Summary
CAM-Delam-analysen til evaluering af kræftcellernes metastatiske kapacitet er relativt hurtig, nem og billig. Metoden kan bruges til at optrævle de molekylære mekanismer, der regulerer metastasedannelse og til lægemiddelscreening. Et optimeret assay til analyse af humane tumorprøver kan være en klinisk metode til personlig kræftbehandling.
Abstract
Hovedårsagen til kræftrelaterede dødsfald er metastasedannelse (dvs. når kræftceller spredes fra den primære tumor til fjerne organer og danner sekundære tumorer). Delaminering, defineret som nedbrydning af basal lamina og kældermembran, er den indledende proces, der letter transmigration og spredning af kræftceller til andre væv og organer. Scoring af kræftcellernes delamineringskapacitet ville indikere disse cellers metastatiske potentiale.
Vi har udviklet en standardiseret metode, ex ovo CAM-Delam assayet, til at visualisere og kvantificere kræftcellers evne til at delaminere og invadere og derved kunne vurdere metastatisk aggressivitet. Kort fortalt omfatter CAM-Delam-metoden såning af kræftceller i silikoneringe på chick chorioallantoic membrane (CAM) på embryonal dag 10 efterfulgt af inkubation fra timer til et par dage. CAM-Delam-analysen omfatter brugen af et internt befugtet kammer under inkubation af kyllingembryoner. Denne nye tilgang øgede embryooverlevelsen fra 10%-50% til 80%-90%, hvilket løste tidligere tekniske problemer med lave embryooverlevelsesrater i forskellige CAM-assays.
Dernæst blev CAM-prøverne med tilhørende kræftcelleklynger isoleret, fikseret og frosset. Endelig blev kryostatsektionerede prøver visualiseret og analyseret for kældermembranskader og kræftcelleinvasion ved hjælp af immunhistokemi. Ved at evaluere forskellige kendte metastatiske og ikke-metastatiske kræftcellelinjer designet til at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP) viste CAM-Delam kvantitative resultater, at delamineringskapacitetsmønstrene afspejler metastatisk aggressivitet og kan scores i fire kategorier. Fremtidig brug af dette assay, bortset fra at kvantificere delamineringskapacitet som en indikation af metastatisk aggressivitet, er at optrævle de molekylære mekanismer, der styrer delaminering, invasion, dannelse af mikrometastaser og ændringer i tumormikromiljøet.
Introduction
Ca. 90% af dødeligheden hos kræftpatienter skyldes konsekvenserne af kræftmetastase, som er dannelsen af sekundære tumorer i andre dele af kroppen, hvorfra kræften oprindeligt stammer1. Det er derfor vigtigt at identificere metastatiske relaterede mekanismer til at finde potentielle mål for at undertrykke dannelsen af tumormetastaser. Efterfølgende er der behov for modelsystemer, hvor den metastatiske proces kan evalueres.
Under metastase gennemgår kræftceller epitel-til-mesenkymal overgang (EMT), en normal cellulær proces, hvor epitelceller mister deres vedhæftnings- og polaritetsegenskaber og i stedet erhverver en invasiv mesenkymal karakter2. Delaminering er en del af EMT-processen og involverer nedbrydning af laminin i kældermembranen, hvilket er en forudsætning for, at kræftceller kan forlade den primære tumor og invadere andre væv. De vigtigste faktorer, der opreguleres under metastasedannelse, omfatter matrixmetalloproteinaser (MMP'er), ADAM (en disintergin og metalloproteinase), ADAMTS (ADAM med trombospondinmotiver) og membran-type MMP'er (MMP'er)3,4. Disse faktorer nedbryder molekyler som laminin, som udtrykkes i alle kældermembraner, for at lette cellemigration og invasion.
Den chorioallantoiske membran (CAM) af et befrugtet kyllingæg er en type kældermembran. Befrugtede kyllingæg er blevet anvendt som metastatiske modeller, hvor kræftceller er blevet podet på den ekstraembryonale CAM og senere metastasedannelse observeret i kyllingeembryonerne5. Desuden anvendes in vivo-musens metastatiske modeller ofte, hvor kræftceller implanteres i musene, og metastaser i forskellige organer analyseres6. Denne tilgang er tidskrævende, dyr og kan forårsage ubehag for dyrene. For at løse dette har vi udviklet CAM-Delam-analysen, en hurtigere og billigere model til evaluering af kræftcellers metastatiske aggressivitet. I denne model kombineres kræftcellernes evne til at nedbryde chick CAM (f.eks. Delamineringskapaciteten) med potentiel kræftcelleinvasion i mesenchymet og anvendes som en måling af metastatisk aggressivitet.
