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Biology

Detección y cuantificación de nanotubos de túnel utilizando imágenes de vista de volumen 3D

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/63992
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, India
* These authors contributed equally

Summary

Los nanotubos de túnel (TNT) son principalmente nanotubos de membrana de actina F abiertos que conectan las células vecinas, facilitando la comunicación intercelular. La característica notable que distingue a los TNT de otras protuberancias celulares es la naturaleza flotante de los nanotubos entre las células. Aquí, caracterizamos los TNT mediante la construcción de una vista de volumen 3D de imágenes confocales de pila z.

Abstract

Descubrimientos recientes han revelado que las células realizan una transferencia intercelular directa y de largo alcance a través de conductos de membrana de actina a nanoescala, a saber, "nanotubos de túnel" (TNT). Los TNT se definen como extensiones de membrana abiertas rodeadas de bicapa lipídica que median la continuidad entre células vecinas de diámetros que oscilan entre 50 nm y 1 μm. Los TNT se demostraron inicialmente en células neuronales, pero estudios sucesivos han revelado la existencia de TNT en varios tipos de células y enfermedades, como enfermedades neurodegenerativas, infecciones virales y cáncer. Varios estudios se han referido a nanoestructuras de membrana cerradas y acopladas eléctricamente entre células vecinas como TNT o estructuras similares a TNT.

La elucidación de la ultraestructura en términos de continuidad de la membrana en el punto final es técnicamente desafiante. Además, los estudios sobre la comunicación célula-célula son desafiantes en términos de la caracterización de TNT utilizando métodos convencionales debido a la falta de marcadores específicos. Los TNT se definen principalmente como protuberancias de membrana abiertas basadas en actina F. Sin embargo, una limitación importante es que la actina F está presente en todos los tipos de protuberancias, lo que dificulta la diferenciación de los TNT de otras protuberancias. Una de las características notables de los TNT basados en actina F es que estas estructuras flotan entre dos células sin tocar el sustrato. Por lo tanto, los distintos TNT teñidos con actina F se pueden distinguir convenientemente de otras protuberancias como los filopodios y las neuritas en función de su flotación entre las células.

Recientemente hemos demostrado que la internalización de la β amiloide oligomérica 1-42 (oAβ) a través de endocitosis dependiente de actina estimula la quinasa-1 activada por p21 activada (PAK1), que media la formación de TNT que contienen actina F coexpresados con fosfo-PAK1 entre las células neuronalesSH-SY5Y. Este protocolo describe un método de análisis de volumen 3D para identificar y caracterizar TNT a partir de las imágenes capturadas de la pila z de protuberancias de membrana inmunoteñidas con actina F y fosfo-PAK1 en células neuronales tratadas con oAβ. Además, los TNT se distinguen del desarrollo de neuritas y excrecencias neuronales basadas en conductos de membrana inmunoteñidos con tubulina F-actina y β-III.

Introduction

Los nanotubos de túnel (TNT) son conductos de membrana basados principalmente en actina F, principalmente abiertos, y desempeñan un papel vital en la transferencia intercelular de carga y orgánulos1. La característica única de los TNT es que conectan las células vecinas sin ningún contacto con el sustrato; Tienen más de 10-300 μm de longitud y sus diámetros varían entre 50 nm a 1 μm 2,3. Los TNT son estructuras transitorias, y su vida dura entre unos pocos minutos y varias horas. Los TNT se demostraron por primera vez en células neuronales PC121; Posteriormente, numerosos estudios demostraron su existencia en varios tipos celulares in vitro e in vivo 4,5. Varios estudios han revelado la importancia patológica de los TNT en diversos modelos de enfermedades, como enfermedades neurodegenerativas, cáncer e infecciones virales 6,7,8.

