Summary
Tunneling nanorør (TNTs) er primært åpne F-aktin membran nanorør som forbinder naboceller, noe som letter intercellulær kommunikasjon. Den bemerkelsesverdige egenskapen som skiller TNT fra andre cellefremspring er den svevende naturen til nanorørene mellom celler. Her karakteriserer vi TNT-er ved å konstruere en 3D-volumvisning av konfokale z-stack-bilder.
Abstract
Nylige funn har avslørt at celler utfører direkte, langdistanse, intercellulær overføring via nanoskala, aktinmembranledninger, nemlig "tunneling nanorør" (TNTs). TNT er definert som åpne, lipid dobbeltlagsomkransede membranutvidelser som formidler kontinuitet mellom naboceller med diametre mellom 50 nm og 1 μm. TNT ble først demonstrert i nevronceller, men suksessive studier har avslørt eksistensen av TNT i flere celletyper og sykdommer, som nevrodegenerative sykdommer, virusinfeksjoner og kreft. Flere studier har referert til nære, elektrisk koblede membrannanostrukturer mellom naboceller som TNT eller TNT-lignende strukturer.
Belysning av ultrastruktur i form av membrankontinuitet ved endepunktet er teknisk utfordrende. I tillegg er studier på celle-cellekommunikasjon utfordrende når det gjelder karakterisering av TNT ved bruk av konvensjonelle metoder på grunn av mangel på spesifikke markører. TNT er primært definert som F-aktinbaserte, åpne membranfremspring. En stor begrensning er imidlertid at F-aktin er tilstede i alle typer fremspring, noe som gjør det utfordrende å skille TNT fra andre fremspring. En av de bemerkelsesverdige egenskapene til F-aktinbaserte TNT-er er at disse strukturene svever mellom to celler uten å berøre substratumet. Derfor kan distinkte F-aktinfargede TNT-er enkelt skilles fra andre fremspring som filopodi og nevritter basert på at de svever mellom celler.
Vi har nylig vist at internalisering av oligomer amyloid-β 1-42 (oAβ) via aktinavhengig endocytose stimulerer aktivert p21-aktivert kinase-1 (PAK1), som medierer dannelsen av F-aktinholdige TNTer coexpressed med fosfo-PAK1 mellomSH-SY5Y nevronceller. Denne protokollen skisserer en 3D-volumanalysemetode for å identifisere og karakterisere TNT-er fra de fangede z-stack-bildene av F-aktin- og fosfo-PAK1-immunstained membranfremspring i oAβ-behandlede nevronceller. Videre skiller TNTer seg fra å utvikle nevritter og nevronale utvekster basert på F-aktin- og β-III tubulinimmunostained membranledninger.
Introduction
Tunneling nanorør (TNTs) er F-aktinbaserte, primært åpne membranledninger og spiller en viktig rolle i intercellulær overføring av last og organeller1. Den unike egenskapen til TNT-er er at de forbinder naboceller uten kontakt med substratumet; De er over 10-300 μm lange og diametrene varierer mellom 50 nm og 1 μm 2,3. TNT er forbigående strukturer, og deres levetid varer mellom noen få minutter til flere timer. TNT ble først vist i PC12 nevronceller1; Senere viste mange studier deres eksistens i flere celletyper in vitro og in vivo 4,5. Flere studier har avdekket den patologiske betydningen av TNT i ulike sykdomsmodeller, som nevrodegenerative sykdommer, kreft og virusinfeksjoner 6,7,8.
De strukturelle heterogenitetene til TNT har blitt demonstrert av flere studier i ulike cellulære systemer9. Forskjellene er basert på cytoskelettsammensetning, dannelsesmekanismen og lasttypene som overføres10. Primært anses den åpne, F-aktinpositive membrankontinuiteten som svinger mellom to naboceller og overføringsorganeller å bestå av TNTs11. Mangelen på klarhet eller mangfold observert i dannelsen av TNT legger imidlertid til vanskeligheten med å utvikle TNT-spesifikke markører. Dermed er det vanskelig å identifisere TNT-strukturer ved konvensjonelle deteksjonsmetoder og skille membrannanorør når det gjelder åpne og lukkede fremspring12. Imidlertid er karakteristikken for TNT-er å sveve som F-aktinmembranfremspring mellom to celler relativt enklere og mer gjennomførbart å identifisere ved hjelp av konvensjonelle bildebehandlingsteknikker. Andre aktinbaserte cellulære fremspring som filopodi og dorsal filopodi kan ikke sveve mellom to fjerne celler, spesielt når celler er faste. Merk at nært, elektrisk koblet, utviklende nevritter ofte kalles TNT-lignende strukturer13.
