende områder, fremme lokalisert kondrogenese og fremme et antihypertrofisk mikromiljø.

Introduction

Stillas i vevsteknikk spiller en viktig rolle i å gi strukturell støtte til cellefeste og påfølgende vevsutvikling1. Vanligvis er konvensjonelle vevskonstruksjoner uten stillas avhengig av cellekulturmiljøet og tilførte vekstfaktorer for å formidle celledifferensiering. Videre er denne tilsetningen av bioaktive molekyler i stillaser ofte den foretrukne tilnærmingen for å lede celledifferensiering og funksjon 2,3. Noen stillaser kan etterligne det biokjemiske mikromiljøet i innfødte vev uavhengig, mens andre kan direkte påvirke cellefunksjoner via vekstfaktorer. Imidlertid møter forskere ofte utfordringer ved valg av stillaser som kan påvirke celleadhesjon, vekst og differensiering positivt, samtidig som det gir optimal strukturell støtte og stabilitet over en lang periode 4,5. De bioaktive molekylene er ofte løst bundet til stillaset, noe som fører til rask frigjøring av disse proteinene ved implantasjon, noe som resulterer i frigjøring på uønskede steder. Dette kulminerer i bivirkninger på vev eller celler som ikke med vilje var målrettet 6,7.

Stillaser er vanligvis laget av polymere materialer. Janus base nano-matrix (JBNm) er en biomimetisk stillasplattform laget med en ny lag-for-lag-metode for selvbærende bruskvevskonstruksjon8. Disse nye DNA-inspirerte nanorørene har blitt kalt Janus base nanorør (JBNts), da de riktig etterligner strukturen og overflatekjemien til kollagen som finnes i den ekstracellulære matrisen (ECM). Med tilsetning av bioaktive molekyler, som matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan JBNm skape et optimalt mikromiljø som deretter kan stimulere ønsket celle- og vevsfunksjonalitet9.

JBNts er nye nanorør avledet fra syntetiske versjoner av nukleobase adenin og tymin. JBNts dannes gjennom selvmontering10; Seks syntetiske nukleobaser bindes for å danne en ring, og disse ringene gjennomgår π-π stablingsinteraksjoner for å skape et nanorør 200-300 μm i lengde11. Disse nanorørene er strukturelt lik kollagenproteiner; ved å etterligne et aspekt av det innfødte bruskmikromiljøet, har JBNts vist seg å gi et gunstig festested for kondrocytter og humane mesenkymale stamceller (hMSCs)11,12,13,14. Fordi nanorørene gjennomgår selvmontering og ikke krever noen form for initiator (for eksempel UV-lys), viser de spennende potensial som et injiserbart stillas for vanskelig tilgjengelige defektområder15.

Matrilin-3 er et strukturelt ekstracellulært matriksprotein som finnes i brusk. Dette proteinet spiller en viktig rolle i kondrogenese og riktig bruskfunksjon16,17. Nylig har det blitt inkludert i biomateriale stillaser, oppmuntrende kondrogenese uten hypertrofi 9,18,19. Ved å inkludere dette proteinet i JBNm, tiltrekkes bruskceller til et stillas som inneholder lignende komponenter som det opprinnelige mikromiljøet. I tillegg har det vist seg at matrilin-3 er nødvendig for riktig TGF-β1-signalering i kondrocytter20. Vekstfaktorer fungerer som signalmolekyler, noe som forårsaker spesifikk vekst av en bestemt celle eller vev. For å oppnå optimal bruskregenerering er matrilin-3 og TGF-β1 essensielle komponenter i JBNm. Tilsetningen av TGF-β1 i lag-for-lag-stillaset kan ytterligere fremme bruskregenerering i en vevskonstruksjon. TGF-β1 er en vekstfaktor som brukes til å oppmuntre helbredelsesprosessen av osteokondrale defekter, oppmuntre kondrocytt og hMSC-spredning og differensiering21,22. Dermed spiller TGF-β1 en nøkkelrolle i bruskregenerering JBNm (J / T / M JBNm) 23, og oppmuntrer til riktig vekst, spesielt når den er lokalisert i JBNm-lagene.

Som nevnt tidligere er vekstfaktorer vanligvis samlet på utsiden av stillas uten spesifikke metoder for inkorporering. Her, med den nøyaktig utformede nanoarkitekturen til biomaterialene, ble JBNm utviklet for spesifikk målretting av tiltenkte celler og vev. JBNm består av TGF-β1 festet på JBNt-overflater i det indre laget og matrilin-3 festet på JBNt-overflater i det ytre laget24,25. Inkorporeringen av TGF-β1 i det indre laget av lag-for-lag-strukturen muliggjør et svært lokalisert mikromiljø langs JBNm-fibrene, og skaper en homeostatisk vevskonstruksjon med en mye langsommere frigjøring av proteinet12. Injiserbarheten til JBNm gjør den til en ideell bruskvevskonstruksjon for ulike fremtidige biomaterialeapplikasjoner26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntese av JBNts

  1. Forbered JBNt-monomeren ved bruk av tidligere publiserte metoder, som involverer syntese av en rekke forbindelser12.
  2. Rens rå JBNt-monomer etter at den har blitt syntetisert med høyytelses væskekromatografi (HPLC) ved hjelp av en omvendt fasekolonne. Bruk løsningsmiddel A: 100% vann, løsningsmiddel B: 100% acetonitril og løsningsmiddel C: HCl vannoppløsning med pH = 1. Bruk en strømningshastighet på 3 ml/min. Samle den største toppen oppnådd i HPLC på 7,2 min.