Denne artikel,der er baseret på en tidligere publikation 7, beskriver CAM-Delam-analysen i detaljer, fra befrugtet chick egg-håndtering, kræftcellekultur og såning, dissektion og analyser af CAM-prøver til scoring af kræftcellernes delamineringskapacitet i fire kategorier: intakt, ændret, beskadiget og invasion. Vi giver også eksempler på, hvordan dette assay kan bruges til at bestemme de molekylære mekanismer, der regulerer delamineringsprocessen.
Protocol
Kort fortalt opsummerer figur 1 de overordnede trin i CAM-Delam-analysen. Nedenstående protokol er baseret på 30 dyrkede befrugtede kyllingæg og brugen af to forskellige kræftcellelinjer podet separat i tre ringe / æg og analyseret på fire tidspunkter.
1. Æginkubation
- Brug befrugtede kyllingæg fra et lokalt rugeri, som garanterer over 90% befrugtning
BEMÆRK: Æggene bør ikke have været opbevaret i mere end 4 dage ved stuetemperatur (RT). I Sverige kræves der kun etisk tilladelse til forsøgsbrug af embryonale kyllinger fra embryonal dag (E) 14 og derefter. - Tør om nødvendigt forsigtigt mekanisk snavs eller fjer af æggene med et tørt papirhåndklæde eller vådt i vand.
- Rengør og steriliser æginkubatoren med 70% ethanol før brug (hver gang).
- Læg det ønskede antal æg i ægbakker og inkuber kyllingægene vandret i en æginkubator ved 37,5-38 ° C med 70% fugtighed. Betragt dette som inkubationsdag 0 (figur 1A).
2. Klargøring af vejebåd, plastkasser og dissektionsinstrumenter
- Brug 70% ethanol til at sterilisere 30 vejebåde og 30 små plastkasser (~ 0,4 L) med gennemsigtige hætter.
- Vejebådene og kasserne tørres i en laminær hætte natten over (ON) og opbevares i en lukket plastkasse indtil videre brug på inkubationsdag 3.
- Steriliser 2 liter destilleret eller deioniseretH20pr. 30 inkuberede æg.
- Steriliser to par sakse og tre par tang ved at sprøjte 70% ethanol. Lufttør instrumenterne og opbevar dem derefter i en steriliseret kasse indtil inkubationsdag 3.
BEMÆRK: Disse handlinger (trin 2.1-2.4) kan udføres en hvilken som helst dag før inkubationsdag 3. Brug handsker for at undgå forurening.
3. Åbning af æggene og overførsel til det indre befugtede kammer
BEMÆRK: Brug handsker og mundbind for at undgå forurening.
- Tilsæt ca. 50 ml steriliseretH20til de steriliserede plastkasser. Opbevar de vandfyldte kasser med lukkede låg for at undgå forurening ved RT indtil brug.
- På inkubationsdag 3 skal du knække æggeskallen ved hjælp af den skarpe del af saksen og skære en lige åbning i skallen.
- Bryd æggeskallen manuelt op over en vejebåd, og opsaml æggehviden, æggeblommen og dens fastgjorte sunde embryon i vejebåden (figur 1B). Kig efter et intakt embryo med et bankende hjerte, intakt æggeblomme og udviklede blodkar til eksperimentet (>95% af de inkuberede æg). Kassér æg med et misdannet embryo, et embryo uden et bankende hjerte, en brudt æggeblomme eller beskadigede æggeblomme blodkar.
- Overfør forsigtigt vejebåden til et indvendigt befugtet kammer.
BEMÆRK: I trin 3.2.-3.4. skal du arbejde så hurtigt som muligt for at undgå forurening og om muligt bruge en laminær hætte. - Inkuber det indre befugtede kammer i æginkubatoren (figur 1C).
- Kultur de skalløse æg fra dag 3 til dag 10 i æginkubatoren, før de bruges (se trin 3.6.), og tilsæt om nødvendigt vand til inkubatoren for at opretholde 70% fugtighed.
- Kontroller de indre befugtede kamre gennem det gennemsigtige plastlåg for døde embryoner eller forurenede skalløse æg hver dag, og fjern dem fra inkubatoren.
4. Fremstilling af silikoneringe
- For at forberede silikoneringe skal du skære et silikonerør med en indvendig og ydre diameter på henholdsvis 4 mm og 5 mm i ~ 1 mm tykkelse, helst ved hjælp af en papirskærer (figur 1D).
