Summary
Tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) öncelikle komşu hücreleri birbirine bağlayan ve hücreler arası iletişimi kolaylaştıran açık uçlu F-aktin membran nanotüpleridir. TNT'leri diğer hücre çıkıntılarından ayıran göze çarpan özellik, nanotüplerin hücreler arasında gezinen doğasıdır. Burada, TNT'leri konfokal z-yığın görüntülerinin 3B hacim görünümünü oluşturarak karakterize ediyoruz.
Abstract
Son keşifler, hücrelerin nano ölçekli, aktin-membran kanalları, yani "tünelleme nanotüpleri" (TNT'ler) yoluyla doğrudan, uzun menzilli, hücreler arası transfer gerçekleştirdiğini ortaya koymuştur. TNT'ler, 50 nm ile 1 μm arasında değişen çaplardaki komşu hücreler arasında sürekliliğe aracılık eden açık uçlu, lipid çift katmanlı kuşatılmış membran uzantıları olarak tanımlanmaktadır. TNT'ler başlangıçta nöronal hücrelerde gösterilmiştir, ancak birbirini izleyen çalışmalar, nörodejeneratif hastalıklar, viral enfeksiyonlar ve kanser gibi çeşitli hücre tiplerinde ve hastalıklarında TNT'lerin varlığını ortaya koymuştur. Birçok çalışma, komşu hücreler arasındaki yakın uçlu, elektriksel olarak bağlanmış membran nanoyapılarına TNT'ler veya TNT benzeri yapılar olarak atıfta bulunmuştur.
Ultrayapının uç noktadaki membran sürekliliği açısından aydınlatılması teknik olarak zordur. Ayrıca hücre-hücre iletişimi üzerine yapılan çalışmalar, spesifik belirteçlerin bulunmaması nedeniyle TNT'lerin konvansiyonel yöntemler kullanılarak karakterizasyonu açısından zordur. TNT'ler öncelikle F-aktin bazlı, açık uçlu membran çıkıntıları olarak tanımlanır. Bununla birlikte, önemli bir sınırlama, F-aktin'in her türlü çıkıntıda mevcut olmasıdır ve TNT'leri diğer çıkıntılardan ayırt etmeyi zorlaştırır. F-aktin bazlı TNT'lerin göze çarpan özelliklerinden biri, bu yapıların substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinmesidir. Bu nedenle, farklı F-aktin boyalı TNT'ler, hücreler arasında gezinmelerine bağlı olarak filopodia ve nöritler gibi diğer çıkıntılardan, kolayca ayırt edilebilir.
Son zamanlarda, oligomerik amiloid β 1-42'nin (oAβ) aktin bağımlı endositoz yoluyla içselleştirilmesinin, SH-SY5Y nöronal hücreleri arasında fosfo-PAK1 ile birlikte eksprese edilen F-aktin içeren TNT'lerin oluşumuna aracılık eden aktif p21-aktivekinaz-1'i (PAK1) uyardığını gösterdik. Bu protokol, oAβ ile tedavi edilen nöronal hücrelerde F-aktin ve fosfo-PAK1-immünoboyalı membran çıkıntılarının yakalanan z-yığın görüntülerinden TNT'leri tanımlamak ve karakterize etmek için bir 3D hacim analizi yöntemini özetlemektedir. Ayrıca, TNT'ler, F-aktin ve β-III tübülin-immünoboyalı membran kanallarına dayanan nöritler ve nöronal çıkıntılar geliştirmekten ayırt edilir.
Introduction
Tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) F-aktin bazlı, öncelikle açık uçlu membran kanallarıdır ve kargo ve organellerin hücreler arası transferinde hayati bir rol oynarlar1. TNT'lerin benzersiz özelliği, komşu hücreleri substratla herhangi bir temas olmadan bağlamalarıdır; uzunlukları 10-300 μm'nin üzerindedir ve çapları 50 nm ila 1 μm 2,3 arasında değişmektedir. TNT'ler geçici yapılardır ve ömürleri birkaç dakika ila birkaç saat arasında sürer. TNT'ler ilk olarak PC12 nöronal hücrelerindegösterilmiştir 1; Daha sonra, çok sayıda çalışma, in vitro ve in vivo 4,5 çeşitli hücre tiplerinde varlıklarını göstermiştir. Birçok çalışma, nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve viral enfeksiyonlar gibi çeşitli hastalık modellerinde TNT'lerin patolojik önemini ortaya koymuştur 6,7,8.