2. Fabrikasjon for JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

MERK: Video 1 viser at JBNm er et injiserbart fast stoff dannet i et fysiologisk miljø (vannløsning, ingen UV-lys, ingen kjemiske tilsetningsstoffer og ingen oppvarming), som også er biologisk inspirert.

  1. Tilsett 8 μL 1 mg / ml TGF-β1 suspendert i H 2 O til 32 μL1 mg / ml matrilin-3 suspendert i H2O. Pipette for å sikre riktig blanding av disse proteinene.
  2. Tilsett 80 μL 1 mg / ml JBNts suspendert i H2O til TGF-β1 / matrilin-3-løsningen. Pipette gjentatte ganger for å sikre riktig blanding. Tilstedeværelsen av hvite flokker kan observeres umiddelbart etter tilsetning av JBNts, noe som indikerer dannelsen av JBNm (Video 1).

3. Observasjon av prøver med ultrafiolett-synlig (UV-Vis) absorpsjon

MERK: UV-Vis-absorpsjonsspektrene ble studert for å karakterisere monteringen av JBNm. Denne målingen ble analysert for fire kategorier: JBNts alene, matrilin-3 alene, TGF-β1 alene, og hele lag-for-lag JBNm, som består av alle tre delene. Alle innledende konsentrasjoner suspenderes i H2O.

  1. For JBNt-gruppen, tilsett 5 μL 1 mg / ml JBNts til 50 μL H2O for å lage en 90,9 μg / ml løsning.
  2. For matrilin-3-gruppen, tilsett 40 μL 10 μg / ml matrilin-3 til 15 μL H2O for å lage en 7,3 μg / ml løsning.
  3. For TGF-β1-gruppen, tilsett 10 μL 10 μg / ml TGF-β1 til 45 μL H2O for å lage en 1,8 μg / ml løsning.
  4. For JBNm-gruppen, tilsett 40 μL 10 μg / ml matrilin-3 til 10 μL på 10 μg / ml tgf-β1. Agiter for å sikre riktig blanding, og tilsett deretter 5 μL 1 mg / ml JBNts til løsningen, pipettering gjentatte ganger for å blande prøven.
  5. Bruk et spektrofotometer til å måle absorpsjonsspekteret til hver gruppe.

4. Zeta-potensiell måling av prøver

MERK: Zeta-potensialet ble analysert for bedre å forutsi hvordan JBNm ville samhandle med in vivo vev. Tre grupper ble målt: matrilin-3 alene, matrilin-3 med TGF-β1, og hele lag-for-lag JBNm.

  1. For matrilin-3-gruppen, tilsett 160 μL 10 mg / ml matrilin-3 til 640 μL H2O for å lage en 800 μL løsning.
  2. For matrilin-3 / TGF-β1-forbindelsen, tilsett 160 μL 10 μg / ml matrilin-3 til 40 μL 10 μg / ml TGF-β1. Pipette gjentatte ganger for å sikre riktig homogenitet. Deretter tilsettes det til 600 μL H2O, noe som resulterer i en 800 μL løsning.
  3. For JBNm-gruppen, tilsett 160 μL 10 μg / ml matrilin-3 til 40 μL på 10 μg / ml TGF-β1. Pipette flere ganger for å blande proteinene. Tilsett deretter 20 μL 1 mg/ml JBNts til oppløsningen og pipetten for å sikre homogenitet. Til slutt legger du JBNm-løsningen til 580 μL H2O for å produsere en 800 μL-løsning.
  4. Mål zeta-potensielle verdier for de tre gruppene.

5. Fremstilling av JBNt / matrilin-3 nanomatrise for transmisjonselektronmikroskopi (TEM)

MERK: TEM-karakterisering utføres for å karakterisere morfologien til JBNts og JBNm.

  1. Sett inn to rutenett i en plasmarenser for å rengjøre rutenettene ordentlig før den negative fargingen av JBNts og JBNm i henhold til de publiserte protokollene og produsentens protokoller12.
  2. Lag en 200 μg / ml JBNt-løsning ved å blande 10 μL 1 mg / ml JBNts med 40 μL destillert vann.
  3. Bland 30 μL 100 μg / ml matrilin-3 med 20 μL 100 μg / ml TGF-β1 og pipette flere ganger. Tilsett 10 μL 1 mg / ml JBNts til matrilin-3 / TGF-β1-blandingen for å fremstille JBNm-prøven. Igjen, pipette gjentatte ganger.
  4. Tilsett 3 μL JBNt-løsningen (200 μg/ml) og 3 μL JBNm-løsningen i separate gitter, og la dem stå i 2 minutter.
  5. Skyll hvert rutenett med 100 μL uranylacetatoppløsning (0,5%). Bruk filterpapir for å fjerne overflødig løsning og la ristene lufttørke.
  6. Bruk et transmisjonselektronmikroskop for å observere og karakterisere prøvene riktig, som publisert tidligere11,12.