Det er kjent at F-aktin spiller en viktig rolle i TNT-dannelsen, og flere studier har vist at F-aktinhemmeren cytochalasin D hemmer dannelsen av TNT14,15. Hemmere av mikrotubuli har derimot ingen effekt på TNT-dannelse16. De siste 2 tiårene har sett flere rapporter om den betydelige rollen som TNT spiller i spredning av patologi og tumorresistens og terapi17. Derfor er det en uendelig etterspørsel etter bedre teknikker for TNT-karakterisering.
Mangelen på spesifikke markører for TNT og mangfoldet i morfologi og cytoskeletal sammensetning gjør det vanskelig å utvikle en unik karakteriseringsmetode. Noen studier har brukt automatisert bildedeteksjon og TNT-kvantifiseringsteknikker18,19. Det er imidlertid flere fordeler med den nåværende manuelle 3D-volumanalysemetoden fremfor automatisk bildeanalyse for deteksjon og kvantifisering av TNT-er. Ofte kan trente menneskelige øyne oppdage disse svevende nanostrukturene lettere enn en automatisert bildedeteksjonsmetode. Videre kan automatiske deteksjonsmetoder være vanskelige å implementere i laboratorier som mangler algoritmekompetanse. Den nåværende metoden kan bli allment vedtatt av forskere på grunn av sin presisjon og reproduserbarhet.
I en nylig studie viste vi at oAβ fremmer biogenesen av TNT i nevronceller via en PAK1-mediert, aktinavhengig endocytosemekanisme12. oAβ-induserte TNTer uttrykker også aktivert PAK1 (eller fosfo-PAK1). Vi utviklet en 3D-volumvisningsbilde-rekonstruksjonsmetode for å skille mellom oAβ-induserte, F-aktin- og fosfo-PAK1-immunstained TNTs. β-III tubulin-positive, utviklende neuritter ligner ofte TNT-lignende svevende strukturer20. Derfor skilte vi videre F-aktinbaserte TNTer fra β-III tubulin-positive nevritter og andre TNT-lignende fremspring. 3D-volumvisningsbilder har blitt brukt til å identifisere TNT-er på grunnlag av deres egenskaper ved å sveve over underlaget og holde kontakten mellom to naboceller. Dette papiret beskriver identifisering og deteksjon av aktinholdige membranrør eller TNT-er ved hjelp av konfokale z-stack-bilder og til slutt manuell kvantifisering av de identifiserte strukturene fra rekonstruksjonsbilder av 3D-volumvisning. Den presenterte metoden kan ikke skille åpne riktige TNT-er fra nære TNT-lignende strukturer; denne metoden bidrar til å identifisere TNT i in vitro 2D-cellekultur på et flatt substratum. Metoden er imidlertid enkel å implementere og reprodusere og kan brukes mye til presis kvantifisering av bare aktinbaserte TNT-er og for å skille dem fra nevritter og β-tubulinpositive TNT-lignende strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: SH-SY5Y-celler dyrket i DMEM/F-12-medier ble differensiert med 10 μM retinsyre i 7 dager og behandlet med 1 μM oAβ oligomerer i 2 timer ved 37 °C (5 % CO2). Etter behandling ble cellene fiksert med Karnovskys fiksative løsning og dobbeltimmunstainert med fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) antistoff og F-aktinbindende phalloidin. Senere ble konfokale z-stack-bilder tatt ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop. TNT-ene ble kvantifisert ved manuell telling og skilt fra andre nevritter/cellefremspring ved å konstruere 3D-volumvisningsbilder og identifisere strukturene fra deres karakteristikk av å sveve mellom to celler uten å berøre underlaget (figur 1).
