Summary
Tunneling nanorör (TNT) är främst öppna F-aktinmembrannanorör som förbinder angränsande celler, vilket underlättar intercellulär kommunikation. Den anmärkningsvärda egenskapen som skiljer TNT från andra cellutsprång är nanorörens svävande natur mellan celler. Här karakteriserar vi TNT genom att konstruera en 3D-volymvy av konfokala z-stackbilder.
Abstract
Nya upptäckter har avslöjat att celler utför direkt, långdistans, intercellulär överföring via nano-skala, aktinmembranledningar, nämligen "tunneling nanotubes" (TNT). TNT definieras som öppna, lipid-dubbelskiktade membranförlängningar som förmedlar kontinuitet mellan angränsande celler med diametrar mellan 50 nm och 1 μm. TNT demonstrerades initialt i neuronala celler, men successiva studier har avslöjat förekomsten av TNT i flera celltyper och sjukdomar, såsom neurodegenerativa sjukdomar, virusinfektioner och cancer. Flera studier har hänvisat till nära, elektriskt kopplade membrannanostrukturer mellan angränsande celler som TNT eller TNT-liknande strukturer.
Belysningen av ultrastruktur när det gäller membrankontinuitet vid slutpunkten är tekniskt utmanande. Dessutom är studier om cell-cellkommunikation utmanande när det gäller karakterisering av TNT med konventionella metoder på grund av bristen på specifika markörer. TNT definieras främst som F-aktinbaserade, öppna membranutsprång. En stor begränsning är dock att F-aktin finns i alla typer av utsprång, vilket gör det utmanande att skilja TNT från andra utsprång. En av de anmärkningsvärda egenskaperna hos F-aktinbaserade TNT är att dessa strukturer svävar mellan två celler utan att röra vid underlaget. Därför kan distinkta F-aktinfärgade TNT bekvämt särskiljas från andra utsprång såsom filopodier och neuriter baserat på deras svävande mellan celler.
Vi har nyligen visat att internaliseringen av oligomera amyloid-β 1-42 (oAβ) via aktinberoende endocytos stimulerar aktiverat p21-aktiverat kinas-1 (PAK1), som förmedlar bildandet av F-aktininnehållande TNT samuttryckta med fosfo-PAK1 mellanSH-SY5Y neuronala celler. Detta protokoll beskriver en 3D-volymanalysmetod för att identifiera och karakterisera TNT från de tagna z-stackbilderna av F-aktin- och fosfo-PAK1-immunfärgade membranutsprång i oAβ-behandlade neuronala celler. Vidare skiljer sig TNT från att utveckla neuriter och neuronala utväxter baserade på F-aktin- och β-III tubulinimmunfärgade membranledningar.
Introduction
Tunnelnanorör (TNT) är F-aktinbaserade, främst öppna membranledningar och spelar en viktig roll i den intercellulära överföringen av last och organeller1. Det unika kännetecknet för TNT är att de förbinder angränsande celler utan kontakt med substratet; De är över 10–300 μm långa och deras diametrar varierar mellan 50 nm och 1 μm 2,3. TNT är övergående strukturer, och deras livslängd varar mellan några minuter till flera timmar. TNT demonstrerades först i PC12 neuronala celler1; Senare visade många studier att de fanns i flera celltyper in vitro och in vivo 4,5. Flera studier har avslöjat den patologiska betydelsen av TNT i olika sjukdomsmodeller, såsom neurodegenerativa sjukdomar, cancer och virusinfektioner 6,7,8.