6. Absorpsjonsspektramåling av fluorescerende merkede proteiner

MERK: Strukturen til JBNm er verifisert ved å observere strukturene til JBNm med absorpsjonsspektralanalyse.

  1. Merk TGF-β1 ved å bruke et proteinmerkingssett som følger produsentens instruksjoner. Tilsett 20 μL på 20 μg / ml merket TGF-β1 til 25 μL H2O for å lage en 8,9 μg / ml testløsning.
  2. Merk matrilin-3 ved å bruke et eget merkesett. Tilsett 20 μL 80 μg / ml merket matrilin-3 til 25 μL H2O for å lage en 36 μg / ml testløsning.
    MERK: Den fluorescerende fargestoffmerkingen av TGF-β1 resulterte i en endelig konsentrasjon på 20 μg / ml, mens merkingen av matrilin-3 resulterte i en endelig konsentrasjon på 80 μg / ml.
  3. Bland 20 μL 80 μg / ml merket matrilin-3 med 20 μL 20 μg / ml merket TGF-β1 og 5 μL H2O, noe som resulterer i en merket TGF-β1 / matrilin-3-forbindelse. Pipette blandingen flere ganger for å blande.
  4. Tilsett 5 μL 1 mg / ml JBNts til 40 μL H2O, noe som resulterer i en 111 μg / ml løsning.
  5. Tilsett 20 μL 20 μg / ml merket TGF-β1 til 20 μL på 80 μg / ml merket matrilin-3 og pipette flere ganger. Tilsett 5 μL 1 mg / ml JBNts til den merkede TGF-β1 / matrilin-3-løsningen, og pipette gjentatte ganger for å blande forbindelsen riktig.
    MERK: De endelige konsentrasjonene av JBNt, merket TGF-β1, og merkede matrilin-3-prøver var henholdsvis 111 μg / ml, 8,9 μg / ml og 36 μg / ml.
  6. Overfør hver prøvegruppe (dvs. merket TGF-β1 (trinn 6.1), merket matrilin-3 (trinn 6.2), merket TGF-β1 / matrilin-3 (trinn 6.3), JBNts (trinn 6.4), JBNm (trinn 6.5)) til sin egen brønn av en svart 384-brønnplate.
  7. Last den svarte 384-brønnplaten inn i en multi-mode mikroplateleser og ta målinger ved eksitasjonsbølgelengder på 488 nm og 555 nm etter produsentens protokoll.

