Summary
Os nanotubos de tunelamento (TNTs) são principalmente nanotubos de membrana de actina F abertos que conectam células vizinhas, facilitando a comunicação intercelular. A característica notável que distingue os TNTs de outras saliências celulares é a natureza flutuante dos nanotubos entre as células. Aqui, caracterizamos os TNTs construindo uma visão de volume 3D de imagens confocais z-stack.
Abstract
Descobertas recentes revelaram que as células realizam transferência intercelular direta, de longo alcance, através de conduítes de membrana de actina em nanoescala, ou seja, "nanotubos de tunelamento" (TNTs). Os TNTs são definidos como extensões de membrana abertas e circundadas por bicamadas lipídicas que medeiam a continuidade entre células vizinhas de diâmetros que variam entre 50 nm e 1 μm. Os TNTs foram demonstrados inicialmente em células neuronais, mas estudos sucessivos revelaram a existência de TNTs em vários tipos celulares e doenças, como doenças neurodegenerativas, infecções virais e câncer. Vários estudos se referiram a nanoestruturas de membrana fechadas e eletricamente acopladas entre células vizinhas como TNTs ou estruturas semelhantes a TNT.
A elucidação da ultraestrutura em termos de continuidade da membrana no desfecho é tecnicamente desafiadora. Além disso, estudos sobre comunicação célula-célula são desafiadores em termos de caracterização de TNTs usando métodos convencionais devido à falta de marcadores específicos. Os TNTs são definidos principalmente como saliências de membrana abertas à base de F-actina. No entanto, uma grande limitação é que a F-actina está presente em todos os tipos de saliências, tornando desafiador diferenciar TNTs de outras saliências. Uma das características notáveis dos TNTs à base de actina F é que essas estruturas pairam entre duas células sem tocar o substrato. Portanto, TNTs distintos corados com F-actina podem ser convenientemente distinguidos de outras saliências, como filópodes e neurites, com base em seu pairar entre as células.
Recentemente, mostramos que a internalização da amilóide-βoligomérica 1-42 (oAβ) via endocitose dependente de actina estimula a quinase-1 ativada por p21 ativada (PAK1), que medeia a formação de TNTs contendo F-actina coexpressos com fosfo-PAK1 entre células neuronais SH-SY5Y. Este protocolo descreve um método de análise de volume 3D para identificar e caracterizar TNTs a partir das imagens capturadas de z-stack de protuberâncias de membrana imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1 em células neuronais tratadas com oAβ. Além disso, os TNTs distinguem-se do desenvolvimento de neurites e excrescências neuronais com base em condutos de membrana imunocorados de tubulina F-actina e β-III.
Introduction
Os nanotubos de tunelamento (TNTs) são condutos de membrana à base de actina F, principalmente abertos, e desempenham um papel vital na transferência intercelular de carga e organelas1. A característica única dos TNTs é que eles conectam células vizinhas sem qualquer contato com o substrato; têm mais de 10-300 μm de comprimento e os seus diâmetros variam entre 50 nm a 1 μm 2,3. Os TNTs são estruturas transitórias e sua vida útil dura entre alguns minutos a várias horas. Os TNTs foram demonstrados pela primeira vez em células neuronaisPC12 1; posteriormente, numerosos estudos mostraram sua existência em vários tipos celulares in vitro e in vivo 4,5. Diversos estudos têm revelado a significância patológica dos TNTs em diversos modelos de doenças, como doenças neurodegenerativas, câncer e infecções virais 6,7,8.