Las heterogeneidades estructurales de los TNT han sido demostradas por varios estudios en diversos sistemas celulares9. Las diferencias se basan en la composición del citoesqueleto, el mecanismo de formación y los tipos de carga transferidos10. Principalmente, se considera que la continuidad de membrana abierta y positiva para actina F que se cierne entre dos células vecinas y transfiere orgánulos consiste en TNT11. Sin embargo, la falta de claridad o diversidad observada en la formación de TNT se suma a la dificultad en el desarrollo de marcadores específicos de TNT. Por lo tanto, es difícil identificar estructuras de TNT por métodos de detección convencionales y distinguir nanotubos de membrana en términos de protuberancias abiertas y cerradas12. Sin embargo, la característica de los TNT de flotar como protuberancias de membrana de actina F entre dos células es relativamente más fácil y más factible de identificar utilizando técnicas de imagen convencionales. Otras protuberancias celulares basadas en actina, como los filopodios y los filopodios dorsales, no pueden flotar entre dos células distantes, particularmente cuando las células son fijas. Cabe destacar que las neuritas en desarrollo cerradas, acopladas eléctricamente, a menudo se denominan estructuras similares al TNT13.

Se sabe que la actina F juega un papel importante en la formación de TNT, y varios estudios han demostrado que el inhibidor de la actina F citocalasina D inhibe la formación de TNTs14,15. En contraste, los inhibidores de los microtúbulos no tienen ningún efecto sobre la formación de TNT16. En las últimas 2 décadas se han producido varios informes sobre el importante papel que desempeñan los TNT en la propagación de la patología y la resistencia tumoral y la terapia17. Por lo tanto, existe una demanda interminable de mejores técnicas para la caracterización de TNT.

La falta de marcadores específicos de TNT y la diversidad en morfología y composición citoesquelética dificultan el desarrollo de un método único de caracterización. Algunos estudios han utilizado técnicas automatizadas de detección de imágenes y cuantificación de TNT18,19. Sin embargo, hay varias ventajas del actual método de análisis manual de volumen 3D sobre el análisis automático de imágenes para la detección y cuantificación de TNT. A menudo, los ojos humanos entrenados pueden detectar estas nanoestructuras flotantes más fácilmente que un método automatizado de detección de imágenes. Además, los métodos de detección automática podrían ser difíciles de implementar en laboratorios que carecen de experiencia en algoritmos. El presente método podría ser ampliamente adoptado por los investigadores debido a su precisión y reproducibilidad.

En un estudio reciente, demostramos que oAβ promueve la biogénesis de TNTs en células neuronales a través de un mecanismo de endocitosis mediado por PAK1, dependiente de actina12. oLos TNT inducidos por Aβ también expresan PAK1 activado (o fosfo-PAK1). Desarrollamos un método de reconstrucción de imágenes de vista de volumen 3D para distinguir TNT inmunoteñidos con oAβ, F-actina y fosfo-PAK1. Las neuritas en desarrollo β-III positivas para tubulina a menudo se asemejan a estructuras flotantes similares al TNT20. Por lo tanto, distinguimos aún más los TNT basados en actina F de las neuritas β-III tubulina positivas y otras protuberancias similares al TNT. Las imágenes de vista de volumen 3D se han utilizado para identificar TNT sobre la base de sus características de flotar sobre el sustrato y permanecer conectado entre dos células vecinas. Este artículo describe la identificación y detección de conductos de membrana que contienen actina o TNT utilizando imágenes confocales de pila z y, finalmente, la cuantificación manual de las estructuras identificadas a partir de imágenes de reconstrucción de vista de volumen 3D. El método presentado no puede distinguir los TNT propios de final abierto de las estructuras similares al TNT de extremo cerrado; este método ayuda a identificar TNT en cultivo celular 2D in vitro en un sustrato plano. Sin embargo, el método es fácil de implementar y reproducir y puede ser ampliamente utilizado para la cuantificación precisa de TNT basados en actina y para distinguirlos de las neuritas y las estructuras similares al TNT positivas para β-tubulina.

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Protocol

NOTA: Las células SH-SY5Y cultivadas en medios DMEM/F-12 se diferenciaron con ácido retinoico 10 μM durante 7 días y se trataron con oligómeros oAβ de 1 μM durante 2 h a 37 °C (5% deCO2). Después del tratamiento, las células se fijaron con la solución fijadora de Karnovsky y se inmunotiñeron dos veces con el anticuerpo fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) y faloidina de unión a actina F. Más tarde, se tomaron imágenes confocales de la pila z utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Los TNT se cuantificaron mediante conteo manual y se distinguieron de otras protuberancias neuritas / células mediante la construcción de imágenes de vista de volumen 3D e identificando las estructuras a partir de su característica de flotar entre dos células sin tocar el sustrato (Figura 1).