7. Analyse av biologisk funksjon in vitro

  1. Celleadhesjonstest på forhåndsbelagte dekkglasskamre
    1. Forbered to kammerbriller med fem grupper av prøver, da en coverglass brukes til hver celletype.
    2. Tilsett 1,25 μL 1 mg / ml JBNts til 198,75 μL destillert vann, noe som resulterer i en 6,25 μg / ml løsning.
    3. Tilsett 10 μL 10 μg / ml matrilin-3 til 190 μL destillert vann, noe som resulterer i en 0,5 μg / mLsolution.
    4. Tilsett 2,5 μL 10 μg / ml TGF-β1 til 197,5 μg / ml destillert vann, noe som resulterer i en 0,125 μg / mLsolution.
    5. For JBNm-gruppen, tilsett 10 μL 10 μg / ml matrilin-3 til 2,5 μL 10 μg / mLTGF-β1 og pipette gjentatte ganger. Tilsett 1,25 μL JBNts med en konsentrasjon på 1 mg/ml til blandingsoppløsningen og pipetten. Til slutt tilsett 186,25 μL destillert vann for å resultere i en 200 μL JBNm-løsning.
      1. For kontrollgruppen, bruk 200 μL destillert vann.
    6. Legg hver prøvegruppe i sin egen brønn av et nr. 1.5 kammerglass. Plasser dekselglasset i en fryser på -80 °C i 1 time, og tørk det deretter med et lyofiliseringsinstrument.
    7. Frø humane mesenkymale stamceller (hMSCs) og humane kondrocyttceller (10.000 celler per brønn) inn i hver brønn i de tilberedte kammerglassene.
    8. Inkuber de to dekselglassene i 4 timer i en 37 ° C inkubator. Deretter aspirerer du cellekulturmediet og skyll to ganger med PBS.
    9. Fest celler med 4% paraformaldehyd i 5 minutter, og fjern og skyll prøver med PBS. Skyll prøven en gang til for å fjerne 4% paraformaldehydet helt.
    10. Inkuber celler med 100 μL 0,1% Triton-X i 10 minutter og vask med PBS. Tilsett 100 μL 0,165 μM rhodamin-phalloidin til hver brønn. Vent i 30 minutter og vask deretter med PBS igjen.
    11. Tilsett 0,1 μg/ml DAPI i hver brønn for å flekke kjernene. Vent i 5 min og skyll brønnene med PBS to ganger.
    12. Bruk et spektralt konfokalt mikroskop for å observere cellemorfologi og fange fluorescerende bilder.
    13. Videre analyserer du cellenummeret og morfologien ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Åpne programvaren og last inn bildene. Legg til en skalalinje og kalibrer programvaren. Tell antall celler i et gitt område for hver prøve. Bruk deretter måleverktøyet til å samle inn data om cellemorfologi for hver prøve.
  2. Celleproliferasjon
    1. Forbered tre ubehandlede 96-brønnsplater, og legg til fem grupper av prøver til hver.
      1. For JBNt-gruppen tilsettes 3,75 μL 1 mg / ml JBNts til 596,25 μL destillert vann, noe som resulterer i en 600 μL JBNt-løsning med en konsentrasjon på 6,25 μg / ml.
      2. For TGF-β1-gruppen tilsettes 7,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 til 592,5 μL destillert vann, noe som resulterer i en testløsning på 0,125 μg/ml.
      3. For matrilin-3-gruppen tilsettes 30 μL 10 μg / ml matrilin-3 til 570 μL destillert vann, noe som resulterer i en testløsning på 0,5 μg / ml.
      4. For JBNm-gruppen blandes 7,5 μL 10 μg / ml TGF-β1 med 30 μL 10 μg / ml matrilin-3 og pipette flere ganger, etterfulgt av tilsetning av 3,75 μL 1 mg / ml JBNts til løsningen.
      5. Fortynn JBNm-oppløsning med 558,75 μL destillert vann for å oppnå de endelige konsentrasjonene på henholdsvis 6,25 μg / ml, 0,125 μg / ml og 0,5 μg / ml for JBNt, TGF-β1 og matrilin-3 prøver.
      6. For kontrollgruppen, bruk 600 μL destillert vann.
    2. Del hver prøvegruppe i seks brønner (100 μL prøve per brønn).
    3. Plasser de tre platene som inneholder alle prøvene i en fryser på -80 °C i 1 time og frys deretter ned med et lyofiliiserende instrument.
    4. Frø hMSCs på disse platene, hver mottar en 100 μL cellesuspensjon (per brønn) som inneholder 5000 celler. Inkuber de tre platene ved 37 °C i 1 dag, 3 dager eller 5 dager ved 5 % CO2.
    5. Tilsett 10 μL CCK-8-løsning til hver brønn med cellene og inkuber ved 37 °C i ytterligere 2 timer.
    6. Mål absorpsjonsverdiene for hver brønn med multi-mode mikroplatelesere ved 450 nm.
    7. Frø en kjent gradient av hMSCs på en 96-brønns plate og inkubere i 4 timer. Bruk CCK-8-analysen til å måle absorpsjonsverdiene til det kjente antallet celler og generere en standardkurve.
    8. Beregn celleproliferasjon ved hjelp av absorpsjonsstandardkurven.
  3. Stabilitetstest
    MERK: Et humant TGF-β1-målrettet ELISA-sett ble brukt til å bestemme prosentvis frigjøring av TGF-β1 fra JBNm i en agarosehydrogel.
    1. Forbered 2% agarose ved å tilsette 400 mg agarosepulver til 20 ml PBS og varme det opp til 100 ° C for å oppløse agarosepulveret helt.
    2. Forbered JBNm inne i den avkjølte 2% agarosehydrogelen.
      1. Kombiner 10 μL 10 μg / ml TGF-β1, 40 μL 10 μg / ml matrilin-3, 5 μL 1 mg / ml JBNts og 195 μL PBS. Bland denne løsningen med 250 μL 2% agarose, og opprett JBNm-hydrogelen.
    3. Tilsett 500 μL PBS, bruk den som en utgivelsesløsning, og sørg for å endre den hver 3. Behold hver utgitt løsning, og la prøven sitte i 15 dager.
    4. Bruk et ELISA-sett til å teste hver av de fangede utløserløsningene ved å følge produsentens instruksjoner.
      MERK: Ved å trekke mengden TGF-β1 frigjort i PBS fra den teoretiske belastningsverdien på 100%, kan den gjenværende mengden TGF-β1 bestemmes.
  4. Celledifferensieringsanalyse med PCR26.
    1. Forbered syv grupper av prøver med hver prøve som inneholder 20 μL cellesuspensjon (4 x 104 celler), 30 μL av den spesifikke løsningen (eller PBS, avhengig av prøvegruppen) og 50 μL 2 vekt% agarose.
      1. For TGF-β1-gruppen, tilsett 5 μL 10 μg / ml TGF-β1 til 25 μL PBS, noe som resulterer i en 1,6 μg / ml løsning.
      2. For matrilin-3-gruppen tilsettes 20 μL 10 μg / ml matrilin-3 til 10 μL PBS, noe som resulterer i en 6,7 μg / ml løsning.
      3. For JBNt-gruppen tilsettes 2,5 μL 1 mg / ml JBNts til 27,5 μL PBS, noe som resulterer i en 83,3 μg / ml løsning.
      4. For J / T / M JBNm-gruppen, tilsett 10 μL 10 μg / ml matrilin-3 til 5 μL 10 μg / ml TGF-β1 og pipette opp og ned for å blande løsningen. Deretter tilsettes 2,5 μL 1 mg/ml JBNts og pipette igjen. Til slutt, fortynn med 2,5 μL PBS.
      5. For hver kontrollgruppe bruker du 30 μL PBS som prøve.
    2. Tilsett 0,5 ml cellekulturmedium til hver brønn, og sørg for å erstatte den hver 3.
      1. For den positive kontrollgruppen, bruk et kommersielt tilgjengelig hMSC-kondrogent medium som inneholder tilsatt TGF-β1. Denne ekstra TGF-β1 er lik mengden i både TGF-β1- og J / T / M JBNm-gruppene.
      2. For en av de negative kontrollgruppene, bruk et kommersielt hMSC-kondrogent medium som ikke inneholder TGF-β1. For den andre negative kontrollgruppen, bruk et DMEM-cellekulturmedium som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS).
      3. For annenhver gruppe, bruk et kommersielt hMSC-kondrogent cellekulturmedium uten TGF-β1.
    3. Kultur prøvene i 15 dager.
    4. Trekk ut prøvenes RNA og utfør PCR for å studere differensieringen av prøvene som beskrevet tidligere26.
  5. Immunostaining for kollagenuttrykksanalyse av type X
    1. Forbered syv agarosebaserte prøver på samme måte som celledifferensieringen med PCR-metodedelen (trinn 7.4).
    2. Kultur prøvene i 15 dager.
    3. Fest prøvene med 4% formaldehyd i 1 dag, suge i 30% sukroseløsning over natten, og frys deretter over natten ved -80 ° C med flytende nitrogen. Fest prøvene ved hjelp av det optimale skjæretemperaturforbindelsesreagenset (OCT), en blanding av vannløselige glykoler og harpikser, ved -10 °C.
    4. Bruk en kryostatmikrotom for å oppnå 20 μm tykke frosne deler av hver prøve.
    5. Stain hver seksjon med et antikollagen X antistoff med 1:800 fortynning og et fluorescerende merking sekundært antistoff fortynnet med PBS, i henhold til produsentens protokoller.
    6. Observer hver seksjon med et konfokalt mikroskop, ved hjelp av en eksitasjon på 488 nm og en forstørrelse på 40x på okularet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter protokollen ble JBNts vellykket syntetisert og karakterisert med UV-Vis-absorpsjon og TEM. JBNm er et injiserbart fast stillas som gjennomgår en rask biomimetisk prosess. Etter at JBNts ble tilsatt til en blanding av TGF-β1 / matrilin-3-løsning i et fysiologisk miljø, ble det dannet et solidt hvitmasket stillas som indikerer vellykket montering av JBNm, som vist i figur 1. Dette ble demonstrert i karakteriseringsmetodene.