De strukturella heterogeniteterna hos TNT har visats av flera studier i olika cellulära system9. Skillnaderna är baserade på cytoskelettkomposition, bildningsmekanismen och de överförda lasttyperna10. I första hand anses den öppna, F-aktinpositiva membrankontinuiteten som svävar mellan två angränsande celler och överför organeller bestå av TNT11. Bristen på tydlighet eller mångfald som observerats vid bildandet av TNT ökar emellertid svårigheten att utveckla TNT-specifika markörer. Således är det svårt att identifiera TNT-strukturer med konventionella detektionsmetoder och skilja membrannanorör i termer av öppna och nära utsprång12. Karaktäristiken hos TNT att sväva som F-aktinmembranutsprång mellan två celler är dock relativt lättare och mer genomförbar att identifiera med konventionella bildtekniker. Andra aktinbaserade cellulära utsprång såsom filopodier och dorsala filopodier kan inte sväva mellan två avlägsna celler, särskilt när cellerna är fixerade. Observera att nära, elektriskt kopplade, utvecklande neuriter ofta kallas TNT-liknande strukturer13.
Det är känt att F-aktin spelar en viktig roll vid TNT-bildning, och flera studier har visat att F-aktinhämmaren cytochalasin D hämmar bildandet av TNT14,15. Däremot har hämmare av mikrotubuli ingen effekt på TNT-bildning16. De senaste 2 decennierna har sett flera rapporter om den betydande roll som TNT spelar i spridningen av patologi och tumörresistens och terapi17. Därför finns det en oändlig efterfrågan på bättre tekniker för TNT-karakterisering.
Bristen på specifika markörer för TNT och mångfalden i morfologi och cytoskeletal komposition gör det svårt att utveckla en unik metod för karakterisering. Vissa studier har använt automatiserad bilddetektering och TNT-kvantifieringstekniker18,19. Det finns dock flera fördelar med den nuvarande manuella 3D-volymanalysmetoden jämfört med automatisk bildanalys för detektering och kvantifiering av TNT: er. Ofta kan tränade mänskliga ögon lättare upptäcka dessa svävande nanostrukturer än en automatiserad bilddetekteringsmetod. Dessutom kan automatiska detektionsmetoder vara svåra att implementera i laboratorier som saknar algoritmexpertis. Den nuvarande metoden kan i stor utsträckning antas av forskare på grund av dess precision och reproducerbarhet.
I en nyligen genomförd studie visade vi att oAβ främjar biogenesen av TNT i neuronala celler via en PAK1-medierad, aktinberoende, endocytosmekanism12. oAβ-inducerade TNT uttrycker också aktiverad PAK1 (eller fosfo-PAK1). Vi utvecklade en 3D-volymvybildrekonstruktionsmetod för att skilja oAβ-inducerade, F-aktin- och fosfo-PAK1-immunfärgade TNT: er. β-III tubulinpositiva, utvecklande neuriter liknar ofta TNT-liknande svävande strukturer20. Därför skilde vi ytterligare F-aktinbaserade TNT från β-III tubulinpositiva neuriter och andra TNT-liknande utsprång. 3D-volymvisningsbilder har använts för att identifiera TNT på grundval av deras egenskaper att sväva över underlaget och hålla kontakten mellan två angränsande celler. Detta dokument beskriver identifiering och detektion av aktininnehållande membranledningar eller TNT med hjälp av konfokala z-stackbilder och slutligen manuell kvantifiering av de identifierade strukturerna från rekonstruktionsbilder av 3D-volymvyer. Den presenterade metoden kan inte skilja öppna korrekta TNT från nära TNT-liknande strukturer; denna metod hjälper till att identifiera TNT i in vitro 2D-cellodling på ett platt underlag. Metoden är dock lätt att implementera och reproducera och kan användas i stor utsträckning för exakt kvantifiering av endast aktinbaserade TNT och för att skilja dem från neuriter och β-tubulinpositiva TNT-liknande strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: SH-SY5Y-celler odlade i DMEM / F-12-media differentierades med 10 μM retinsyra i 7 dagar och behandlades med 1 μM oAβ-oligomerer i 2 timmar vid 37 ° C (5%CO2). Efter behandling fixerades cellerna med Karnovskys fixativa lösning och dubbelimmunbehandlades med fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) antikropp och F-aktinbindande falloidin. Senare togs konfokala z-stack-bilder med hjälp av ett konfokalt laserscanningsmikroskop. TNT: erna kvantifierades genom manuell räkning och skilde sig från andra neuriter / cellutsprång genom att konstruera 3D-volymvybilder och identifiera strukturerna från deras karakteristiska att sväva mellan två celler utan att röra vid underlaget (figur 1).