1. Cultivo celular y diferenciación

  1. Cultivar las células neuronales SH-SY5Y en medios DMEM/F12 (Ham) 1:1 con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de mezcla de penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN). Siembra las células en un plato de imágenes de 35 mm con un pozo de 14 mm compuesto por un cubreobjetos # 1.5 en el centro del plato unido a la parte inferior. Siembra las células en la placa de imagen a una concentración de 12.000 células/cm2 y realiza los experimentos a una confluencia del 60%-70%.
  2. Diferenciar parcialmente las células con ácido retinoico (AR) de 10 μM de una solución madre de 100 mM (5 mg de AR en 15 ml de dimetilsulfóxido [DMSO]). Luego, incubar las células durante 7 días a 37 °C (5%CO2) para diferenciarlas con cambio de medios cada 2 días.
    NOTA: Tenga cuidado al mantener la confluencia (60%-70%) de las células (tanto células indiferenciadas como parcialmente diferenciadas). La densidad celular puede influir en la formación de TNT entre las células.

2. Preparación de oligómeros de amiloide-β1-42 (oAβ) para tratar células neuronales

  1. Disolver Aβ 1-42 (1 mg) en 200 μL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol y dividir la solución en 20 alícuotas, cada una de las cuales contiene 0,05 mg de péptidos. Liofilizar y almacenar las alícuotas a −20 °C para su uso posterior.
  2. Preparar la solución madre (5 mM) del Aβ 1-42 liofilizado en DMSO añadiendo 2,2 μL de DMSO a 0,05 mg de péptido liofilizado. Para disolver cuidadosamente los péptidos, vortex la solución y sonicar durante 2 minutos en un sonicador de baño de agua.
  3. Diluir la solución madre a una concentración de 100 μM en DMEM, pH 7.4, y vórtice para convertir los péptidos en monómeros, seguido de la incubación a 4 °C durante 24 h para obtener oligómeros de Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.
  4. Caracterizar oAβ antes de los experimentos como se informó anteriormente21,22 por imágenes de microscopía electrónica de transmisión.
  5. Tratar las células SH-SY5Y parcialmente diferenciadas con 1 μM oAβ. Retire el medio antes de los tratamientos y agregue DMEM fresco libre de FBS. Después del cambio de medio, añadir oAβ previamente preparado (100 μM) al medio hasta una concentración final de 1 μM. Incubar las células con 1 μM oAβ durante 2 h a 37 °C (5% CO2). Incluir un control negativo en forma de células no tratadas.

3. Inmunotinción de F-actina y activado-PAK1 para la caracterización de TNTs

  1. Realizar inmunotinción diferencial mediante el uso de anticuerpos fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) y faloidina falotoxina fijadora a actina F.
  2. Lave las células de control y tratadas con oAβ con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 2 x 2 min antes de la fijación. Preparar la solución fijadora de Karnovsky utilizando fijador de formalina al 2% y glutaraldehído al 2,5% disuelto en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,2. Luego, fije las células en la placa de imágenes agregando la solución fijadora de Karnovsky (lo suficiente para cubrir las células) durante 45 minutos a temperatura ambiente.
  3. Lave las celdas fijas 2 x 2 min usando tampón de incubación. Preparar el tampón de incubación (20x) disolviendo 0,1 g de saponina en 5 mL de FBS y diluir a 1x añadiendo 95 mL de 1x PBS.
  4. Después de la fijación, añadir el primer anticuerpo contra phopho-PAK1 a una dilución de 1:250 en el tampón de incubación e incubar durante la noche a 4 °C en una cámara húmeda oscura.
  5. Al día siguiente, después de 24 h de incubación, lavar las células 2 x 2 min con el tampón de incubación; luego, agregue el anticuerpo secundario conjugado a Alexa Fluor 488 (dilución 1: 1,000) y faloidina 555 (dilución 1: 1,000). Incubar las células en la cámara húmeda oscura durante 1,5 h a temperatura ambiente.
  6. Después de la incubación, lavar las celdas 2 x 2 min con tampón de incubación. Manchar el núcleo añadiendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en una dilución 1:2.000 e incubar durante 5 min a 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  7. Prepare el medio de montaje DABCO utilizando 25 mg de DABCO en 90% de glicerol y 10% 1x PBS. Para disolver correctamente, ajuste el pH a 8.6 usando grado espectrofotométrico, diluya HCl (diluido 1:20 con agua) y mantenga la solución en un balancín para mezclar.
  8. Como agente antiblanqueador, agregue el medio de montaje DABCO directamente sobre la placa de imagen que contiene el cubreobjetos en la parte inferior. Espere al menos 1-2 h y proceda directamente a realizar imágenes confocales.
    NOTA: No se requieren adhesivos para fijar los cubreobjetos.