Under fysiologiske forhold er matrilin-3 negativt ladet på grunn av dets isoelektriske punkt27 (figur 2A). Etter tilsetning av TGF-β1-løsningen til matrilin-3-løsningen økte zeta-potensialet til TGF-β1 / matrilin-3-forbindelsen til en nesten nøytral verdi, noe som indikerer at de to proteinene ble bundet via ladningsinteraksjoner. Som vist i figur 2A er zeta-potensialet til JBNm det høyeste blant de tre gruppene på grunn av JBNts, da det isoelektriske punktet i lysinsidekjeden er rundt 9,74 i et fysiologisk miljø. Økningen i zeta-potensielle verdier av JBNm indikerer vellykket montering av lag-for-lag-struktur.

UV-Vis absorpsjonsspektra (figur 2B) klargjør dannelsen av den hierarkiske lag-for-lag-indre strukturen til JBNm. De aromatiske ringene til lysinsidekjedene og JBNts bidro til de to absorpsjonstoppene ved henholdsvis 220 nm og 280 nm. Reduksjonen i absorpsjonsverdi ble observert etter tillegg av TGF-β1, noe som indikerer at binding skjer mellom TGF-β1 og JBNts. Etter tilsetning av JBNts til matrilin-3 ble det observert en mer åpenbar reduksjon i absorpsjonsintensiteten til toppene, noe som igjen indikerer vellykket binding mellom matrilin-3 og JBNts. Tilsvarende, etter tilsetning av JBNts til en blanding av TGF-β1 / matrilin-3, ble JBNm dannet, og absorpsjonstoppene ble redusert i intensitet. Absorpsjonstoppen til JBNm er nærmere matrilin-3/JBNts-linjen enn TGF-β1/JBNts-linjen, noe som indikerer at JBNts foretrekker å binde seg til matrilin-3, og danner en lag-for-lag ytre struktur med matrilin-3 mens TGF-β1 ligger i det indre laget. TEM brukes til å karakterisere morfologien til JBNts og JBNm (figur 2C). Etter kombinasjon med proteiner ble tykke bunter av JBNm observert å danne en stillasstruktur.

Fluorescensmikroskopi har bekreftet tilstedeværelsen av lag-for-lag-strukturen (figur 3A) og demonstrert tverrsnittet av JBNm. Etter merking av TGF-β1 og matrilin-3 ble det observert at den røde fluorescerende matrilin-3 omslutter JBNt-buntene og danner det ytre laget av JBNm. I figur 3B dannet den grønn-fluorescerende TGF-β1 et indre lag, noe som bidro til evnen til å lagre vekstfaktorer og tillate lokalisering av TGF-β1. Figur 3C viser fluorescensresonansenergioverføringsprosessen (FRET) mellom de fluorescerende fargestoffmerkede proteinene som karakterisert ved fluorescensspektra, med utslippstopper ved 520 nm og 570 nm for merkede TGF-β1- og matrilin-3-grupper, henholdsvis28. Etter tilsetning av JBNts i henhold til protokollen dannes lag-for-lag-strukturen; topper ble observert ved både 520 nm og 570 nm for JBNm-gruppen, noe som indikerer en vellykket binding og sammenstilling av proteiner og JBNts.