TNT'lerin yapısal heterojenlikleri çeşitli hücresel sistemlerde yapılan çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir9. Farklılıklar sitoiskelet bileşimine, oluşum mekanizmasına ve10 aktarılan kargo tiplerine dayanmaktadır. Öncelikle, iki komşu hücre arasında gezinen ve organelleri transfer eden açık uçlu, F-aktin-pozitif membran sürekliliğinin TNT'lerden oluştuğu düşünülmektedir11. Bununla birlikte, TNT'lerin oluşumunda gözlenen netlik veya çeşitlilik eksikliği, TNT'ye özgü belirteçlerin geliştirilmesindeki zorluğu arttırmaktadır. Bu nedenle, TNT yapılarını geleneksel tespit yöntemleriyle tanımlamak ve membran nanotüplerini açık uçlu ve kapalı uçlu çıkıntılar açısından ayırt etmek zordur12. Bununla birlikte, TNT'lerin iki hücre arasında F-aktin membran çıkıntıları olarak gezinme özelliği, geleneksel görüntüleme teknikleri kullanılarak tanımlanması nispeten daha kolay ve daha uygundur. Filopodia ve dorsal filopodia gibi diğer aktin bazlı hücresel çıkıntılar, özellikle hücreler sabitlendiğinde, iki uzak hücre arasında gezinemez. Not olarak, yakın uçlu, elektriksel olarak birleşmiş, gelişmekte olan nöritler genellikle TNT benzeri yapılar olarak adlandırılır13.
F-aktinin TNT oluşumunda önemli bir rol oynadığı bilinmektedir ve birçok çalışma F-aktin inhibitörü sitokalasin D'nin TNT oluşumunu inhibe ettiğini göstermiştir14,15. Buna karşılık, mikrotübül inhibitörlerinin TNT oluşumu16 üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Son 2 yılda, TNT'lerin patoloji ve tümör direncinin ve tedavisinin yayılmasında oynadığı önemli rol hakkında çeşitli raporlar görülmüştür17. Bu nedenle, TNT karakterizasyonu için daha iyi teknikler için hiç bitmeyen bir talep vardır.
TNT'lerin spesifik belirteçlerinin eksikliği ve morfoloji ve sitoiskelet kompozisyonundaki çeşitlilik, benzersiz bir karakterizasyon yönteminin geliştirilmesini zorlaştırmaktadır. Bazı çalışmalarda otomatik görüntü algılama ve TNT niceleme teknikleri kullanılmıştır18,19. Bununla birlikte, mevcut 3D hacimli manuel analiz yönteminin, TNT'lerin tespiti ve nicelleştirilmesi için otomatik görüntü analizine göre birkaç avantajı vardır. Ayrıca, algoritma uzmanlığı olmayan laboratuvarlarda otomatik algılama yöntemlerinin uygulanması zor olabilir. Mevcut yöntem, hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği nedeniyle araştırmacılar tarafından yaygın olarak benimsenebilir.
Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, oAβ'nın nöronal hücrelerdeki TNT'lerin biyogenezini PAK1 aracılı, aktin bağımlı, endositoz mekanizması12 aracılığıyla desteklediğini gösterdik. oAβ kaynaklı TNT'ler ayrıca aktif PAK1'i (veya fosfo-PAK1) eksprese eder. OAβ ile indüklenen, F-aktin ve fosfo-PAK1-immünoboyalı TNT'leri ayırt etmek için bir 3D hacim görünümü görüntü rekonstrüksiyon yöntemi geliştirdik. β-III tübülin-pozitif, gelişen nöritler genellikle TNT benzeri gezinme yapılarına benzerler20. Bu nedenle, F-aktin bazlı TNT'leri β-III tübülin pozitif nöritlerden ve diğer TNT benzeri çıkıntılardan daha da ayırt ettik. 3D hacim görünümü görüntüleri, TNT'leri substratum üzerinde gezinme ve iki komşu hücre arasında bağlı kalma özelliklerine dayanarak tanımlamak için kullanılmıştır. Bu yazıda, aktin içeren membran kanallarının veya TNT'lerin konfokal z-yığın görüntüleri kullanılarak tanımlanması ve tespiti ve son olarak, 3D hacim görünümü rekonstrüksiyon görüntülerinden tanımlanan yapıların manuel olarak ölçülmesi açıklanmaktadır. Sunulan yöntem, açık uçlu uygun TNT'leri kapalı uçlu TNT benzeri yapılardan ayırt edemez; Bu yöntem, TNT'lerin in vitro 2D hücre kültürünü düz bir substrat üzerinde tanımlamaya yardımcı olur. Bununla birlikte, yöntemin uygulanması ve çoğaltılması kolaydır ve sadece aktin bazlı TNT'lerin hassas bir şekilde ölçülmesi ve bunları nöritlerden ve β-tübülin pozitif TNT benzeri yapılardan ayırt etmek için yaygın olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: DMEM/F-12 ortamında kültürlenen SH-SY5Y hücreleri 7 gün boyunca 10 μM retinoik asit ile farklılaştırıldı ve 37 °C'de (% 5 CO2) 2 saat boyunca 1 μM oAβ oligomerleri ile muamele edildi. Tedaviden sonra, hücreler Karnovsky'nin fiksatif çözeltisi ile sabitlendi ve fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) antikoru ve F-aktin bağlayıcı faloidin ile çift immüno-boyandı. Daha sonra, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak konfokal z-stack görüntüleri alındı. TNT'ler manuel sayımla ölçüldü ve 3D hacim görünümü görüntüleri oluşturarak ve yapıları substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinme özelliklerinden tanımlayarak diğer nöritlerden / hücre çıkıntılarından ayırt edildi (Şekil 1).