4. Inmunotinción de F-actina y tubulina β-III para distinguir los TNT de las neuritas

  1. Realizar inmunotinción diferencial con el anticuerpo de tubulina β-III y la faloidina falotoxina fijadora a actina F.
  2. Lave las células tratadas con oAβ 2x con 1x PBS antes de agregar la solución fijadora de Karnovsky. Incubar las celdas durante 45 min a temperatura ambiente y lavar las celdas 2 x 2 min con tampón de incubación.
  3. Después de la fijación, añadir el anticuerpo contra la tubulina β-III (TUBb3) a una dilución de 1:250 en el tampón de incubación e incubar a 4 °C durante la noche en la cámara húmeda oscura.
  4. Al día siguiente, lave las células con tampón de incubación (2 x 2 min) y agregue el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (dilución 1: 1,000) y Phalloidin 555 (dilución 1: 1,000) juntos al mismo plato. Luego, incubar las células durante 1,5 h a temperatura ambiente en la cámara húmeda oscura.
  5. Lave las células 2 veces con tampón de incubación y agregue DAPI de tinción nuclear en una dilución 1: 2,000 durante 5-10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
  6. Agregue el agente antiblanqueador DABCO en el medio de montaje como se mencionó anteriormente y espere 2 horas antes de obtener imágenes.

5. Imagen con microscopía confocal

  1. Para identificar TNT, capture imágenes z-stack de células inmunoteñidas utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Tome las imágenes utilizando el objetivo DIC de aceite 40x / 1.40 con DAPI, isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjuntos de filtros de tetrametilrodamina (TRITC).
  2. Primero, seleccione los canales haciendo clic secuencialmente en los láseres requeridos en las ventanas Track 1, Track 2 y Track 3 en el software confocal. Haga clic en la opción T-PMT debajo de la ventana Pista 1 para tomar las imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) con canales de fluorescencia.
    NOTA: Las imágenes DIC son capturadas por un detector diferente etiquetado como T-PMT.
  3. Seleccione la pestaña de adquisición del software, haga clic en la pestaña Z-stack y espere a que se abra una ventana. Luego, haga clic en escaneo en vivo para enfocar las celdas en la parte inferior del plato. Seleccione esa imagen enfocada como la primera pila. Luego, concéntrese hacia arriba para ver la parte superior de la celda y selecciónela como la última pila. Detenga el escaneo en vivo y haga clic en el número junto a la pestaña óptima para corregir el tamaño del paso de las pilas. El tamaño del paso determina el número de cortes y los intervalos en función del grosor de las celdas.
    NOTA: El tamaño del paso se seleccionará en función del muestreo de Nyquist para tomar suficientes cortes y garantizar que no haya espacios entre las dos pilas. El muestreo de Nyquist se determina sobre la base del objetivo y las longitudes de onda de las luces23.
  4. Tome imágenes secuenciales de tres canales de DAPI, FITC y TRITC con láseres de 405 nm, 488 nm y 561 nm y capture con un tiempo de permanencia de píxeles de 1,02 μs. Capture imágenes en el canal DIC con canales de fluorescencia para observar el límite celular.
  5. Captura una pila de imágenes con las dimensiones de x: 224,92 μm e y: 224,92 μm, con cada píxel de 220 nm 2 de tamaño y escala z de 415 nm.
  6. Tome imágenes capturando varias pilas z (15-22 pilas) desde la parte inferior hasta la parte superior de las celdas. Adquiera al menos 10 imágenes del campo aleatorio de la placa de cultivo para obtener un total de ~ 200-300 células.
  7. Analice las imágenes capturadas sin conexión para identificar los TNT mediante el análisis de vista de volumen 3D