- Overfør silikoneringene til små glasflasker (figur 1D), dæk med metalfolie, og steriliser dem ved hjælp af en autoklave eller lignende.
BEMÆRK: Undgå gentagen autoklavering af ubrugte silikoneringe, der kan være forurenet, da en sådan behandling nedsætter silikoneringenes evne til at fastgøre sig til membranen med efterfølgende lækage af kræftcellen/kollagen/RPMI-opløsningen uden for ringene. - Opbevar de sterile silikoneringe hos RT.
BEMÆRK: Dette trin kan udføres enhver dag før inkubationsdag 10.
5. Forberedelse af kræftceller
BEMÆRK: Opløsninger såsom cellekulturmedium, trypsin og 1x PBS opbevares ved 4 °C og skal opvarmes til 37 °C i et vandbad, inden de tilsættes cellerne. Efter opvarmning skylles flaskerne i 70% ethanol og tørres inden brug.
- Dyrkning af kræftcellelinjerne i det relevante dyrkningsmedium i en cellekulturinkubator ved 37 °C i nærvær af 5 % (v/v) CO2.
BEMÆRK: Her blev U251-GFP glioblastom og PC-3U-GFP prostatacancerceller dyrket i komplet RPMI medium-RPMI medium suppleret med 10% (v / v) føtal kvæg serum (FBS) og 1% (v / v) penicillin-streptomycin (PS). - Planlæg dyrkningen af kræftceller, så ca. 50 × 106 kræftceller er klar til høst på inkubationsdag 10 i CAM-Delam-analysen.
- Skift cellekulturmediet hver 2-3 dage, eller når mellemfarven skifter fra lyserød til orange/gul.
- Valgfrit: Inducer hypoxi ved at behandle kræftcellerne med CoCl2 for at undersøge de molekylære mekanistiske virkninger på delaminering 1 dag før cellehøst.
FORSIGTIG: CoCl2 har moderat toksicitet. Håndter med omhu i en stinkhætte, og følg producentens anvisninger.- Forbered frisk 20 mM CoCl2-stamopløsning ved at opløse 0,0258 g i 10 ml steriliseret destilleretH20i et 15 ml konisk rør indpakket med aluminiumsfolie for at beskytte mod lys.
- I et 50 ml konisk rør blandes 250 μL af 20 mM CoCl 2-stamopløsningen i 25 ml RPMI-medium suppleret med 1% (v/v) PS (men uden FBS) pr. cellekulturskål med en diameter på 15 cm. Vortex forsigtigt.
- Fjern det komplette RPMI-medium fra cellekulturskålene.
- Vask cellerne med steriliseret 1x PBS 2x.
- Tilsæt 25 ml RPMI-medium med 200 μM CoCl 2-celleprøvepsinisering (se trin 5.6).
- På æginkubationsdag 10 skal du forberede 1 ml kollagen / RPMI-blanding (forhold 1: 3), der indeholder 250 μL type I kollagen (5 mg / ml) og 750 μL cellekultur RPMI-medium suppleret med 10% FBS og 1% (v / v) PS. Opbevar kollagen / RPMI-blandingen på is.
- Trypsinize kræftcellerne for at isolere cellerne ved først at fjerne cellekulturmediet og vaske 2x med 1x PBS.
- Tilsæt 3 ml trypsinopløsning (0,05%) pr. 15 cm diameter cellekulturskål og inkuber i 2-3 minutter i en cellekulturinkubator, indtil cellerne løsnes. Brug et omvendt mikroskop på bordet til at se de løsrevne celler. Tryk om nødvendigt forsigtigt på siden af kolben for at løsne de resterende klyngede eller fastgjorte celler.
- Inaktiver trypsin ved at tilsætte 5 ml komplet RPMI-medium til hver cellekulturskål og opsaml cellesuspensionen fra alle cellekulturskåle i et 50 ml rør.
- Tæl kræftcellerne ved hjælp af Trypan Blue-udelukkelsesmetoden for at skelne levende fra døde celler ved hjælp af en celletæller. Tilsæt 10 μL af cellesuspensionen til 10 μL af 0,4% trypan blå plet. Bland prøven ved at pipettere op og ned et par gange, og læg derefter 10 μL af celleblandingen pr. kammer i prøveglideren i celletælleren. Gentag celletælling 3x for at bekræfte cellenummeret/ml.
- Beregn og centrifuger den korrekte volumencellekultursuspension indeholdende 50 x 106 levende kræftceller i et 50 ml rør ved 500 × g i 5 minutter.