1. Hücre kültürü ve farklılaşması
- DMEM/F12 (Ham's) media 1:1'deki SH-SY5Y nöronal hücrelerini, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin-neomisin karışımı (PSN) ile kültüre alın. Hücreleri, tabana tutturulmuş çanağın ortasındaki #1.5 kapak kaymasından oluşan 14 mm'lik bir kuyu ile 35 mm'lik bir görüntüleme kabına tohumlayın. Görüntüleme kabındaki hücreleri 12.000 hücre/ cm2 konsantrasyonda tohumlayın ve deneyleri% 60 -% 70 oranında gerçekleştirin.
- 10 μM retinoik asit (RA) içeren hücreleri 100 mM'lik bir stok çözeltisinden (15 mL dimetil sülfoksit [DMSO] içinde 5 mg RA) kısmen ayırt edin. Daha sonra, her 2 günde bir medya değişikliği ile farklılaşma için hücreleri 7 gün boyunca 37 ° C'de (% 5 CO2) inkübe edin.
NOT: Hücrelerin (hem farklılaşmamış hem de kısmen farklılaşmış hücreler) akıcılığını (% 60-% 70) korumaya dikkat edin. Hücre yoğunluğu, hücreler arasındaki TNT'lerin oluşumunu etkileyebilir.
2. Nöronal hücreleri tedavi etmek için amiloid β1-42 (oAβ) oligomerlerinin hazırlanması
- Aβ 1-42'yi (1 mg) 200 μL 1,1,1,3,3,3-hekzafloro-2-propanol içinde çözün ve çözeltiyi her biri 0.05 mg peptit içeren 20 alikot'a bölün. Alikotları liyofilize edin ve daha sonra kullanmak üzere -20 ° C'de saklayın.
- DMSO'daki liyofilize Aβ 1-42'nin stok çözeltisini (5 mM), 0.05 mg liyofilize peptide 2.2 μL DMSO ekleyerek hazırlayın. Peptitleri dikkatlice çözmek için, çözeltiyi vorteksleyin ve bir su banyosu sonikatöründe 2 dakika boyunca sonikat yapın.
- Peptitleri monomerlere dönüştürmek için stok çözeltisini DMEM, pH 7.4 ve vortekste 100 μM'lik bir konsantrasyona kadar seyreltin, ardından Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22 oligomerleri elde etmek için 24 saat boyunca 4 ° C'de inkübasyon yapın.
- Deneylerden önce oAβ'yı daha önce bildirildiği gibi21,22 transmisyon elektron mikroskobu görüntüleme ile karakterize edin.
- Kısmen farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerini 1 μM oAβ ile tedavi edin. Tedavilerden önce ortamı çıkarın ve taze FBS içermeyen DMEM ekleyin. Orta değişimden sonra, önceden hazırlanmış oAβ'yu (100 μM) ortama 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. hücreleri 37 ° C'de (% 5 CO 2) 2 saat boyunca 1 μM oAβ ile inkübeedin. Tedavi edilmemiş hücreler şeklinde negatif bir kontrol ekleyin.
3. TNT'lerin karakterizasyonu için F-aktin ve aktif-PAK1'in immün boyanması
- Fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) antikoru ve F-aktin bağlayıcı fallotoksin falloidin kullanarak diferansiyel immün boyama yapın.
- Sabitlemeden önce kontrol ve oAβ ile muamele edilmiş hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 x 2 dakika yıkayın. Karnovsky'nin fiksatif çözeltisini, 0.1 M fosfat tamponunda, pH 7.2'de çözünmüş% 2 formalin fiksatif ve% 2.5 glutaraldehit kullanarak hazırlayın. Ardından, Karnovsky'nin fiksatif çözeltisini (hücreleri örtmek için yeterli) oda sıcaklığında 45 dakika ekleyerek görüntüleme kabındaki hücreleri sabitleyin.
- Sabit hücreleri inkübasyon tamponu kullanarak 2 x 2 dakika yıkayın. Kuluçka tamponunu (20x) 0.1 g saponini 5 mL FBS'de çözerek hazırlayın ve 95 mL 1x PBS ekleyerek 1x'e seyreltin.