6. Análisis de imágenes confocales z-stack para identificar y cuantificar TNTs

  1. Abra las imágenes confocales guardadas en formato de datos .czi en el software Fiji para su análisis.
  2. Seleccione la opción Hyperstack para ver cada z-stack y canal de la imagen. Busque las hiperpilas de las pilas z y los canales, que se abren en una sola ventana, como se muestra en la Figura 2. Desplácese por las barras de desplazamiento del canal (indicado por flechas rojas y verdes) y la pila z (indicada por flechas azules) para seleccionar la pila exacta de un canal de interés en particular.
    NOTA: En las celdas fijas, como los TNT flotantes o los conductos de membrana permanecen por encima de la superficie, las estructuras no son visibles en las partes inferiores de las pilas z. Sin embargo, en las células fijas, las neuritas se encuentran en la superficie y son detectables en las partes inferiores de las pilas z (z = 0 a 2). Consulte la figura 2 para conocer los pasos de identificación.
  3. Como se muestra en la Figura 2, seleccione primero el canal teñido con actina F (indicado con flechas rojas) desplazándose por la barra de canales. Luego, desplácese manualmente por las pilas z (indicadas por flechas azules) para ver cada pila una por una. Identifique las estructuras teñidas con actina F que parecen estar conectando células, son visibles en las partes inferiores de las pilas z y están cerca de la superficie de la placa de imágenes (z = 2) como neuritas (indicadas por flechas blancas).
    NOTA: La mayoría de las neuritas son fáciles de identificar, ya que aparecen como protuberancias extendidas (indicadas por flechas rosas).
  4. Identifique los TNT, los conductos de célula a celda positivos para la actina F, desplazándose por las pilas z hacia la parte superior (de z = 4 en la Figura 2; indicado por flechas amarillas). Busque neuritas cerca de las partes inferiores de las pilas z hacia la superficie y observe que comienzan a desaparecer con el desplazamiento de las pilas z hacia la parte superior (en z = 6 en la Figura 2; las neuritas no son claramente visibles).
  5. Identifique los TNT fosfo-PAK1 positivos de manera similar a los TNT positivos para la actina F analizando la naturaleza flotante de los conductos de las pilas z. Como la tinción de fosfo-PAK1 es más débil que la tinción de actina F, busque TNT teñidos con fosfo-PAK1 en z = 4 (apenas visible) y en z = 6 (prominente).
  6. Además, observe las imágenes DIC para verificar que las estructuras TNT teñidas con F-actina y fosfo-PAK1 son conductos de membrana entre las células (Figura 3). Además, fusionar los canales F-actina (rojo) y fosfo-PAK1 (verde) para verificar que los TNT identificados son estructuras co-teñidas con F-actina y fosfo-PAK1 (Figura 3).
  7. Para cuantificar los TNT, cuente los números totales de celdas y los TNT identificados manualmente y represente los números como porcentajes.
  8. Para distinguir los TNT positivos para la actina F y los conductos flotantes positivos para la tubulina β-III (TUBb3) y similares al TNT de las imágenes de pila z, combine los canales F-actina (rojo) y TUBb3 (verde) (Figura 4). Luego, analice las pilas z de las imágenes combinadas.
    1. Busque TNT teñidos exclusivamente con actina F que sean apenas visibles en z = 3 y prominentes en z = 6 y z = 9 (flechas amarillas). Del mismo modo, identifique conductos flotantes tipo TNT doblemente positivos con actina F y tubulina β-III (TUBb3) en z = 6 y z = 9 (flechas cian). Identifique otras protuberancias no flotantes teñidas con actina F y β-III de las partes inferiores de las pilas z (flechas blancas).
  9. Mida el diámetro de los TNT utilizando la herramienta de línea en Fiji. Verifique la escala de medición haciendo clic en Analizar | Establezca Escala para que la "distancia en píxeles" se establezca automáticamente a partir de las imágenes .czi. Mida los diámetros de los TNT en el plano xy.
    NOTA: La mayoría de los diámetros están entre 1 píxel y 4 píxeles (es decir, 220-880 nm); Cada píxel es de 220 nm. Consulte la figura 5 para obtener un resumen del protocolo para el análisis de imágenes confocales z-stack.