1. Cellodling och differentiering
- Odla SH-SY5Y-neuronala celler i DMEM / F12 (Hams) media 1: 1 med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin-neomycinblandning (PSN). Frö cellerna i en 35 mm bildskål med en 14 mm brunn som består av en # 1.5 täckglas i mitten av skålen fäst vid botten. Frö cellerna på bildskålen i en koncentration av 12 000 celler / cm2 och utför experimenten vid 60% -70% sammanflöde.
- Delvis differentiera cellerna med 10 μM retinsyra (RA) från en 100 mM stamlösning (5 mg RA i 15 ml dimetylsulfoxid [DMSO]). Inkubera sedan cellerna i 7 dagar vid 37 ° C (5% CO 2) för differentiering med mediebyte var2: e dag.
OBS: Var försiktig med att upprätthålla sammanflödet (60% -70%) av cellerna (både odifferentierade och delvis differentierade celler). Celldensitet kan påverka bildandet av TNT mellan cellerna.
2. Beredning av oligomerer av amyloid-β1-42 (oAβ) för att behandla neuronala celler
- Lös upp Aβ 1-42 (1 mg) i 200 μl 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol och dela lösningen i 20 alikvoter, var och en innehållande 0,05 mg peptider. Frystorka, förvara alikvoterna vid −20 °C för senare användning.
- Bered stamlösningen (5 mM) av den frystorkade Aβ 1-42 i DMSO genom att tillsätta 2,2 μL DMSO till 0,05 mg frystorkad peptid. För att försiktigt lösa peptiderna, virvla lösningen och sonika i 2 min i en vattenbad sonicator.
- Späd stamlösningen till en koncentration av 100 μM i DMEM, pH 7,4, och virvel för att omvandla peptiderna till monomerer, följt av inkubation vid 4 °C i 24 timmar för att erhålla oligomerer av Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.
- Karakterisera oAβ före experimenten som rapporterats tidigare21,22 genom transmissionselektronmikroskopiavbildning.
- Behandla de delvis differentierade SH-SY5Y-cellerna med 1 μM oAβ. Ta bort mediet före behandlingarna och tillsätt färsk FBS-fri DMEM. Efter mediumbytet, tillsätt tidigare beredd oAβ (100 μM) till mediet till en slutlig koncentration av 1 μM. Inkubera cellerna med 1 μM oAβ i 2 timmar vid 37 °C (5% CO2). Inkludera en negativ kontroll i form av obehandlade celler.
3. Immunfärgning av F-aktin och aktiverad-PAK1 för karakterisering av TNT
- Utför differentiell immunfärgning genom att använda fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) antikropp och F-aktinbindande fallotoxinfalloidin.
- Tvätta kontroll- och oAβ-behandlade celler med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 2 x 2 min före fixering. Förbered Karnovskys fixativa lösning genom att använda 2% formalinfixativ och 2,5% glutaraldehyd upplöst i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,2. Fixera sedan cellerna i bildskålen genom att tillsätta Karnovskys fixativa lösning (precis tillräckligt för att täcka cellerna) i 45 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta de fasta cellerna 2 x 2 min med inkubationsbuffert. Förbered inkubationsbufferten (20x) genom att lösa upp 0,1 g saponin i 5 ml FBS och späd till 1x genom att tillsätta 95 ml 1x PBS.
- Efter fixering, tillsätt den första antikroppen mot phopho-PAK1 vid en spädning av 1:250 i inkubationsbufferten och inkubera över natten vid 4 °C i en mörk fuktig kammare.