- Fiksasyondan sonra, ilk antikoru phopho-PAK1'e karşı inkübasyon tamponunda 1:250'lik bir seyreltmede ekleyin ve karanlık nemli bir odada 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- Ertesi gün, 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri inkübasyon tamponu ile 2 x 2 dakika yıkayın; daha sonra, Alexa Fluor 488 (1: 1.000 seyreltme) ve Phalloidin 555'e (1: 1.000 seyreltme) konjuge edilmiş ikincil antikor ekleyin. Karanlık nemli odadaki hücreleri oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, hücreleri inkübasyon tamponu ile 2 x 2 dakika yıkayın. 1:2.000 seyreltmeye 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyerek çekirdeği sabitleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika ila 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- DABCO montaj ortamını, %90 gliserol ve %10 1x PBS'de 25 mg DABCO kullanarak hazırlayın. Düzgün bir şekilde çözünmesi için, spektrofotometrik sınıf kullanarak pH'ı 8.6'ya ayarlayın, HCl'yi seyreltin (suyla 1:20 seyreltilmiş) ve çözeltiyi karıştırmak için bir rocker üzerinde tutun.
- Ağartma önleyici bir ajan olarak, DABCO montaj ortamını doğrudan alttaki kapak kaymasını içeren görüntüleme kabının üzerine ekleyin. En az 1-2 saat bekleyin ve doğrudan konfokal görüntüleme yapmaya devam edin.
NOT: Kapak kapaklarını sabitlemek için yapıştırıcı gerekmez.
4. TNT'leri nöritlerden ayırt etmek için F-aktin ve β-III tübülinin immün boyanması
- β-III tübülin antikoru ve F-aktin bağlayıcı fallotoksin faloidin ile diferansiyel immün boyama yapın.
- Karnovsky'nin fiksatif çözeltisini eklemeden önce oAβ ile muamele edilmiş hücreleri 1x PBS ile 2 kat yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin ve hücreleri 2 x 2 dakika inkübasyon tamponu ile yıkayın.
- Fiksasyondan sonra, β-III tübüline (TUBb3) karşı antikoru inkübasyon tamponunda 1:250'lik bir seyreltmede ekleyin ve karanlık nemli odada gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, hücreleri kuluçka tamponu (2 x 2 dakika) ile yıkayın ve Alexa Fluor 488 (1: 1.000 seyreltme) ve Phalloidin 555'e (1: 1.000 seyreltme) konjuge edilmiş ikincil antikoru aynı kaba ekleyin. Daha sonra, hücreleri karanlık nemli odada oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin.
- Hücreleri inkübasyon tamponu ile 2 kat yıkayın ve karanlıkta oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca 1:2.000 seyreltmede nükleer lekeli DAPI ekleyin.
- Yukarıda belirtildiği gibi montaj ortamına ağartma önleyici ajan DABCO ekleyin ve görüntülemeden önce 2 saat bekleyin.
5. Konfokal mikroskopi ile görüntüleme
- TNT'leri tanımlamak için, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak immünoboyalı hücrelerin z-yığın görüntülerini yakalayın. DAPI, floresein izotiyosiyanat (FITC) ve tetrametilrodamin (TRITC) filtre setleri ile 40x/1.40 Oil DIC objektifini kullanarak görüntüleri çekin.
- İlk olarak, konfokal yazılımdaki Track 1, Track 2 ve Track 3 pencerelerinde gerekli lazerleri sırayla tıklatarak kanalları seçin. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) görüntülerini floresan kanallarıyla çekmek için İzleme 1 penceresinin altındaki T-PMT seçeneğini tıklatın.
NOT: DIC görüntüleri, T-PMT olarak etiketlenmiş farklı bir dedektör tarafından yakalanır. - Yazılımın edinme sekmesini seçin, Z-yığını sekmesine tıklayın ve bir pencerenin açılmasını bekleyin. Ardından, çanağın altındaki hücreleri odaklamak için canlı tarama'yı tıklayın. Bu odaklanmış görüntüyü ilk yığın olarak seçin. Ardından, hücrenin en üst kısmını görmek için yukarı odaklanın ve bunu son yığın olarak seçin. Canlı taramayı durdurun ve yığınların adım boyutunu düzeltmek için en uygun sekmenin yanındaki sayıyı tıklatın. Adım boyutu, dilim sayısını ve hücrelerin kalınlığına bağlı olarak aralıkları belirler.
NOT: Adım boyutu, yeterli dilim almak ve iki yığın arasında boşluk olmadığından emin olmak için Nyquist örneklemesine göre seçilecektir. Nyquist örneklemesi, ışıkların amacı ve dalga boyları temelinde belirlenir23. - 405 nm, 488 nm ve 561 nm lazerlerle DAPI, FTC ve TRITC'nin üç kanalının sıralı görüntülerini alın ve 1,02 μs piksel bekleme süresiyle çekim yapın. Hücre sınırını gözlemlemek için floresan kanallı DIC kanalındaki görüntüleri yakalayın.