I tillegg ble effekten av JBNm på hMSCs adhesjon og celleproliferasjon utforsket. Som vist i figur 4 ble celleadhesjonstettheten til JBNm belagt på overflaten av de kammerede dekkbrillene bestemt. JBNm viste hMSCs gruppert langs seg selv (figur 4A), mens færre celler holdt seg til JBNts. For de andre gruppene var imidlertid hMSCene jevnt fordelt uten justering sammenlignet med JBNm-gruppen. Justeringen av celler, samt størrelsen på cellene på JBNm, viste at JBNts spilte en rolle i celleadhesjon, mens proteinene i JBNm økte affiniteten av celleadhesjon (figur 4B, C).

Etter dag 1 av cellekultur med JBNm, JBNts, matrilin-3 alene, TGF-β1 alene og negativ kontroll, viste JBNm- og TGF-β1-gruppene signifikant celleproliferasjon sammenlignet med de andre gruppene. Når cellekulturvarigheten ble økt til 3 og 5 dager, viste JBNm- og TGF-β1-gruppene enda mer økt celleproliferasjon, som vist i figur 5. En langtidsfunksjonsstudie ble utført for å bestemme differensiering av hMSCs med JBNm og uten JBNm (negativ kontroll). Etter 15 dager ble det observert en forbedret alkisk blå flekk, noe som indikerer kondrogenese av hMSCs som vokser sammen med JBNm26. Dermed foretrakk cellene JBNts av JBNm. Dette skyldtes sannsynligvis dens DNA-etterlignende struktur og evne til å bli demontert i småmolekylære enheter, hvorav sistnevnte kan utløses av lav pH eller tilstrekkelig enzymatisk aktivitet (for eksempel opptak av celler)14,29.

Video 1: Videoopptak av JBNm-montering. Dette opptaket viser dannelsen av JBNts, matrilin-3 og TGF-β1 i JBNm. Dette tallet er modifisert fra Zhou og medarbeidere (2021)26. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av den kjemiske strukturen til JBNts, J / T / M JBNm og J / T / M JBNms kondrogene evne. (A) Den kjemiske strukturen til JBNts, som fremhever dannelsen fra monomer til rosettring til JBNt. (B) Komponentene som utgjør J / T / M JBNm, samt hvordan de monteres i JBNm. (C ) Skjematisk fremstilling av dyrking av humane mesenkymale stamceller på J/T/M JBNm. Dette tallet er modifisert fra Zhou og medarbeidere (2021)26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Materialkarakterisering av J/T/M JBNm. (A) Zeta-potensielle spektra av matrilin-3 alene, TGF-β1/matrilin-3-forbindelsen og J/T/M JBNm. (B) UV-Vis-absorpsjonsspektra av JBNts alene, matrilin-3 alene, TGF-β1 alene, matrilin-3/JBNts-forbindelsen, TGF-β1/JBNts-forbindelsen og J/T/M JBNm. (C ) Bilder av JBNts alene og J / T / M JBNm oppnådd fra transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Dette tallet er modifisert fra Zhou og medarbeidere (2021)26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Fluorescerende konfokal avbildning og fluorescensspektra av J / T / M JBNm. (A) 3D konfokalt bilde av J / T / M JBNm, med rød-fluorescerende-merket matrilin-3 og grønn-fluorescerende-merket TGF-β1. (B) 2D konfokale bilder av J / T / M JBNm, med rød-fluorescerende-merket matrilin-3, grønn-fluorescerende-merket TGF-β1, og en sammenslått versjon. (C) Fluorescensspektra av forskjellige forbindelser for å karakterisere FRET-prosessen mellom de merkede proteinene. Dette tallet er modifisert fra Zhou og medarbeidere (2021)26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Analyse av human mesenkymal stamcelle (hMSC) kultur. (A) Optiske mikroskopibilder av hMSCs med TGF-β1, matrilin-3 og JBNts, dyrket på en agarosegel. (B) Konfokale mikroskopibilder av hMSCs dyrket på kammerglasset belagt med en rekke JBNm-komponenter. (C) Graf over antall celler festet per kvadratmillimeter for hver gruppe. Feilfelt angir standardavvik. (D) Graf over cellehovedakselengde i μm per gruppe. Feilfelt angir standardavvik. Merk: N ≥ 3, *P< 0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, ****P< 0,0001 (sammenlignet med negative kontroller, NC). Dette tallet er modifisert fra Zhou og medarbeidere (2021)26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Sammenligning av celletall for ulike grupper mellom dag 1, 3 og 5. Cellenummerstatistikk over hMSCs etter å ha blitt dyrket med forskjellige materialer på dag 1, 3 og 5. Feilfelt angir standardavvik. Merk: N = 6, * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Dette tallet er modifisert fra Zhou og medarbeidere (2021)26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med denne studien er å utvikle en biomimetisk stillasplattform, JBNm, for å overvinne begrensningene i konvensjonelle vevskonstruksjoner som er avhengige av cellekulturmiljøer for å formidle celledifferensiering. JBNm er et lag-for-lag struktur stillas for en selvbærende bruskvevskonstruksjon. Den innovative designen er basert på nye DNA-inspirerte nanomaterialer, JBNts. JBNm, sammensatt av JBNts30, TGF-β1 og matrilin-3, er satt sammen gjennom en ny lag-for-lag-teknikk der stillasets selvmontering ble kontrollert på molekylært nivå. Samlingen av JBNm ble observert og karakterisert med zeta-potensialmåling, UV-Vis-absorpsjon, TEM og fluorescensspektralanalyse.