1. Cellekultur og differensiering
- Kultur SH-SY5Y nevronceller i DMEM / F12 (Ham's) media 1: 1 med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin-neomycin blanding (PSN). Frø cellene i en 35 mm bildebehandlingsfat med en 14 mm brønn som består av en # 1.5 coverslip i midten av parabolen festet til bunnen. Frø cellene på bildeparabolen i en konsentrasjon på 12.000 celler / cm2 og utfør forsøkene ved 60% -70% sammenløp.
- Delvis skille cellene med 10 μM retinsyre (RA) fra en 100 mM stamløsning (5 mg RA i 15 ml dimetylsulfoksid [DMSO]). Inkuber deretter cellene i 7 dager ved 37 ° C (5% CO 2) for differensiering med medieendring hver2.
MERK: Vær forsiktig med å opprettholde sammenløpet (60% -70%) av cellene (både utifferentierte og delvis differensierte celler). Celletetthet kan påvirke dannelsen av TNT mellom cellene.
2. Fremstilling av oligomerer av amyloid-β1-42 (oAβ) for å behandle nevronceller
- Oppløs Aβ 1-42 (1 mg) i 200 μL på 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol og del oppløsningen i 20 aliquots, hver inneholdende 0,05 mg peptider. Lyofiliser og oppbevar aliquotene ved -20 °C for senere bruk.
- Forbered stamløsningen (5 mM) av lyofilisert Aβ 1-42 i DMSO ved å tilsette 2,2 μL DMSO til 0,05 mg lyofilisert peptid. For å forsiktig oppløse peptidene, vortex løsningen og sonicat i 2 minutter i et vannbad sonicator.
- Fortynn stamløsningen til en konsentrasjon på 100 μM i DMEM, pH 7,4 og virvel for å omdanne peptidene til monomerer, etterfulgt av inkubasjon ved 4 °C i 24 timer for å oppnå oligomerer av Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.
- Karakteriser oAβ før forsøkene som rapportert tidligere21,22 ved transmisjonselektronmikroskopiavbildning.
- Behandle de delvis differensierte SH-SY5Y-cellene med 1 μM oAβ. Fjern mediet før behandlingene, og legg til fersk FBS-fri DMEM. Etter mediumendringen, tilsett tidligere tilberedt oAβ (100 μM) til mediet til en endelig konsentrasjon på 1 μM. Inkuber cellene med 1 μM oAβ i 2 timer ved 37 ° C (5% CO2). Inkluder en negativ kontroll i form av ubehandlede celler.
3. Immunostaining av F-aktin og aktivert-PAK1 for karakterisering av TNT
- Utfør differensialimmunfarging ved bruk av fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) antistoff og F-aktinbindende phallotoksin phalloidin.
- Vask kontroll- og oAβ-behandlede celler med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i 2 x 2 minutter før fiksering. Forbered Karnovskys fikseringsløsning ved å bruke 2% formalinfikseringsmiddel og 2,5% glutaraldehyd oppløst i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,2. Deretter fikser du cellene i bildeparabolen ved å legge til Karnovskys fikseringsløsning (akkurat nok til å dekke cellene) i 45 minutter ved romtemperatur.
- Vask de faste cellene 2 x 2 min ved hjelp av inkubasjonsbuffer. Forbered inkubasjonsbufferen (20x) ved å oppløse 0,1 g saponin i 5 ml FBS og fortynn til 1x ved å tilsette 95 ml 1x PBS.
- Etter fiksering, tilsett det første antistoffet mot pho-PAK1 ved en fortynning på 1:250 i inkubasjonsbufferen og inkuber over natten ved 4 °C i et mørkt fuktig kammer.
- Neste dag, etter 24 timers inkubasjon, vask cellene 2 x 2 minutter med inkubasjonsbufferen; Deretter legger du til sekundært antistoff konjugert til Alexa Fluor 488 (1: 1,000 fortynning) og Phalloidin 555 (1: 1,000 fortynning). Inkuber cellene i det mørke fuktige kammeret i 1,5 time ved romtemperatur.