As heterogeneidades estruturais dos TNTs têm sido demonstradas por diversos estudos em diversos sistemas celulares9. As diferenças são baseadas na composição do citoesqueleto, no mecanismo de formação e nos tipos de carga transferidos10. Primeiramente, considera-se que a continuidade da membrana aberta e positiva para F-actina que paira entre duas células vizinhas e transfere organelas consiste em TNTs11. No entanto, a falta de clareza ou diversidade observada na formação de TNTs aumenta a dificuldade no desenvolvimento de marcadores específicos de TNT. Assim, é difícil identificar estruturas de TNT por métodos convencionais de detecção e distinguir nanotubos de membrana em termos de saliências abertas e fechadas12. No entanto, a característica dos TNTs pairarem como saliências de membrana de actina F entre duas células é relativamente mais fácil e mais viável de identificar usando técnicas de imagem convencionais. Outras saliências celulares à base de actina, como filópodes e filópodes dorsais, não podem pairar entre duas células distantes, particularmente quando as células são fixas. É importante ressaltar que neurites em desenvolvimento fechadas, eletricamente acoplados e são frequentemente denominados estruturas semelhantes ao TNT13.
Sabe-se que a F-actina desempenha um papel importante na formação de TNT, e vários estudos têm demonstrado que o inibidor de F-actina citocalasina D inibe a formação de TNTs14,15. Em contraste, os inibidores dos microtúbulos não têm qualquer efeito sobre a formação de TNT16. Nas últimas 2 décadas, houve vários relatos sobre o papel significativo que os TNTs desempenham na disseminação da patologia e da resistência e terapia tumoral17. Portanto, há uma demanda interminável por melhores técnicas para caracterização do TNT.
A falta de marcadores específicos de TNTs e a diversidade na morfologia e composição citoesquelética dificultam o desenvolvimento de um método único de caracterização. Alguns estudos têm utilizado técnicas automatizadas de detecção de imagens e quantificação de TNT18,19. No entanto, existem várias vantagens do atual método de análise manual de volume 3D sobre a análise automática de imagens para a detecção e quantificação de TNTs. Muitas vezes, os olhos humanos treinados podem detectar essas nanoestruturas pairando mais facilmente do que um método automatizado de detecção de imagem. Além disso, os métodos de detecção automática podem ser difíceis de implementar em laboratórios sem experiência em algoritmos. O presente método poderia ser amplamente adotado pelos pesquisadores devido à sua precisão e reprodutibilidade.
Em um estudo recente, mostramos que a oAβ promove a biogênese de TNTs em células neuronais por meio de um mecanismo de endocitose mediado por PAK1, dependente deactina12. TNTs induzidos por oAβ também expressam PAK1 ativado (ou fosfo-PAK1). Desenvolvemos um método de reconstrução de imagem de visão de volume 3D para distinguir TNTs imunocorados por oAβ, F-actina e fosfo-PAK1. β-III tubulina positiva, neurites em desenvolvimento muitas vezes se assemelham a estruturas flutuantes semelhantes a TNT20. Assim, distinguimos ainda mais os TNTs à base de F-actina dos neurites positivos para tubulina β-III e de outras saliências semelhantes ao TNT. Imagens de visualização de volume 3D têm sido usadas para identificar TNTs com base em suas características de pairar sobre o substrato e permanecer conectado entre duas células vizinhas. Este trabalho descreve a identificação e detecção de condutos de membrana contendo actina ou TNTs usando imagens confocais z-stack e, finalmente, quantificação manual das estruturas identificadas a partir de imagens de reconstrução de visualização de volume 3D. O método apresentado não pode distinguir TNTs próprios abertos de estruturas semelhantes a TNT fechadas; este método ajuda a identificar TNTs em cultura de células 2D in vitro em um substrato plano. No entanto, o método é fácil de implementar e reproduzir e pode ser amplamente utilizado para a quantificação precisa de apenas TNTs à base de actina e para distingui-los de neurites e estruturas β-tubulina positivas semelhantes a TNT.