7.3D reconstrucción de imágenes z-stack para caracterizar TNTs

  1. Utilice el complemento de visor de volumen en Fiji, que permite la resegmentación 3D y la visualización 3D habilitada para umbrales (Figura 6).
  2. Divida las imágenes z-stack en canales individuales. Luego, recorte las imágenes de pila z de un solo canal (canal F-actina) para usar la vista de reconstrucción 3D para resaltar uno o dos TNT o neuritas a la vez. Habilite el complemento de vista de volumen para visualizar las vistas xy, yz y xz.
  3. Ancle un solo TNT o neurita en el plano xy (las flechas blancas representan neuritas en la Figura 6A; las flechas amarillas representan TNT en la Figura 6B) y marque las secciones transversales de los ejes xz (rojo) e yz (verde). Observe las neuritas en la parte inferior del plano xz en los planos xz e yz (flechas blancas, Figura 6A) y los TNT en las pilas z superiores (flechas amarillas, Figura 6B).
  4. Seleccione el TNT o neurita individual para reconstruir la vista de volumen 3D en el plano xz (Figura 6C, D). En la reconstrucción 3D, observe las neuritas en la parte inferior del plano z (flechas blancas, Figura 6C) y los TNT que aparecen como estructuras flotantes que conectan dos células sin tocar el plano z inferior (flechas amarillas, Figura 6D).

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Representative Results

Aquí, identificamos y caracterizamos TNT inducidos por oAβ en células neuronales SH-SY5Y mediante la construcción de vistas de volumen 3D a partir de imágenes confocales de pila z (Figura 1). Las células fueron doblemente inmunoteñidas con actina F y fosfo-PAK1. Se analizaron imágenes confocales de pila z de células inmunoteñidas para identificar TNT (Figura 2). Además, se analizaron imágenes DIC para verificar que las estructuras de TNT teñidas con F-actina y fosfo-PAK1 eran conductos de membrana entre las células (Figura 3). Además, las células fueron doblemente inmunoteñidas con actina F y tubulina β-III (Figura 4). Los conductos de membrana doble positivos de la actina F similar al TNT y la tubulina β-III se distinguieron de los TNT positivos para la actina F (Figura 4). Los TNT coexpresados con fosfo-PAK1 (o PAK1 activado) y actina F se distinguieron de otras protuberancias neuritas / celulares mediante la construcción de imágenes de vista de volumen 3D basadas en su característica de flotar entre dos células sin tocar el sustrato (Figura 6). Los TNT identificados se detectaron manualmente, y el porcentaje de TNT se calculó con precisión a partir de las imágenes de vista de volumen 3D. El diámetro y la longitud de los TNT también se determinaron mediante el análisis de los TNT identificados individualmente.