- Kassér supernatanten og bland cellepillen med 1 ml kollagen /RPMI-blandingen. Da kollagen er et gelatinøst materiale, blandes cellerne meget langsomt og forsigtigt med en 1 ml pipette for at undgå at miste celler i dannelsen af bobler.
- Hold den forberedte cellesuspension på is og bring den til ægarbejdsområdet.
BEMÆRK: Undgå at holde de forberedte kræftceller på is for længe. De tilberedte kræftceller skal placeres på CAM inden for 15-25 min.
6. Såning af kræftcellerne på CAM
BEMÆRK: Brug handsker og mundbind for at undgå forurening.
- På inkubationsdag 10 skal du tage de indre befugtede kamre ud med de inkuberede skalløse æg fra inkubatoren.
BEMÆRK: Ca. 90% af det oprindelige antal af de inkuberede æg kan anvendes; se figur 2. - Åbn det indre befugtede kammer, og læg op til seks silikoneringe på CAM ved hjælp af steriliserede tang.
BEMÆRK: Undgå at placere silikoneringene i nærheden af hinanden eller tæt på større blodkar. - Bland kræftcellesuspensionen ved pipettering for at få en jævn fordeling af kræftceller, og tilsæt 20 μL (1 × 106 celler) af den forberedte kræftcellesuspension inde i en silikonering (figur 1E). Når du tilføjer cellerne, skal du holde pipettespidsen over CAM for at sikre, at membranen ikke beskadiges.
BEMÆRK: Ifølge tidligere resultater7 kan forskellige kræftceller podes i separate ringe på samme CAM. - Luk det indre befugtede kammer og læg det i æginkubatoren.
7. Isolering af CAM med tilhørende kræftceller
- Efter 14 timer, 1,5 dage, 2,5 dage og 3,5 dages inkubation skal du tage ca. syv interne befugtede kamre ud og åbne lågene et ad gangen.
- Med en saks dissekeres de dyrkede kræftceller, der er fastgjort til CAM (såkaldte CAM-Delam-prøver) ved at skære uden for silikoneringen (figur 1F).
- Overfør straks den isolerede CAM-Delam-prøve ved hjælp af tang til 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffer (PB) i en petriskål til fiksering af vævet. Opbevares på is eller ved 4 °C i 1 time.
BEMÆRK: Opbevar 4% PFA-opløsning ved 4 °C i maksimalt 5 dage. FORSIGTIG: PFA er giftigt. Ved håndtering af PFA-pulver og PFA-opløsninger skal du bruge en stinkhætte og bære mundbind og handsker. Undgå at indånde pulver- eller opløsningsdampe. Følg producentens anvisninger. - Halshug kyllingeembryonerne og kassér dem som biologisk affald i specifikke skraldespande.
- Pfa-opløsningen fjernes, og der tilsættes 30 % saccharose i 0,1 M PB til CAM-Delam-prøverne, og der udvilibres ved 4 °C i 1 time.
- Under et dissektionsmikroskop skal du forsigtigt fjerne silikoneringen ved hjælp af tang. Skær CAM-Delam-prøven med en saks i en rektangulær form med kræftcellerne i midten (figur 1G).
- Med et par tang overføres CAM-Delam-prøverne til frosset sektionsmedium i en petriskål for at fjerne overskydende saccharose og derefter til indlejring af forme i frosset sektionsmedium.
- Under et dissektionsmikroskop skal du placere CAM-Delam-prøven i en U-form i lodret retning i indlejringsformene ved hjælp af et hvilket som helst nålelignende instrument (figur 1G).
- Cam-Delam-prøverne fryses og opbevares ved −80 °C.
8. Sektionering af CAM-Delam-prøver
- Sektion de frosne CAM-Delam-prøver ved 10 μm på 5-6 på hinanden følgende dias ved hjælp af kryosektionering.
- Opbevar diasene med sektioner ved -80 °C eller brug dem direkte til farvning af immunhistokemi.
9. Immunohistokemi farvning
- Lysbillederne bringes fra -80 °C til RT i 5 minutter, før immunprotokollet startes.
- Lav en linje med en hydrofob markør på diasene, hvor sektionerne slutter. Lad dem tørre i et par minutter.
- Anbring lysbillederne i et befugtet (H20) kammer og dæk sektionerne med ~ 200-500 μL blokerende opløsning (10% føtalt kalveserum og 0,1% natriumazid i Tris-bufret saltvand med 0,1% Triton X-100 [TBST]) og inkuber i 15-30 minutter.
BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter må du ikke lade gliderne tørre på noget tidspunkt. - Den blokerende opløsning hældes af, og der udskiftes den med 100-150 μL af det primære antistof af interesse fortyndet i blokeringsopløsningen, og inkuberes ON ved 4 °C. Brug fortrinsvis kaninanti-laminin-111-antistoffet til at definere basal lamina sammen med en kræftcellemarkør, hvis ikke ved hjælp af GFP eller andre fluorescerende mærkede kræftcellelinjer.
BEMÆRK: Her blev en kanin anti-von Willebrand Factor også brugt til at detektere blodkar i CAM. - Forbered tre glas kuvetter fyldt med TBST buffer.
- Hæld den primære antistofopløsning af, overfør diasene til glaskuvetterne, og vask mindst 3x i 5 minutter hver i TBST.
- Fjern overskydende TBST fra diaset og fra det hydrofobe barriereområde med et blødt papirvæv.
- Dæk glideren med 100-150 μL af et egnet sekundært fluorescerende antistof fortyndet i blokerende opløsning kombineret med 4',6-diamidino-2-phenylindol, dihydrochlorid (DAPI) og inkuber i mørke ved RT i 1 time.
- Hæld den sekundære antistofopløsning af, overfør diasene til glaskuvetterne, og vask mindst 3x i 5 minutter hver i TBST.
- Fjern overskydende TBST fra diaset og fra det hydrofobe barriereområde med et blødt papirvæv.
- Monter diasene ved at lægge 1-2 dråber fluorescerende monteringsmedium på diaset, og læg forsigtigt et glasdæksler, så du undgår luftbobler.
- Lad gliderne tørre i mindst 1 time ved 4 °C, inden de analyseres, og opbevar lysbillederne 4 °C.
10. Mikroskopi billeddannelse og delaminering scoring
- Fotografer sektionerne ved hjælp af et epifluorescensmikroskop udstyret med et digitalt kamera, helst ved 10x forstørrelse (figur 1H).
- Analyser sektionerne ved hjælp af følgende CAM-Delam-scoringskategorier (figur 3):
- Kig efter intakt basal lamina uden synlige ændringer.
- Kig efter ændret, men ubeskadiget basal lamina.
- Kig efter beskadiget basal lamina uden celleinvasion.
- Kig efter beskadiget basal lamina med celleinvasion.
Representative Results
Figur 1 viser de vigtigste trin i CAM-Delam-analysen7. Anvendelsen af interne befugtede kamre (figur 1C) forbedrede signifikant overlevelsesraten for kyllingembryoner fra <50% op til 90% ved inkubationsdag 10 og fra ~ 15% op til 80% ved inkubationsdag 13 (figur 2).
Figur 1: Nøgletrin i CAM-Delam-analysen. (A) Inkuber befrugtede kyllingæg vandret uden rotation. (B,C) På inkubationens dag 3 skal du knække æggene og placere dem i sterile vejebåde (B) og placere bådene i et internt befugtet kammer til yderligere inkubation (C). (D) Forbered silikoneringe. (E) På inkubationsdag 10 anbringes silikoneringene på CAM'en og frø 1 x 106 kræftceller inde i ringene ved hjælp af en pipette. (F,G) På forskellige tidspunkter (timer til dage) dissekeres CAM med vedhæftede kræftceller, (F) fixes i PFA, behandles med saccharose, placeres i frosset sektionsmedium (G) og fryses i -80 ° C. (H) Et eksempel på en sektioneret CAM med tilhørende GFP + kræftceller (grøn) og lamininimmunhistokemifarvning (rød). Vægtstænger = 2 mm (E,F), 1 mm (G) og 100 μm (H). Denne figur er fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: CAM = chorioallantoisk membran; PFA = paraformaldehyd; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kyllingembryooverlevelse i forhold til inkubationsmetode. (A,B) På inkubationsdag 10 blev kyllingembryoets overlevelse i interne HC'er fordoblet (gennemsnitsværdi 89,33; N = 105) sammenlignet med inkubation i petriskåle (A; middelværdi 40; N = 64) og ikke-befugtede kamre (B; gennemsnitsværdi 48,67; N = 46). (C,D) På inkubationsdag 13 blev der stadig observeret en høj overlevelsesrate ved hjælp af HC (gennemsnitsværdi 81,67; N = 105), der henviser til, at der blev bemærket et stort fald i embryooverlevelsen ved hjælp af PD (C; gennemsnitsværdi 11,33; N = 64) og N-HC (D; gennemsnitsværdi 18,33; N = 46). Statistisk signifikans blev testet ved hjælp af en uparret to-halet t-test. Fejllinjerne angiver standardafvigelsen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Dette tal blev modificeret fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: HC = befugtet kammer; PD = Petriskåle; N-HC = ikke-befugtet kammer; E X = Inkubationsdag X. Klik her for at se en større version af denne figur.