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Protocol
NOTA: As células SH-SY5Y cultivadas em meio DMEM/F-12 foram diferenciadas com ácido retinóico de 10 μM por 7 dias e tratadas com oligômeros de 1 μM oAβ por 2 h a 37 °C (5% de CO2). Após o tratamento, as células foram fixadas com solução fixadora de Karnovsky e duplamente imunocoradas com anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) e faloidina ligadora de F-actina. Posteriormente, imagens confocais de pilha z foram obtidas usando um microscópio de varredura a laser confocal. Os TNTs foram quantificados por contagem manual e distinguidos de outras neurites/saliências celulares por meio da construção de imagens de visualização de volume 3D e identificação das estruturas a partir de sua característica de pairar entre duas células sem tocar o substrato (Figura 1).
1. Cultura e diferenciação celular
- Cultura das células neuronais SH-SY5Y em meio DMEM/F12 (Ham) 1:1 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de mistura de penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN). Semeia as células em um prato de imagem de 35 mm com um poço de 14 mm composto por uma tampa # 1.5 no centro do prato preso ao fundo. Semeia as células na placa de imagem a uma concentração de 12.000 células/cm2 e realize os experimentos com 60% a 70% de confluência.
- Diferenciar parcialmente as células com ácido retinóico (AR) de 10 μM de uma solução-mãe de 100 mM (5 mg de AR em 15 mL de dimetilsulfóxido [DMSO]). Em seguida, incubar as células por 7 dias a 37 °C (5% de CO 2) para diferenciação com mudança de meio a cada2 dias.
NOTA: Tenha cuidado ao manter a confluência (60%-70%) das células (células indiferenciadas e parcialmente diferenciadas). A densidade celular pode influenciar a formação de TNTs entre as células.
2. Preparação de oligômeros de βamiloide 1-42 (oAβ) para tratar células neuronais
- Dissolver Aβ 1-42 (1 mg) em 200 μL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol e dividir a solução em 20 alíquotas, cada uma contendo 0,05 mg de péptidos. Liofilizar e armazenar as alíquotas a -20 °C para utilização posterior.
- Preparar a solução-mãe (5 mM) do Aβ 1-42 liofilizado em DMSO adicionando 2,2 μL de DMSO a 0,05 mg de péptido liofilizado. Para dissolver cuidadosamente os peptídeos, vortex a solução e sonicate por 2 min em um sonicator de banho de água.
- Diluir a solução-mãe até uma concentração de 100 μM em DMEM, pH 7,4 e vórtice para converter os peptídeos em monômeros, seguida de incubação a 4 °C por 24 h para obtenção de oligômeros de Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.
- Caracterizar oAβ antes dos experimentos como relatado anteriormente21,22 por microscopia eletrônica de transmissão.
- Trate as células SH-SY5Y parcialmente diferenciadas com 1 μM oAβ. Remova o meio antes dos tratamentos e adicione DMEM fresco sem FBS. Após a mudança do meio, adicionar oAβ previamente preparado (100 μM) ao meio até uma concentração final de 1 μM. Incubar as células com 1 μM oAβ durante 2 h a 37 °C (5% CO2). Inclua um controle negativo na forma de células não tratadas.
3. Imunocoloração de F-actina e PAK1 ativada para caracterização de TNTs
- Realize imunocoloração diferencial usando o anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) e faloidina falotoxina ligadora de F-actina.
- Lavar as células de controle e as células tratadas com oAβ com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 2 x 2 min antes da fixação. Preparar a solução fixadora de Karnovsky utilizando fixador de formalina a 2% e glutaraldeído a 2,5% dissolvido em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2. Em seguida, fixe as células no prato de imagem adicionando a solução fixadora de Karnovsky (apenas o suficiente para cobrir as células) por 45 minutos à temperatura ambiente.
- Lave as células fixas 2 x 2 min usando tampão de incubação. Preparar o tampão de incubação (20x) dissolvendo 0,1 g de saponina em 5 mL de FBS e diluir para 1x adicionando 95 mL de 1x PBS.
- Após a fixação, adicionar o primeiro anticorpo contra o fofo-PAK1 a uma diluição de 1:250 no tampão de incubação e incubar durante a noite a 4 °C numa câmara húmida escura.