- Etter inkubasjonen, vask cellene 2 x 2 min med inkubasjonsbuffer. Flekk kjernen ved å tilsette 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i en fortynning på 1:2,000 og ruge i 5 minutter til 10 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Forbered DABCO monteringsmedium ved bruk av 25 mg DABCO i 90% glyserol og 10% 1x PBS. For å oppløses riktig, juster pH til 8,6 ved hjelp av spektrofotometrisk kvalitet, fortynn HCl (fortynnet 1:20 med vann) og hold løsningen på en rocker for blanding.
- Som et antiblekingsmiddel, tilsett DABCO-monteringsmediet direkte på bildebehandlingsfatet som inneholder dekselet nederst. Vent i minst 1-2 timer og fortsett direkte å utføre konfokal bildebehandling.
MERK: Ingen lim er nødvendig for å fikse dekslene.
4. Immunostaining av F-aktin og β-III tubulin for å skille TNT fra neuritter
- Utfør differensialimmunfarging med β-III tubulinantistoff og F-aktinbindende phallotoxin phalloidin.
- Vask de oAβ-behandlede cellene 2x med 1x PBS før du legger til Karnovskys fikseringsløsning. Inkuber cellene i 45 minutter ved romtemperatur og vask cellene 2 x 2 min med inkubasjonsbuffer.
- Etter fiksering tilsettes antistoffet mot β-III tubulin (TUBb3) ved en fortynning på 1:250 i inkubasjonsbufferen og inkuberer ved 4 °C over natten i det mørke fuktige kammeret.
- Neste dag, vask cellene med inkubasjonsbuffer (2 x 2 min), og tilsett sekundært antistoff konjugert til Alexa Fluor 488 (1: 1,000 fortynning) og Phalloidin 555 (1: 1,000 fortynning) sammen til samme tallerken. Deretter inkuberer cellene i 1,5 timer ved romtemperatur i det mørke fuktige kammeret.
- Vask cellene 2x med inkubasjonsbuffer, og tilsett kjernefysisk farging DAPI i en 1: 2000 fortynning i 5-10 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Tilsett antiblekemiddel DABCO i monteringsmedium som nevnt ovenfor og vent i 2 timer før avbildning.
5. Avbildning med konfokal mikroskopi
- For å identifisere TNT-er, ta z-stack-bilder av immunostained celler ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop. Ta bildene ved hjelp av 40x/1.40 Oil DIC-objektiv med DAPI, fluoresceinisotiocyanat (FITC) og tetrametylrhodamin (TRITC) filtersett.
- Velg først kanalene ved å klikke på de nødvendige laserne sekvensielt i vinduene Spor 1, Spor 2 og Spor 3 i den konfokale programvaren. Klikk på alternativet T-PMT under Spor 1-vinduet for å ta bildene med differensiell interferenskontrast (DIC) med fluorescenskanaler.
MERK: DIC-bilder fanges av en annen detektor merket som T-PMT. - Velg anskaffelsesfanen til programvaren, klikk på Z-stack-fanen og vent til et vindu åpnes. Klikk deretter på live scan for å fokusere cellene nederst på parabolen. Velg det fokuserte bildet som den første stakken. Fokuser deretter opp for å se den øverste delen av cellen, og velg den som den siste stakken. Stopp live skanning og klikk på nummeret ved siden av den optimale fanen for å fikse trinnstørrelsen på stablene. Trinnstørrelse bestemmer antall skiver og intervaller basert på tykkelsen på cellene.
MERK: Trinnstørrelse vil bli valgt basert på Nyquist-prøvetaking for å ta nok skiver og sikre at det ikke er hull mellom de to stablene. Nyquist-prøvetaking bestemmes ut fra målet og bølgelengdene til lysene23. - Ta sekvensielle bilder av tre kanaler med DAPI-, FITC- og TRITC med lasere på 405 nm, 488 nm og 561 nm , og ta opp med en pikseloppholdstid på 1,02 μs. Ta bilder i DIC-kanalen med fluorescenskanaler for å observere cellegrensen.
