Summary
Tunneling nanorør (TNT'er) er primært åbne F-actin membran nanorør, der forbinder naboceller, hvilket letter intercellulær kommunikation. Den bemærkelsesværdige egenskab, der adskiller TNT'er fra andre cellefremspring, er nanorørenes svævende natur mellem celler. Her karakteriserer vi TNT'er ved at konstruere en 3D-volumenvisning af konfokale z-stack-billeder.
Abstract
Nylige opdagelser har afsløret, at celler udfører direkte, langtrækkende, intercellulær overførsel via nanoskala, actin-membranledninger, nemlig "tunneling nanorør" (TNT'er). TNT'er defineres som åbne, lipid dobbeltlagsomkransede membranforlængelser, der formidler kontinuitet mellem naboceller med diametre på mellem 50 nm og 1 μm. TNT'er blev oprindeligt demonstreret i neuronale celler, men successive undersøgelser har afsløret eksistensen af TNT'er i flere celletyper og sygdomme, såsom neurodegenerative sygdomme, virusinfektioner og kræft. Flere undersøgelser har henvist til tætte, elektrisk koblede membrannanostrukturer mellem naboceller som TNT'er eller TNT-lignende strukturer.
Belysningen af ultrastruktur med hensyn til membrankontinuitet ved slutpunktet er teknisk udfordrende. Derudover er undersøgelser af cellecellekommunikation udfordrende med hensyn til karakterisering af TNT'er ved hjælp af konventionelle metoder på grund af manglen på specifikke markører. TNT'er defineres primært som F-actinbaserede, åbne membranfremspring. En væsentlig begrænsning er imidlertid, at F-actin er til stede i alle typer fremspring, hvilket gør det udfordrende at skelne TNT'er fra andre fremspring. Et af de bemærkelsesværdige kendetegn ved F-actinbaserede TNT'er er, at disse strukturer svæver mellem to celler uden at røre undergrunden. Derfor kan forskellige F-actinfarvede TNT'er bekvemt skelnes fra andre fremspring såsom filopodia og neuritter baseret på deres svævende mellem celler.
Vi har for nylig vist, at internaliseringen af oligomere amyloid-β1-42 (oAβ) via actinafhængig endocytose stimulerer aktiveret p21-aktiveret kinase-1 (PAK1), som medierer dannelsen af F-actinholdige TNT'er, der udtrykkes sammen med phospho-PAK1 mellem SH-SY5Y neuronale celler. Denne protokol skitserer en 3D-volumenanalysemetode til at identificere og karakterisere TNT'er fra de fangede z-stack-billeder af F-actin- og phospho-PAK1-immunostained membranfremspring i oAβ-behandlede neuronale celler. Endvidere skelnes TNT'er fra udvikling af neuritter og neuronale udvækst baseret på F-actin- og β-III tubulin-immunostained membranledninger.
Introduction
Tunneling nanorør (TNT'er) er F-actin-baserede, primært åbne membranledninger og spiller en afgørende rolle i den intercellulære overførsel af last og organeller1. Det unikke kendetegn ved TNT'er er, at de forbinder naboceller uden kontakt med undergrunden; De er over 10-300 μm lange, og deres diametre varierer mellem 50 nm og 1 μm 2,3. TNT'er er forbigående strukturer, og deres levetid varer mellem et par minutter til flere timer. TNT'er blev først demonstreret i PC12 neuronale celler1; Senere viste talrige undersøgelser deres eksistens i flere celletyper in vitro og in vivo 4,5. Flere undersøgelser har afsløret den patologiske betydning af TNT'er i forskellige sygdomsmodeller, såsom neurodegenerative sygdomme, kræft og virusinfektioner 6,7,8.
De strukturelle heterogeniteter af TNT'er er blevet påvist ved flere undersøgelser i forskellige cellulære systemer9. Forskellene er baseret på cytoskeletsammensætning, dannelsesmekanismen og de overførte lasttyper10. Primært anses den åbne, F-actin-positive membrankontinuitet, der svæver mellem to naboceller og overfører organeller, for at bestå af TNT'er11. Den manglende klarhed eller mangfoldighed, der observeres i dannelsen af TNT'er, øger imidlertid vanskeligheden ved at udvikle TNT-specifikke markører. Det er således vanskeligt at identificere TNT-strukturer ved konventionelle detektionsmetoder og skelne membrannanorør med hensyn til åbne og tætte fremspring12. Imidlertid er karakteristikken ved TNT'er at svæve som F-actinmembranfremspring mellem to celler relativt lettere og mere gennemførlig at identificere ved hjælp af konventionelle billeddannelsesteknikker. Andre actinbaserede cellulære fremspring såsom filopodia og dorsal filopodia kan ikke svæve mellem to fjerne celler, især når celler er fastgjort. Bemærk, at tætte, elektrisk koblede, udviklende neuritter ofte kaldes TNT-lignende strukturer13.
Det er kendt, at F-actin spiller en vigtig rolle i TNT-dannelse, og flere undersøgelser har vist, at F-actinhæmmeren cytochalasin D hæmmer dannelsen af TNT'er14,15. I modsætning hertil har hæmmere af mikrotubuli ingen effekt på TNT-dannelse16. De sidste 2 årtier har set flere rapporter om den betydelige rolle, som TNT'er spiller i spredningen af patologi og tumorresistens og terapi17. Derfor er der en uendelig efterspørgsel efter bedre teknikker til TNT-karakterisering.
Manglen på specifikke markører for TNT'er og mangfoldigheden i morfologi og cytoskeletal sammensætning gør det vanskeligt at udvikle en unik karakteriseringsmetode. Nogle undersøgelser har brugt automatiseret billeddetektion og TNT-kvantificeringsteknikker18,19. Der er dog flere fordele ved den nuværende manuelle 3D-volumenanalysemetode i forhold til automatisk billedanalyse til påvisning og kvantificering af TNT'er. Desuden kan automatiske detektionsmetoder være vanskelige at implementere i laboratorier, der mangler algoritmeekspertise. Den nuværende metode kunne i vid udstrækning vedtages af forskere på grund af dens præcision og reproducerbarhed.
I en nylig undersøgelse viste vi, at oAβ fremmer biogenesen af TNT'er i neuronale celler via en PAK1-medieret, actinafhængig endocytosemekanisme12. oAβ-inducerede TNT'er udtrykker også aktiveret PAK1 (eller phospho-PAK1). Vi udviklede en 3D-volumenvisningsbilledrekonstruktionsmetode til at skelne mellem oAβ-inducerede, F-actin- og phospho-PAK1-immunostainerede TNT'er. β-III tubulin-positive, udviklende neuritter ligner ofte TNT-lignende svævende strukturer20. Derfor skelnede vi yderligere F-actin-baserede TNT'er fra β-III tubulin-positive neuritter og andre TNT-lignende fremspring. 3D-volumenvisningsbilleder er blevet brugt til at identificere TNT'er på grundlag af deres egenskaber ved at svæve over undergrunden og forblive forbundet mellem to naboceller. Dette papir beskriver identifikation og detektion af actinholdige membranledninger eller TNT'er ved hjælp af konfokale z-stack-billeder og endelig manuel kvantificering af de identificerede strukturer fra 3D-volumenvisningsrekonstruktionsbilleder. Den præsenterede metode kan ikke skelne åbne egentlige TNT'er fra tætte TNT-lignende strukturer; denne metode hjælper med at identificere TNT'er i in vitro 2D-cellekultur på et fladt underlag. Metoden er imidlertid let at implementere og reproducere og kan i vid udstrækning anvendes til præcis kvantificering af kun actinbaserede TNT'er og til at skelne dem fra neuritter og β-tubulinpositive TNT-lignende strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: SH-SY5Y-celler dyrket i DMEM/F-12-medier blev differentieret med 10 μM retinsyre i 7 dage og behandlet med 1 μM oAβ-oligomerer i 2 timer ved 37 °C (5 % CO2). Efter behandling blev cellerne fikseret med Karnovskys fikseringsopløsning og dobbeltimmunfarvet med phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) antistof og F-actinbindende phalloidin. Senere blev konfokale z-stack-billeder taget ved hjælp af et konfokal laserscanningsmikroskop. TNT'erne blev kvantificeret ved manuel tælling og skelnet fra andre neuritter / cellefremspring ved at konstruere 3D-volumenvisningsbilleder og identificere strukturerne ud fra deres karakteristika ved at svæve mellem to celler uden at røre undergrunden (figur 1).
1. Cellekultur og differentiering
- Kultur SH-SY5Y neuronale celler i DMEM / F12 (Hams) medier 1: 1 med 10% føtalt bovin serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin-neomycin blanding (PSN). Frø cellerne i en 35 mm billeddannelsesskål med en 14 mm brønd, der består af en # 1.5 coverslip i midten af skålen, der er fastgjort til bunden. Frø cellerne på billeddannelsesskålen i en koncentration på 12.000 celler / cm2 og udfør eksperimenterne ved 60% -70% sammenløb.
- Delvist differentiere cellerne med 10 μM retinsyre (RA) fra en 100 mM stamopløsning (5 mg RA i 15 ml dimethylsulfoxid [DMSO]). Derefter inkuberes cellerne i 7 dage ved 37 °C (5% CO 2) til differentiering med medieskift hver2. dag.
BEMÆRK: Vær forsigtig med at opretholde sammenløbet (60% -70%) af cellerne (både udifferentierede og delvist differentierede celler). Celletæthed kan påvirke dannelsen af TNT'er mellem cellerne.
2. Fremstilling af oligomerer af amyloid-β1-42 (oAβ) til behandling af neuronale celler
- Aβ 1-42 (1 mg) opløses i 200 μL af 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol og opløsningen opdeles i 20 aliquoter, der hver indeholder 0,05 mg peptider. Lyofiliser og opbevar aliquoterne ved -20 °C til senere brug.
- Stamopløsningen (5 mM) af den frysetørrede Aβ 1-42 i DMSO fremstilles ved at tilsætte 2,2 μL DMSO til 0,05 mg frysetørret peptid. For forsigtigt at opløse peptiderne skal du fylde opløsningen og sonikere i 2 minutter i en sonikator til vandbad.
- Stamopløsningen fortyndes til en koncentration på 100 μM i DMEM, pH 7,4, og hvirvel for at omdanne peptiderne til monomerer efterfulgt af inkubation ved 4 °C i 24 timer for at opnå oligomerer af Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.
- Karakteriser oAβ før eksperimenterne som rapporteret tidligere21,22 ved transmission elektronmikroskopi billeddannelse.
- De delvist differentierede SH-SY5Y-celler behandles med 1 μM oAβ. Fjern mediet før behandlingerne, og tilsæt frisk FBS-fri DMEM. Efter medieændringen tilsættes tidligere fremstillet oAβ (100 μM) til mediet til en slutkoncentration på 1 μM. Cellerne inkuberes med 1 μM oAβ i 2 timer ved 37 °C (5 % CO2). Medtag en negativ kontrol i form af ubehandlede celler.
3. Immunostaining af F-actin og aktiveret-PAK1 til karakterisering af TNT'er
- Udfør differentiel immunostaining ved hjælp af phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) antistof og F-actinbindende phallotoxin phalloidin.
- De kontrol- og oAβ-behandlede celler vaskes med 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) i 2 x 2 minutter før fiksering. Forbered Karnovskys fikseringsopløsning ved anvendelse af 2% formalinfikseringsmiddel og 2,5% glutaraldehyd opløst i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,2. Fastgør derefter cellerne i billeddannelsesskålen ved at tilføje Karnovskys fikseringsopløsning (lige nok til at dække cellerne) i 45 minutter ved stuetemperatur.
- Vask de faste celler 2 x 2 min ved hjælp af inkubationsbuffer. Inkubationsbufferen (20x) forberedes ved at opløse 0,1 g saponin i 5 ml FBS og fortyndes til 1x ved at tilsætte 95 ml 1x PBS.
- Efter fiksering tilsættes det første antistof mod phopho-PAK1 ved en fortynding på 1:250 i inkubationsbufferen og inkuberes natten over ved 4 °C i et mørkt fugtigt kammer.
- Den næste dag, efter 24 timers inkubation, vaskes cellerne 2 x 2 minutter med inkubationsbufferen; derefter tilsættes sekundært antistof konjugeret til Alexa Fluor 488 (1: 1.000 fortynding) og Phalloidin 555 (1: 1.000 fortynding). Inkuber cellerne i det mørke fugtige kammer i 1,5 timer ved stuetemperatur.
- Efter inkubationen vaskes cellerne 2 x 2 min med inkubationsbuffer. Plet kernen ved at tilsætte 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i en 1:2.000 fortynding og inkuberes i 5 minutter til 10 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Tilbered DABCO monteringsmedium ved hjælp af 25 mg DABCO i 90% glycerol og 10% 1x PBS. For at opløses korrekt justeres pH til 8,6 ved hjælp af spektrofotometrisk kvalitet, fortyndes HCI l (fortyndet 1:20 med vand) og holdes opløsningen på en vipper til blanding.
- Som et antiblegemiddel tilsættes DABCO-monteringsmediet direkte på billeddannelsesskålen, der indeholder dækslikket i bunden. Vent i mindst 1-2 timer, og fortsæt direkte med at udføre konfokal billeddannelse.
BEMÆRK: Der kræves ingen klæbemidler for at fastgøre dækslerne.
4. Immunostaining af F-actin og β-III tubulin for at skelne TNT'er fra neuritter
- Udfør differentiel immunostaining med β-III tubulinantistof og F-actinbindende phallotoxin phalloidin.
- Vask de oAβ-behandlede celler 2x med 1x PBS, før du tilføjer Karnovskys fikseringsopløsning. Inkuber cellerne i 45 min ved stuetemperatur og vask cellerne 2 x 2 min med inkubationsbuffer.
- Efter fiksering tilsættes antistoffet mod β-III tubulin (TUBb3) ved en fortynding på 1:250 i inkubationsbufferen og inkuberes ved 4 °C natten over i det mørke fugtige kammer.
- Den næste dag vaskes cellerne med inkubationsbuffer (2 x 2 min), og der tilsættes sekundært antistof konjugeret til Alexa Fluor 488 (1: 1.000 fortynding) og Phalloidin 555 (1: 1.000 fortynding) sammen til den samme skål. Derefter inkuberes cellerne i 1,5 time ved stuetemperatur i det mørke fugtige kammer.
- Cellerne vaskes 2x med inkubationsbuffer, og der tilsættes nuklearfarvnings-DAPI i en fortynding på 1:2.000 i 5-10 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Tilsæt antiblegemiddel DABCO i monteringsmedium som nævnt ovenfor, og vent i 2 timer før billeddannelse.
5. Billeddannelse med konfokal mikroskopi
- For at identificere TNT'er skal du tage z-stack-billeder af immunfarvede celler ved hjælp af et konfokal laserscanningsmikroskop. Tag billederne ved hjælp af 40x/1.40 Oil DIC-mål med DAPI, fluoresceinisothiocyanat (FITC) og tetramethylrhodamin (TRITC) filtersæt.
- Vælg først kanalerne ved at klikke på de nødvendige lasere sekventielt i vinduerne Spor 1, Spor 2 og Spor 3 i konfokalsoftwaren. Klik på indstillingen T-PMT under vinduet Spor 1 for at tage billederne af differentialinterferenskontrasten (DIC) med fluorescenskanaler.
BEMÆRK: DIC-billeder optages af en anden detektor mærket som T-PMT. - Vælg anskaffelsesfanen for softwaren, klik på fanen Z-stack , og vent på, at et vindue åbnes. Klik derefter på live scanning for at fokusere cellerne i bunden af skålen. Vælg det fokuserede billede som den første stak. Fokuser derefter op for at se den øverste del af cellen, og vælg den som den sidste stak. Stop live scanning, og klik på nummeret ved siden af den optimale fane for at rette trinstørrelsen på stablerne. Trinstørrelse bestemmer antallet af skiver og intervallerne baseret på cellernes tykkelse.
BEMÆRK: Trinstørrelse vælges ud fra Nyquist-prøveudtagning for at tage nok skiver og sikre, at der ikke er huller mellem de to stakke. Nyquist-prøveudtagningen bestemmes ud fra lysets mål og bølgelængder23. - Tag sekventielle billeder af tre kanaler med DAPI-, FITC- og TRITC-lasere med lasere på 405 nm, 488 nm og 561 nm , og tag dem med en pixelopholdstid på 1,02 μs. Tag billeder i DIC-kanalen med fluorescenskanaler for at observere cellegrænsen.
- Tag en stak billeder med dimensionerne x: 224,92 μm og y: 224,92 μm, med hver pixel på 220 nm2 størrelse og z-skalering på 415 nm.
- Tag billeder, der fanger flere z-stakke (15-22 stakke) fra bunden til toppen af cellerne. Anskaf mindst 10 billeder fra det tilfældige felt i kulturskålen for at få i alt ~ 200-300 celler.
- Analyser de optagne billeder offline for at identificere TNT'erne ved hjælp af 3D-volumenvisningsanalyse
6. Analyse af konfokale z-stack-billeder for at identificere og kvantificere TNT'er
- Åbn de konfokale billeder, der er gemt i .czi-dataformat i Fiji-softwaren, til analyse.
- Vælg indstillingen Hyperstack for at se hver z-stak og kanal i billedet. Se efter hyperstacks af z-stacks og kanaler, som åbnes i et enkelt vindue som vist i figur 2. Rul kanalen (angivet med røde og grønne pile) og z-stack (angivet med blå pile) rullepaneler for at vælge den nøjagtige stak af en bestemt kanal af interesse.
BEMÆRK: I faste celler, da de svævende TNT'er eller membranledninger forbliver over overfladen, er strukturerne ikke synlige i de nederste dele af z-stakke. I faste celler ligger neuritter imidlertid på overfladen og kan påvises i de nedre dele af z-stakke (z = 0 til 2). Se figur 2 for identifikationstrinnene. - Som vist i figur 2 skal du først vælge den F-actinfarvede kanal (angivet med røde pile) ved at rulle på kanallinjen. Rul derefter manuelt z-stakke (angivet med blå pile) for at se hver stak en efter en. Identificer de F-actin-farvede strukturer, der ser ud til at forbinde celler, er synlige i de nederste dele af z-stakke og er tæt på overfladen af billeddannelsesskålen (z = 2) som neuritter (angivet med hvide pile).
BEMÆRK: Størstedelen af neuritterne er lette at identificere, da de fremstår som forlængede fremspring (angivet med lyserøde pile). - Identificer TNT'erne, de F-actin-positive, svævende celle-til-celle-ledninger, ved at rulle z-stakke mod toppen (fra z = 4 i figur 2; angivet med gule pile). Se efter neuritter nær de nederste dele af z-stakke mod overfladen og observer, at de begynder at forsvinde med rulning af z-stakke mod toppen (ved z = 6 i figur 2; neuritter er ikke tydeligt synlige).
- Identificer phospho-PAK1-positive TNT'er på samme måde som F-actin-positive TNT'er ved at analysere den svævende karakter af ledningerne fra z-stablerne. Da phospho-PAK1-farvning er svagere end F-actinfarvning, skal du kigge efter phopho-PAK1-farvede TNT'er ved z = 4 (svagt synlig) og ved z = 6 (fremtrædende).
- Observer endvidere DIC-billederne for at kontrollere, at de F-actin- og phospho-PAK1-farvede TNT-strukturer er membranledninger mellem celler (figur 3). Derudover flettes F-actin (rød) og phospho-PAK1 (grøn) kanaler for at verificere, at de identificerede TNT'er er F-actin og phospho-PAK1 co-farvede strukturer (figur 3).
- For at kvantificere TNT'erne skal du tælle de samlede cellenumre og de identificerede TNT'er manuelt og repræsentere tallene som procentdele.
- For at skelne mellem F-actin-positive TNT'er og β-III tubulin (TUBb3)-positive, TNT-lignende svævende ledninger fra z-stack-billeder skal F-actin (rød) og TUBb3 (grøn) kanaler (figur 4) flettes (figur 4). Analyser derefter z-stakke af de flettede billeder.
- Se udelukkende efter F-actinfarvede TNT'er, der er svagt synlige ved z = 3 og fremtrædende ved z = 6 og z = 9 (gule pile). På samme måde identificeres F-actin og β-III tubulin (TUBb3) dobbeltpositive, TNT-lignende svævende ledninger ved z = 6 og z = 9 (cyanpile). Identificer andre F-actin- og β-III tubulinfarvede, ikke-svævende fremspring fra de nederste dele af z-stablerne (hvide pile).
- Mål diameteren af TNT'erne ved hjælp af linjeværktøjet i Fiji. Kontrollér måleskalaen ved at klikke på Analysér | Indstil Skala, så "afstand i pixels" indstilles automatisk fra .czi-billederne. Mål TNT'ernes diametre ved xy-planet.
BEMÆRK: De fleste diametre er mellem 1 pixel og 4 pixels (dvs. 220-880 nm); Hver pixel er 220 Nm. Se figur 5 for et resumé af protokollen til analyse af z-stack konfokale billeder.
7.3D rekonstruktion af z-stack-billeder for at karakterisere TNT'er
- Brug volumenfremviser-pluginet i Fiji, som tillader 3D-relicering og tærskelaktiveret 3D-visualisering (figur 6).
- Opdel z-stack-billederne i individuelle kanaler. Beskær derefter enkeltkanals (F-actin-kanal) z-stack-billeder for at bruge 3D-rekonstruktionsvisning til at fremhæve en eller to TNT'er eller neuritter ad gangen. Aktivér volumenvisningspluginet for at visualisere xy-, yz- og xz-visninger.
- Fastgør en enkelt TNT eller neurit i xy-planet (hvide pile repræsenterer neuritter i figur 6A; gule pile repræsenterer TNT'er i figur 6B) og markerer xz (rød) og yz (grøn) aksetværsnit. Overhold neuritterne i bunden af xz-planet i xz- og yz-planerne (hvide pile, figur 6A) og TNT'erne i de øverste z-stakke (gule pile, figur 6B).
- Vælg den enkelte TNT eller neurit for at rekonstruere 3D-volumenvisningen i xz-planet (figur 6C, D). I 3D-rekonstruktionen observeres neuritterne i bunden af z-planet (hvide pile, figur 6C) og TNT'erne, der vises som svævende strukturer, der forbinder to celler uden at røre det nederste z-plan (gule pile, figur 6D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her identificerer og karakteriserer vi oAβ-inducerede TNT'er i SH-SY5Y neuronale celler ved at konstruere 3D-volumenvisninger fra konfokale z-stack-billeder (figur 1). Cellerne blev dobbeltimmunfarvet med F-actin og phospho-PAK1. Konfokale z-stack-billeder af immunfarvede celler blev analyseret for at identificere TNT'er (figur 2). Endvidere blev DIC-billeder analyseret for at verificere, at de F-actin- og phospho-PAK1-farvede TNT-strukturer var membranledninger mellem celler (figur 3). Endvidere blev cellerne dobbeltimmuniseret med F-actin og β-III tubulin (figur 4). De TNT-lignende F-actin og β-III tubulin dobbeltpositive membranledninger blev skelnet fra kun F-actin-positive TNT'er (figur 4). TNT'erne coudtrykt med phospho-PAK1 (eller aktiveret PAK1) og F-actin blev skelnet fra andre neuritter / cellefremspring ved at konstruere 3D-volumenvisningsbilleder baseret på deres karakteristika ved at svæve mellem to celler uden at røre undergrunden (figur 6). De identificerede TNT'er blev opdaget manuelt, og procentdelen af TNT'er blev beregnet præcist ud fra 3D-volumenvisningsbillederne. Diameteren og længden af TNT'erne blev også bestemt ved at analysere de individuelt identificerede TNT'er.
Figur 1: Skematisk diagram, der repræsenterer protokolresuméet af detektionsmetoden for TNT'er. Skalabjælke = 100 μm for mikroskopibilleder (øverst); 10 μm (3D-volumenvisninger). Forkortelser: oAβ = oligomert amyloid-β1-42; PAK1 = p21-aktiveret kinase-1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af konfokale z-stack-billeder for at identificere og kvantificere TNT'er. Konfokale z-stack-billeder blev analyseret i Fiji-software. Hyperstacks af z-stakke og kanaler åbnes i et enkelt vindue, der viser (A) F-actin og (B) phospho-PAK1. Ved at rulle kanalen (angivet med røde og grønne pile) og z-stack (angivet med blå pile) rullebjælker blev de enkelte stakke af en bestemt kanal af interesse analyseret. (A) De F-actinfarvede strukturer, der forbinder celler, synlige i de nederste dele af z-stakke, og anses for at være tæt på overfladen af billedskålen (z = 2) blev identificeret som neuritter (angivet med hvide pile). I modsætning hertil blev svævende celle-til-celle-tilsluttede ledninger, der var synlige i højere dele af z-stakke, identificeret som TNT'er (angivet med gule pile). (B) Tilsvarende blev phospho-PAK1-farvede neuritter og TNT'er identificeret. Andre F-actin-positive korte fremspring, der ikke er forbundet med naboceller, er angivet med lyserøde pile. Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: TNT = tunneling nanorør; PAK1 = p21-aktiveret kinase-1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Analyse af DIC-billeder for at bekræfte TNT'er. (A) DIC-billeder blev observeret for at verificere, at F-actin- og phospho-PAK1-farvede TNT'er og neuritfremspring faktisk var membranledninger. (B) Desuden blev F-actin (rød) og phospho-PAK1 (grøn) kanaler slået sammen for at verificere, at de identificerede, oAβ-inducerede TNT'er var F-actin og phospho-PAK1 co-farvede strukturer. Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: TNT = tunneling nanorør; DIC = differentiel interferenskontrast; PAK1 = p21-aktiveret kinase-1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Konfokale z-stack-billeder analyseret ved hjælp af Fiji-software til kun at skelne F-actin-farvede TNT'er fra β-III tubulin og F-actin dobbeltfarvede, TNT-lignende svævende ledninger. Først blev F-actin (rød) og TUBb3 (grøn) kanaler af hyperstacks fusioneret. Derefter blev de flettede billeder åbnet i et enkelt vindue. Ved at rulle z-stack rullebjælkerne blev F-actin-farvede TNT'er udelukkende identificeret; disse var svagt synlige ved z = 3 og fremtrædende ved z = 6 og z = 9 (gule pile, B). Tilsvarende kunne F-actin og TUBb3 dobbeltpositive, TNT-lignende svævende ledninger påvises ved z = 6 og z = 9 (cyanpile, A). Andre F-actin- og β-III tubulinfarvede, ikke-svævende fremspring blev identificeret fra de nederste dele af z-stablerne (hvide pile). Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: TNT'er = tunneling nanorør; TUBb3 = β-III tubulin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Skematisk oversigt, der repræsenterer den detaljerede protokol til analyse af z-stack konfokale billeder. Forkortelse: TNT'er = tunneling nanorør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: 3D-rekonstruktionsvisning for at fremhæve en eller to TNT'er eller neuritter ad gangen. Pluginet "volume view" i Fiji bruges til at visualisere xy-, yz- og xz-visninger. 3D-rekonstruktionen viser neurit liggende i bunden af z-planet (hvide pile i panelerne A og C), mens TNT'er fremstår som svævende strukturer, der forbinder to celler uden at røre ved det nederste z-plan (gul pil i panelerne B og D). Skalastænger = 10 μm. Forkortelse: TNT'er = tunneling nanorør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere forskere i de sidste 2 årtier har forsøgt at forstå og karakterisere strukturen af TNTs18. Manglen på specifikke markører hindrer fremskridt, og der er en stigende efterspørgsel efter en praktisk, standardiseret metode, der kan bruges til at identificere, karakterisere og kvantificere TNT'er. TNT'er defineres som F-actinbaserede membranledninger, der svæver mellem to celler. Undersøgelser har vist, at β-tubulin-positive, tætslutte, udviklende neuritter svæver mellem to fjerne celler og ligner TNT-lignende strukturer12,13. Derfor identificeres og skelnes TNT'er fra neuritter og andre TNT-lignende strukturer baseret på deres positivitet for kun actin og for at være membranledninger, der svæver mellem to fjerne celler. Forskere finder det ofte udfordrende at opnå intakte TNT-strukturer under fiksering før billeddannelse24. For at overvinde dette problem brugte vi en modificeret fikseringsopløsning med 2,5% glutaraldehyd (Karnovskys fikseringsmiddel) til at fiksere SH-SY5Y neuronale celler, der anvendes i denne protokol25.
Et kritisk trin i ethvert immunohistokemi / immunocytokemi eksperiment er fiksering af prøven, som er afhængig af udvælgelsen af det passende fikseringsmiddel. Ufuldkommen fiksering af prøven kan føre til hurtig proteolytisk nedbrydning af målproteinerne og en reduktion i den specifikke immunreaktivitet. Overfiksering forårsager maskering af epitopen og usikkerhed i specifik mærkning forårsaget af den ikke-specifikke baggrund. Metode, timing eller varighed, temperatur og pH påvirker også den korrekte fiksering af cellerne26.
Paraformaldehyd anvendes i vid udstrækning som fikseringsmiddel til immunfarvning af celler. Ulemperne ved at anvende paraformaldehyd som fikseringsmiddel indbefatter tabet af antigenicitet og ændringer i morfologi. Glutaraldehyd har et lavere osmotisk tryk, er mere stabilt i opløsning og tværbindinger let, hvilket giver bedre resultater27. En kombination af formaldehyd-glutaraldehyd (i fosfatbuffer) fikseringsmiddel resulterer i ekstraordinær fiksering af en lang række vævs-/celleprøver. Denne kombination muliggør hurtig stabilisering af cellens ultrastruktur ved formaldehyd efterfulgt af en permanent fiksering af den langsommere penetrerende virkning af glutaraldehyd28.
TNT'er, der er positive for F-actin og phospho-PAK1, adskiller sig fra neuritter baseret på deres karakteristika ved at svæve mellem to celler i in vitro 2D-cellekultur på et fladt underlag. De identificerede TNT'er blev manuelt opdaget med 3D-volumenvisningsanalyse, og procentdelene af dannede TNT'er blev beregnet ved manuel tælling. Den manuelle metode gør kvantificeringen af store mængder data vanskelig, da det kræver enorm arbejdskraft19. Imidlertid kan trænede øjne få øje på TNT'er effektivt og skelne dem fra neuritter med bedre præcision end automatiske detektionsmetoder. De eksisterende automatiske detektionsmetoder er også vanskelige at implementere i hvert laboratorium uden den tilgængelige ekspertise til at udvikle en algoritme og / eller ændre den eksisterende algoritme som krævet til den eksperimentelle opsætning. Den manuelle 3D-volumenvisningsanalysemetode gør det lettere at identificere membranstrukturerne, der ligger mellem celler i de nederste dele af z-stakke, og dem, der svæver i de midterste og højere dele af z-stakke for tydeligt at skelne mellem neuritter og TNT'er.
TNT'er kan skelnes fra andre membranfremspring såsom neuritter eller tumormikrorør. Det er imidlertid vanskeligt at skelne mellem åbne og lukkede nanostørrelsesrør med diametermembran, hvilket rejser følgende spørgsmål: er de TNT'er eller TNT-lignende strukturer? Siden det sidste årti er der akkumuleret en enorm mængde data for at vise TNT'ernes uundgåelige rolle i spredningen af patologi, kræftresistens og terapi17. Derfor leder forskere efter udviklingen af specifikke producenter, der vil ændre området for direkte, langdistance intercellulær kommunikation. Indtil da er reproducerbare billeddannelsesmetoder til karakterisering i høj efterspørgsel for at bane vejen for kontinuerlig fremgang på området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
D.K.V og A.R takker Manipal Academy of Higher Education for TMA Pai-stipendiet. Vi takker Science and Engineering Research Board of India for SERB-SRG (#SRG/2021/001315) samt Indian Council of Medical Research of India (# 5/4-5 / Ad-hoc / Neuro / 216/2020-NCD-I) og Intramural Fund of Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Indien. Vi takker JNCASR's (Jawaharlal Nehru Center for Advanced Scientific Research, Indien) konfokal facilitet og B. Suma for den konfokale mikroskopi i JNCASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
- Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
- Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
- Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
- Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
- Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
- Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
- Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
- Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
- Zurzolo, C.
- Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
- Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
- Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
- Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
- Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
- Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
- Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
- Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
- Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
- Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
- Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
- Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
- Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
- Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).