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático que representa el resumen del protocolo del método de detección de TNT. Barra de escala = 100 μm para imágenes de microscopía (arriba); 10 μm (vistas de volumen 3D). Abreviaturas: oAβ = amiloide oligomérico-β1-42; PAK1 = quinasa-1 activada por p21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis de imágenes confocales z-stack para identificar y cuantificar TNTs. Las imágenes confocales de la pila z se analizaron en el software Fiji. Hiperpilas de pilas z y canales abiertos en una sola ventana que muestra (A) F-actina y (B) fosfo-PAK1. Al desplazar las barras de desplazamiento del canal (indicado por flechas rojas y verdes) y la pila z (indicada por flechas azules), se analizaron las pilas individuales de un canal de interés en particular. (A) Las estructuras teñidas con actina F que conectan las células, visibles en las partes inferiores de las pilas z, y consideradas cercanas a la superficie de la antena de imagen (z = 2) se identificaron como neuritas (indicadas por flechas blancas). En contraste, los conductos conectados de celda a celda visibles en las partes más altas de las pilas z se identificaron como TNT (indicados por flechas amarillas). (B) Del mismo modo, se identificaron neuritas y TNT teñidas con fosfo-PAK1. Otras protuberancias cortas positivas para actina F que no están conectadas a células vecinas se indican con flechas rosadas. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: TNT = nanotubos de túnel; PAK1 = quinasa-1 activada por p21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de imágenes DIC para confirmar TNT. (A) Se observaron imágenes DIC para verificar que los TNT teñidos con F-actina y fosfo-PAK1 y las protuberancias de neurita eran realmente conductos de membrana. (B) Además, los canales F-actina (rojo) y fosfo-PAK1 (verde) se fusionaron para verificar que los TNT inducidos por oAβ identificados eran estructuras co-teñidas con F-actina y fosfo-PAK1. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: TNT = nanotubos de túnel; DIC = contraste de interferencia diferencial; PAK1 = quinasa-1 activada por p21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes confocales de pila z analizadas utilizando el software de Fiji para distinguir solo los TNT teñidos con actina F de la tubulina β-III y los conductos flotantes similares al TNT con doble tinción de actina F. Primero, se fusionaron los canales F-actina (rojo) y TUBb3 (verde) de las hiperpilas. Luego, las imágenes combinadas se abrieron en una sola ventana. Al desplazarse por las barras de desplazamiento de la pila z, se identificaron exclusivamente los TNT teñidos con actina F; estos eran apenas visibles en z = 3 y prominentes en z = 6 y z = 9 (flechas amarillas, B). De manera similar, los conductos flotantes tipo TNT doblemente positivos y doble positivos de actina F y TUBb3 fueron detectables en z = 6 y z = 9 (flechas cian, A). Se identificaron otras protuberancias no flotantes teñidas con actina F y β-III en las partes inferiores de las pilas z (flechas blancas). Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: TNTs = nanotubos de túnel; TUBb3 = tubulina β-III. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Resumen esquemático que representa el protocolo detallado para el análisis de imágenes confocales z-stack. Abreviatura: TNTs = nanotubos de túnel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Vista de reconstrucción 3D para resaltar uno o dos TNT o neuritas a la vez. El complemento "vista de volumen" en Fiji se utiliza para visualizar las vistas xy, yz y xz. La reconstrucción 3D muestra neuritas en la parte inferior del plano z (flechas blancas en los paneles A y C), mientras que los TNT aparecen como estructuras flotantes que conectan dos celdas sin tocar el plano z inferior (flecha amarilla en los paneles B y D). Barras de escala = 10 μm. Abreviatura: TNTs = nanotubos de túnel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Varios investigadores en las últimas 2 décadas han estado tratando de entender y caracterizar la estructura de TNTs18. La falta de marcadores específicos dificulta el progreso, y existe una creciente demanda de un método conveniente y estandarizado que se pueda utilizar para identificar, caracterizar y cuantificar los TNT. Los TNT se definen como conductos de membrana basados en actina F que flotan entre dos células. Los estudios han demostrado que las neuritas en desarrollo β positivas para la tubulina, de extremo cerrado, flotan entre dos células distantes y se asemejan a estructuras similares al TNT12,13. Por lo tanto, los TNT se identifican y distinguen de las neuritas y otras estructuras similares al TNT en función de su positividad solo para la actina y para ser conductos de membrana que flotan entre dos células distantes. A los investigadores a menudo les resulta difícil obtener estructuras intactas de TNT durante la fijación antes de la obtención de imágenes24. Para superar este problema, utilizamos una solución fijadora modificada con glutaraldehído al 2,5% (fijador de Karnovsky) para fijar las células neuronales SH-SY5Y utilizadas en este protocolo25.

Un paso crítico de cada experimento de inmunohistoquímica/inmunocitoquímica es la fijación de la muestra, que se basa en la selección del agente fijador apropiado. La fijación imperfecta de la muestra puede conducir a una rápida degradación proteolítica de las proteínas diana y a una reducción de la inmunorreactividad específica. La sobrefijación causa enmascaramiento del epítopo e incertidumbre en el etiquetado específico causado por el fondo no específico. El método, el tiempo o la duración, la temperatura y el pH también influyen en la fijación adecuada de las células26.