Analyser af forskellige kræftcellelinjer, der udtrykker GFP (U251 glioblastom, PC-3U prostata, SW620 tyktarm og A549 lunge) ved hjælp af denne protokol blev tidligere rapporteret af Palaniappan et al.7. Resultaterne fra CAM-Delam-analysen omfatter forskelle i morfologi af basal lamina, detekteret ved laminin, og kræftcelleinvasion, defineret som celler, der har krydset chick basal lamina lag ind i chick mesodermal lag (figur 3). Disse resultater viser, at kræftcellernes evne til at nedbryde basal lamina og invadere mesenchymet kan scores i en af fire kategorier: 1) intakt basal lamina uden synlige ændringer (figur 3B), 2) ændret, men ubeskadiget basal lamina (figur 3C), 3) beskadiget basal lamina uden celleinvasion (figur 3D) og 4) beskadiget basal lamina med celleinvasion (figur 3E ). En anden observation var, at når kræftceller forårsagede en ændret eller beskadiget basal lamina, blev CAM også fortykket med en stigning i blodkardannelse, defineret ved antistoffarvning mod von Willebrands faktor, som syntetiseres i blodkar8 (figur 4C-H). Disse to fænotyper, en fortykket CAM og øget dannelse af blodkar, blev ikke observeret, da CAM var intakt (figur 4A,B).
Figur 3: CAM-Delam scoring. (A-E) Et CAM-Delam scoringseksempel baseret på integriteten af CAM basal lamina, visualiseret af anti-laminin (rød) og potentiel invasion af GFP-ekspressionerende kræftceller (grøn). (A) Kontrol CAM uden kræftceller. (B-E) I reaktionerne på kræftceller kan fire kategorier, der beskriver morfologien af basal lamina, scores: (B) intakt laminin, (C) ændret, men ubeskadiget laminin (angivet med en stjerne), (D) beskadiget laminin, men uden kræftcelleinvasion (pile), beskadiget laminin med celleinvasion (pilespidser). Skalabjælke = 100 μm (A-E). Denne figur er fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: CAM = chorioallantoisk membran; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Evaluering af CAM-fortykkelse og dannelse af blodkar. (A-H) Et eksempel på visualisering af CAM-fortykkelse og dannelse af blodkar, påvist ved anti-Von Willebrand Factor (rød) som reaktion på lamina af forskellige kræftcelletyper. (A,B) Kontroller CAM uden kræftceller. (C,D) Som reaktion på en ikke-metastatisk kræftcellelinje (scoret som intakt) blev der ikke påvist nogen tydelig fortykkelse af mesenchymet eller øget dannelse af blodkar. (E-H) Som reaktion på metastatiske kræftceller, der resulterede i ændret eller beskadiget Laminin, blev mesenchymet fortykket (indikeret med dobbelte pilespidser), og øget dannelse af blodkar blev observeret (angivet med pile). Skalabjælke = 100 μm. Dette tal blev modificeret fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: CAM = chorioallantoisk membran; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
U251 glioblastom og PC-3U prostatacancerceller er to eksempler på kræftcellelinjer med helt forskellig delamineringskapacitet (figur 5). PC-3U-celler inducerede beskadiget laminin efter 1,5 dage med klar invasion efter 2,5 dage (figur 5A). I modsætning hertil inducerede U251-celler kun mindre ændringer af laminin efter 1,5-3,5 dage, men forårsagede aldrig nogen synlig skade på laminin (figur 5B).
Figur 5: Visualisering af delamineringskapaciteten for prostata (PC-3U) og glioblastom (U251) kræftceller. (A) PC-3U-celler inducerede mindre ændring af laminin efter 14 timer, beskadigelse af laminin efter 1,5 dage (pil) og indledning af invasion efter 2,5 dage, som blev øget efter 3,5 dage (pilespidser). (B) U251-celler forårsagede mindre ændring af laminin efter 1,5-3,5 dage. De højre paneler viser grafer, der repræsenterer CAM-Delam-scoringen. Y-aksen angiver antallet af prøver, og x-aksen angiver kulturens tidspunkter. Skalabjælke = 100 μm (A,B). Dette tal blev modificeret fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: CAM = chorioallantoisk membran; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
CAM-Delam-analysen kan bruges til at definere molekylære mekanismer, der regulerer delamineringsprocessen. Et eksempel er brugen af CoCl2-behandling til at inducere hypoxi med eller uden kombinationen af hæmmende matrixmetalloproteinaser (MMP) ved anvendelse af den brede MMP-hæmmer GM6001 (figur 6). Efter CoCl2-behandling erhvervede U251 ikke-metastatiske kræftceller evnen til at fremkalde delaminering og invasive celler, som blev undertrykt, når CoCl2-behandling blev kombineret med MMP-hæmmeren GM6001 (figur 6). Cam-Delam-analysen kan således være nyttig, når man definerer molekyler og molekylære veje, der påvirker delamineringsprocessen.