- No dia seguinte, após 24 h de incubação, lavar as células 2 x 2 min com o tampão de incubação; em seguida, adicione anticorpos secundários conjugados ao Alexa Fluor 488 (diluição 1:1.000) e à faloidina 555 (diluição 1:1.000). Incubar as células na câmara escura húmida durante 1,5 h à temperatura ambiente.
- Após a incubação, lave as células 2 x 2 min com tampão de incubação. Coloração do núcleo adicionando 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em uma diluição de 1:2.000 e incubar por 5 min a 10 min à temperatura ambiente no escuro.
- Prepare o meio de montagem DABCO usando 25 mg de DABCO em 90% de glicerol e 10% 1x PBS. Para dissolver corretamente, ajuste o pH para 8,6 usando o grau espectrofotométrico, dilua o HCl (diluído 1:20 com água) e mantenha a solução em um balancim para mistura.
- Como agente antibranqueador, adicione o meio de montagem DABCO diretamente no prato de imagem que contém a tampa na parte inferior. Aguarde pelo menos 1-2 h e prossiga diretamente para a realização de imagens confocais.
NOTA: Não são necessários adesivos para fixar as tampas.
4. Imunocoloração de F-actina e tubulina β-III para distinguir TNTs de neurites
- Realizar imunocoloração diferencial com anticorpo de tubulina β-III e falotoxina faloidina ligadora de F-actina.
- Lave as células tratadas com oAβ 2x com 1x PBS antes de adicionar a solução fixadora de Karnovsky. Incubar as células por 45 min à temperatura ambiente e lavar as células 2 x 2 min com tampão de incubação.
- Após a fixação, adicionar o anticorpo contra a tubulina β-III (TUBb3) a uma diluição de 1:250 no tampão de incubação e incubar a 4 °C durante a noite na câmara húmida escura.
- No dia seguinte, lave as células com tampão de incubação (2 x 2 min) e adicione anticorpos secundários conjugados ao Alexa Fluor 488 (diluição 1:1.000) e à faloidina 555 (diluição 1:1.000) juntos ao mesmo prato. Em seguida, incubar as células por 1,5 h à temperatura ambiente na câmara escura e úmida.
- Lave as células 2x com tampão de incubação e adicione DAPI de coloração nuclear em uma diluição de 1:2.000 por 5-10 min à temperatura ambiente no escuro.
- Adicione o agente antibranqueamento DABCO no meio de montagem, conforme mencionado acima, e aguarde 2 horas antes da imagem.
5. Imagem com microscopia confocal
- Para identificar TNTs, capture imagens z-stack de células imunocoradas usando um microscópio de varredura a laser confocal. Tire as imagens usando a objetiva DIC de óleo 40x/1.40 com DAPI, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e conjuntos de filtros de tetrametilrodamina (TRITC).
- Primeiro, selecione os canais clicando nos lasers necessários sequencialmente nas janelas Faixa 1, Faixa 2 e Faixa 3 no software confocal. Clique na opção T-PMT abaixo da janela Faixa 1 para obter as imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) com canais de fluorescência.
NOTA: As imagens DIC são capturadas por um detector diferente rotulado como T-PMT. - Selecione a guia de aquisição do software, clique na guia Z-stack e aguarde a abertura de uma janela. Em seguida, clique em varredura ao vivo para focar as células na parte inferior do prato. Selecione essa imagem focada como a primeira pilha. Em seguida, concentre-se para ver a parte superior da célula e selecione-a como a última pilha. Pare a varredura ao vivo e clique no número ao lado da guia ideal para corrigir o tamanho da etapa das pilhas. O tamanho da etapa determina o número de fatias e os intervalos com base na espessura das células.