- Nästa dag, efter 24 timmars inkubation, tvätta cellerna 2 x 2 min med inkubationsbufferten; Tillsätt sedan sekundär antikropp konjugerad till Alexa Fluor 488 (1: 1,000 utspädning) och Phalloidin 555 (1: 1,000 utspädning). Inkubera cellerna i den mörka fuktiga kammaren i 1,5 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna 2 x 2 min med inkubationsbuffert efter inkubationen. Färga kärnan genom att tillsätta 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i en utspädning på 1:2 000 och inkubera i 5 minuter till 10 min vid rumstemperatur i mörker.
- Förbered DABCO monteringsmedium med 25 mg DABCO i 90% glycerol och 10% 1x PBS. För att lösa upp ordentligt, justera pH till 8,6 med spektrofotometrisk kvalitet, späd HCl (utspädd 1:20 med vatten) och håll lösningen på en vippa för blandning.
- Som ett antiblekmedel, tillsätt DABCO-monteringsmediet direkt på bildskålen som innehåller täckglaset längst ner. Vänta i minst 1-2 timmar och fortsätt direkt för att utföra konfokal avbildning.
OBS: Inga lim krävs för att fixera täckglasen.
4. Immunfärgning av F-aktin och β-III tubulin för att skilja TNT från neuriter
- Utför differentiell immunfärgning med β-III tubulinantikropp och F-aktinbindande fallotoxin falloidin.
- Tvätta de oAβ-behandlade cellerna 2x med 1x PBS innan du tillsätter Karnovskys fixeringslösning. Inkubera cellerna i 45 min vid rumstemperatur och tvätta cellerna 2 x 2 min med inkubationsbuffert.
- Efter fixering, tillsätt antikroppen mot β-III-tubulin (TUBb3) vid en spädning av 1:250 i inkubationsbufferten och inkubera vid 4 °C över natten i den mörka fuktiga kammaren.
- Nästa dag, tvätta cellerna med inkubationsbuffert (2 x 2 min) och tillsätt sekundär antikropp konjugerad till Alexa Fluor 488 (1: 1,000 utspädning) och Phalloidin 555 (1: 1,000 utspädning) tillsammans till samma maträtt. Inkubera sedan cellerna i 1,5 timmar vid rumstemperatur i den mörka fuktiga kammaren.
- Tvätta cellerna 2x med inkubationsbuffert och tillsätt kärnfärgning DAPI i en 1: 2,000 utspädning i 5-10 min vid rumstemperatur i mörkret.
- Tillsätt antiblekmedel DABCO i monteringsmedium som nämnts ovan och vänta i 2 timmar innan du bildlägger.
5. Bildbehandling med konfokalmikroskopi
- För att identifiera TNT: er, fånga z-stack-bilder av immunfärgade celler med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop. Ta bilderna med 40x/1.40 Oil DIC-mål med DAPI, fluorescein isotiocyanat (FITC) och tetrametylrhodamin (TRITC) filteruppsättningar.
- Välj först kanalerna genom att klicka på önskade lasrar sekventiellt i fönstren Spår 1, Spår 2 och Spår 3 i konfokalprogramvaran. Klicka på alternativet T-PMT under fönstret Spår 1 för att ta bilder av differentiell interferenskontrast (DIC) med fluorescenskanaler.
DIC-bilder tas av en annan detektor märkt som T-PMT. - Välj förvärvsfliken för programvaran, klicka på fliken Z-stack och vänta tills ett fönster öppnas. Klicka sedan på live-skanning för att fokusera cellerna längst ner på skålen. Välj den fokuserade bilden som den första stapeln. Fokusera sedan uppåt för att se den översta delen av cellen och välj den som den sista stapeln. Stoppa live-skanning och klicka på numret bredvid den optimala fliken för att fixa stegstorleken på staplarna. Stegstorlek bestämmer antalet segment och intervallen baserat på cellernas tjocklek.
OBS: Stegstorlek kommer att väljas baserat på Nyquist-provtagning för att ta tillräckligt med skivor och se till att det inte finns några mellanrum mellan de två staplarna. Nyquists provtagning bestäms utifrån ljusets mål och våglängder23. - Ta sekventiella bilder av tre kanaler med DAPI, FITC och TRITC med 405 nm, 488 nm och 561 nm lasrar och fånga med en pixeluppehållstid på 1,02 μs. Ta bilder i DIC-kanalen med fluorescenskanaler för att observera cellgränsen.