- Ta en stabel med bilder med dimensjonene x: 224,92 μm og y: 224,92 μm, med hver piksel på 220 nm 2 størrelse og z-skalering på 415 nm.
- Ta bilder som tar flere z-stabler (15–22 stakker) fra bunnen til toppen av cellene. Skaff minst 10 bilder fra det tilfeldige feltet av kulturskålen for å få totalt ~ 200-300 celler.
- Analyser de fangede bildene offline for å identifisere TNT-ene ved hjelp av 3D-volumvisningsanalyse
6. Analyse av konfokale z-stack-bilder for å identifisere og kvantifisere TNT-er
- Åpne de konfokale bildene som er lagret i .czi-dataformat i Fiji-programvare for analyse.
- Velg Hyperstack-alternativet for å se hver z-stack og kanal i bildet. Se etter hyperstackene til z-stablene og kanalene, som åpnes i ett enkelt vindu som vist i figur 2. Bla i rullefeltene kanalen (angitt med røde og grønne piler) og z-stack (angitt med blå piler) for å velge den nøyaktige stakken for en bestemt kanal av interesse.
MERK: I faste celler, da de svevende TNT-ene eller membranrørene holder seg over overflaten, er strukturene ikke synlige i de nedre delene av z-stablene. I faste celler ligger imidlertid nevritter på overflaten og kan påvises i de nedre delene av z-stablene (z = 0 til 2). Se figur 2 for identifikasjonstrinnene. - Som vist i figur 2, velg først den F-aktinfargede kanalen (indikert med røde piler) ved å rulle kanallinjen. Bla deretter manuelt z-stablene (angitt med blå piler) for å se hver stabel en etter en. Identifiser de F-aktinfargede strukturene som ser ut til å forbinde celler, er synlige i de nedre delene av z-stablene, og er nær overflaten av bildeparabolen (z = 2) som nevritter (indikert med hvite piler).
MERK: De fleste nevrittene er enkle å identifisere da de ser ut som utvidede fremspring (indikert med rosa piler). - Identifiser TNT-ene, de F-aktinpositive, svevende celle-til-celle-kanalene, ved å rulle z-stablene mot toppen (fra z = 4 i figur 2; indikert med gule piler). Se etter nevritter nær de nedre delene av z-stablene mot overflaten og observer at de begynner å forsvinne med rulling av z-stabler mot toppen (ved z = 6 i figur 2; nevritter er ikke godt synlige).
- Identifiser fosfo-PAK1-positive TNT-er på samme måte som F-aktin-positive TNT-er ved å analysere den svevende naturen til ledningene fra z-stablene. Siden fosfo-PAK1-farging er svakere enn F-aktinfarging, se etter pho-PAK1-farget TNT ved z = 4 (svakt synlig) og ved z = 6 (fremtredende).
- Videre observerer du DIC-bildene for å verifisere at F-aktin- og fosfo-PAK1-fargede TNT-strukturer er membrankanaler mellom celler (figur 3). I tillegg slår du sammen F-aktin (rød) og fosfo-PAK1 (grønn) kanaler for å verifisere at de identifiserte TNTene er F-aktin og fosfo-PAK1 samfargede strukturer (figur 3).
- Hvis du vil kvantifisere TNT-ene, teller du de totale cellenumrene og de identifiserte TNT-ene manuelt og representerer tallene som prosenter.
- For å skille F-aktin-positive TNTer og β-III tubulin (TUBb3)-positive, TNT-lignende svevende kanaler fra z-stack-bilder, slå sammen F-aktin (rød) og TUBb3 (grønn) kanaler (figur 4). Analyser deretter z-stablene til de sammenslåtte bildene.
- Se etter utelukkende F-aktinfargede TNT-er som er svakt synlige ved z = 3 og fremtredende ved z = 6 og z = 9 (gule piler). Tilsvarende identifisere F-aktin og β-III tubulin (TUBb3) dobbelt-positive, TNT-lignende svevende kanaler ved z = 6 og z = 9 (cyan piler). Identifiser andre F-aktin- og β-III tubulinfargede, ikke-svevende fremspring fra de nedre delene av z-stablene (hvite piler).
- Mål diameteren på TNT-ene ved hjelp av linjeverktøyet i Fiji. Kontroller målskalaen ved å klikke Analyser | Angi Skala slik at "avstand i piksler" angis automatisk fra .czi-bildene. Mål diametrene til TNT-ene på xy-planet.
MERK: De fleste diametrene er mellom 1 piksel og 4 piksler (dvs. 220-880 nm); Hver piksel er 220 nm. Se figur 5 for et sammendrag av protokollen for analyse av z-stack konfokale bilder.
7.3D rekonstruksjon av z-stack-bilder for å karakterisere TNT-er
- Bruk volumvisningsprogrammet i Fiji, som tillater 3D-reslicing og terskelaktivert 3D-visualisering (figur 6).
- Del z-stack-bildene i individuelle kanaler. Beskjær deretter z-stack-bildene med én kanal (F-aktinkanal) for å bruke 3D-rekonstruksjonsvisning til å utheve én eller to TNT-er eller nevitter om gangen. Aktiver volumvisningspluggen for å visualisere xy-, yz- og xz-visninger.
- Fest en enkelt TNT eller nevritt i xy-planet (hvite piler representerer nevritter i figur 6A, gule piler representerer TNT-er i figur 6B) og xz (rød) og yz (grønn) aksetverrsnitt. Observer nevrittene nederst i xz-planet i xz- og yz-planene (hvite piler, figur 6A) og TNT-ene i de øvre z-stablene (gule piler, figur 6B).
- Velg den enkelte TNT eller neuritt for å rekonstruere 3D-volumvisningen i xz-planet (figur 6C, D). I 3D-rekonstruksjonen observerer du nevrittene nederst på z-planet (hvite piler, figur 6C) og at TNT-ene vises som svevende strukturer som forbinder to celler uten å berøre det nederste z-planet (gule piler, figur 6D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her identifiserer og karakteriserer vi oAβ-induserte TNT-er i SH-SY5Y-nevronceller ved å konstruere 3D-volumvisninger fra konfokale z-stack-bilder (figur 1). Cellene ble dobbeltimmunisert med F-aktin og fosfo-PAK1. Konfokale z-stack-bilder av immunstainede celler ble analysert for å identifisere TNT-er (figur 2). Videre ble DIC-bilder analysert for å verifisere at F-aktin- og fosfo-PAK1-fargede TNT-strukturer var membrankanaler mellom celler (figur 3). Videre var cellene dobbeltimmunstainert med F-aktin og β-III tubulin (figur 4). De TNT-lignende F-aktin- og β-III-tubulin-dobbeltpositive membrankanalene skilte seg fra kun F-aktinpositive TNTer (figur 4). TNTene som ble uttrykt sammen med fosfo-PAK1 (eller aktivert PAK1) og F-aktin skilte seg fra andre nevritter/cellefremspring ved å konstruere 3D-volumvisningsbilder basert på deres karakteristikk av å sveve mellom to celler uten å berøre substratum (figur 6). De identifiserte TNT-ene ble oppdaget manuelt, og prosentandelen av TNT-er ble beregnet nøyaktig fra 3D-volumvisningsbildene. Diameteren og lengden på TNT-ene ble også bestemt ved å analysere de individuelt identifiserte TNT-ene.