El paraformaldehído se utiliza ampliamente como agente fijador en la inmunotinción de las células. Las desventajas de usar paraformaldehído como agente fijador incluyen la pérdida de antigenicidad y cambios en la morfología. El glutaraldehído tiene una presión osmótica más baja, es más estable en solución y se entrecruza fácilmente, dando así mejores resultados27. Una combinación de fijador formaldehído-glutaraldehído (en tampón fosfato) da como resultado una fijación excepcional de una amplia gama de muestras de tejido/célula. Esta combinación permite una rápida estabilización de la ultraestructura de la célula por formaldehído, seguida de una fijación permanente por la acción penetrante más lenta del glutaraldehído28.

Los TNT que son positivos para F-actina y fosfo-PAK1 se distinguen de las neuritas en función de su característica de flotar entre dos células en cultivo celular 2D in vitro en un sustrato plano. Los TNT identificados se detectaron manualmente con análisis de vista de volumen 3D, y los porcentajes de TNT formados se calcularon mediante conteo manual. El método manual dificulta la cuantificación de grandes cantidades de datos, ya que requiere una inmensa mano de obra19. Sin embargo, los ojos entrenados pueden detectar TNT de manera eficiente y distinguirlos de las neuritas con mejor precisión que los métodos de detección automática. Los métodos de detección automática existentes también son difíciles de implementar en todos los laboratorios sin la experiencia disponible para desarrollar un algoritmo y / o cambiar el algoritmo existente según sea necesario para la configuración experimental. El método manual de análisis de vista de volumen 3D facilita la identificación de las estructuras de membrana que se encuentran entre las células en las partes inferiores de las pilas z y las que flotan en las partes media y superior de las pilas z para distinguir claramente entre neuritas y TNT.

Los TNT se pueden distinguir de otras protuberancias de membrana como neuritas o microtubos tumorales. Sin embargo, es difícil distinguir entre tubos de membrana de diámetro abierto y cerrado, de tamaño nanométrico, lo que plantea la siguiente pregunta: ¿son TNT o estructuras similares al TNT? Desde la última década, se ha acumulado una gran cantidad de datos para mostrar el papel inevitable de los TNT en la propagación de la patología, la resistencia al cáncer y la terapia17. Por lo tanto, los investigadores están buscando el desarrollo de fabricantes específicos que cambien el campo de la comunicación intercelular directa a larga distancia. Hasta entonces, los métodos de caracterización de imágenes reproducibles tienen una gran demanda para allanar el camino para el progreso continuo en el campo.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Acknowledgments

D.K.V y A.R agradecen a la Academia Manipal de Educación Superior por la beca TMA Pai. Agradecemos a la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería de la India por SERB-SRG (#SRG/2021/001315), así como al Consejo Indio de Investigación Médica de la India (# 5/4-5 / Ad-hoc / Neuro / 216 / 2020-NCD-I) y al fondo intramuros de la Academia Manipal de Educación Superior, Manipal, India. Agradecemos a la instalación confocal de JNCASR (Centro Jawaharlal Nehru para la Investigación Científica Avanzada, India) y a B. Suma por la microscopía confocal en JNCASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip Cellvis D35-14-1.5-N Imaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mg AnaSpec #64129 Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11070 Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety Cabinet Thermo Scientific (MSC Advantage) 51025411 Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 Incubator Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) 51026556 For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS (Carl Zeiss) LSM 880 Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] Merck 8034560100 Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-1MG Neuclear stainer
DMEM media Gibco 11965092 Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
 DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) Gibco 12500062 Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade Cryopur CP-100 Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade Himedia MB058 Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine Serum Gibco 16000044  Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) Sigma Aldrich HT5014-120ML Component in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) Sigma G5882 Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution TCI H024 Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) National Institute of Health (NIH) Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
Lyophilizer Christ, Alpha 2.4 LDplus 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture Thermo fisher Scientific 15640055 Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555 Abcam ab176756 F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] CST #2601 Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) Cloud clone PAE711Hu01 Primary antibody
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Differentiating reagent
Saponin Merck 8047-15-2 Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) Ultrasonic Cleaner 3.0 L/3.2 Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy software ZEISS (Carl Zeiss) Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation

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References

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Detección y cuantificación de nanotubos de túnel utilizando imágenes de vista de volumen 3D
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Valappil, D. K., Raghavan, A., Nath, S. Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images. J. Vis. Exp. (186), e63992, doi:10.3791/63992 (2022).

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