UV-Vis-spektrene i figur 2B (trinn 3) har vist dannelsen av det hierarkiske lag-for-lag-interiøret i JBNm. En forskjell i absorbanstopper kan observeres på grunn av en forskjell i bindingsaffinitet. Flere store interaksjoner forekommer mellom JBNts og matrilin-3 enn mellom JBNts og TGF-β1, noe som indikerer at JBNts etterligner kollagenproteiner når det gjelder deres fibrøse morfologi og lysinoverflatekjemi. Denne teknikken er nødvendig for å observere bindingen av JBNts til matrilin-3 i stedet for TGF-β1, noe som muliggjør innkapsling av TGF-β1 og gir derfor en langsom frigjøring av TGF-β1 i det omkringliggende vevet. Det mest kritiske trinnet i utviklingen av JBNm er kombinasjonen av proteiner med JBNts. TGF-β1 og matrilin-3 må tilsettes før tilsetning av JBNts for å observere den fulle effekten av FRET-fenomenet mellom merket matrilin-3 og TGF-β1. Begrensningen av denne teknikken stammer fra feil tilsetningssekvens av proteiner og nanorør, noe som resulterer i varierte målinger. Dette er et viktig skritt for dannelsen av JBNm for fremtidige studier, og vil derfor bli brukt på fremtidige JBNm-fabrikasjoner og studier.

Matrilin-3 er et svært negativt protein, mens TGF-β1 er et litt nøytralt protein, som vist i figur 2A. Ladningsforskjellen ble observert for å bestemme bindingen av disse proteinene. Fra den negativt ladede tilstanden til matrilin-3 økte zeta-potensialet til en nesten nøytral verdi etter tilsetning av TGF-β1 (figur 2A). Dette trinnet er viktig for å bestemme det første indre laget av det biomimetiske stillaset, og for å indikere at kombinasjonen av begge proteinene er gjennom ladningsinteraksjon. Etter tilsetning av JBNts, som er det andre trinnet i JBNm-fabrikasjonen, ble zeta-potensialet til JBNm målt til ~ 10 ± 5 mV (figur 2A). Fordi JBNts er svært positive, ble ladningen av JBNm observert å øke som forventet. Bestemmelse av ladninger med zeta-potensial er derfor viktig for å observere dannelsen av JBNm trinn for trinn via ladningsinteraksjoner. I likhet med UV-Vis-spektroskopi er sekvensen av addisjon viktig i dette trinnet, og feil addisjonsrekkefølge kan resultere i varierte målinger. På samme måte er det viktig å pipette blandingen opp og ned før måling.

Deretter merkes TGF-β1 og matrilin-3 slik at utviklingen av JBNm kan observeres med konfokal mikroskopi og fluorescensspektralanalyse med multimode mikroplatelesere. Prøvene ble eksitert med en 488 nm laser og viste utslippstopper ved 520 nm og 570 nm (figur 3). Ingen utslippstopp ble observert for JBNts alene fordi de ikke er merket. FRET skjedde fra TGF-β1-giveren til matrilin-3-akseptoren, og reduserte dermed utslippstoppen ved 520 nm og økte utslippstoppen ved 570 nm; de to komponentene er 10 nm fra hverandre i avstand, slik at FRET-fenomenet kan oppstå. Derfor er samlingen av JBNm basert på romlige (dvs. fysisk avstand) prosesser sammen med ladningsinteraksjoner. Det mest kritiske trinnet i utviklingen av JBNm er tilleggssekvensen; TGF-β1 og matrilin-3 må tilsettes før tilsetning av JBNts for å observere den fulle effekten av FRET-fenomenet. Forstørrelse på minst 40x på okularet er nødvendig for å observere fluorescerende JBNm. Begrensningen av denne teknikken er at JBNts ikke er merket og derfor ikke kunne observeres med konfokal mikroskopi. Imidlertid kan proteinmerkingsteknikken brukes til å merke JBNt med noen modifikasjoner for fremtidige applikasjoner.