- x: 224,92 μm ve y: 224,92 μm boyutlarında, her piksel 220 nm 2 boyutunda ve z ölçeklendirmesi 415 nm olan bir görüntü yığını yakalayın.
- Hücrelerin altından üstüne kadar birkaç z-yığını (15-22 yığın) yakalayan görüntüler çekin. Toplam ~ 200-300 hücre elde etmek için kültür çanağının rastgele alanından en az 10 görüntü elde edin.
- TNT'leri 3B hacim görünümü analizi ile tanımlamak için yakalanan görüntüleri çevrimdışı olarak analiz edin
6. TNT'leri tanımlamak ve ölçmek için konfokal z-yığını görüntülerinin analizi
- Analiz için Fiji yazılımında .czi veri biçiminde kaydedilmiş konfokal görüntüleri açın.
- Görüntünün her z-yığınını ve kanalını görmek için Hyperstack seçeneğini belirleyin. Şekil 2'de gösterildiği gibi tek bir pencerede açılan z yığınlarının ve kanallarının hiperyığınlarını arayın. Belirli bir ilgi alanı kanalının tam yığınını seçmek için kanalı (kırmızı ve yeşil oklarla gösterilir) ve z-yığınını (mavi oklarla gösterilir) kaydırma çubuklarını kaydırın.
NOT: Sabit hücrelerde, havada asılı duran TNT'ler veya membran kanalları yüzeyin üzerinde kaldığından, yapılar z-yığınlarının alt kısımlarında görünmez. Bununla birlikte, sabit hücrelerde, nöritler yüzeyde bulunur ve z-yığınlarının alt kısımlarında tespit edilebilir (z = 0 ila 2). Tanımlama adımları için Şekil 2'ye bakın. - Şekil 2'de gösterildiği gibi, önce kanal çubuğunu kaydırarak F-aktin lekeli kanalı (kırmızı oklarla gösterilir) seçin. Ardından, her bir yığını tek tek görmek için z yığınlarını (mavi oklarla gösterilir) manuel olarak kaydırın. Hücreleri birbirine bağlıyor gibi görünen, z-yığınlarının alt kısımlarında görülebilen ve görüntüleme kabının yüzeyine yakın olan (z = 2) F-aktin lekeli yapıları nöritler olarak tanımlayın (beyaz oklarla gösterilir).
NOT: Nöritlerin çoğunluğunun, uzatılmış çıkıntılar (pembe oklarla gösterilir) olarak göründükleri için tanımlanması kolaydır. - TNT'leri, F-aktin pozitif, hücreden hücreye gezinen kanalları, z-yığınlarını üste doğru kaydırarak tanımlayın (Şekil 2'de z = 4'ten; sarı oklarla gösterilir). Z-yığınlarının alt kısımlarının yakınında yüzeye doğru nöritleri arayın ve z-yığınlarının üste doğru kaydırılmasıyla kaybolmaya başladıklarını gözlemleyin (Şekil 2'de z = 6'da; nöritler açıkça görülemez).
- Fosfo-PAK1-pozitif TNT'leri, z-yığınlarından gelen kanalların gezinen doğasını analiz ederek F-aktin-pozitif TNT'lere benzer şekilde tanımlayın. Fosfo-PAK1 boyaması F-aktin boyamasından daha zayıf olduğundan, z = 4 (hafif görünür) ve z = 6'da (belirgin) phopho-PAK1 boyalı TNT'leri arayın.
- Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 boyalı TNT yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları olduğunu doğrulamak için DIC görüntülerini gözlemleyin (Şekil 3). Ek olarak, tanımlanan TNT'lerin F-aktin ve fosfo-PAK1 birlikte boyanmış yapılar olduğunu doğrulamak için F-aktin (kırmızı) ve fosfo-PAK1 (yeşil) kanallarını birleştirin (Şekil 3).
- TNT'leri ölçmek için, toplam hücre sayılarını ve tanımlanan TNT'leri manuel olarak sayın ve sayıları yüzde olarak temsil edin.
- F-aktin pozitif TNT'leri ve β-III tübülin (TUBb3)-pozitif, TNT benzeri gezinme kanallarını z-yığın görüntülerden ayırt etmek için, F-aktin (kırmızı) ve TUBb3 (yeşil) kanallarını birleştirin (Şekil 4). Ardından, birleştirilen görüntülerin z yığınlarını analiz edin.
- Sadece z = 3'te hafifçe görülebilen ve z = 6 ve z = 9'da belirgin olan F-aktin lekeli TNT'leri arayın (sarı oklar). Benzer şekilde, F-aktin ve β-III tübülini (TUBb3) çift pozitif, TNT benzeri gezinme kanallarını z = 6 ve z = 9'da (camgöbeği okları) tanımlayın. Diğer F-aktin ve β-III tübülin lekeli, z-yığınlarının alt kısımlarından (beyaz oklar) gezinmeyen çıkıntıları tanımlayın.