Figur 1: Skjematisk diagram som representerer protokollsammendraget av deteksjonsmetoden til TNT. Skala bar = 100 μm for mikroskopi bilder (øverst); 10 μm (3D-volum visninger). Forkortelser: oAβ = oligomer amyloid-β1-42; PAK1 = p21-aktivert kinase-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Analyse av konfokale z-stack-bilder for å identifisere og kvantifisere TNT-er. Konfokale z-stack-bilder ble analysert i Fiji-programvare. Hyperstacker av z-stabler og kanaler åpnet i et enkelt vindu som viser (A) F-aktin og (B) fosfo-PAK1. Ved å rulle kanalen (indikert med røde og grønne piler) og z-stack (indikert med blå piler) rullefelt, ble de enkelte stablene til en bestemt kanal av interesse analysert. (A) F-aktinfargede strukturer som forbinder celler, synlige i de nedre delene av z-stablene, og anses å være nær overflaten av bildeskålen (z = 2) ble identifisert som nevritter (indikert med hvite piler). I motsetning til dette ble svevende celle-til-celle-tilkoblede kanaler synlige i høyere deler av z-stablene identifisert som TNT-er (indikert med gule piler). (B) Tilsvarende ble fosfo-PAK1-fargede nevritter og TNT identifisert. Andre F-aktin-positive korte fremspring som ikke er koblet til naboceller, indikeres med rosa piler. Skala barer = 10 μm. Forkortelser: TNT = tunneling nanorør; PAK1 = p21-aktivert kinase-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Analyse av DIC-bilder for å bekrefte TNTs. (A) DIC-bilder ble observert for å verifisere at F-aktin- og fosfo-PAK1-fargede TNT-er og neurittfremspring faktisk var membranledninger. (B) I tillegg ble F-aktin (rød) og fosfo-PAK1 (grønn) kanaler slått sammen for å verifisere at de identifiserte, oAβ-induserte TNT-ene var F-aktin- og fosfo-PAK1-samfargede strukturer. Skala barer = 10 μm. Forkortelser: TNT = tunneling nanorør; DIC = differensiell interferenskontrast; PAK1 = p21-aktivert kinase-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Konfokale z-stack-bilder analysert ved hjelp av Fiji-programvare for å skille bare F-aktinfargede TNT-er fra β-III tubulin og F-aktin dobbeltfargede, TNT-lignende svevende ledninger. Først ble F-aktin (rød) og TUBb3 (grønn) kanalene til hyperstackene slått sammen. Deretter ble de sammenslåtte bildene åpnet i et enkelt vindu. Ved å rulle z-stack-rullefeltene ble F-aktinfargede TNT-er utelukkende identifisert; Disse var svakt synlige ved z = 3 og fremtredende ved z = 6 og z = 9 (gule piler, B). Tilsvarende ble F-aktin og TUBb3 dobbeltpositive, TNT-lignende svevende kanaler detekterbare ved z = 6 og z = 9 (cyan piler, A). Andre F-aktin- og β-III tubulinfargede, ikke-svevende fremspring ble identifisert fra de nedre delene av z-stablene (hvite piler). Skala barer = 10 μm. Forkortelser: TNTs = tunneling nanorør; TUBb3 = β-III tubulin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Skjematisk sammendrag som representerer den detaljerte protokollen for analyse av z-stack konfokale bilder. Forkortelse: TNTs = tunneling nanorør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: 3D-rekonstruksjonsvisning for å markere en eller to TNT-er eller nevritter om gangen. Plugin-modulen "volumvisning" i Fiji brukes til å visualisere xy-, yz- og xz-visninger. 3D-rekonstruksjonen viser nevritt liggende nederst på z-planet (hvite piler i panelene A og C), mens TNT-er vises som svevende strukturer som forbinder to celler uten å berøre det nederste z-planet (gul pil i panelene B og D). Skala barer = 10 μm. Forkortelse: TNTs = tunneling nanorør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere forskere de siste 2 tiårene har forsøkt å forstå og karakterisere strukturen til TNTs18. Mangelen på spesifikke markører hindrer fremgang, og det er en økende etterspørsel etter en praktisk, standardisert metode som kan brukes til å identifisere, karakterisere og kvantifisere TNTs. TNTs er definert som F-aktinbaserte membranledninger som svinger mellom to celler. Studier har vist at β-tubulin-positive, nære, utviklende nevritter svever mellom to fjerne celler og ligner TNT-lignende strukturer12,13. Derfor er TNT identifisert og skilt fra nevritter og andre TNT-lignende strukturer basert på deres positivitet for bare aktin og for å være membrankanaler som svever mellom to fjerne celler. Forskere finner det ofte utfordrende å oppnå intakte TNT-strukturer under fiksering før avbildning24. For å overvinne dette problemet brukte vi en modifisert fikseringsløsning med 2,5% glutaraldehyd (Karnovskys fikseringsmiddel) for å fikse SH-SY5Y-nevroncellene som brukes i denne protokollen25.
Et kritisk trinn i hvert immunhistokjemi / immuncytokjemieksperiment er fiksering av prøven, som er avhengig av valg av passende fikseringsmiddel. Ufullkommen fiksering av prøven kan føre til rask proteolytisk nedbrytning av målproteinene og en reduksjon i spesifikk immunreaktivitet. Overfiksering forårsaker maskering av epitopen og usikkerhet i spesifikk merking forårsaket av den ikke-spesifikke bakgrunnen. Metode, timing eller varighet, temperatur og pH påvirker også riktig fiksering av cellene26.
Paraformaldehyd er mye brukt som et fiksativt middel i immunostaining av celler. Ulempene ved bruk av paraformaldehyd som fikseringsmiddel inkluderer tap av antigenitet og endringer i morfologi. Glutaraldehyd har et lavere osmotisk trykk, er mer stabilt i løsning, og tverrbindinger lett, og gir dermed bedre resultater27. En kombinasjon av formaldehyd-glutaraldehyd (i fosfatbuffer) fikseringsmiddel resulterer i eksepsjonell fiksering av et bredt spekter av vev / celleprøver. Denne kombinasjonen muliggjør rask stabilisering av cellens ultrastruktur med formaldehyd, etterfulgt av en permanent fiksering av den langsommere penetrerende virkningen av glutaraldehyd28.
TNTer som er positive for F-aktin og fosfo-PAK1 skiller seg fra nevritter basert på deres karakteristikk av å sveve mellom to celler i in vitro 2D-cellekultur på et flatt substratum. De identifiserte TNT-ene ble manuelt oppdaget med 3D-volumvisningsanalyse, og prosentandelen av TNT-er som ble dannet ble beregnet ved manuell telling. Den manuelle metoden gjør kvantifisering av store datamengder vanskelig siden det krever enorm arbeidskraft19. Imidlertid kan trente øyne oppdage TNT-er effektivt og skille dem fra nevritter med bedre presisjon enn automatiske deteksjonsmetoder. De eksisterende automatiske deteksjonsmetodene er også vanskelige å implementere i hvert laboratorium uten tilgjengelig kompetanse til å utvikle en algoritme og / eller endre den eksisterende algoritmen etter behov for det eksperimentelle oppsettet. Den manuelle 3D-volumvisningsmetoden gjør det lettere å identifisere membranstrukturene som ligger mellom celler i de nedre delene av z-stablene og de som svever i midtre og høyere deler av z-stablene for å tydelig skille mellom nevritter og TNTer.
TNT kan skilles fra andre membranfremspring som nevritter eller tumormikrorør. Det er imidlertid vanskelig å skille mellom åpne og lukkede, nanostørrelse, diametermembranrør, noe som reiser følgende spørsmål: er de TNT-er eller TNT-lignende strukturer? Siden det siste tiåret har en stor mengde data blitt akkumulert for å vise den uunngåelige rollen til TNT i spredning av patologi, kreftresistens og terapi17. Derfor ser forskere etter utvikling av spesifikke beslutningstakere som vil endre feltet direkte, langdistanse intercellulær kommunikasjon. Inntil da er reproduserbare bildebehandlingsmetoder i stor etterspørsel for å bane vei for kontinuerlig fremgang i feltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å opplyse om.
Acknowledgments
D.K.V og A.R takker Manipal Academy of Higher Education for TMA Pai-fellesskapet. Vi takker Science and Engineering Research Board of India for SERB-SRG (#SRG/2021/001315), samt Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) og Intramural fund of Manipal Academy of Higher Education, Manipal, India. Vi takker JNCASRs (Jawaharlal Nehru Center for Advanced Scientific Research, India) konfokalanlegg og B. Suma for konfokalmikroskopi i JNCASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
- Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
- Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
- Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
- Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
- Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
- Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
- Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
- Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
- Zurzolo, C.
- Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
- Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
- Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
- Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
- Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
- Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
- Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
- Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
- Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
- Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
- Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
- Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
- Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
- Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).