Figur 6: Delamineringsmønstre som reaktion på U251-celler eksponeret for CoCl2 alene eller sammen med en MMP-hæmmer. (A-C) U251-celler dyrket i 3,5 dage på CAM under forskellige forhold. (A) U251-celler dyrket alene inducerede ingen skade på laminin. (B) Dyrkede U251-celler, der er præeksponeret for CoCl2 (24 timer) før vask og cellesåning på CAM-induceret lamininskade og celleinvasion. (C) Forbehandling med en bredspektret MMP-hæmmer GM6001 (i 1 time) efterfulgt af CoCl2-eksponering (24 timer) før vask og såning af U251-celler på CAM, undertrykte virkningen af CoCl2-behandlingen, og der blev ikke påvist nogen åbenlys lamininskade eller kræftcelleinvasion. Skalabjælke = 100 μm (A-C). Panelerne (B) og (C) er fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: CAM = chorioallantoisk membran; GFP = grønt fluorescerende protein; CoCl2 = koboltchlorid; MMP = matrixmetalloproteinase. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Dette papir beskriver CAM-Delam-analysen for at evaluere kræftcellernes metastatiske aggressivitet, bestemt ved at score basale laminamoduleringer og potentiel celleinvasion i mesenchymet inden for en periode på timer til et par dage. Et tidligere teknisk problem for forskellige CAM-assays har været den lave overlevelse af kyllingembryoner. Dette problem blev løst ved at indføre brugen af et internt befugtet kammer under embryoinkubation, hvilket øgede embryooverlevelsen fra 10% -50% til 80% -90%7. Anvendelsen af et internt befugtet kammer kan derfor være værdifuldt i CAM-assays generelt såvel som i andre ex ovo chick-eksperimenter.
De præsenterede scoringstidspunkter på 14 timer, 1,5 dage, 2,5 dage og 3,5 dage efter såning af 1 x 106 kræftceller på CAM er baseret på streng metodeudvikling ved hjælp af seks forskellige kræftcellelinjer og er tilstrækkelige til at skelne mellem området fra ikke-delaminerende til delaminerende-med-invasionskapacitet af kræftcellelinjer. Der foreslås en minimumsanvendelse af fire æg med tre ringe i hver pr. tidspunkt og pr. cellelinje, og dette bør gentages mindst én gang eller i henhold til forsøgsdesign og statistiske krav. En fordel ved CAM-Delam-analysen er at opnå informative resultater vedrørende kræftcellernes delamineringskapacitet inden for få dage for at estimere kræftcellernes aggressivitet og potentiel risiko for metastasedannelse. Den hurtige levering af resultater lettes ved at overvåge nedbrydningen af basal lamina på grund af de invaderende kræftceller og de efterfølgende mikrotumorer / tumorknopper og organmetastaser. Traditionelt er CAM-modeller blevet brugt til at analysere dannelsen af organmetastaser, hvilket tager omkring 2 uger at blive bestemt9. Ved at bruge syv forskellige kræftcellelinjer har vi tidligere verificeret7, at delamineringsscoringsscoren er knyttet til kræftcellernes evne til at danne metastaser i gnavermodeller 10,11,12,13,14, hvilket understøtter den prædiktive værdi af CAM-Delam-analysen. Desuden kræver musemodeller endnu længere tid, flere uger op til måneder, før metastaser kan undersøges15,16. Kort fortalt er dette udviklede CAM-Delam-assay, der fokuserer på at score delamineringskapacitet og ikke på at undersøge senere tumordannelse i kyllingeembryoet, derfor et godt supplement til eksisterende kylling CAM invasion og musetumormodeller.
En begrænsning i CAM-Delam-analysen kan være den uklare visualisering af basal lamina, hvis kræftcellerne selv udtrykker laminin. I så fald kan andre markører, der angiver basal lamina, såsom E-cadherin, anvendes7. Andre CAM invasion undersøgelser har brugt type IV kollagen til at visualisere CAM og pan-cytokeratin og vimentin til at identificere invaderende kræftceller og dannelsen af mikrotumorer / tumorknopper 17,18.
Delaminering er en normal cellulær proces, både under udvikling og senere i livet, hvilket gør det muligt for celler at forlade et epitel og migrere til andre væv. Eksempler på delaminerende celler under udvikling er neurale kam og olfaktoriske banebrydende neuroner19,20; senere i livet er sårheling afhængig af delaminering21. Under kræft opreguleres denne proces i de forkerte celler og / eller på det forkerte tidspunkt. CAM-Delam-metoden kan således være til nytte til at optrævle de molekylære mekanismer, der regulerer delaminering, hvilket ville være af betydning for både grundlæggende biologisk og sygdomskendskab. Sådanne delamineringsundersøgelser vil omfatte tilføjelse af faktorer af interesse for de kræftceller, der er podet på CAM, eller undersøgelse af genetisk modificerede kræftceller. Et eksempel, der præsenteres her, er CoCl 2-forbehandling af den ikke-metastatiske cellelinje U251 for at inducere hypoxi, hvilket fører til induktion af en metastatisk aggressiv kapacitet, der kan undertrykkes af en bredspektret MMP-hæmmer. At finde nøglemolekyler, der styrer delaminering, øger således muligheden for at designe hæmmere til at undertrykke denne proces. I forhold til dette er en anden potentiel anvendelse af CAM-Delam-protokollen i lægemiddelscreening til undertrykkelse af delaminering og celleinvasion. Desuden er evalueringen af kræftens sværhedsgrad i klinikken en kritisk komponent til diagnose, planlægning af behandling og pleje. I øjeblikket er TNM-iscenesættelsessystemet (T, tumorstørrelse; N, knude-om kræften har spredt sig til lymfeknuderne; M, fjern metastase) bruges til at evaluere sværhedsgraden af kræften22. CAM-Delam-analysen definerer en innovativ tilgang til evaluering af kræftcellernes aggressivitet og potentielle risiko for dannelse af metastaser og kan være et nyttigt supplement til TNM-iscenesættelsessystemet. Bemærkelsesværdigt er, at TNM-iscenesættelse er baseret på analyser af faste vævsprøver, mens en potentiel klinisk CAM-Delam-tilgang ville undersøge frisk eller friskfrosset væv i kombination med teknikker til genoplivning af frosne celler23.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker følgende forskere ved Umeå Universitet for deres hjælp med relevante kræftcellelinjer og antistoffer: L. Carlsson (von Willebrand Factor antistof), J. Gilthorpe (U251) og M. Landström (PC-3U). Vi takker også Hauke Holthusen i Gilthorpe-laboratoriet for genereringen af HEK293-TLR-AAVS1 stabile cellelinje. Arbejdet i Gunhaga-laboratoriet blev støttet af den svenske kræftfond (18 0463), Umeå Biotech Incubator, Norrlands Cancerforskningsfond, det svenske forskningsråd (2017-01430) og det medicinske fakultet ved Umeå Universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
| Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
| Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
| Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
| Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
| Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| MATERIALS | |||
| anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
| anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
| anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
| Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
| Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
| Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
| Plastic box | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
| RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
| Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
| SOLUTIONS | |||
| Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
| PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
| Mix and use immediately | |||
| Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
| FBS 50 mL |
|||
| Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
| Store at 4 °C | |||
| PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
| NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
| add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
| Store in RT | |||
| PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
| 0.2 M PB 50 mL |
|||
| Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
| heat to 60 °C in water bath | |||
| add 5 M NaOH 25 µL |
|||
| Stir to dissolve the PFA powder | |||
| Store at 4 °C | |||
| TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
| 150mM NaCI 30 mL |
|||
| 0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
| H2O (MQ) 900 mL |
|||
| Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
| 10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
| 10 mL in total, Store at 4 °C |
References
- Vasantharajan, S. S., et al. The epigenetic landscape of circulating tumour cells. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).
- Itoh, Y. Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations. Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).
- Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis. BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).
- Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies. Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells. Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).
- Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P.
- Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells. Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).
- Jia, Y., et al. Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer. Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).
- Liu, B., et al. RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling. Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).
- Qin, T., et al. Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer. Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
- Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model. Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).
- Liu, M., et al. The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Steinmann, S., et al. DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells. Cell Death & Disease. 10 (12), 895 (2019).
- Andrieu, C., et al. MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity. Development. 147 (7), (2020).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers. Differentiation. 110, 8-16 (2019).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Pineros, M., et al. Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information. The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).
- Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