NOTA: O tamanho da etapa será selecionado com base na amostragem de Nyquist para obter fatias suficientes e garantir que não haja lacunas entre as duas pilhas. A amostragem de Nyquist é determinada com base na objetiva e nos comprimentos de onda das luzes23. - Tire imagens sequenciais de três canais de DAPI, FITC e TRITC com lasers de 405 nm, 488 nm e 561 nm e capture com um tempo de permanência de pixels de 1,02 μs. Capture imagens no canal DIC com canais de fluorescência para observar o limite celular.
- Capture uma pilha de imagens com as dimensões de x: 224,92 μm e y: 224,92 μm, com cada pixel de 220 nm2 de tamanho e z-scaling de 415 nm.
- Tire imagens capturando várias pilhas z (15-22 pilhas) da parte inferior para a parte superior das células. Adquira pelo menos 10 imagens do campo aleatório do prato de cultura para obter um total de ~ 200-300 células.
- Analise as imagens capturadas off-line para identificar os TNTs por análise de visualização de volume 3D
6. Análise de imagens confocais z-stack para identificar e quantificar TNTs
- Abra as imagens confocais salvas no formato de dados .czi no software Fiji para análise.
- Selecione a opção Hyperstack para ver cada z-stack e canal da imagem. Procure as hiperpilhas das pilhas z e canais, que são abertos em uma única janela, como mostra a Figura 2. Role as barras de rolagem do canal (indicado pelas setas vermelha e verde) e z-stack (indicado pelas setas azuis) para selecionar a pilha exata de um determinado canal de interesse.
NOTA: Em células fixas, como os TNTs pairando ou os conduítes de membrana permanecem acima da superfície, as estruturas não são visíveis nas partes inferiores das pilhas z. No entanto, em células fixas, os neurites encontram-se na superfície e são detectáveis nas partes inferiores das pilhas z (z = 0 a 2). Consulte a Figura 2 para as etapas de identificação. - Como mostrado na Figura 2, selecione o canal manchado de F actina (indicado por setas vermelhas) primeiro rolando a barra de canais. Em seguida, role manualmente as pilhas z (indicadas por setas azuis) para ver cada pilha uma a uma. Identifique as estruturas coradas com actina F que parecem estar conectando células, são visíveis nas partes inferiores das pilhas z e estão próximas à superfície do prato de imagem (z = 2) como neurites (indicadas por setas brancas).
NOTA: A maioria dos neurites é fácil de identificar, pois aparecem como saliências estendidas (indicadas por setas rosas). - Identifique os TNTs, os conduítes F-actin-positivos, pairando célula a célula, rolando as pilhas z em direção ao topo (de z = 4 na Figura 2; indicado por setas amarelas). Procure neurites perto das partes inferiores das pilhas z em direção à superfície e observe que elas começam a desaparecer com a rolagem das pilhas z em direção ao topo (em z = 6 na Figura 2; neurites não são claramente visíveis).
- Identifique TNTs fosfo-PAK1-positivos de forma semelhante aos TNTs F-actin-positivos analisando a natureza pairando dos conduítes das pilhas z. Como a coloração fosfo-PAK1 é mais fraca do que a coloração F-actina, procure TNTs corados com fosfo-PAK1 em z = 4 (fracamente visível) e em z = 6 (proeminente).
- Além disso, observe as imagens DIC para verificar se as estruturas TNT coradas com F-actina e fosfo-PAK1 são condutos de membrana entre as células (Figura 3). Além disso, mescle os canais F-actina (vermelho) e fosfo-PAK1 (verde) para verificar se os TNTs identificados são estruturas cocoradas de F-actina e fosfo-PAK1 (Figura 3).
- Para quantificar os TNTs, conte o número total de células e os TNTs identificados manualmente e represente os números como porcentagens.
- Para distinguir TNTs positivos para F-actina e conduítes flutuantes β-III positivos para TNT (TUBb3) de imagens de pilha z, mescle os canais F-actina (vermelho) e TUBb3 (verde) (Figura 4). Em seguida, analise as pilhas z das imagens mescladas.