JBNm kan hjelpe cellefunksjoner, for eksempel celleadhesjon og celleproliferasjon. I denne studien ble hMSCs dyrket (starter med 5000 celler) på forskjellige materialer (JBNm, JBNts, TGF-β1, matrilin-3 og negative kontroller uten tilsetningsstoffer) for å sammenligne celletallene etter inkubering i 1, 3 og 5 dager ved bruk av CCK-8-løsning, etter de nøyaktige produsentens protokoller for å bestemme celleproliferasjon. JBNm, spesielt i nærvær av TGF-β1, og TGF-β1 alene viste signifikant celleproliferasjon sammenlignet med de tre andre gruppene. JBNts etterligner kollagen i ECM morfologisk mens matrilin-3 er et bruskspesifikt protein, noe som resulterer i økt celleproliferasjonsaktivitet etter inkubasjon ved 37 °C i 3 og 5 dager (figur 5). JBNm har vist stort potensial for å tjene som et injiserbart og biomimetisk vevsteknisk stillas for å overvinne begrensningene i tradisjonelle cellekonstruksjoner for ulike fremtidige applikasjoner som biomaterialer 29,31. JBNm etterligner brusk ECM morfologisk, gir adhesjonssteder og tillater frigjøring av pro-kondrogene differensierende faktorer i mikromiljøet, for eksempel TGF-β132,33. JBNms evne til å inkorporere TGF-β1 i stillasets indre lag forhindrer at det lekker til uønskede områder, og forbedrer dermed stillasets effektivitet (figur 4 og figur 5). Mange hMSCer ses å klynge seg langs JBNm-stillaset, mens cellene er sparsomt fordelt i matrilin-3, TGF-β1 og negative kontrollgrupper (figur 4). Cellens morfologi ble også observert, noe som indikerer utmerket affinitet med JBNm-overflater. Disse nøyaktig utformede biomaterialene forhindrer rask frigjøring av innlemmede bioaktive molekyler i cellekulturmiljøet og forbedrer selvbærekraften til vevskonstruksjonene i matrisen34. En begrensning av denne teknikken er at startcellenumrene er kritiske for å bestemme spredning av celler. Et startcellenummer på 5000 ble funnet mest optimalt for denne studien. En standardkurve er også nødvendig for å bestemme cellenummeret ved å plotte et kjent antall celler og måle dem i multimode mikroplateleseren. Denne teknikken kan brukes i fremtiden som en standardisert metode for å bestemme celleproliferasjon på tvers av alle studier relatert til JBNm-stillaser.

hMSCs ble dyrket i 3D agarosepellets med og uten JBNm for å bestemme langtidsfunksjonsstudien i 15 dager. Etter 15 dager ble totalt RNA ekstrahert fra hMSCs i agarosepellets, som inneholdt positiv kontroll (pellets ble levert med fersk TGF-β1 hver gang medium ble endret), JBNm, JBNts, matrilin-3, TGF-β1, og ingen tilsetningsstoffer. Sanntids qPCR ble utført for genanalyse, testing for kondrogene differensieringsmarkører, Aggrecan (ACAN) og hypertrofimarkør type X kollagen (COL X). ACAN-ekspresjon i JBNm-gruppen økte betydelig sammenlignet med andre grupper, noe som viser at JBNm fremmer stamcellekondrogen differensiering betydelig mens den hemmer COL X. I mellomtiden har den positive kontrollen forbedret kondrogenese, som nevnt i økningen i ACAN, og også hypertrofi av den differensierte cellen26. En ytterligere begrensning av denne studien er at RNA-ekstraksjonen er fra cellene innebygd i en hydrogel. Det totale RNA oppnådd i denne protokollen var derfor lavt i konsentrasjon og renhet. For å overvinne denne begrensningen ble flere prøver dyrket og ekstrahert for å oppnå optimal konsentrasjon og renhet for neste trinn, sanntids qPCR. Mens qPCR er viktig for studien, er mindre modifikasjon av denne teknikken nødvendig for fremtidige studier for å sikre effektiv prøveutvinning uten å ofre et stort antall prøver.

En stabilitetstest ble utført med et humant TGF-β1 ELISA-sett for å teste frigjøringen av protein fra JBNm-hydrogelen. I denne studien forventes TGF-β1 å være innkapslet i J / T / M JBNm, og derfor bør ingen TGF-β1-frigjøring observeres (dvs. den teoretiske belastningsverdien er 100%). En begrensning av dette trinnet er at alle TGF-β1 antas å være innkapslet i JBNm lag-for-lag stillas. Etter 15 dager oppsamles og testes løsninger frigjort fra hydrogelen med settet, i henhold til produsentens protokoller. Deretter ble mengden TGF-β1 beregnet ved å trekke mengden av den frigjorte TGF-β1 i PBS fra den teoretiske belastningsverdien. Fordi TGF-β1 ble innkapslet i det indre laget av JBNm, ble den langsomme frigjøringen av proteinet forventet. Studien viste at TGF-β1 er lokalisert i JBNm-stillaset og ikke slippes raskt ut i de omkringliggende områdene26.

Denne innovative lag-for-lag JBNm bruskvevskonstruksjonen ble realisert ved høyt organisert og kontrollert selvmontering på molekylært nivå. TGF-β1 er begrenset i det indre laget av matriksfibrene, forhindrer lekkasje til uønskede steder, og fremmer lokalisert kondrogenese samtidig. I tillegg er matrilin-3 lokalisert i det ytre laget av matriksfibrene, og skaper et antihypertrofisk mikromiljø35. JBNts har vist seg å ikke bare tjene som en strukturell stillas ryggrad, men også forbedre stamcelleforankring og vedheft for å lokalisere celler langs matrisefibrene30,36. Når det gjelder fremtidig arbeid, vil lag-for-lag-designen til det JBNt-baserte stillaset bli tilpasset applikasjoner i forskjellige vev37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Yupeng Chen er en av grunnleggerne av Eascra Biotech, Inc. og NanoDe Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av NIH-tilskudd 7R01AR072027 og 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 og University of Connecticut. Dette arbeidet støttes også delvis av NIH-stipend S10OD016435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

Tags

Bioteknologi utgave 185
Fabrikasjon og karakterisering av lag-for-lag Janus base nano-matrise for å fremme brusk regenerering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter