Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling og karakterisering af lag-for-lag Janus base nano-matrix for at fremme bruskregenerering

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver samlingen af et lag for lag Janus base nano-matrix (JBNm) stillads ved at tilføje Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sekventielt. JBNm blev fabrikeret og karakteriseret; Derudover viste den fremragende bioaktivitet og tilskyndede cellefunktioner såsom vedhæftning, spredning og differentiering.

Abstract

Forskellige biomateriale stilladser er blevet udviklet til at styre celleadhæsion og spredning i håb om at fremme specifikke funktioner til in vitro og in vivo anvendelser. Tilsætningen af vækstfaktorer i disse biomaterialestilladser udføres generelt for at give et optimalt cellekulturmiljø, medierende celledifferentiering og dets efterfølgende funktioner. Imidlertid er vækstfaktorerne i et konventionelt biomaterialestillads typisk designet til at blive frigivet ved implantation, hvilket kan resultere i utilsigtede bivirkninger på omgivende væv eller celler. Her har den DNA-inspirerede Janus base nano-matrix (JBNm) med succes opnået et meget lokaliseret mikromiljø med en lag-for-lag struktur til selvbærende bruskvævskonstruktioner. JBNms er selvsamlet fra Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3 og transformerende vækstfaktor beta-1 (TGF-β1) via bioaffinitet. JBNm blev samlet i et TGF-β1: matrilin-3: JBNt-forhold på 1: 4: 10, da dette har været det bestemte forhold, hvor korrekt samling i lag-for-lag-strukturen kunne forekomme. Først blev TGF-β1-opløsningen tilsat til matrilin-3-opløsningen. Derefter blev denne blanding pipetteret flere gange for at sikre tilstrækkelig homogenitet før tilsætningen af JBNt-opløsningen. Dette dannede lag for lag JBNm efter pipettering flere gange igen. En række eksperimenter blev udført for at karakterisere JBNm-strukturen lag for lag, JBNts alene, matrilin-3 alene og TGF-β1 alene. Dannelsen af JBNm blev undersøgt med UV-Vis absorptionsspektre, og strukturen af JBNm blev observeret med transmissionselektronmikroskopi (TEM). Da det innovative JBNm-stillads lag for lag dannes i molekylær skala, kunne det fluorescerende farvestofmærkede JBNm observeres. TGF-β1 er begrænset inden for det indre lag af den injicerbare JBNm, som kan forhindre frigivelse af vækstfaktorer til omkringliggende områder, fremme lokaliseret chondrogenese og fremme et antihypertrofisk mikromiljø.

Introduction

Stilladser inden for vævsteknik spiller en afgørende rolle i at yde strukturel støtte til cellebinding og efterfølgende vævsudvikling1. Typisk er konventionelle vævskonstruktioner uden stilladser afhængige af cellekulturmiljøet og tilføjede vækstfaktorer for at formidle celledifferentiering. Desuden er denne tilsætning af bioaktive molekyler til stilladser ofte den foretrukne tilgang til styring af celledifferentiering og funktion 2,3. Nogle stilladser kan efterligne det biokemiske mikromiljø af naturligt væv uafhængigt, mens andre direkte kan påvirke cellefunktioner via vækstfaktorer. Forskere støder dog ofte på udfordringer med at vælge stilladser, der kan påvirke celleadhæsion, vækst og differentiering positivt, samtidig med at de giver optimal strukturel støtte og stabilitet over en lang periode 4,5. De bioaktive molekyler er ofte løst bundet til stilladset, hvilket fører til hurtig frigivelse af disse proteiner ved implantation, hvilket resulterer i deres frigivelse på uønskede steder. Dette kulminerer i bivirkninger på væv eller celler, der ikke bevidst blev målrettet 6,7.

Stilladser er typisk lavet af polymere materialer. Janus base nano-matrix (JBNm) er en biomimetisk stilladsplatform skabt med en ny lag-for-lag metode til selvbærende bruskvævskonstruktion8. Disse nye DNA-inspirerede nanorør er blevet navngivet Janus base nanorør (JBNts), da de korrekt efterligner strukturen og overfladekemien af kollagen, der findes i den ekstracellulære matrix (ECM). Med tilføjelsen af bioaktive molekyler, såsom matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan JBNm skabe et optimalt mikromiljø, som derefter kan stimulere ønsket celle- og vævsfunktionalitet9.

JBNts er nye nanorør afledt af syntetiske versioner af nukleobase-adenin og thymin. JBNts dannes gennem selvmontering10; Seks syntetiske nukleobaser binder sig til dannelse af en ring, og disse ringe gennemgår π-π stablingsinteraktioner for at skabe et nanorør 200-300 μm i længde11. Disse nanorør ligner strukturelt kollagenproteiner; ved at efterligne et aspekt af det indfødte bruskmikromiljø har JBNts vist sig at give et gunstigt fastgørelsessted for chondrocytter og humane mesenkymale stamceller (hMSC'er)11,12,13,14. Fordi nanorørene gennemgår selvmontering og ikke kræver nogen form for initiator (såsom UV-lys), viser de spændende potentiale som et injicerbart stillads til svært tilgængelige defektområder15.

Matrilin-3 er et strukturelt ekstracellulært matrixprotein, der findes i brusk. Dette protein spiller en væsentlig rolle i chondrogenese og korrekt bruskfunktion16,17. For nylig er det blevet inkluderet i biomateriale stilladser, der tilskynder til chondrogenese uden hypertrofi 9,18,19. Ved at inkludere dette protein i JBNm tiltrækkes bruskceller til et stillads, der indeholder lignende komponenter som dets oprindelige mikromiljø. Derudover har det vist sig, at matrilin-3 er nødvendig for korrekt TGF-β1-signalering inden for kondrocytter20. Vækstfaktorer fungerer som signalmolekyler, der forårsager specifik vækst af en bestemt celle eller væv. For at opnå optimal bruskregenerering er matrilin-3 og TGF-β1 væsentlige komponenter inden for JBNm. Tilsætningen af TGF-β1 i stilladset lag for lag kan yderligere fremme bruskregenerering i en vævskonstruktion. TGF-β1 er en vækstfaktor, der anvendes til at fremme helingsprocessen af osteochondrale defekter, tilskynde til chondrocyt og hMSC-spredning og differentiering21,22. TGF-β1 spiller således en nøglerolle i bruskregenereringen JBNm (J / T / M JBNm)23, hvilket tilskynder til korrekt vækst, især når den er lokaliseret inden for JBNm-lagene.

Som tidligere nævnt samles vækstfaktorer typisk på ydersiden af stilladser uden specifikke metoder til inkorporering. Her, med biomaterialernes præcist designede nanoarkitektur, blev JBNm udviklet til specifik målretning af tilsigtede celler og væv. JBNm består af TGF-β1 klæbet på JBNt-overflader i det indre lag og matrilin-3 klæbet på JBNt-overflader i det ydre lag24,25. Inkorporeringen af TGF-β1 i det indre lag af lag-for-lag-strukturen muliggør et stærkt lokaliseret mikromiljø langs JBNm-fibrene, hvilket skaber en homeostatisk vævskonstruktion med en meget langsommere frigivelse af proteinet12. JBNm's injicerbarhed gør det til en ideel bruskvævskonstruktion til forskellige fremtidige biomaterialeanvendelser26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntese af JBNts

  1. Forbered JBNt-monomeren ved hjælp af tidligere offentliggjorte metoder, der involverer syntesen af en række forbindelser12.
  2. Rens rå JBNt-monomer, efter at den er blevet syntetiseret med højtydende væskekromatografi (HPLC) ved hjælp af en omvendt fasekolonne. Brug opløsningsmiddel A: 100% vand, opløsningsmiddel B: 100% acetonitril og opløsningsmiddel C: HCI-vandopløsning med pH = 1. Brug en strømningshastighed på 3 ml/min. Saml den største top opnået i HPLC på 7,2 min.

2. Fabrikation af JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

BEMÆRK: Video 1 viser, at JBNm er et injicerbart fast stof dannet i et fysiologisk miljø (vandopløsning, intet UV-lys, ingen kemiske tilsætningsstoffer og ingen opvarmning), som også er biologisk inspireret.

  1. Der tilsættes 8 μL 1 mg/ml TGF-β1 suspenderet i H2O, til 32 μL af 1 mg/ml matrilin-3 suspenderet i H2O. Pipette for at sikre korrekt blanding afdisse proteiner.
  2. Der tilsættes 80 μL 1 mg/ml JBNts suspenderet i H2O, tilTGF-β1/matrilin-3-opløsningen. Pipetter gentagne gange for at sikre korrekt blanding. Tilstedeværelsen af hvide flokkuler kan observeres umiddelbart efter tilsætningen af JBNts, hvilket indikerer dannelsen af JBNm (Video 1).

3. Observation af prøver med ultraviolet synlig (UV-Vis) absorption

BEMÆRK: UV-Vis-absorptionsspektrene blev undersøgt for at karakterisere samlingen af JBNm. Denne måling blev analyseret for fire kategorier: JBNts alene, matrilin-3 alene, TGF-β1 alene og den fulde lag-for-lag JBNm, der består af alle tre dele. Alle indledende koncentrationer suspenderes iH2O.

  1. For JBNt-gruppen tilsættes 5 μL 1 mg/ml JBNts til 50 μL H2O for at fremstille en 90,9 μg/ml opløsning.
  2. For matrilin-3-gruppen tilsættes 40 μL 10 μg/ml matrilin-3 til 15 μL H2O, for at fremstille en 7,3μg/ml opløsning.
  3. For TGF-β1-gruppen tilsættes 10 μL 10 μg/ml TGF-β1 til 45 μL H2O for at lave en 1,8 μg/ml opløsning.
  4. For JBNm-gruppen tilsættes 40 μL 10 μg/ml matrilin-3 til 10 μL af 10 μg/mL TGF-β1. Agitere for at sikre korrekt blanding, og tilsæt derefter 5 μL 1 mg / ml JBNts til opløsningen, pipettering gentagne gange for at blande prøven.
  5. Ved hjælp af et spektrofotometer måles absorptionsspektret for hver gruppe.

4. Zeta-potentiel måling af prøver

BEMÆRK: Zeta-potentialet blev analyseret for bedre at forudsige, hvordan JBNm ville interagere med in vivo-væv . Tre grupper blev målt: matrilin-3 alene, matrilin-3 med TGF-β1 og den fulde lag-for-lag JBNm.

  1. For matrilin-3-gruppen tilsættes 160 μL 10 mg/ml matrilin-3 til 640 μL H2O, for at fremstille en 800μL opløsning.
  2. For matrilin-3/TGF-β1-forbindelsen tilsættes 160 μL 10 μg/ml matrilin-3 til 40 μL af 10 μg/ml TGF-β1. Pipette gentagne gange for at sikre korrekt homogenitet. Derefter tilsættes det til 600 μL H2O, hvilket resulterer i en 800 μL opløsning.
  3. For JBNm-gruppen tilføjes 160 μL 10 μg/ml matrilin-3 til 40 μL af 10 μg/ml TGF-β1. Pipette flere gange for at blande proteinerne. Derefter tilsættes 20 μL 1 mg/ml JBNts til opløsningen og pipetten for at sikre homogenitet. Til sidst tilsættes JBNm-opløsningen til 580 μL H2O, så der produceres en 800 μL-opløsning.
  4. Mål zeta-potentialeværdierne for de tre grupper.

5. Fremstilling af JBNt/matrilin-3 nanomatrix til transmissionselektronmikroskopi (TEM)

BEMÆRK: TEM-karakterisering udføres for at karakterisere morfologien af JBNts og JBNm.

  1. Indsæt to gitre i en plasmarenser for at rengøre gitterene korrekt før den negative farvning af JBNts og JBNm i henhold til de offentliggjorte protokoller og producentens protokoller12.
  2. Der oprettes en 200 μg/ml JBNt-opløsning ved at blande 10 μL 1 mg/ml JBNts med 40 μL destilleret vand.
  3. Bland 30 μL 100 μg/ml matrilin-3 med 20 μL 100 μg/ml TGF-β1 og pipette flere gange. Der tilsættes 10 μL 1 mg/ml JBNts til blandingen matrilin-3/TGF-β1 for at forberede JBNm-prøven. Igen pipetter gentagne gange.
  4. Tilsæt 3 μL af JBNt-opløsningen (200 μg/ml) og 3 μL af JBNm-løsningen på separate gitre, og lad dem stå i 2 min.
  5. Skyl hvert gitter med 100 μL uranylacetatopløsning (0,5%). Brug filterpapir til at fjerne den overskydende opløsning og lade gitterene lufttørre.
  6. Betjen et transmissionselektronmikroskop for korrekt at observere og karakterisere prøverne, som tidligere offentliggjort11,12.

6. Absorptionsspektre måling af fluorescerende mærkede proteiner

BEMÆRK: Strukturen af JBNm verificeres ved at observere JBNm's strukturer med absorptionsspektralanalyse.

  1. Mærk TGF-β1 ved hjælp af et proteinmærkningssæt efter producentens anvisninger. Der tilsættes 20 μL 20 μg/ml mærket TGF-β1 til 25 μL H2O for at fremstille en 8,9 μg/ml testopløsning.
  2. Mærk matrilin-3 ved hjælp af et separat mærkningssæt. Der tilsættes 20 μL 80 μg/ml mærket matrilin-3 til 25 μL H2O for at fremstille en testopløsning på 36 μg/ml.
    BEMÆRK: Den fluorescerende farvemærkning af TGF-β1 resulterede i en endelig koncentration på 20 μg / ml, mens mærkningen af matrilin-3 resulterede i en endelig koncentration på 80 μg / ml.
  3. Bland 20 μL 80 μg/ml mærket matrilin-3 med 20 μL 20 μg/ml mærket TGF-β1 og 5 μL H2O, hvilket resulterer i en mærket TGF-β1/matrilin-3-forbindelse. Pipetter blandingen flere gange for at blande.
  4. Der tilsættes 5 μL 1 mg/ml JBNts til 40 μL H2O, hvilket resulterer ien opløsning på 111 μg/ml.
  5. Der tilsættes 20 μL 20 μg/ml mærket TGF-β1 til 20 μL 80 μg/ml mærket matrilin-3 og pipette flere gange. Der tilsættes 5 μL 1 mg/ml JBNts til den mærkede TGF-β1/matrilin-3-opløsning og pipetteres gentagne gange for at blande forbindelsen korrekt.
    BEMÆRK: De endelige koncentrationer af JBNt, mærket TGF-β1, og mærkede matrilin-3 prøver var henholdsvis 111 μg / ml, 8,9 μg / ml og 36 μg / ml.
  6. Overfør hver prøvegruppe (dvs. mærket TGF-β1 (trin 6.1), mærket matrilin-3 (trin 6.2), mærket TGF-β1/matrilin-3 (trin 6.3), JBNts (trin 6.4), JBNm (trin 6.5)) til deres egen brønd af en sort 384-brøndplade.
  7. Indlæs den sorte 384-brøndplade i en multi-mode mikropladelæser, og tag målinger ved excitationsbølgelængder på 488 nm og 555 nm efter producentens protokol.

7. In vitro biologisk funktion assay

  1. Celleadhæsionstest på præovertrukne dækglaskamre
    1. Forbered to kammerdæksler med fem grupper af prøver, da der bruges et dækglas til hver celletype.
    2. Der tilsættes 1,25 μL 1 mg/ml JBNts til 198,75 μL destilleret vand, hvilket resulterer i en opløsning på 6,25 μg/ml.
    3. Der tilsættes 10 μL 10 μg/ml matrilin-3 til 190 μL destilleret vand, hvilket resulterer i en 0,5 μg/ml-opløsning.
    4. Der tilsættes 2,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 til 197,5 μg/ml destilleret vand, hvilket resulterer i en 0,125 μg/ml-opløsning.
    5. For JBNm-gruppen tilsættes 10 μL 10 μg/ml matrilin-3 til 2,5 μL 10 μg/mLTGF-β1 og pipetteres gentagne gange. Der tilsættes 1,25 μL JBNts med en koncentration på 1 mg/ml til blandingsopløsningen og pipetten. Til sidst tilsættes 186,25 μL destilleret vand for at resultere i en 200 μL JBNm-opløsning.
      1. Til kontrolgruppen skal du bruge 200 μL destilleret vand.
    6. Hver prøvegruppe tilsættes i deres egen brønd af et kammerglas nr. 1,5. Anbring dækglasset i en -80 °C fryser i 1 time, og frys derefter og tør det med et fryseinstrument.
    7. Frø humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) og humane chondrocytceller (10.000 celler pr. Brønd) i hver brønd i de forberedte kammerdækbriller.
    8. Inkuber de to dækbriller i 4 timer i en 37 °C inkubator. Derefter aspireres cellekulturmediet og skylles to gange med PBS.
    9. Fix celler med 4% paraformaldehyd i 5 min, og fjern og skyl derefter prøver med PBS. Skyl prøven en anden gang for helt at fjerne 4% paraformaldehyd.
    10. Inkuber celler med 100 μL 0,1% Triton-X i 10 min og vask med PBS. Tilsæt 100 μL 0,165 μM rhodamin-phalloidin til hver brønd. Vent i 30 min og vask derefter med PBS igen.
    11. Tilsæt 0,1 μg/ml DAPI til hver brønd for at plette kernerne. Vent i 5 min og skyl brøndene med PBS to gange.
    12. Brug et spektral konfokalt mikroskop til at observere cellemorfologi og fange fluorescerende billeder.
    13. Analyser endvidere cellenummeret og morfologien ved hjælp af billedbehandlingssoftware. Åbn softwaren, og indlæs billederne. Tilføj en skalalinje, og kalibrer softwaren. Tæl antallet af celler i et givet område for hver prøve. Brug derefter måleværktøjet til at indsamle data om cellemorfologi for hver prøve.
  2. Celle spredning
    1. Forbered tre ubehandlede 96-brøndplader, tilsæt fem grupper af prøver til hver.
      1. For JBNt-gruppen tilsættes 3,75 μL 1 mg/ml JBNts til 596,25 μL destilleret vand, hvilket resulterer i en 600 μL JBNt-opløsning med en koncentration på 6,25 μg/ml.
      2. For TGF-β1-gruppen tilsættes 7,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 til 592,5 μL destilleret vand, hvilket resulterer i en 0,125 μg/ml testopløsning.
      3. Til matrilin-3-gruppen tilsættes 30 μL 10 μg/ml matrilin-3 til 570 μL destilleret vand, hvilket resulterer i en 0,5 μg/ml testopløsning.
      4. For JBNm-gruppen blandes 7,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 med 30 μL 10 μg/ml matrilin-3 og pipette flere gange efterfulgt af tilsætning af 3,75 μL 1 mg/ml JBNts til opløsningen.
      5. Fortynd JBNm-opløsning med 558,75 μL destilleret vand for at opnå de endelige koncentrationer på henholdsvis 6,25 μg/ml, 0,125 μg/ml og 0,5 μg/ml for JBNt-, TGF-β1- og matrilin-3-prøver.
      6. Til kontrolgruppen skal du bruge 600 μL destilleret vand.
    2. Hver prøvegruppe opdeles i seks brønde (100 μL prøve pr. Brønd).
    3. De tre plader, der indeholder alle prøver, anbringes i en -80 °C fryser i 1 time, og frysetørres derefter med et fryseinstrument.
    4. Frø hMSC'er på disse plader, der hver modtager en 100 μL cellesuspension (pr. Brønd) indeholdende 5.000 celler. De tre plader inkuberes ved 37 °C i 1 dag, 3 dage eller 5 dage ved 5 % CO2.
    5. Der tilsættes 10 μL CCK-8-opløsning til hver brønd med cellerne, og der inkuberes ved 37 °C i yderligere 2 timer.
    6. Mål absorptionsværdierne for hver brønd med multi-mode mikropladelæsere ved 450 nm.
    7. Frø en kendt gradient af hMSC'er på en 96-brøndplade og inkuberes i 4 timer. Brug CCK-8-analysen til at måle absorptionsværdierne for det kendte antal celler og generere en standardkurve.
    8. Beregn celleproliferation ved hjælp af absorptionsstandardkurven.
  3. Stabilitetstest
    BEMÆRK: Et humant TGF-β1-målrettet ELISA-sæt blev brugt til at bestemme den procentvise frigivelse af TGF-β1 fra JBNm i en agarosehydrogel.
    1. Der fremstilles 2% agarose ved at tilsætte 400 mg agarosepulver til 20 ml PBS og opvarme det op til 100 °C for at opløse agarosepulveret fuldstændigt.
    2. Forbered JBNm inde i den afkølede 2% agarosehydrogel.
      1. Kombiner 10 μL 10 μg/ml TGF-β1, 40 μL 10 μg/ml matrilin-3, 5 μL 1 mg/ml JBNts og 195 μL PBS. Bland denne opløsning med 250 μL 2% agarose, hvilket skaber JBNm-hydrogelen.
    3. Tilsæt 500 μL PBS ved hjælp af det som en frigivelsesløsning, og sørg for at ændre det hver 3. dag. Opbevar hver frigivet opløsning, og lad prøven sidde i 15 dage.
    4. Brug et ELISA-sæt til at teste hver af de optagne frigivelsesløsninger ved at følge producentens anvisninger.
      BEMÆRK: Ved at trække mængden af TGF-β1 frigivet i PBS fra den teoretiske belastningsværdi på 100%, kan den resterende mængde TGF-β1 bestemmes.
  4. Celledifferentieringsanalyse med PCR26.
    1. Der fremstilles syv grupper af prøver, hvor hver prøve indeholder 20 μL cellesuspension (4 x 104 celler), 30 μL af den specifikke opløsning (eller PBS, afhængigt af prøvegruppen) og 50 μL 2 vægt% agarose.
      1. For TGF-β1-gruppen tilsættes 5 μL 10 μg/ml TGF-β1 til 25 μL PBS, hvilket resulterer i en 1,6 μg/ml opløsning.
      2. For matrilin-3-gruppen tilsættes 20 μL 10 μg/ml matrilin-3 til 10 μL PBS, hvilket resulterer i en 6,7 μg/ml opløsning.
      3. For JBNt-gruppen tilsættes 2,5 μL 1 mg/ml JBNts til 27,5 μL PBS, hvilket resulterer i en 83,3 μg/ml opløsning.
      4. For J/T/M JBNm-gruppen tilsættes 10 μL 10 μg/ml matrilin-3 til 5 μL 10 μg/ml TGF-β1 og pipetteres op og ned for at blande opløsningen. Derefter tilsættes 2,5 μL 1 mg/ml JBNts og pipetteres igen. Til sidst fortyndes med 2,5 μL PBS.
      5. For hver kontrolgruppe anvendes 30 μL PBS som prøve.
    2. Tilsæt 0,5 ml cellekulturmedium til hver brønd, og sørg for at udskifte det hver 3. dag.
      1. Til den positive kontrolgruppe skal du bruge et kommercielt tilgængeligt hMSC chondrogent medium indeholdende tilsat TGF-β1. Denne ekstra TGF-β1 er lig med beløbet i både TGF-β1 og J/T/M JBNm-grupperne.
      2. For en af de negative kontrolgrupper skal du bruge et kommercielt hMSC-kondrogent medium, der ikke indeholder TGF-β1. For den anden negative kontrolgruppe skal du bruge et DMEM-cellekulturmedium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS).
      3. For hver anden gruppe skal du bruge et kommercielt hMSC chondrogenic cellekulturmedium uden TGF-β1.
    3. Kultur prøverne i 15 dage.
    4. Ekstraher prøvernes RNA og udfør PCR for at studere differentieringen af prøverne som beskrevet tidligere26.
  5. Immunostaining til type X kollagenekspressionsassay
    1. Der fremstilles syv agarosebaserede prøver på samme måde som celledifferentieringen med PCR-metodeafsnittet (trin 7.4).
    2. Kultur prøverne i 15 dage.
    3. Prøverne fikseres med 4% formaldehyd i 1 dag, blødlægges i 30% saccharoseopløsning natten over, og fryses derefter natten over ved -80 °C med flydende nitrogen. Prøverne fastgøres ved hjælp af det optimale skæretemperaturforbindelsesreagens (OCT), en blanding af vandopløselige glycoler og harpikser, ved -10 °C.
    4. Brug en kryostatmikrotom for at opnå 20 μm tykke frosne sektioner af hver prøve.
    5. Plet hver sektion med et antikollagen X-antistof med 1:800 fortynding og et fluorescerende mærkning sekundært antistof fortyndet med PBS i henhold til producentens protokoller.
    6. Overhold hvert afsnit med et konfokalt mikroskop ved hjælp af en excitation på 488 nm og en forstørrelse på 40x på okularet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter protokollen blev JBNts med succes syntetiseret og karakteriseret med UV-Vis-absorption og TEM. JBNm er et injicerbart fast stillads, der gennemgår en hurtig biomimetisk proces. Efter at JBNts blev tilsat til en blanding af TGF-β1/matrilin-3-opløsning i et fysiologisk miljø, blev der dannet et fast hvidmasket stillads, der indikerer den vellykkede samling af JBNm, som det ses i figur 1. Dette blev demonstreret i karakteriseringsmetoderne.

Under fysiologiske forhold er matrilin-3 negativt ladet på grund af dets isoelektriske punkt27 (figur 2A). Efter tilsætningen af TGF-β1-opløsningen til matrilin-3-opløsningen steg zeta-potentialet for TGF-β1/matrilin-3-forbindelsen til en næsten neutral værdi, hvilket indikerer, at de to proteiner var bundet via ladningsinteraktioner. Som det ses i figur 2A, er zeta-potentialet i JBNm det højeste blandt de tre grupper på grund af JBNts, da det isoelektriske punkt i lysinsidekæden er omkring 9,74 i et fysiologisk miljø. Stigningen i zeta-potentielle værdier af JBNm indikerer den vellykkede samling af dens lag-for-lag struktur.

UV-Vis absorptionsspektre (figur 2B) tydeliggør dannelsen af JBNm's hierarkiske lag-for-lag indvendige struktur. De aromatiske ringe i lysinsidekæderne og JBNts bidrog til de to absorptionstoppe ved henholdsvis 220 nm og 280 nm. Faldet i absorptionsværdien blev observeret efter tilsætningen af TGF-β1, hvilket indikerer, at binding forekommer mellem TGF-β1 og JBNts. Efter tilsætningen af JBNts til matrilin-3 blev der observeret et mere tydeligt fald i absorptionsintensiteten af toppe, hvilket igen indikerer vellykket binding mellem matrilin-3 og JBNts. På samme måde blev JBNm dannet efter tilsætning af JBNts til en blanding af TGF-β1/matrilin-3, og absorptionstoppene faldt i intensitet. Absorptionstoppen af JBNm er tættere på matrilin-3/JBNts-linjen end TGF-β1/JBNts-linjen, hvilket indikerer, at JBNts foretrækker at binde til matrilin-3 og danner en lag-for-lag ydre struktur med matrilin-3, mens TGF-β1 ligger i det indre lag. TEM bruges til at karakterisere morfologien af JBNts og JBNm (figur 2C). Efter kombination med proteiner blev tykke bundter af JBNm observeret danne en stilladsstruktur.

Fluorescensmikroskopi har bekræftet tilstedeværelsen af lag-for-lag-strukturen (figur 3A) og demonstreret tværsnittet af JBNm. Efter mærkning af TGF-β1 og matrilin-3 blev det observeret, at den røde fluorescerende matrilin-3 omslutter JBNt-bundterne og danner det ydre lag af JBNm. I figur 3B dannede den grøn-fluorescerende TGF-β1 et indre lag, der bidrog til evnen til at lagre vækstfaktorer og muliggøre lokalisering af TGF-β1. Figur 3C viser fluorescensresonansenergioverførselsprocessen (FRET) mellem de fluorescerende farvestofmærkede proteiner som karakteriseret ved fluorescensspektre med emissionstoppe ved 520 nm og 570 nm for henholdsvis mærket TGF-β1 og matrilin-3 grupper28. Efter tilsætning af JBNts i henhold til protokollen dannes lag-for-lag-strukturen; toppe blev observeret ved både 520 nm og 570 nm for JBNm-gruppen, hvilket indikerer en vellykket binding og samling af proteinerne og JBNts.

Derudover blev effekten af JBNm på hMSC-adhæsion og celleproliferation undersøgt. Som vist i figur 4 blev celleadhæsionstætheden af JBNm belagt på overfladen af de kammerbelagte dækbriller bestemt. JBNm viste hMSC'er grupperet langs sig selv (figur 4A), mens færre celler klæbede til JBNts. For de andre grupper var hMSC'erne imidlertid jævnt fordelt uden justering sammenlignet med JBNm-gruppen. Justeringen af celler såvel som størrelsen af cellerne på JBNm viste, at JBNts spillede en rolle i celleadhæsion, mens proteinerne i JBNm øgede affiniteten af celleadhæsion (figur 4B, C).

Efter dag 1 af cellekultur med JBNm, JBNts, matrilin-3 alene, TGF-β1 alene og negativ kontrol viste JBNm- og TGF-β1-grupperne signifikant celleproliferation sammenlignet med de andre grupper. Da cellekulturens varighed blev øget til 3 og 5 dage, viste JBNm- og TGF-β1-grupperne endnu mere øget celleproliferation, som det ses i figur 5. En langtidsfunktionsundersøgelse blev udført for at bestemme differentieringen af hMSC'er med JBNm og uden JBNm (negativ kontrol). Efter 15 dage blev der observeret en forbedret alkisk blå plet, hvilket indikerer chondrogenese af hMSC'er, der vokser sammen medJBNm 26. Således foretrak cellerne JBNts af JBNm. Dette skyldtes sandsynligvis dets DNA-efterlignende struktur og evne til at blive adskilt i småmolekyleenheder, hvoraf sidstnævnte kan udløses af en lav pH eller tilstrækkelig enzymatisk aktivitet (såsom optagelse af celler)14,29.

Video 1: Videooptagelse af JBNm-samling. Denne optagelse skildrer dannelsen af JBNts, matrilin-3 og TGF-β1 i JBNm. Dette tal er blevet ændret fra Zhou et al. (2021)26. Klik her for at downloade denne video.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af den kemiske struktur af JBNts, J/T/M JBNm og J/T/M JBNm's kondrogene evne. (A) JBNt'ernes kemiske struktur, der fremhæver deres dannelse fra monomer til rosetring til JBNt. (B) De komponenter, der udgør J/T/M JBNm, samt hvordan de samles i JBNm. (C ) Skematisk for dyrkning af humane mesenkymale stamceller på J/T/M JBNm. Dette tal er blevet ændret fra Zhou et al. (2021)26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Materialekarakterisering af J/T/M JBNM. (A) Zeta-potentielle spektre af matrilin-3 alene, TGF-β1/matrilin-3-forbindelsen og J/T/M JBNm. (B) UV-Vis-absorptionsspektre af JBNts alene, matrilin-3 alene, TGF-β1 alene, matrilin-3/JBNts-forbindelsen, TGF-β1/JBNts-forbindelsen og J/T/M JBNm. (C ) Billeder af JBNts alene og J/T/M JBNm opnået ved transmissionselektronmikroskopi (TEM). Dette tal er blevet ændret fra Zhou et al. (2021)26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Fluorescerende konfokal billeddannelse og fluorescensspektre af J / T / M JBNm. (A) 3D-konfokalbillede af J / T / M JBNm med rød-fluorescerende mærket matrilin-3 og grøn-fluorescerende-mærket TGF-β1. (B) 2D konfokale billeder af J/T/M JBNm, med rød-fluorescerende-mærket matrilin-3, grøn-fluorescerende-mærket TGF-β1, og en fusioneret version. (C) Fluorescensspektre af forskellige forbindelser til karakterisering af FRET-processen mellem de mærkede proteiner. Dette tal er blevet ændret fra Zhou et al. (2021)26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Analyse af human mesenkymal stamcellekultur (hMSC). (A) Optiske mikroskopibilleder af hMSC'er med TGF-β1, matrilin-3 og JBNts, dyrket på en agarosegel. (B) Konfokale mikroskopibilleder af hMSC'er dyrket på det kammerdækkede dækglas belagt med en række JBNm-komponenter. (C) Graf over antallet af celler, der klæbes pr. kvadratmillimeter for hver gruppe. Fejllinjer angiver standardafvigelser. (D) Graf over cellens hovedakselængde i μm pr. gruppe. Fejllinjer angiver standardafvigelser. Bemærk: N ≥ 3, *P< 0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, ****P< 0,0001 (sammenlignet med negativ kontrol, NC). Dette tal er blevet ændret fra Zhou et al. (2021)26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Sammenligning af celletal for forskellige grupper mellem dag 1, 3 og 5. Cellenummerstatistik for hMSC'er efter dyrkning med forskellige materialer på dag 1, 3 og 5. Fejllinjer angiver standardafvigelser. Bemærk: N = 6, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Dette tal er blevet ændret fra Zhou et al. (2021)26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med denne undersøgelse er at udvikle en biomimetisk stilladsplatform, JBNm, for at overvinde begrænsningerne ved konventionelle vævskonstruktioner, der er afhængige af cellekulturmiljøer for at formidle celledifferentiering. JBNm er et lag-for-lag strukturstillads til en selvbærende bruskvævskonstruktion. Det innovative design er baseret på nye DNA-inspirerede nanomaterialer, JBNts. JBNm, der består af JBNts30, TGF-β1 og matrilin-3, er samlet gennem en ny lag-for-lag-teknik, hvor stilladsets selvmontering blev styret på molekylært niveau. Samlingen af JBNm blev observeret og karakteriseret med zeta-potentiel måling, UV-Vis-absorption, TEM og fluorescensspektralanalyse.

UV-Vis-spektrene i figur 2B (trin 3) har vist dannelsen af JBNm's hierarkiske lag for lag-indre. En forskel i absorbans toppe kan observeres på grund af en forskel i bindingsaffinitet. Flere større interaktioner forekommer mellem JBNts og matrilin-3 end mellem JBNts og TGF-β1, hvilket indikerer, at JBNts efterligner kollagenproteiner med hensyn til deres fibrøse morfologi og lysinoverfladekemi. Denne teknik er nødvendig for at observere bindingen af JBNts til matrilin-3 snarere end TGF-β1, hvilket muliggør indkapsling af TGF-β1 og derfor giver en langsom frigivelse af TGF-β1 i det omgivende væv. Det mest kritiske trin i udviklingen af JBNm er kombinationen af proteiner med JBNts. TGF-β1 og matrilin-3 skal tilsættes inden tilsætning af JBNts for at observere den fulde effekt af FRET-fænomenet mellem den mærkede matrilin-3 og TGF-β1. Begrænsningen af denne teknik stammer fra den forkerte additionssekvens af proteiner og nanorør, hvilket resulterer i forskellige målinger. Dette er et vigtigt skridt for dannelsen af JBNm til fremtidige undersøgelser og vil derfor blive anvendt på fremtidige JBNm-fabrikationer og undersøgelser.

Matrilin-3 er et meget negativt protein, mens TGF-β1 er et lidt neutralt protein, som det ses i figur 2A. Ladningsforskellen blev observeret for at bestemme bindingen af disse proteiner. Fra den negativt ladede tilstand af matrilin-3 steg zeta-potentialet til en næsten neutral værdi efter tilsætning af TGF-β1 (figur 2A). Dette trin er vigtigt for at bestemme det første indre lag af det biomimetiske stillads og for at indikere, at kombinationen af begge proteiner er gennem ladningsinteraktion. Efter tilføjelsen af JBNts, som er det andet trin i JBNm-fremstillingen, blev JBNm's zeta-potentiale målt til ~ 10 ± 5 mV (figur 2A). Da JBNts er meget positive, blev ladningen af JBNm observeret at stige som forventet. Bestemmelse af ladninger med zeta-potentiale er derfor vigtig for at observere dannelsen af JBNm trin for trin via ladningsinteraktioner. I lighed med UV-Vis-spektroskopi er additionssekvensen vigtig i dette trin, og forkert additionsrækkefølge kan resultere i forskellige målinger. På samme måde er det vigtigt at pipettere blandingen op og ned inden måling.

Dernæst mærkes TGF-β1 og matrilin-3, så udviklingen af JBNm kan observeres med konfokal mikroskopi og fluorescensspektralanalyse med multimode mikropladelæsere. Prøverne blev exciteret med en 488 nm laser og viste emissionstoppe ved 520 nm og 570 nm (figur 3). Der blev ikke observeret nogen emissionstop for JBNts alene, fordi de ikke er mærket. FRET opstod fra TGF-β1-donoren til matrilin-3-acceptoren, hvorved emissionstoppen blev reduceret ved 520 nm og emissionstoppen øget ved 570 nm; de to komponenter er 10 nm fra hinanden i afstand, hvilket gør det muligt for FRET-fænomenet at forekomme. Derfor er samlingen af JBNm baseret på rumlige (dvs. fysiske afstand) processer sammen med ladningsinteraktioner. Det mest kritiske trin i udviklingen af JBNm er additionssekvensen; TGF-β1 og matrilin-3 skal tilsættes før tilsætning af JBNts for at observere den fulde effekt af FRET-fænomenet. Forstørrelse på mindst 40x på okularet er påkrævet for at observere den fluorescerende JBNm. Begrænsningen ved denne teknik er, at JBNts ikke er mærket og derfor ikke kunne observeres med konfokal mikroskopi. Proteinmærkningsteknikken kan dog anvendes til mærkning af JBNt med nogle ændringer til fremtidige applikationer.

JBNm kan hjælpe cellefunktioner, såsom celleadhæsion og celleproliferation. I denne undersøgelse blev hMSC'er dyrket (startende med 5.000 celler) på forskellige materialer (JBNm, JBNts, TGF-β1, matrilin-3 og negative kontroller uden additiver) for at sammenligne cellenumrene efter inkubation i 1, 3 og 5 dage ved hjælp af CCK-8-opløsning efter den nøjagtige producents protokoller til bestemmelse af celleproliferation. JBNm, især i nærværelse af TGF-β1, og TGF-β1 alene viste signifikant celleproliferation sammenlignet med de tre andre grupper. JBNts efterligner kollagen i ECM morfologisk, mens matrilin-3 er et bruskspecifikt protein, hvilket resulterer i øget celleproliferationsaktivitet efter inkubation ved 37 ° C i 3 og 5 dage (figur 5). JBNm har vist stort potentiale til at fungere som et injicerbart og biomimetisk vævsteknisk stillads for at overvinde begrænsningerne ved traditionelle cellekonstruktioner til forskellige fremtidige anvendelser som biomaterialer29,31. JBNm efterligner brusk ECM morfologisk, tilvejebringer vedhæftningssteder og tillader frigivelse af pro-chondrogene differentiative faktorer i mikromiljøet, såsom TGF-β132,33. JBNm's evne til at inkorporere TGF-β1 i stilladsets indre lag forhindrer det i at lække til uønskede områder og forbedrer dermed stilladsets effektivitet (figur 4 og figur 5). Mange hMSC'er ses at klynge sig langs JBNm-stilladset, mens cellerne er sparsomt fordelt i matrilin-3, TGF-β1 og negative kontrolgrupper (figur 4). Cellernes morfologi blev også observeret, hvilket indikerer fremragende affinitet med JBNm-overflader. Disse præcist designede biomaterialer forhindrer hurtig frigivelse af inkorporerede bioaktive molekyler i cellekulturmiljøet og forbedrer selvbæredygtigheden af vævskonstruktionerne i matrixen34. En begrænsning ved denne teknik er, at startcellenumrene er kritiske for at bestemme spredningen af celler. Et startcelletal på 5.000 blev fundet mest optimalt for denne undersøgelse. En standardkurve er også nødvendig for at bestemme cellenummeret ved at plotte et kendt antal celler og måle dem i multimode mikropladelæseren. Denne teknik kan anvendes i fremtiden som en standardiseret metode til at bestemme celleproliferation på tværs af alle undersøgelser vedrørende JBNm-stilladser.

hMSC'er blev dyrket i 3D-agarosepiller med og uden JBNm for at bestemme langtidsfunktionsundersøgelsen i 15 dage. Efter 15 dage blev total RNA ekstraheret fra hMSC'erne i agarosepillerne, indeholdende positiv kontrol (pellets blev forsynet med frisk TGF-β1 hver gang medium blev ændret), JBNm, JBNts, matrilin-3, TGF-β1 og ingen tilsætningsstoffer. Real-time qPCR blev udført til genanalyse, test for kondrogene differentieringsmarkører, Aggrecan (ACAN) og hypertrofimarkør type X kollagen (COL X). ACAN-ekspression i JBNm-gruppen steg signifikant sammenlignet med andre grupper, hvilket viser, at JBNm fremmer stamcelle chondrogen differentiering signifikant, mens COL X hæmmes. I mellemtiden har den positive kontrol forbedret chondrogenese, som det fremgår af stigningen i ACAN, og også hypertrofi af den differentierede celle26. En yderligere begrænsning af denne undersøgelse er, at RNA-ekstraktionen er fra cellerne indlejret i en hydrogel. Det samlede RNA opnået i denne protokol var derfor lavt i koncentration og renhed. For at overvinde denne begrænsning blev flere prøver dyrket og ekstraheret for at opnå den optimale koncentration og renhed til det næste trin, qPCR i realtid. Mens qPCR er vigtig for undersøgelsen, er mindre ændring af denne teknik nødvendig for fremtidige undersøgelser for at sikre effektiv prøveekstraktion uden at ofre et stort antal prøver.

En stabilitetstest blev udført med et humant TGF-β1 ELISA-kit for at teste frigivelsen af protein fra JBNm-hydrogelen. I denne undersøgelse forventes TGF-β1 at blive indkapslet i J/T/M JBNm, og derfor bør der ikke observeres nogen TGF-β1-frigivelse (dvs. den teoretiske belastningsværdi er 100%). En begrænsning af dette trin er, at al TGF-β1 antages at være indkapslet i JBNm lag-for-lag stillads. Efter 15 dage opsamles opløsninger frigivet fra hydrogelen og testes med sættet efter producentens protokoller. Derefter blev mængden af TGF-β1 beregnet ved at trække mængden af den frigivne TGF-β1 i PBS fra den teoretiske belastningsværdi. Fordi TGF-β1 blev indkapslet i det indre lag af JBNm, forventedes den langsomme frigivelse af proteinet. Undersøgelsen viste, at TGF-β1 er lokaliseret i JBNm-stilladset og ikke frigives hurtigt i de omkringliggende områder26.

Denne innovative lag-for-lag JBNm bruskvævskonstruktion blev realiseret ved højt organiseret og kontrolleret selvmontering på molekylært niveau. TGF-β1 er begrænset i det indre lag af matrixfibrene, hvilket forhindrer dets lækage til uønskede steder og fremmer lokaliseret chondrogenese samtidigt. Derudover er matrilin-3 lokaliseret i det ydre lag af matrixfibrene, hvilket skaber et antihypertrofisk mikromiljø35. JBNts har vist sig ikke kun at fungere som en strukturel stillads rygrad, men også forbedre stamcelleforankring og vedhæftning for at lokalisere celler langs matrixfibrene30,36. Med hensyn til fremtidigt arbejde vil det lag-for-lag-design af det JBNt-baserede stillads blive tilpasset til applikationer i forskellige væv37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Yupeng Chen er medstifter af Eascra Biotech, Inc. og NanoDe Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Dette arbejde understøttes af NIH-tilskud 7R01AR072027 og 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 og University of Connecticut. Dette arbejde støttes også delvist af NIH-bevillingen S10OD016435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

Tags

Bioengineering udgave 185
Fremstilling og karakterisering af lag-for-lag Janus base nano-matrix for at fremme bruskregenerering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter