Summary
癌細胞の転移能を評価するためのCAM-Delamアッセイは、比較的速く、簡単で、安価である。この方法は、転移形成を調節する分子機構を解明し、薬物スクリーニングに使用することができる。ヒト腫瘍サンプルを分析するための最適化されたアッセイは、パーソナライズされたがん治療のための臨床方法となり得る。
Abstract
がん関連死の主な原因は転移形成(すなわち、がん細胞が原発巣から遠隔臓器に広がり、二次腫瘍を形成する場合)である。層間剥離は、基底薄層および基底膜の分解として定義され、癌細胞の他の組織および器官への転位および拡散を容易にする初期プロセスである。癌細胞の層間剥離能をスコアリングすることは、これらの細胞の転移能を示すであろう。
我々は、癌細胞が剥離および浸潤する能力を可視化および定量化するために、標準化された方法、 ex ovo CAM-Delamアッセイを開発し、それによって転移性攻撃性を評価することができる。簡単に言えば、CAM-Delam法は、胚発生10日目にひよこ絨毛膜(CAM)上のシリコーンリングに癌細胞を播種し、続いて数時間から数日のインキュベーションを含む。CAM-Delamアッセイには、ひよこの胚の孵化中の内部加湿チャンバーの使用が含まれます。この新規アプローチは、胚の生存率を10%-50%から80%-90%に増加させ、異なるCAMアッセイにおける胚生存率が低いという以前の技術的問題を解決した。
次に、関連する癌細胞クラスターを有するCAMサンプルを単離し、固定し、凍結した。最後に、クライオスタット切片サンプルを可視化し、免疫組織化学を用いて基底膜損傷および癌細胞浸潤について分析した。緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するように設計された様々な既知の転移性および非転移性癌細胞株を評価することによって、CAM-Delam定量的結果は、層間剥離能力パターンが転移性攻撃性を反映し、4つのカテゴリーにスコアリングできることを示した。このアッセイの将来の使用は、転移性攻撃性の指標としての層間剥離能力の定量化とは別に、層間剥離、浸潤、微小転移の形成、および腫瘍微小環境の変化を制御する分子メカニズムを解明することである。
Introduction
がん患者の死亡率の約90%は、がん転移の結果、すなわちがんが最初に発生した身体の他の部分に二次性腫瘍が形成されることによって引き起こされます1。したがって、腫瘍転移の形成を抑制するための潜在的な標的を見出すために、転移関連メカニズムを同定することは重要である。続いて、転移過程を評価できるモデルシステムが必要である。
転移の間、癌細胞は上皮から間葉への移行(EMT)を受け、上皮細胞が付着性と極性特性を失い、代わりに侵襲的な間葉系特性を獲得する正常な細胞プロセス2。層間剥離はEMTプロセスの一部であり、癌細胞が原発性腫瘍を離れ、他の組織に浸潤するための前提条件である基底膜におけるラミニンの分解を伴う。転移形成中にアップレギュレートされる主な因子には、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、ADAM(ジインタージンおよびメタロプロテイナーゼ)、ADAMTS(トロンボスポンジンモチーフを有するADAM)、および膜型MMP(MT-MMP)が含まれる3,4。これらの因子は、すべての基底膜で発現されるラミニンなどの分子を分解し、細胞の遊走および浸潤を促進する。
受精したひよこの卵の絨毛膜(CAM)は、基底膜の一種です。受精したニワトリの卵は転移モデルとして用いられており、胚外CAMに癌細胞を播種し、その後ニワトリ胚5に転移形成が認められている。また、 in vivo マウス転移モデルが多用されており、マウスに癌細胞を移植し、各種臓器の転移を解析する6。このアプローチは時間がかかり、高価であり、動物に不快感を与える可能性があります。これに対処するために、我々は、癌細胞の転移性攻撃性を評価するためのより速く、より安価なモデルであるCAM-Delamアッセイを開発しました。このモデルでは、雛CAMを分解する癌細胞の能力(例えば、層間剥離能力)は、間葉系への潜在的な癌細胞浸潤と組み合わされ、転移性攻撃性の測定値として使用される。
本稿では、以前の刊行物7に基づいて、受精したニワトリの卵の取り扱い、癌細胞の培養および播種、解剖、およびCAMサンプルの分析から、癌細胞の層間剥離能力のスコアリングまで、CAM-Delamアッセイを4つのカテゴリー(無傷、改変、損傷、および浸潤)に詳細に記述する。また、このアッセイを使用して層間剥離プロセスを調節する分子メカニズムを決定する方法の例も示します。
Protocol
簡単に言えば、 図1は 、CAM-Delamアッセイにおける全体的なステップを要約する。以下のプロトコルは、30個の培養受精鶏卵と、3つのリング/卵に別々に播種され、4つの時点で分析された2つの異なる癌細胞株の使用に基づいています。
1. 卵の孵化
- 地元の孵化場の受精したひよこの卵を使用し、90%以上の受精を保証する
注:卵は室温(RT)で4日以上保存してはなりません。スウェーデンでは、胚性ニワトリの実験的使用のための倫理的許可は、胚発生日(E)14以降からのみ必要とされる。 - 必要に応じて、乾いたペーパータオルまたは水に濡れたペーパータオルを使用して、卵の汚れや羽毛を慎重に機械的に拭き取ります。
- 使用前に卵インキュベーターを70%エタノールで清掃して滅菌してください(毎回)。
- 卵トレイに所望の数の卵を置き、湿度70%で37.5〜38°Cの卵インキュベーターで鶏の卵を水平に孵化させる。これをインキュベーション0日目と考えてください(図1A)。
2. 計量ボート、プラスチック箱、解剖器具の準備
- 70%エタノールを使用して、30個の計量ボートと30個の小さなプラスチック製の箱(〜0.4L)を透明なキャップで滅菌します。
- 計量ボートと箱を層状フードで一晩(ON)乾燥させ、インキュベーション3日目にさらに使用するまで閉じたプラスチック製の箱に保管してください。
- 30個の孵卵あたり2Lの蒸留または脱イオン化H2Oを滅菌する。
- 2対のはさみと3対の鉗子を70%エタノールを噴霧して滅菌する。器具を空気乾燥させ、滅菌した箱に入れてインキュベーション3日目まで保管します。
注:これらのアクション(ステップ2.1-2.4)は、インキュベーション3日目の前日であればいつでも実行できます。汚染を避けるために手袋を使用してください。
3.卵を開き、内部加湿チャンバーに移す
注:汚染を避けるために手袋とフェイスマスクを使用してください。
- 滅菌されたプラスチック製の箱に約50mLの滅菌H2Oを加える。汚染を避けるために、蓋を閉じた水で満たされた箱をRTで使用時まで保管してください。
- 孵化3日目に、はさみの鋭い部分を使って卵殻を割り、殻のまっすぐな開口部を切ります。
- 計量ボートの上で卵殻を手動で開き、卵白、卵黄、およびそれに付着した健康な胚を計量ボートで収集します(図1B)。実験のために、鼓動する心臓、無傷の卵黄、発達した血管(孵化した卵の>95%)を持つ無傷の胚を探してください。奇形の胚、鼓動する心臓のない胚、壊れた卵黄、または損傷した卵黄血管を含む卵子を捨てる。
- 計量ボートを内部の加湿チャンバーに静かに移します。
メモ: 手順 3.2.-3.4 では、汚染を避けるためにできるだけ速く作業し、可能であれば層状フードを使用します。 - 内部加湿チャンバーを卵培養器内で孵化させる(図1C)。
- 殻のない卵を3日目から10日目まで、使用前に卵培養器で培養し(ステップ3.6を参照)、必要に応じて、インキュベーターに水を加えて湿度70%を維持します。
- 透明なプラスチック製の蓋を通して内部の加湿チャンバーに毎日死んだ胚や汚染された殻のない卵がないかチェックし、インキュベーターから取り出します。
4. シリコーンリングの調製
- シリコーンリングを作製するには、好ましくは紙カッターを使用して、内径4mmおよび外径5mmのシリコーンチューブをそれぞれ〜1mmの厚さに切断する(図1D)。
- シリコンリングを小さなガラス瓶(図1D)に移し、金属箔で覆い、オートクレーブなどを使用して滅菌します。
注:汚染されている可能性のある未使用のシリコーンリングのオートクレーブを繰り返し行うと、シリコーンリングが膜に付着する能力が低下し、その後がん細胞/コラーゲン/RPMI溶液がリングの外側に漏れるため、避けてください。 - 滅菌シリコーンリングをRTに保管してください。
注:このステップは、インキュベーション10日目の前日であればいつでも行うことができます。
5. がん細胞の作製
注:細胞培養培地、トリプシン、および1x PBSなどの溶液は4°Cで保存され、細胞に添加する前に水浴中で37°Cに加熱する必要があります。加熱後、ボトルを70%エタノールですすぎ、使用前に乾燥させてください。
- 目的の癌細胞株を、5%(v/v)CO2の存在下で37°Cの細胞培養インキュベーター内の関連する培養培地で培養する。
注:ここで、U251-GFP膠芽腫およびPC-3U-GFP前立腺癌細胞は、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)および1%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシン(PS)を添加した完全RPMI培地-RPMI培地で培養した。 - CAM-Delam アッセイの培養 10 日目に約 50 ×106 個のがん細胞を採取する準備ができるように、がん細胞の培養を計画します。
- 細胞培養培地を2〜3日ごとに交換するか、培地の色がピンクからオレンジ/黄色に変化したとき。
- 任意選択:癌細胞をCoCl2 で処理して低酸素を誘導し、細胞採取の1日前に層間剥離に対する分子機構的効果を調査する。
注意: CoCl2 は中程度の毒性があります。ヒュームフードで慎重に取り扱い、製造元の指示に従ってください。- 光から保護するために、アルミニウム箔で包まれた15mL 円錐管内の滅菌蒸留H2 0の10mLに0.0258gを溶解することによって、新鮮な20mM CoCl2ストック溶液を調製する。
- 50 mL の円錐管内で、直径 15 cm の細胞培養皿あたり 1% (v/v) PS (ただし FBS なし) を添加した 25 mL の RPMI 培地に 250 μL の 20 mM CoCl2 ストック溶液 を混ぜます。渦が優しく。
- 細胞培養皿から完全なRPMI培地を除去する。
- 滅菌した1x PBS 2xで細胞を洗浄する。
- 200 μM CoCl 2細胞トリプシン処理で25 mLのRPMI 培地を加える(ステップ5.6を参照)。
- 卵子孵化10日目に、250 μLのI型コラーゲン(5 mg/mL)と750 μLの細胞培養RPMI培地に10%FBSと1%(v/v)PSを添加した1 mLのコラーゲン/RPMIミックス(比1:3)を調製します。
- 癌細胞をトリプシン処理し、最初に細胞培養培地を除去し、1x PBSで2倍に洗浄することによって細胞を単離する。
- 直径15cmの細胞培養皿あたり3 mLのトリプシン溶液(0.05%)を加え、細胞が剥離するまで細胞培養インキュベーター内で2〜3分間インキュベートする。卓上の倒立顕微鏡を使用して、剥離した細胞を確認します。必要に応じて、フラスコの側面を軽く叩いて、残りのクラスター化または付着した細胞を取り除きます。
- 各細胞培養ディッシュに5 mLの完全RPMI培地を加えてトリプシンを不活化し、すべての細胞培養ディッシュから細胞懸濁液を50 mLチューブに集めた。
- トリパンブルー排除法により癌細胞を計数し、細胞カウンターを用いて生細胞と死細胞を区別した。10 μLの細胞懸濁液を10 μLの0.4%トリパンブルー染色剤に加える。数回上下にピペッティングしてサンプルを混合し、チャンバーあたり10 μLの細胞混合物をセルカウンターのサンプルスライドにロードします。細胞数を3倍に繰り返して、細胞数/mLを確認します。
- 50 x106 個の生癌細胞を含む正しい体積の細胞培養懸濁液を500 × g で50 mLチューブに入れ、5分間遠心分離する。
- 上清を捨て、細胞ペレットをコラーゲン/RPMIミックス1mLと混合する。コラーゲンはゼラチン状の材料であるため、気泡の形成で細胞が失われないように、細胞を1mLピペットで非常にゆっくりと慎重に混合します。
- 調製した細胞懸濁液を氷の上に保管し、卵の作業領域に持ち込む。
注:準備したがん細胞を氷の上に長時間置きすぎないようにしてください。調製した癌細胞は、15〜25分以内にCAM上に配置しなければならない。
6. CAMに癌細胞を播種する
注:汚染を避けるために手袋とフェイスマスクを使用してください。
- 孵化10日目に、孵化した殻のない卵と共に内部加湿チャンバーをインキュベーターから取り出した。
注:孵化した卵の初期数の約90%を使用することができます。 図 2 を参照してください。 - 内部の加湿チャンバーを開き、滅菌された鉗子を使用してCAMに最大6つのシリコーンリングを置きます。
注:シリコンリングを互いに近づけたり、大きな血管に近づけたりしないでください。 - ピペッティングにより癌細胞懸濁液を混合して癌細胞の均一な分布を得、調製した癌細胞懸濁液の20μL(1×106 細胞)をシリコーンリングの内側に加える(図1E)。細胞を追加するときは、ピペットチップをCAMの上に保ち、膜を傷つけないようにしてください。
注:以前の知見7によると、異なる癌細胞を同じCAM上の別々のリングに播種することができる。 - 内部の加湿チャンバーを閉じ、卵インキュベーターに入れます。
7. 関連する癌細胞とのCAMの単離
- 14時間、1.5日、2.5日、および3.5日のインキュベーション後、約7つの内部加湿チャンバーを取り出し、蓋を一度に1つずつ開きます。
- 一対のはさみで、CAM(いわゆるCAM-Delamサンプル)に結合した培養癌細胞をシリコーンリングの外側に切断することによって解剖する(図1F)。
- 分離したCAM-Delamサンプルを鉗子を用いて直ちに0.1 Mリン酸緩衝液(PB)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)に移し、組織の固定を行う。氷の上または4°Cで1時間保ちます。
注: 4% PFA 溶液を 4 °C で最大 5 日間保存します。注意: PFA は有毒です。PFA粉末およびPFA溶液を取り扱うときは、ヒュームフードを使用し、フェイスマスクと手袋を着用してください。粉末や溶液の蒸気を吸い込まないでください。製造元の指示に従ってください。 - ニワトリの胚を斬首し、特定のビンに生物学的廃棄物として廃棄する。
- 4% PFA溶液を除去し、0.1 M PB中の30%スクロースをCAM-Delamサンプルに加え、4°Cで1時間平衡化する。
- 解剖顕微鏡下で、鉗子を使用してシリコーンリングを慎重に取り外す。一対のはさみで、CAM-Delamサンプルを長方形に切り、中央に癌細胞を持たせます(図1G)。
- 一対の鉗子を用いて、CAM-Delamサンプルをペトリ皿内の凍結切片培地に移して余分なスクロースを除去し、次いで凍結切片培地にカビを埋め込む。
- 解剖顕微鏡下で、任意の針状の器具を使用して、埋め込み型に垂直方向にU字型のCAM-Delamサンプルを配置します(図1G)。
- CAM-Delam サンプルを凍結し、-80 °C で保存します。
8. カムデラムサンプルのセクショニング
- 凍結したCAM-Delamサンプルを凍結切除法を用いて5~6枚の連続スライド上に10μmで切断する。
- 切片付きのスライドを-80°Cで保存するか、免疫組織化学染色に直接使用してください。
9. 免疫組織化学染色
- イムノプロトコールを開始する前に、スライドを-80°CからRTまで5分間持ち込みます。
- セクションが終わるスライドに疎水性マーカーで線を作ります。数分間乾かします。
- スライドを加湿(H2O)チャンバーに入れ、約200〜500μLのブロッキング溶液(10%ウシ胎児血清および0.1%アジ化ナトリウムをトリス緩衝生理食塩水および0.1%Triton X-100 [TBST])で覆い、15〜30分間インキュベートする。
メモ: このステップ以降は、スライドを乾燥させないでください。 - ブロッキング溶液を注ぎ、ブロッキング溶液で希釈した目的の一次抗体100〜150μLと交換し、4°Cでオンにインキュベートする。 好ましくは、GFPまたは他の蛍光タグ付き癌細胞株を使用しない場合は、癌細胞マーカーと共に基底薄層を定義するためにウサギ抗ラミニン−111抗体を使用する。
注:ここでは、ウサギのアンチフォンビルブランド因子もCAM内の血管を検出するために使用されました。 - TBSTバッファーを充填したガラスキュベットを3枚用意する。
- 一次抗体溶液を注ぎ、スライドをガラスキュベットに移し、TBSTでそれぞれ5分間少なくとも3倍に洗浄する。
- スライドから余分なTBSTを取り除き、柔らかい紙ティッシュで疎水性バリア領域から除去します。
- スライドをブロッキング溶液で希釈した適切な二次蛍光抗体100〜150μLで覆い、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩(DAPI)と組み合わせ、暗所でRTで1時間インキュベートする。
- 二次抗体溶液を注ぎ、スライドをガラスキュベットに移し、TBSTでそれぞれ5分間少なくとも3倍に洗浄する。
- スライドから余分なTBSTを取り除き、柔らかい紙ティッシュで疎水性バリア領域から除去します。
- スライドに蛍光付着剤を1~2滴入れてスライドを取り付け、気泡を避けてガラスカバースリップをそっと置きます。
- 分析する前にスライドを 4 °C で少なくとも 1 時間乾燥させ、スライドを 4 °C に保管します。
10. 顕微鏡イメージングと層間剥離スコアリング
- 切片をデジタルカメラを搭載した落射蛍光顕微鏡を用いて、好ましくは10倍の倍率で撮影する(図1H)。
- 次の CAM-Delam スコアリング カテゴリを使用してセクションを分析します (図 3)。
- 目に見える変化のない無傷の基底薄層を探してください。
- 変化しているが損傷を受けていない基底ラミナを探します。
- 細胞の侵入なしに損傷した基底薄層を探してください。
- 細胞の侵入で損傷した基底薄層を探します。
Representative Results
図1は 、CAM-Delamアッセイ7における重要なステップを示す。内部加湿チャンバー(図1C)の使用により、ニワトリ胚の生存率は、孵化10日目に<50%から90%まで、孵化13日目に約15%から80%まで有意に改善されました(図2)。
図1:CAM-Delamアッセイの主なステップ。 (A)受精鶏卵を回転せずに水平に孵化させる。(B,C)孵化の3日目に、卵を割って滅菌計量ボートに入れ(B)、ボートを内部加湿チャンバーに入れてさらに孵化させます(C)。(D)シリコーンリングを用意する。(e)インキュベーションの10日目に、CAM上にシリコーンリングを置き、ピペットを使用してリング内に1 x106 個の癌細胞をシードする。(F,G)異なる時点(数時間〜数日)で、癌細胞を付着させたCAMを解剖し、(F)PFA中で固定し、スクロースで処置し、凍結切片培地中での位置、(G)−80°Cで凍結した(H)関連するGFP+ 癌細胞(緑)およびラミニン免疫組織化学染色(赤)を有する切片CAMの例を示す。スケールバー = 2 mm (E、F)、1 mm (G)、および 100 μm (H) です。この数字はパラニアパンらのものです。略語: CAM = 絨毛膜;PFA = パラホルムアルデヒド;GFP = 緑色蛍光タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:インキュベーション法に関連するニワトリ胚の 生存率(A,B)インキュベーション10日目に、内部HCにおけるニワトリ胚の生存率は2倍になった(平均値89.N=105)をペトリ皿中でのインキュベーションと比較した(A;平均値40;N=64)および非加湿チャンバー(B;平均値48.N = 46)。(C、D)インキュベーション13日目に、HCを用いても高い生存率が観察された(平均値81.67;N = 105)、一方、胚生存率の大幅な低下がPDを用いて認められた(C;平均値11.N=64)、およびN-HC(D;平均値18.N = 46)。統計的有意性は、不対応両側 t検定を用いて検定した。エラーバーは標準偏差を示す。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。この図はPalaniappan et al.7から修正された。略語: HC = 加湿チャンバー;PD = ペトリ皿;N-HC = 非加湿チャンバー;E X = 潜伏期 X. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
このプロトコールを用いたGFPを発現する異なる癌細胞株(U251膠芽腫、PC-3U前立腺、SW620結腸、およびA549肺)の解析は、Palaniappan et al.7によって以前に報告された。CAM-Delamアッセイの結果には、ラミニンによって検出された基底ラミナの形態の違い、およびヒナ基底ラミナ層を横断してニワトリ中胚葉層に交差した細胞として定義される癌細胞浸潤が含まれる(図3)。これらの結果は、がん細胞が基底薄層を分解して間葉系に侵入する能力を、1)目に見える変化のない無傷の基底薄層(図3B)、2)変化しているが損傷していない基底薄層(図3C)、3)細胞浸潤のない損傷した基底薄層(図3D)、および4)細胞浸潤を伴う損傷基底薄層(図3E)の4つのカテゴリーのいずれかにスコアリングできることを示しています。).別の観察は、癌細胞が基底薄層の変化または損傷を引き起こしたとき、CAMはまた、血管で合成されるフォンビルブランド因子に対する抗体染色によって定義される血管形成の増加とともに肥厚した8(図4C-H)。これら2つの表現型、肥厚したCAMおよび血管の形成の増加は、CAMが無傷であった場合には観察されなかった(図4A、B)。
(A-E)抗ラミニンによって可視化されたCAM基底ラミナの完全性(赤色)およびGFP発現癌細胞の潜在的な浸潤(緑色)に基づくCAM-Delamスコアリング例。(A)癌細胞を含まないCAMを制御する。(B-E)癌細胞に対する応答において、基底ラミナの形態を記述する4つのカテゴリーをスコアリングすることができる:(B)無傷のラミニン、(C)変化したが損傷を受けていないラミニン(アスタリスクで示す)、(D)損傷したラミニンが癌細胞の浸潤を伴わない(矢印)、細胞浸潤を伴う損傷ラミニン(矢じり)。スケールバー = 100 μm (A-E)。この数字はパラニアパンらのものです。略語: CAM = 絨毛膜;GFP = 緑色蛍光タンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:CAM増粘及び血管形成の評価 (A-H)CAM肥厚および血管形成の可視化の一例は、様々な癌細胞型の薄層に応答して、抗フォンビルブラント因子(赤色)によって検出される。(A,B)癌細胞なしでCAMを制御します。(C、D)非転移性癌細胞株(インタクトとしてスコアリング)に応答して、間葉の明らかな肥厚または血管形成の増加は検出されなかった。(E-H)ラミニンの変化または損傷をもたらす転移性癌細胞に応答して、間葉は肥厚し(二重矢印で示す)、血管形成の増加が観察された(矢印で示す)。スケールバー = 100 μm。この図はPalaniappan et al.7から修正された。略語: CAM = 絨毛膜;GFP = 緑色蛍光タンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
U251膠芽腫およびPC-3U前立腺癌細胞は、完全に異なる層間剥離能力を有する癌細胞株の2つの例である(図5)。PC-3U細胞は、1.5日後に損傷ラミニンを誘導し、2.5日後には明らかな浸潤を伴った(図5A)。対照的に、U251細胞は1.5〜3.5日後にラミニンのわずかな変化を誘導しただけで、ラミニンに目に見える損傷を引き起こすことはなかった(図5B)。
(A)PC-3U細胞は14時間後にラミニンの軽微な変化を誘導し、1.5日後にラミニンの損傷(矢印)、および浸潤の開始は2.5日後に増加し、これは3.5日後に増加した(矢じり)。(b)U251細胞は、1.5〜3.5日後にラミニンの軽微な変化を引き起こした。右側のパネルは、CAM-Delam スコアリングを表すグラフを示しています。y軸はサンプル数を示し、x軸は培養の時点を示す。スケールバー = 100 μm (A,B)。この図はPalaniappan et al.7から修正された。略語: CAM = 絨毛膜;GFP = 緑色蛍光タンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
CAM-Delamアッセイは、層間剥離プロセスを調節する分子機構を定義するために使用できます。1つの例は、広範なMMP阻害剤GM6001を用いて阻害マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の組み合わせの有無にかかわらず低酸素を誘導するためのCoCl2処置の使用である(図6)。CoCl2処理後、U251非転移性癌細胞は層間剥離および浸潤性細胞を誘導する能力を獲得し、CoCl2処理をMMP阻害剤GM6001と併用すると抑制された(図6)。したがって、CAM-Delamアッセイは、層間剥離プロセスに影響を与える分子および分子経路を定義する際に有用であり得る。
図6:CoCl2単独またはMMP阻害剤と共に曝露されたU251細胞に応答した層間剥離パターン。 (A-C)U251細胞を様々な条件の間にCAM上で3.5日間培養した。(ア)単独で培養したU251細胞は、ラミニンに何らの損傷も誘導しなかった。(b)培養したU251細胞をCoCl2に予備暴露し(24時間)、CAM上での洗浄および細胞播種前に、ラミニン損傷および細胞浸潤を誘導した。(c)広域スペクトルMMP阻害剤GM6001による前処理(1時間)、続いてU251細胞をCAM上に洗浄および播種する前にCoCl2曝露(24時間)を行い、CoCl2処理の効果を抑制し、明らかなラミニン損傷または癌細胞浸潤は検出されなかった。スケールバー = 100 μm (A-C)。パネル(B)および(C)は、Palaniappan et al.7からのものである。略語: CAM = 絨毛膜;GFP = 緑色蛍光タンパク質;CoCl2 = 塩化コバルト;MMP = マトリックスメタロプロテイナーゼ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
この論文では、数時間から数日以内に基底薄層変調と間葉系への潜在的な細胞浸潤をスコアリングすることによって決定された、癌細胞の転移性攻撃性を評価するためのCAM-Delamアッセイについて説明します。様々なCAMアッセイの以前の技術的問題は、ひよこ胚の生存率が低いことであった。この問題は、胚の孵化中に内部加湿チャンバーの使用を導入することによって解決され、胚の生存率が10%-50%から80%-90%に増加した7。したがって、内部加湿チャンバーの使用は、一般的なCAMアッセイにおいて、ならびに他の 元オボ ひよこ実験において価値がある可能性がある。
CAM上に1 x106個の癌細胞を播種してから14時間、1.5日、2.5日、および3.5日時点で提示されたスコアリングタイムポイントは、6つの異なる癌細胞株を用いた厳密な方法開発に基づいており、癌細胞株の非層間剥離能力から浸潤を伴う層間剥離能力の範囲を区別するのに十分である。各時点および細胞株ごとに3つのリングを有する4つの卵の最小使用が示唆されており、これは少なくとも1回、または実験計画および統計的要件に従って繰り返されるべきである。CAM-Delamアッセイの利点の1つは、がん細胞の攻撃性と転移形成の潜在的なリスクを推定するために、数日以内にがん細胞の層間剥離能力に関する有益な結果を得ることです。結果の迅速な送達は、侵入する癌細胞およびその後の微小腫瘍/腫瘍芽および器官転移による基底薄層の分解を監視することによって促進される。伝統的に、CAMモデルは臓器転移の形成を分析するために使用されてきたが、これは決定されるまでに約2週間かかる9。7つの異なるがん細胞株を使用することにより、我々は以前に7つの層間剥離スコアリングが、CAM-Delamアッセイの予測値を支持するげっ歯類モデル10、11、12、13、14において転移を形成する癌細胞の能力に関連していることを検証した。さらに、マウスモデルは、転移を検査する前に、数週間から数ヶ月まで、さらに長い時間を必要とする15,16。要するに、この開発されたCAM-Delamアッセイは、雛胚における後の腫瘍形成を調べることではなく、層間剥離能力のスコアリングに焦点を当てており、したがって、既存のニワトリCAM浸潤およびマウス腫瘍モデルを良好に補完するものである。
CAM-Delamアッセイにおける限界は、癌細胞自体がラミニンを発現する場合の基底薄層の不明瞭な可視化であり得る。もしそうなら、E-カドヘリンのような基底薄層を示す他のマーカーを使用することができる7。他のCAM浸潤研究では、IV型コラーゲンを用いてCAMおよび汎サイトケラチンおよびビメンチンを視覚化し、侵入する癌細胞および微小腫瘍/腫瘍芽の形成を同定している17,18。
層間剥離は、発生中および後年の両方における正常な細胞プロセスであり、細胞が上皮を離れて他の組織に移動することを可能にする。発生中の層間剥離細胞の例は、神経堤および嗅覚の先駆的なニューロンである19、20;人生の後半において、創傷治癒は層間剥離21に依存する。がんの間、このプロセスは間違った細胞および/または間違ったタイミングでアップレギュレートされます。したがって、CAM-Delam法は、基本的な生物学的知識と疾患知識の両方にとって重要である層間剥離を調節する分子メカニズムを解明するために使用することができる。このような層間剥離研究には、CAM上に播種された癌細胞に関心のある因子を添加すること、または遺伝子改変癌細胞を研究することが含まれるであろう。ここで提示される1つの例は、低酸素を誘導するための非転移性細胞株U251のCoCl2前処理 であり、これは、広域スペクトルMMP阻害剤によって抑制され得る転移性攻撃能力の誘導をもたらす。したがって、層間剥離を制御する重要な分子を見つけることは、このプロセスを抑制する阻害剤を設計する可能性を高める。これに関連して、CAM-Delamプロトコルの別の潜在的な用途は、層間剥離および細胞浸潤の抑制のための薬物スクリーニングにある。さらに、診療所では、がんの重症度の評価は、診断、治療計画、およびケアのための重要な要素です。現在、TNM病期分類系(T、腫瘍サイズ;N, ノード - 癌がリンパ節に広がっているかどうか;M,遠隔転移)は、癌22の重症度を評価するために用いられる。CAM-Delamアッセイは、がん細胞の攻撃性と転移形成の潜在的なリスクを評価するための革新的なアプローチを定義し、TNM病期分類システムを補完する有用なものとなる可能性があります。注目すべきは、TNM病期分類が固定組織サンプルの分析に基づいているのに対し、潜在的な臨床CAM-Delamアプローチは、凍結細胞を復活させる技術と組み合わせて新鮮または新鮮な凍結組織を調べることである23。
Disclosures
著者らは、開示する競合する利益を持っていません。
Acknowledgments
我々は、関連する癌細胞株および抗体に関するウメオ大学の研究者の協力に感謝します:L. Carlsson(フォンビルブランド因子抗体)、J. Gilthorpe(U251)、およびM. Landström(PC-3U)。また、HEK293-TLR-AAVS1安定細胞株の生成に対してギルソープ研究所のHauke Holthusen氏にも感謝します。Gunhaga研究所での研究は、Swedish Cancer Foundation(18 0463)、Umeå Biotech Incubator、Norrlands Cancerforskningsfond、Swedish Research Council(2017-01430)、およびUmeå Universityの医学部によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
| Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
| Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
| Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
| Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
| Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| MATERIALS | |||
| anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
| anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
| anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
| Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
| Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
| Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
| Plastic box | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
| RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
| Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
| SOLUTIONS | |||
| Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
| PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
| Mix and use immediately | |||
| Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
| FBS 50 mL |
|||
| Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
| Store at 4 °C | |||
| PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
| NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
| add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
| Store in RT | |||
| PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
| 0.2 M PB 50 mL |
|||
| Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
| heat to 60 °C in water bath | |||
| add 5 M NaOH 25 µL |
|||
| Stir to dissolve the PFA powder | |||
| Store at 4 °C | |||
| TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
| 150mM NaCI 30 mL |
|||
| 0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
| H2O (MQ) 900 mL |
|||
| Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
| 10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
| 10 mL in total, Store at 4 °C |
References
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