- Ta en bunt bilder med måtten x: 224,92 μm och y: 224,92 μm, med varje pixel på 220 nm2 storlek och z-skalning på 415 nm.
- Ta bilder som tar flera z-staplar (15-22 staplar) från botten till toppen av cellerna. Skaffa minst 10 bilder från det slumpmässiga fältet i odlingsskålen för att få totalt ~ 200-300 celler.
- Analysera de tagna bilderna offline för att identifiera TNT:erna med 3D-volymvyanalys
6. Analys av konfokala z-stackbilder för att identifiera och kvantifiera TNT
- Öppna konfokalbilderna som sparats i .czi-dataformat i Fiji-programvaran för analys.
- Välj alternativet Hyperstack för att se varje z-stack och kanal i bilden. Leta efter hyperstackarna för z-stackarna och kanalerna, som öppnas i ett enda fönster som visas i figur 2. Bläddra i kanalen (indikeras med röda och gröna pilar) och z-stack (indikeras med blå pilar) rullningslister för att välja den exakta stacken för en viss kanal av intresse.
OBS: I fasta celler, eftersom de svävande TNT: erna eller membranledningarna stannar ovanför ytan, är strukturerna inte synliga i de nedre delarna av z-staplarna. I fasta celler ligger emellertid neuriter på ytan och är detekterbara i de nedre delarna av z-staplarna (z = 0 till 2). Se figur 2 för identifieringsstegen. - Som visas i figur 2 väljer du den F-aktinfärgade kanalen (indikeras med röda pilar) först genom att bläddra i kanalfältet. Bläddra sedan manuellt i z-stackarna (indikeras med blå pilar) för att se varje stapel en efter en. Identifiera de F-aktinfärgade strukturerna som verkar ansluta celler, är synliga i de nedre delarna av z-staplarna och ligger nära bildskålens yta (z = 2) som neuriter (indikeras av vita pilar).
OBS: Majoriteten av neuriterna är lätta att identifiera eftersom de ser ut som förlängda utsprång (indikeras av rosa pilar). - Identifiera TNT: erna, de F-aktinpositiva, svävande cell-till-cell-ledningarna, genom att rulla z-stackarna mot toppen (från z = 4 i figur 2; indikeras med gula pilar). Leta efter neuriter nära de nedre delarna av z-stackarna mot ytan och observera att de börjar försvinna med rullningen av z-stackar mot toppen (vid z = 6 i figur 2; neuriter är inte tydligt synliga).
- Identifiera fosfo-PAK1-positiva TNT på samma sätt som F-aktinpositiva TNT genom att analysera den svävande naturen hos ledningarna från z-stackarna. Eftersom fosfo-PAK1-färgning är svagare än F-aktinfärgning, leta efter phopho-PAK1-färgade TNT vid z = 4 (svagt synlig) och vid z = 6 (framträdande).
- Observera vidare DIC-bilderna för att verifiera att F-aktin- och fosfo-PAK1-färgade TNT-strukturer är membranledningar mellan celler (figur 3). Slå dessutom samman F-aktin (röd) och fosfo-PAK1 (grön) kanaler för att verifiera att de identifierade TNT: erna är F-aktin och fosfo-PAK1 samfärgade strukturer (figur 3).
- För att kvantifiera TNT: erna, räkna de totala cellnumren och de identifierade TNT: erna manuellt och representera siffrorna i procent.
- För att skilja F-aktinpositiva TNT- och β-III-tubulin-positiva (TUBb3)-positiva, TNT-liknande svävande ledningar från z-stackbilder, slå samman F-aktin (röd) och TUBb3 (grön) kanaler (figur 4). Analysera sedan z-stackarna för de sammanslagna bilderna.
- Leta efter uteslutande F-aktinfärgade TNT som är svagt synliga vid z = 3 och framträdande vid z = 6 och z = 9 (gula pilar). På samma sätt identifiera F-aktin och β-III tubulin (TUBb3) dubbelpositiva, TNT-liknande svävande ledningar vid z = 6 och z = 9 (cyanpilar). Identifiera andra F-aktin- och β-III tubulinfärgade, icke-svävande utsprång från de nedre delarna av z-staplarna (vita pilar).
- Mät TNT: s diameter med hjälp av linjeverktyget i Fiji. Kontrollera måttskalan genom att klicka på Analysera | Ställ in Skala så att "avstånd i pixlar" ställs in automatiskt från .czi-bilderna. Mät TNT: s diametrar vid xy-planet.
OBS: De flesta diametrarna är mellan 1 pixel och 4 pixlar (dvs. 220-880 nm); Varje pixel är 220 nm. Se figur 5 för en sammanfattning av protokollet för analys av z-stack konfokala bilder.
7.3D rekonstruktion av z-stack-bilder för att karakterisera TNT
- Använd plugin-programmet för volymvisare i Fiji, som tillåter 3D-skivning och tröskelaktiverad 3D-visualisering (bild 6).
- Dela upp z-stack-bilderna i enskilda kanaler. Beskär sedan z-stackbilderna med en kanal (F-aktinkanal) för att använda 3D-rekonstruktionsvyn för att markera en eller två TNT eller neuriter åt gången. Aktivera plugin-programmet för volymvy för att visualisera xy-, yz- och xz-vyer.
- Fäst en enda TNT eller neurit i xy-planet (vita pilar representerar neuriter i figur 6A; gula pilar representerar TNT i figur 6B) och markera xz (röd) och yz (grön) axeltvärsnitt. Observera neuriterna längst ner på xz-planet i xz- och yz-planen (vita pilar, figur 6A) och TNT:erna i de övre z-staplarna (gula pilar, figur 6B).
- Välj den enskilda TNT eller neuriten för att rekonstruera 3D-volymvyn i xz-planet (figur 6C, D). I 3D-rekonstruktionen, observera neuriterna längst ner på z-planet (vita pilar, figur 6C) och TNT: erna som visas som svävande strukturer som förbinder två celler utan att röra vid det nedre z-planet (gula pilar, figur 6D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här identifierar och karakteriserar vi oAβ-inducerade TNT i SH-SY5Y-neuronala celler genom att konstruera 3D-volymvyer från konfokala z-stackbilder (figur 1). Cellerna dubbelimmunbehandlades med F-aktin och fosfo-PAK1. Konfokala z-stackbilder av immunfärgade celler analyserades för att identifiera TNT (figur 2). Vidare analyserades DIC-bilder för att verifiera att F-aktin- och fosfo-PAK1-färgade TNT-strukturer var membranledningar mellan celler (figur 3). Vidare dubbelimmunbehandlades cellerna med F-aktin och β-III tubulin (figur 4). De TNT-liknande F-aktin- och β-III-tubulin-dubbelpositiva membranledningarna skildes från endast F-aktinpositiva TNT (figur 4). TNT: erna samuttryckta med fosfo-PAK1 (eller aktiverad PAK1) och F-aktin skildes från andra neuriter / cellutsprång genom att konstruera 3D-volymvybilder baserat på deras egenskap att sväva mellan två celler utan att röra vid underlaget (figur 6). De identifierade TNT: erna upptäcktes manuellt och andelen TNT beräknades exakt från 3D-volymvybilderna. TNT: s diameter och längd bestämdes också genom att analysera de individuellt identifierade TNT: erna.
Figur 1: Schematiskt diagram som representerar protokollsammanfattningen av detektionsmetoden för TNT: er. Skalfält = 100 μm för mikroskopibilder (överst); 10 μm (3D-volymvyer). Förkortningar: oAβ = oligomer amyloid-β1-42; PAK1 = p21-aktiverat kinas-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Analys av konfokala z-stackbilder för att identifiera och kvantifiera TNT. Konfokala z-stack-bilder analyserades i Fiji-programvaran. Hyperstacks av z-stackar och kanaler öppnade i ett enda fönster som visar (A) F-aktin och (B) fosfo-PAK1. Genom att rulla kanalen (indikerad med röda och gröna pilar) och z-stack (indikerad med blå pilar) rullningslister analyserades de enskilda staplarna för en viss kanal av intresse. (A) De F-aktinfärgade strukturerna som förbinder celler, synliga i de nedre delarna av z-staplarna och anses vara nära bildskålens yta (z = 2) identifierades som neuriter (indikerade med vita pilar). Däremot identifierades svävande cell-till-cell-anslutna ledningar synliga vid högre delar av z-stackarna som TNT (indikeras med gula pilar). (B) På liknande sätt identifierades fosfo-PAK1-färgade neuriter och TNT. Andra F-aktinpositiva korta utsprång som inte är anslutna till angränsande celler indikeras med rosa pilar. Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: TNT = tunneling nanorör; PAK1 = p21-aktiverat kinas-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Analys av DIC-bilder för att bekräfta TNT. (A) DIC-bilder observerades för att verifiera att F-aktin- och fosfo-PAK1-färgade TNT och neuritutsprång verkligen var membranledningar. (B) Dessutom slogs kanalerna F-aktin (rött) och fosfo-PAK1 (grönt) samman för att verifiera att de identifierade, oAβ-inducerade TNT: erna var F-aktin och fosfo-PAK1 samfärgade strukturer. Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: TNT = tunneling nanorör; DIC = differentiell interferenskontrast; PAK1 = p21-aktiverat kinas-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Konfokala z-stackbilder analyserade med Fiji-programvara för att endast skilja F-aktinfärgade TNT från β-III-tubulin och F-aktin dubbelfärgade, TNT-liknande svävande ledningar. Först slogs kanalerna F-aktin (röd) och TUBb3 (grön) i hyperstackarna samman. Sedan öppnades de sammanslagna bilderna i ett enda fönster. Genom att rulla z-stack-rullningslisterna identifierades F-aktinfärgade TNT: er exklusivt; dessa var svagt synliga vid z = 3 och framträdande vid z = 6 och z = 9 (gula pilar, B). På samma sätt var F-aktin och TUBb3 dubbelpositiva, TNT-liknande svävande ledningar detekterbara vid z = 6 och z = 9 (cyanpilar, A). Andra F-aktin- och β-III tubulinfärgade, icke-svävande utsprång identifierades från de nedre delarna av z-staplarna (vita pilar). Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: TNT = tunneling nanorör; TUBb3 = β-III tubulin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Schematisk sammanfattning som representerar det detaljerade protokollet för analys av z-stack konfokala bilder. Förkortning: TNTs = tunneling nanorör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: 3D-rekonstruktionsvy för att markera en eller två TNT eller neuriter åt gången. Plugin-programmet "volymvy" i Fiji används för att visualisera xy-, yz- och xz-vyer. 3D-rekonstruktionen visar neurit som ligger längst ner på z-planet (vita pilar i panelerna A och C), medan TNT visas som svävande strukturer som förbinder två celler utan att röra vid det nedre z-planet (gul pil i panelerna B och D). Skalstänger = 10 μm. Förkortning: TNTs = tunneling nanorör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera forskare under de senaste 2 decennierna har försökt förstå och karakterisera strukturen hos TNT18. Bristen på specifika markörer hindrar framsteg, och det finns en ökande efterfrågan på en bekväm, standardiserad metod som kan användas för att identifiera, karakterisera och kvantifiera TNT: er. TNT definieras som F-aktinbaserade membranledningar som svävar mellan två celler. Studier har visat att β-tubulinpositiva, nära-slutna, utvecklande neuriter svävar mellan två avlägsna celler och liknar TNT-liknande strukturer12,13. Därför identifieras och särskiljs TNT från neuriter och andra TNT-liknande strukturer baserat på deras positivitet för endast aktin och för att vara membranledningar som svävar mellan två avlägsna celler. Forskare tycker ofta att det är utmanande att få intakta TNT-strukturer under fixering före avbildning24. För att övervinna detta problem använde vi en modifierad fixeringslösning med 2,5% glutaraldehyd (Karnovskys fixativ) för att fixa SH-SY5Y-neuroncellerna som används i detta protokoll25.
Ett kritiskt steg i varje immunohistokemi / immunocytokemiexperiment är fixeringen av provet, vilket är beroende av valet av lämpligt fixeringsmedel. Ofullkomlig fixering av provet kan leda till snabb proteolytisk nedbrytning av målproteinerna och en minskning av den specifika immunreaktiviteten. Överfixering orsakar maskering av epitopen och osäkerhet i specifik märkning orsakad av den icke-specifika bakgrunden. Metod, timing eller varaktighet, temperatur och pH påverkar också korrekt fixering av cellerna26.
Paraformaldehyd används i stor utsträckning som ett fixativt medel vid immunfärgning av celler. Nackdelarna med att använda paraformaldehyd som fixeringsmedel innefattar förlust av antigenicitet och förändringar i morfologi. Glutaraldehyd har ett lägre osmotiskt tryck, är stabilare i lösning och tvärbinds lätt, vilket ger bättre resultat27. En kombination av formaldehyd-glutaraldehyd (i fosfatbuffert) fixativ resulterar i exceptionell fixering av ett brett spektrum av vävnads-/cellprover. Denna kombination möjliggör snabb stabilisering av cellens ultrastruktur med formaldehyd, följt av en permanent fixering av den långsammare penetrerande verkan av glutaraldehyd28.
TNT som är positiva för F-aktin och fosfo-PAK1 skiljer sig från neuriter baserat på deras karakteristiska för att sväva mellan två celler i in vitro 2D-cellodling på ett platt underlag. De identifierade TNT: erna upptäcktes manuellt med 3D-volymvyanalys, och procentandelarna av TNT som bildades beräknades genom manuell räkning. Den manuella metoden gör det svårt att kvantifiera stora mängder data eftersom det kräver enorm arbetskraft19. Tränade ögon kan dock upptäcka TNT effektivt och skilja dem från neuriter med bättre precision än automatiska detektionsmetoder. De befintliga automatiska detektionsmetoderna är också svåra att implementera i varje laboratorium utan tillgänglig expertis för att utveckla en algoritm och/eller ändra den befintliga algoritmen efter behov för den experimentella installationen. Den manuella 3D-volymvyanalysmetoden gör det lättare att identifiera membranstrukturerna som ligger mellan celler i de nedre delarna av z-stackarna och de som svävar i mitten och högre delar av z-stackarna för att tydligt skilja mellan neuriter och TNT.
TNT kan särskiljas från andra membranutsprång såsom neuriter eller tumörmikrorör. Det är emellertid svårt att skilja mellan öppna och nära, nanostora, diametermembranrör, vilket väcker följande fråga: är de TNT eller TNT-liknande strukturer? Sedan det senaste decenniet har en stor mängd data ackumulerats för att visa TNT: s oundvikliga roll i spridningen av patologi, cancerresistens och terapi17. Därför letar forskare efter utvecklingen av specifika tillverkare som kommer att förändra området för direkt, långväga intercellulär kommunikation. Fram till dess är reproducerbara avbildningsmetoder för karakterisering i hög efterfrågan för att bana väg för kontinuerliga framsteg inom området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
D.K.V och A.R tackar Manipal Academy of Higher Education för TMA Pai-stipendiet. Vi tackar Science and Engineering Research Board of India för SERB-SRG (#SRG/2021/001315), liksom Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) och Intramural fund of Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Indien. Vi tackar JNCASR:s (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Indien) konfokala anläggning och B. Suma för den konfokalmikroskopi i JNCASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
- Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
- Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
- Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
- Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
- Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
- Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
- Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
- Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
- Zurzolo, C.
- Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
- Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
- Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
- Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
- Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
- Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
- Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
- Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
- Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
- Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
- Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
- Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
- Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
- Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).