- Procure TNTs exclusivamente corados com F-actina que sejam fracamente visíveis em z = 3 e proeminentes em z = 6 e z = 9 (setas amarelas). Da mesma forma, identifique os conduítes flutuantes duplo-positivos para F-actina e β-III (TUBb3), semelhantes a TNT, em z = 6 e z = 9 (setas ciano). Identifique outras saliências coradas de tubulina F-actina e β-III, sem pairar, das partes inferiores das pilhas z (setas brancas).
- Meça o diâmetro dos TNTs usando a ferramenta de linha em Fiji. Verifique a escala de medição clicando em Analisar | Defina Escala para que a "distância em pixels" seja definida automaticamente a partir das imagens .czi. Meça os diâmetros dos TNTs no plano xy.
NOTA: A maioria dos diâmetros está entre 1 pixel e 4 pixels (ou seja, 220-880 nm); cada pixel tem 220 nm. Consulte a Figura 5 para um resumo do protocolo para a análise de imagens confocais z-stack.
7.3D reconstrução de imagens z-stack para caracterizar TNTs
- Use o plug-in visualizador de volume em Fiji, que permite o reconhecimento 3D e a visualização 3D habilitada para limite (Figura 6).
- Divida as imagens z-stack em canais individuais. Em seguida, corte as imagens z-stack de canal único (canal F-actina) para usar a visualização de reconstrução 3D para destacar um ou dois TNTs ou neurites de cada vez. Habilite o plug-in de visualização de volume para visualizar as visualizações xy, yz e xz.
- Fixe um único TNT ou neurito no plano xy (setas brancas representam neurites na Figura 6A; setas amarelas representam TNTs na Figura 6B) e marque as seções transversais dos eixos xz (vermelho) e yz (verde). Observe os neurites na parte inferior do plano xz nos planos xz e yz (setas brancas, Figura 6A) e os TNTs nas pilhas z superiores (setas amarelas, Figura 6B).
- Selecione o TNT ou neurito individual para reconstruir a visualização do volume 3D no plano xz (Figura 6C, D). Na reconstrução 3D, observe os neurites na parte inferior do plano z (setas brancas, Figura 6C) e os TNTs aparecendo como estruturas pairando conectando duas células sem tocar no plano z inferior (setas amarelas, Figura 6D).
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Representative Results
Aqui, identificamos e caracterizamos TNTs induzidos por oAβ em células neuronais SH-SY5Y através da construção de visualizações de volume 3D a partir de imagens confocais z-stack (Figura 1). As células foram duplamente imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1. Imagens confocais de z-stack de células imunocoradas foram analisadas para identificar TNTs (Figura 2). Além disso, as imagens DIC foram analisadas para verificar se as estruturas TNT coradas com F-actina e fosfo-PAK1 eram condutos de membrana entre as células (Figura 3). Além disso, as células foram duplamente imunocoradas com actina F e tubulina β-III (Figura 4). Os condutos de membrana duplamente positivos de tubulina do tipo TNT e tubulina β-III foram distinguidos apenas dos TNTs F-actin-positivos (Figura 4). Os TNTs coexpressos com fosfo-PAK1 (ou PAK1 ativado) e Cactina-F foram distinguidos de outras neurites/saliências celulares pela construção de imagens de visualização de volume 3D com base em sua característica de pairar entre duas células sem tocar o substrato (Figura 6). Os TNTs identificados foram detectados manualmente, e a porcentagem de TNTs foi calculada precisamente a partir das imagens de visualização de volume 3D. O diâmetro e o comprimento dos TNTs também foram determinados pela análise dos TNTs identificados individualmente.
Figura 1: Diagrama esquemático que representa o resumo do protocolo do método de detecção de TNTs. Barra de escala = 100 μm para imagens de microscopia (topo); 10 μm (visualizações de volume 3D). Abreviaturas: oAβ = oligomérico-amilóide-β1-42; PAK1 = quinase-1 ativada por p21. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise de imagens confocais z-stack para identificar e quantificar TNTs. Imagens confocais z-stack foram analisadas em software Fiji. Hyperstacks de z-stacks e canais abertos em uma única janela mostrando (A) F-actina e (B) fosfo-PAK1. Rolando as barras de rolagem do canal (indicado pelas setas vermelha e verde) e z-stack (indicado pelas setas azuis), as pilhas individuais de um determinado canal de interesse foram analisadas. (A) As estruturas coradas com actina F que conectam as células, visíveis nas partes inferiores das pilhas z, e consideradas próximas à superfície do prato da imagem (z = 2) foram identificadas como neurites (indicadas por setas brancas). Em contraste, os condutos conectados célula a célula visíveis nas partes mais altas das pilhas z foram identificados como TNTs (indicados por setas amarelas). (B) Da mesma forma, neurites corados com fosfo-PAK1 e TNTs foram identificados. Outras saliências curtas positivas para F-actina que não estão conectadas a células vizinhas são indicadas por setas rosas. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: TNT = nanotubos de tunelamento; PAK1 = quinase-1 ativada por p21. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de imagens DIC para confirmar TNTs. (A) Imagens DIC foram observadas para verificar que os TNTs corados com F-actina e fosfo-PAK1 e as saliências de neurite eram de fato condutos de membrana. (B) Além disso, os canais F-actina (vermelho) e fosfo-PAK1 (verde) foram fundidos para verificar se os TNTs identificados induzidos por oAβ eram estruturas cocoradas de F-actina e fosfo-PAK1. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: TNT = nanotubos de tunelamento; DIC = contraste de interferência diferencial; PAK1 = quinase-1 ativada por p21. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens confocais de pilha z analisadas usando o software de Fiji para distinguir apenas TNTs corados com F-actina da tubulina β-III e dos conduítes flutuantes de dupla coloração F-actina, semelhantes a TNT. Primeiro, os canais F-actina (vermelho) e TUBb3 (verde) das hiperpilhas foram fundidos. Em seguida, as imagens mescladas foram abertas em uma única janela. Ao rolar as barras de rolagem z-stack, TNTs corados com F-actina foram exclusivamente identificados; estes eram fracamente visíveis em z = 3 e proeminentes em z = 6 e z = 9 (setas amarelas, B). Da mesma forma, os condutos flutuantes F-actin e TUBb3 duplo-positivos, semelhantes ao TNT, foram detectáveis em z = 6 e z = 9 (setas ciano, A). Outras saliências coradas com tubulina F-actina e β-III, sem pairar, foram identificadas a partir das partes inferiores das pilhas z (setas brancas). Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: TNTs = nanotubos de tunelamento; TUBb3 = tubulina β-III. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resumo esquemático que representa o protocolo detalhado para a análise de imagens confocais z-stack. Abreviação: TNTs = nanotubos de tunelamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Vista de reconstrução 3D para destacar um ou dois TNTs ou neurites de cada vez. O plugin "volume view" em Fiji é usado para visualizar visualizações xy, yz e xz. A reconstrução 3D mostra neurite deitado na parte inferior do plano z (setas brancas nos painéis A e C), enquanto os TNTs aparecem como estruturas pairantes que conectam duas células sem tocar no plano z inferior (seta amarela nos painéis B e D). Barras de escala = 10 μm. Abreviação: TNTs = nanotubos de tunelamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Vários pesquisadores nas últimas 2 décadas vêm tentando entender e caracterizar a estrutura dos TNTs18. A falta de marcadores específicos dificulta o progresso, e há uma demanda crescente por um método conveniente e padronizado que possa ser usado para identificar, caracterizar e quantificar TNTs. Os TNTs são definidos como conduítes de membrana à base de actina F que pairam entre duas células. Estudos têm demonstrado que neurites em desenvolvimento β-tubulina-positivas, fechadas, pairam entre duas células distantes e se assemelham a estruturas semelhantes ao TNT12,13. Portanto, os TNTs são identificados e distinguidos de neurites e outras estruturas semelhantes ao TNT com base em sua positividade apenas para actina e por serem condutos de membrana que pairam entre duas células distantes. Os pesquisadores muitas vezes acham difícil obter estruturas de TNT intactas durante a fixação antes da imagem24. Para superar esse problema, utilizou-se uma solução fixadora modificada com glutaraldeído a 2,5% (fixador de Karnovsky) para fixar as células neuronais SH-SY5Y utilizadas neste protocolo25.
Uma etapa crítica de cada experimento de imuno-histoquímica/imunocitoquímica é a fixação da amostra, que depende da seleção do agente fixador apropriado. A fixação imperfeita da amostra pode levar a uma rápida degradação proteolítica das proteínas-alvo e a uma redução na imunorreatividade específica. A superfixação causa mascaramento do epítopo e incerteza na rotulagem específica causada pelo fundo não específico. Método, tempo ou duração, temperatura e pH também influenciam a fixação adequada das células26.
O paraformaldeído é amplamente utilizado como agente fixador na imunocoloração de células. As desvantagens do uso de paraformaldeído como agente fixador incluem a perda de antigenicidade e alterações na morfologia. O glutaraldeído tem menor pressão osmótica, é mais estável em solução e reticula facilmente, dando melhores resultados27. Uma combinação de fixador de formaldeído-glutaraldeído (em tampão fosfato) resulta em fixação excepcional de uma ampla gama de amostras de tecido/célula. Essa combinação permite a rápida estabilização da ultraestrutura celular pelo formaldeído, seguida de uma fixação permanente pela ação penetrante mais lenta do glutaraldeído28.
Os TNTs que são positivos para F-actina e fosfo-PAK1 distinguem-se dos neurites com base em sua característica de pairar entre duas células em cultura de células 2D in vitro em um substrato plano. Os TNTs identificados foram detectados manualmente com análise de visualização de volume 3D, e as porcentagens de TNTs formados foram calculadas por contagem manual. O método manual dificulta a quantificação de grandes quantidades de dados, uma vez que requer imensa mão de obra19. No entanto, os olhos treinados podem detectar TNTs de forma eficiente e distingui-los dos neurites com melhor precisão do que os métodos de detecção automática. Os métodos de detecção automática existentes também são difíceis de implementar em todos os laboratórios sem a experiência disponível para desenvolver um algoritmo e / ou alterar o algoritmo existente, conforme necessário para a configuração experimental. O método manual de análise de volume 3D facilita a identificação das estruturas de membrana situadas entre as células nas partes inferiores das pilhas z e aquelas que pairam nas partes média e superior das pilhas z para distinguir claramente entre neurites e TNTs.
Os TNTs podem ser distinguidos de outras saliências de membrana, como neurites ou microtubos tumorais. No entanto, é difícil distinguir entre tubos de membrana de diâmetro de tamanho nano abertos e fechados, o que levanta a seguinte questão: eles são TNTs ou estruturas semelhantes a TNT? Desde a última década, uma enorme quantidade de dados foi acumulada para mostrar o papel inevitável dos TNTs na disseminação da patologia, resistência ao câncer e terapia17. Portanto, os pesquisadores estão procurando o desenvolvimento de fabricantes específicos que mudarão o campo da comunicação intercelular direta e de longa distância. Até lá, métodos de imagem reprodutíveis de caracterização estão em alta demanda para preparar o caminho para o progresso contínuo no campo.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.
Acknowledgments
D.K.V e A.R agradecem à Academia Manipal de Ensino Superior pela bolsa TMA Pai. Agradecemos ao Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia da Índia pelo SERB-SRG (#SRG/2021/001315), bem como ao Conselho Indiano de Pesquisa Médica da Índia (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) e ao fundo Intramural da Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Índia. Agradecemos à instalação confocal do JNCASR (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Índia) e à B. Suma pela microscopia confocal no JNCASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
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