- Fiji'deki hat aracını kullanarak TNT'lerin çapını ölçün. Analiz et'i tıklayarak ölçüm ölçeğini doğrulayın | Ölçek'i , .czi görüntülerinden "piksel cinsinden uzaklık" otomatik olarak ayarlanacak şekilde ayarlayın. TNT'lerin çaplarını xy düzleminde ölçün.
NOT: Çapların çoğu 1 piksel ile 4 piksel arasındadır (yani, 220-880 nm); her piksel 220 nm'dir. Z-yığını konfokal görüntülerin analizine yönelik protokolün bir özeti için Şekil 5'e bakın.
7.3D TNT'leri karakterize etmek için z-yığın görüntülerin yeniden yapılandırılması
- Fiji'de, 3B yeniden kaydetme ve eşik özellikli 3B görselleştirmeye izin veren birim görüntüleyici eklentisini kullanın (Şekil 6).
- Z-stack görüntülerini tek tek kanallara bölün. Ardından, tek kanallı (F-aktin kanalı) z-stack görüntülerini kırparak bir seferde bir veya iki TNT veya nörit vurgulamak üzere 3B yeniden yapılandırma görünümünü kullanın. xy, yz ve xz görünümlerini görselleştirmek için birim görünümü eklentisini etkinleştirin.
- xy düzlemine tek bir TNT veya nörit sabitleyin (beyaz oklar Şekil 6A'daki nöritleri temsil eder; sarı oklar Şekil 6B'deki TNT'leri temsil eder) ve xz (kırmızı) ve yz (yeşil) eksen kesitlerini işaretleyin. xz ve yz düzlemlerindeki xz düzleminin altındaki nöritleri (beyaz oklar, Şekil 6A) ve üst z-yığınlarındaki TNT'leri (sarı oklar, Şekil 6B) gözlemleyin.
- xz düzleminde 3B hacim görünümünü yeniden yapılandırmak için tek tek TNT veya nörit seçin (Şekil 6C, D). 3B rekonstrüksiyonunda, z-düzleminin altındaki nöritleri (beyaz oklar, Şekil 6C) ve TNT'lerin alt z-düzlemine dokunmadan iki hücreyi birbirine bağlayan gezinen yapılar olarak göründüğünü gözlemleyin (sarı oklar, Şekil 6D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, SH-SY5Y nöronal hücrelerinde oAβ kaynaklı TNT'leri, konfokal z-yığın görüntülerinden 3D hacim görünümleri oluşturarak tanımlamakta ve karakterize ediyoruz (Şekil 1). Hücreler F-aktin ve fosfo-PAK1 ile çift immün boyandı. İmmünoboyalı hücrelerin konfokal z-stack görüntüleri TNT'leri tanımlamak için analiz edildi (Şekil 2). Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 boyalı TNT yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları olduğunu doğrulamak için DIC görüntüleri analiz edildi (Şekil 3). Ayrıca, hücreler F-aktin ve β-III tübülin ile çift immün boyandı (Şekil 4). TNT benzeri F-aktin ve β-III tübülin çift pozitif membran kanalları sadece F-aktin pozitif TNT'lerden ayırt edildi (Şekil 4). Fosfo-PAK1 (veya aktive PAK1) ve F-aktin ile birlikte eksprese edilen TNT'ler, substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinme özelliklerine dayanarak 3D hacim görünümü görüntüleri oluşturarak diğer nöritlerden / hücre çıkıntılarından ayırt edildi (Şekil 6). Tanımlanan TNT'ler manuel olarak tespit edildi ve TNT'lerin yüzdesi tam olarak 3D hacim görünümü görüntülerinden hesaplandı. TNT'lerin çapı ve uzunluğu, bireysel olarak tanımlanan TNT'lerin analiz edilmesiyle de belirlendi.
Şekil 1: TNT'lerin tespit yönteminin protokol özetini temsil eden şematik diyagram. Mikroskopi görüntüleri için ölçek çubuğu = 100 μm (üstte); 10 μm (3B hacim görünümleri). Kısaltmalar: oAβ = oligomerik amiloid-β1-42; PAK1 = p21 ile aktive edilmiş kinaz-1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TNT'leri tanımlamak ve ölçmek için konfokal z-yığını görüntülerinin analizi. Konfokal z-stack görüntüleri Fiji yazılımında analiz edildi. (A) F-aktin ve (B) fosfo-PAK1'i gösteren tek bir pencerede açılan z-yığınlarının ve kanalların hiperyığınları. Kanal (kırmızı ve yeşil oklarla gösterilir) ve z-stack (mavi oklarla gösterilir) kaydırma çubukları kaydırılarak, belirli bir ilgili kanalın bireysel yığınları analiz edildi. (A) Z-yığınlarının alt kısımlarında görülebilen ve görüntü çanağının yüzeyine yakın olduğu düşünülen hücreleri birbirine bağlayan F-aktin lekeli yapılar (z = 2) nöritler (beyaz oklarla gösterilir) olarak tanımlanmıştır. Buna karşılık, z-yığınlarının daha yüksek kısımlarında görülebilen hücreden hücreye bağlı kanallar TNT'ler olarak tanımlandı (sarı oklarla gösterilir). (B) Benzer şekilde, fosfo-PAK1 boyalı nöritler ve TNT'ler tanımlandı. Komşu hücrelere bağlı olmayan diğer F-aktin-pozitif kısa çıkıntılar pembe oklarla gösterilir. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: TNT = nanotüplerin tünellenmesi; PAK1 = p21 ile aktive edilmiş kinaz-1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: TNT'leri doğrulamak için DIC görüntülerinin analizi. (A) F-aktin ve fosfo-PAK1 boyalı TNT'lerin ve nörit çıkıntılarının gerçekten membran kanalları olduğunu doğrulamak için DIC görüntüleri gözlendi. (B) Ek olarak, F-aktin (kırmızı) ve fosfo-PAK1 (yeşil) kanalları, tanımlanan, oAβ kaynaklı TNT'lerin F-aktin ve fosfo-PAK1 birlikte boyanmış yapılar olduğunu doğrulamak için birleştirildi. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: TNT = nanotüplerin tünellenmesi; DIC = diferansiyel girişim kontrastı; PAK1 = p21 ile aktive edilmiş kinaz-1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Konfokal z-yığın görüntüleri, yalnızca F-aktin boyalı TNT'leri β-III tübülin ve F-aktin çift lekeli, TNT benzeri gezinme kanallarından ayırt etmek için Fiji yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. İlk olarak, hiperyığınların F-aktin (kırmızı) ve TUBb3 (yeşil) kanalları birleştirildi. Ardından, birleştirilen görüntüler tek bir pencerede açıldı. Z-stack kaydırma çubukları kaydırılarak, F-aktin lekeli TNT'ler özel olarak tanımlandı; bunlar z = 3'te hafifçe görülebiliyor ve z = 6 ve z = 9'da belirgindi (sarı oklar, B). Benzer şekilde, F-aktin ve TUBb3 çift pozitif, TNT benzeri gezinme kanalları z = 6 ve z = 9'da (camgöbeği okları, A) tespit edilebildi. Diğer F-aktin ve β-III tübülin lekeli, havada asılı durmayan çıkıntılar, z-yığınlarının alt kısımlarından (beyaz oklar) tespit edildi. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: TNT'ler = nanotüpleri tünelleme; TUBb3 = β-III tübülin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Z-yığını konfokal görüntülerin analizi için ayrıntılı protokolü temsil eden şematik özet. Kısaltma: TNT'ler = nanotüpleri tünelleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bir seferde bir veya iki TNT veya nörit vurgulamak için 3D rekonstrüksiyon görünümü. Fiji'deki "hacim görünümü" eklentisi, xy, yz ve xz görünümlerini görselleştirmek için kullanılır. 3D rekonstrüksiyon, z-düzleminin dibinde yatan nöriti (A ve C panellerindeki beyaz oklar) gösterirken, TNT'ler alt z-düzlemine dokunmadan iki hücreyi birbirine bağlayan gezinen yapılar olarak görünür (B ve D panellerinde sarı ok). Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltma: TNT'ler = nanotüpleri tünelleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son 2 yılda birçok araştırmacı TNT'lerin yapısını anlamaya ve karakterize etmeye çalışıyor18. Spesifik belirteçlerin eksikliği ilerlemeyi engeller ve TNT'leri tanımlamak, karakterize etmek ve ölçmek için kullanılabilecek uygun, standartlaştırılmış bir yönteme olan talep artmaktadır. TNT'ler, iki hücre arasında gezinen F-aktin bazlı membran kanalları olarak tanımlanır. Çalışmalar, β-tübülin-pozitif, yakın uçlu, gelişmekte olan nöritlerin iki uzak hücre arasında gezindiğini ve TNT benzeri yapılara benzediğini göstermiştir12,13. Bu nedenle, TNT'ler sadece aktin ve iki uzak hücre arasında gezinen membran kanalları oldukları için pozitifliklerine dayanarak nöritlerden ve diğer TNT benzeri yapılardan tanımlanır ve ayırt edilir. Araştırmacılar genelliklegörüntüleme 24'ten önce fiksasyon sırasında sağlam TNT yapıları elde etmeyi zor bulmaktadır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, bu protokolde kullanılan SH-SY5Y nöronal hücrelerini sabitlemek için% 2.5 glutaraldehit (Karnovsky'nin fiksatifi) ile modifiye edilmiş bir fiksatif çözelti kullandık25.
Her immünohistokimya / immünositokimya deneyinin kritik bir adımı, uygun fiksatif ajanın seçimine dayanan numunenin fiksasyonudur. Numunenin kusurlu fiksasyonu, hedef proteinlerin hızlı proteolitik bozunmasına ve spesifik immünoreaktivitede bir azalmaya yol açabilir. Aşırı fiksasyon, epitopun maskelenmesine ve spesifik olmayan arka planın neden olduğu spesifik etiketlemede belirsizliğe neden olur. Yöntem, zamanlama veya süre, sıcaklık ve pH da hücrelerin uygun şekilde sabitlenmesini etkiler26.
Paraformaldehit, hücrelerin immünoboyamasında fiksatif bir ajan olarak yaygın olarak kullanılır. Paraformaldehitin fiksatif bir ajan olarak kullanılmasının dezavantajları, antijenite kaybını ve morfolojideki değişiklikleri içerir. Glutaraldehit daha düşük bir ozmotik basınca sahiptir, çözeltide daha kararlıdır ve kolayca çapraz bağlanır, böylece daha iyi sonuçlar verir27. Formaldehit-glutaraldehit (fosfat tamponunda) fiksatif kombinasyonu, çok çeşitli doku / hücre örneklerinin olağanüstü fiksasyonuyla sonuçlanır. Bu kombinasyon, hücrenin ultrayapısının formaldehit ile hızlı bir şekilde stabilize edilmesini ve ardından glutaraldehit28'in daha yavaş nüfuz edici etkisiyle kalıcı bir fiksasyona izin verir.
F-aktin ve fosfo-PAK1 için pozitif olan TNT'ler, düz bir substratum üzerinde in vitro 2D hücre kültüründe iki hücre arasında gezinme özelliklerine dayanarak nöritlerden ayırt edilir. Tanımlanan TNT'ler 3D hacim görünümü analizi ile manuel olarak tespit edildi ve oluşturulan TNT'lerin yüzdeleri manuel sayım ile hesaplandı. Manuel yöntem, muazzam insan gücü gerektirdiği için büyük miktarda verinin nicelleştirilmesini zorlaştırır19. Bununla birlikte, eğitimli gözler TNT'leri verimli bir şekilde tespit edebilir ve onları otomatik algılama yöntemlerinden daha iyi bir hassasiyetle nöritlerden ayırt edebilir. Mevcut otomatik algılama yöntemlerinin, bir algoritma geliştirmek ve/veya deney düzeni için gerekli olan mevcut algoritmayı değiştirmek için mevcut uzmanlık olmadan her laboratuvarda uygulanması da zordur. Manuel 3D hacim görünümü analiz yöntemi, nöritler ve TNT'ler arasında net bir şekilde ayrım yapmak için z-yığınlarının alt kısımlarındaki hücreler ile z-yığınlarının orta ve üst kısımlarında gezinen hücreler arasında yatan membran yapılarını tanımlamayı kolaylaştırır.
TNT'ler, nöritler veya tümör mikrotüpleri gibi diğer membran çıkıntılarından ayırt edilebilir. Bununla birlikte, açık uçlu ve yakın uçlu, nano boyutlu, çap membranlı tüpler arasında ayrım yapmak zordur, bu da aşağıdaki soruyu gündeme getirir: TNT'ler mi yoksa TNT benzeri yapılar mı? Son on yıldan bu yana, TNT'lerin patolojinin, kanser direncinin ve tedavinin yayılmasındaki kaçınılmaz rolünü göstermek için çok miktarda veri toplanmıştır17. Bu nedenle, araştırmacılar doğrudan, uzun mesafeli hücreler arası iletişim alanını değiştirecek belirli üreticilerin gelişimini arıyorlar. O zamana kadar, tekrarlanabilir görüntüleme karakterizasyon yöntemleri, sahada sürekli ilerlemenin önünü açmak için yüksek talep görmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
D.K.V ve A.R, TMA Pai bursu için Manipal Yüksek Öğretim Akademisi'ne teşekkür eder. SERB-SRG için Hindistan Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu'na (#SRG/2021/001315) ve Hindistan Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi'ne (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) ve Manipal Yüksek Öğretim Akademisi, Manipal, Hindistan'ın Intramural fonuna teşekkür ederiz. JNCASR'nin (Jawaharlal Nehru İleri Bilimsel Araştırma Merkezi, Hindistan) konfokal tesisine ve B. Suma'ya JNCASR'deki konfokal mikroskopi için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
- Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
- Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
- Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
- Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
- Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
- Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
- Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
- Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
- Zurzolo, C.
- Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
- Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
- Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
- Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
- Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
- Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
- Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
- Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
- Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
- Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
- Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
- Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
- Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
- Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).
