Summary
El ensayo CAM-Delam para evaluar la capacidad metastásica de las células cancerosas es relativamente rápido, fácil y barato. El método se puede utilizar para desentrañar los mecanismos moleculares que regulan la formación de metástasis y para la detección de fármacos. Un ensayo optimizado para analizar muestras de tumores humanos podría ser un método clínico para el tratamiento personalizado del cáncer.
Abstract
La principal causa de muertes relacionadas con el cáncer es la formación de metástasis (es decir, cuando las células cancerosas se diseminan desde el tumor primario a órganos distantes y forman tumores secundarios). La delaminación, definida como la degradación de la lámina basal y la membrana basal, es el proceso inicial que facilita la transmigración y propagación de las células cancerosas a otros tejidos y órganos. Puntuar la capacidad de delaminación de las células cancerosas indicaría el potencial metastásico de estas células.
Hemos desarrollado un método estandarizado, el ensayo ex ovo CAM-Delam, para visualizar y cuantificar la capacidad de las células cancerosas para delaminar e invadir, pudiendo así evaluar la agresividad metastásica. Brevemente, el método CAM-Delam incluye la siembra de células cancerosas en anillos de silicona en la membrana corioalantoica (CAM) del pollito en el día embrionario 10, seguido de la incubación de horas a unos pocos días. El ensayo CAM-Delam incluye el uso de una cámara humidificada interna durante la incubación de embriones de pollitos. Este nuevo enfoque aumentó la supervivencia embrionaria del 10%-50% al 80%-90%, lo que resolvió problemas técnicos previos con bajas tasas de supervivencia embrionaria en diferentes ensayos CAM.
A continuación, las muestras de CAM con grupos de células cancerosas asociadas se aislaron, fijaron y congelaron. Finalmente, se visualizaron muestras sección de criostato y se analizaron para detectar daños en la membrana basal e invasión de células cancerosas mediante inmunohistoquímica. Al evaluar varias líneas celulares de cáncer metastásicas y no metastásicas conocidas diseñadas para expresar proteína fluorescente verde (GFP), los resultados cuantitativos de CAM-Delam mostraron que los patrones de capacidad de delaminación reflejan la agresividad metastásica y se pueden calificar en cuatro categorías. El uso futuro de este ensayo, además de cuantificar la capacidad de delaminación como una indicación de agresividad metastásica, es desentrañar los mecanismos moleculares que controlan la delaminación, la invasión, la formación de micrometástasis y los cambios en el microambiente tumoral.
Introduction
Aproximadamente el 90% de la mortalidad en pacientes con cáncer es causada por las consecuencias de la metástasis del cáncer, que es la formación de tumores secundarios en otras partes del cuerpo de donde se originó originalmente el cáncer1. Por lo tanto, es importante identificar mecanismos relacionados con la metástasis para encontrar objetivos potenciales para suprimir la formación de metástasis tumorales. Posteriormente, existe la necesidad de sistemas modelo en los que se pueda evaluar el proceso metastásico.
Durante la metástasis, las células cancerosas sufren transición epitelial a mesenquimal (EMT), un proceso celular normal en el que las células epiteliales pierden sus propiedades de adherencia y polaridad y en su lugar adquieren un carácter mesenquimal invasivo2. La delaminación es parte del proceso de EMT e implica la degradación de la laminina en la membrana basal, que es un requisito previo para que las células cancerosas abandonen el tumor primario e invadan otros tejidos. Los principales factores que se regulan al alza durante la formación de metástasis incluyen metaloproteinasas de matriz (MMP), ADAM (una desintergina y metaloproteinasa), ADAMTS (ADAM con motivos de trombospondina) y MMP de tipo membrana (MT-MMPs)3,4. Estos factores degradan moléculas como la laminina, que se expresa en todas las membranas basales, para facilitar la migración e invasión celular.
La membrana corioalantoica (CAM) de un óvulo de pollito fertilizado es un tipo de membrana basal. Se han utilizado óvulos de pollitos fertilizados como modelos metastásicos, en los que se han sembrado células cancerosas en el CAM extraembrionario y posteriormente se ha observado formación de metástasis en los embriones de pollitos5. Además, se utilizan con frecuencia modelos metastásicos de ratón in vivo , en los que se implantan células cancerosas en los ratones y se analizan metástasis en diversos órganos6. Este enfoque requiere mucho tiempo, es costoso y puede causar molestias a los animales. Para abordar esto, hemos desarrollado el ensayo CAM-Delam, un modelo más rápido y barato para evaluar la agresividad metastásica de las células cancerosas. En este modelo, la capacidad de las células cancerosas para degradar el CAM del pollito (por ejemplo, la capacidad de delaminación) se combina con una posible invasión de células cancerosas en el mesénquima y se utiliza como una medida de la agresividad metastásica.
El presente artículo, basado en una publicación anterior7, describe el ensayo CAM-Delam en detalle, desde el manejo de óvulos de pollitos fertilizados, el cultivo de células cancerosas y la siembra, disección y análisis de muestras de CAM, hasta la puntuación de la capacidad de delaminación de las células cancerosas en cuatro categorías: intactas, alteradas, dañadas e invasoras. También damos ejemplos de cómo este ensayo se puede utilizar para determinar los mecanismos moleculares que regulan el proceso de delaminación.
Protocol
En resumen, la Figura 1 resume los pasos generales en el ensayo CAM-Delam. El siguiente protocolo se basa en 30 huevos de gallina fertilizados cultivados y el uso de dos líneas celulares de cáncer diferentes sembradas por separado en tres anillos / huevo y analizadas en cuatro puntos de tiempo.
1. Incubación de huevos
- Use huevos de pollitos fertilizados de un criadero local, que garanticen más del 90% de fertilización
NOTA: Los huevos no deben haberse almacenado durante más de 4 días a temperatura ambiente (RT). En Suecia, el permiso ético para el uso experimental de pollos embrionarios solo se requiere a partir del día embrionario (E) 14 y más allá. - Si es necesario, limpie mecánicamente cuidadosamente cualquier suciedad o plumas en los huevos con una toalla de papel seca o mojada en agua.
- Limpie y esterilice la incubadora de huevos con etanol al 70% antes de su uso (cada vez).
- Coloque el número deseado de huevos en bandejas de huevos e incube los huevos de los pollitos horizontalmente en una incubadora de huevos a 37.5-38 ° C con un 70% de humedad. Considere esto como el día de incubación 0 (Figura 1A).
2. Preparación de botes de pesaje, cajas de plástico e instrumentos de disección
- Use etanol al 70% para esterilizar 30 botes de pesaje y 30 pequeñas cajas de plástico (~ 0.4 L) con tapas transparentes.
- Seque los botes de pesaje y las cajas en una campana laminar durante la noche (ON) y guárdelos en una caja de plástico cerrada hasta su uso posterior el día 3 de la incubación.
- Esterilizar 2 L de H2O destilado o desionizado por cada 30 huevos incubados.
- Esterilizar dos pares de tijeras y tres pares de fórceps rociando etanol al 70%. Seque al aire los instrumentos y luego guárdelos en una caja esterilizada hasta el día 3 de incubación.
NOTA: Estas acciones (Pasos 2.1-2.4) se pueden realizar cualquier día antes del día 3 de incubación. Use guantes para evitar la contaminación.
3. Apertura de los huevos y transferencia a la cámara humidificada interna
NOTA: Use guantes y una máscara facial para evitar la contaminación.
- Agregue aproximadamente 50 ml de H2O esterilizado a las cajas de plástico esterilizadas. Mantenga las cajas llenas de agua con tapas cerradas, para evitar la contaminación, en RT hasta su uso.
- En el día 3 de incubación, rompa la cáscara del huevo con la parte afilada de las tijeras y corte una abertura recta en la cáscara.
- Abra manualmente la cáscara del huevo sobre un bote de pesaje y recoja la clara de huevo, la yema y su embrión sano adjunto en el bote de pesaje (Figura 1B). Busque un embrión intacto con un corazón latiendo, yema intacta y vasos sanguíneos desarrollados para el experimento (>95% de los huevos incubados). Descarte los óvulos con un embrión malformado, un embrión sin un corazón latiendo, una yema de huevo rota o vasos sanguíneos de yema dañados.
- Transfiera suavemente el bote de pesaje a una cámara humidificada interna.
NOTA: Para los pasos 3.2.-3.4., trabaje lo más rápido posible para evitar la contaminación y, si es posible, use una campana laminar. - Incubar la cámara humidificada interna en la incubadora de huevos (Figura 1C).
- Cultive los huevos sin cáscara desde el día 3 hasta el día 10 en la incubadora de huevos antes de ser utilizados (consulte el Paso 3.6.), y cuando sea necesario, agregue agua a la incubadora para mantener un 70% de humedad.
- Revise las cámaras humidificadas internas a través de la tapa de plástico transparente en busca de embriones muertos o huevos contaminados sin cáscara todos los días, y retírelos de la incubadora.
4. Preparación de anillos de silicona
- Para preparar anillos de silicona, corte un tubo de silicona con un diámetro interno y externo de 4 mm y 5 mm, respectivamente, en ~ 1 mm de grosor, preferiblemente usando un cortador de papel (Figura 1D).
- Transfiera los anillos de silicona a pequeñas botellas de vidrio (Figura 1D), cúbralos con lámina de metal y esterilícelos con un autoclave o similar.
NOTA: Evite el autoclave repetido de anillos de silicona no utilizados que puedan estar contaminados, ya que dicho tratamiento disminuye la capacidad de los anillos de silicona para adherirse a la membrana, con la posterior fuga de la solución de célula cancerosa / colágeno / RPMI fuera de los anillos. - Guarde los anillos de silicona estériles en RT.
NOTA: Este paso se puede realizar cualquier día antes del día 10 de incubación.
5. Preparación de células cancerosas
NOTA: Las soluciones como el medio de cultivo celular, la tripsina y 1x PBS se almacenan a 4 °C y deben calentarse a 37 °C en un baño de agua antes de agregarse a las células. Después del calentamiento, enjuague las botellas en etanol al 70% y séquelas antes de usarlas.
- Cultivar las líneas celulares cancerosas de interés en el medio de cultivo correspondiente en una incubadora de cultivo celular a 37 °C en presencia de 5% (v/v) de CO2.
NOTA: Aquí, el glioblastoma U251-GFP y las células de cáncer de próstata PC-3U-GFP se cultivaron en medio RPMI medio RPMI completo suplementado con 10% (v / v) suero fetal bovino (FBS) y 1% (v / v) penicilina-estreptomicina (PS). - Planifique el cultivo de células cancerosas para que aproximadamente 50 × 106 células cancerosas estén listas para la recolección en el día de incubación 10 del ensayo CAM-Delam.
- Cambie el medio de cultivo celular cada 2-3 días, o cuando el color del medio cambie de rosa a naranja / amarillo.
- Opcional: Inducir hipoxia mediante el tratamiento de las células cancerosas con CoCl2 para investigar los efectos mecanicistas moleculares sobre la delaminación 1 día antes de la recolección celular.
PRECAUCIÓN: CoCl2 tiene toxicidad moderada. Manipule con cuidado en una campana extractora de humos y siga las instrucciones del fabricante.- Preparar una solución madre fresca de CoCl2 de 20 mM disolviendo 0,0258 g en 10 ml de H20 destilado esterilizado en un tubo cónico de 15 ml envuelto con papel de aluminio para proteger de la luz.
- En un tubo cónico de 50 ml, mezcle 250 μL de la solución madre de CoCl2 de 20 mM en 25 ml de medio RPMI suplementado con 1% (v/v) PS (pero sin FBS) por plato de cultivo celular de 15 cm de diámetro. Vórtice suavemente.
- Retire el medio RPMI completo de las placas de cultivo celular.
- Lave las células con 1x PBS 2x esterilizado.
- Añadir 25 ml de medio RPMI con tripsinización de células CoCl2 de 200 μM (consulte el paso 5.6).
- En el día 10 de incubación de huevos, preparar 1 ml de una mezcla de colágeno/RPMI (relación 1:3), que contenga 250 μL de colágeno tipo I (5 mg/ml) y 750 μL de medio RPMI de cultivo celular suplementado con 10% de FBS y 1% (v/v) de PS. Mantenga la mezcla de colágeno/RPMI en hielo.
- Tripsinizar las células cancerosas para aislar las células eliminando primero el medio de cultivo celular y lavar 2x con 1x PBS.
- Añadir 3 ml de solución de tripsina (0,05%) por plato de cultivo celular de 15 cm de diámetro e incubar durante 2-3 min en una incubadora de cultivo celular hasta que las células se desprendan. Use un microscopio invertido de mesa para ver las células desprendidas. Si es necesario, golpee suavemente el costado del matraz para desalojar las células agrupadas o unidas restantes.
- Inactive la tripsina agregando 5 ml de medio RPMI completo a cada plato de cultivo celular y recoja la suspensión celular de todos los platos de cultivo celular en un tubo de 50 ml.
- Cuente las células cancerosas mediante el método de exclusión Trypan Blue para distinguir las células vivas de las muertas utilizando un contador celular. Añadir 10 μL de la suspensión celular a 10 μL de tinción azul tripano al 0,4%. Mezcle la muestra mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces, y luego cargue 10 μL de la mezcla de celdas por cámara en el portaobjetos de muestra en el contador de celdas. Repita el conteo de celdas 3x para verificar el número de celda/ml.
- Calcule y centrifugue la suspensión de cultivo celular de volumen correcto que contenga 50 x 106 células cancerosas vivas en un tubo de 50 ml a 500 × g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y mezcle el pellet celular con 1 ml de la mezcla de colágeno / RPMI. Como el colágeno es un material gelatinoso, mezcle las células muy lenta y cuidadosamente con una pipeta de 1 ml para evitar la pérdida de células en la formación de burbujas.
- Mantenga la suspensión celular preparada en hielo y llévela al área de trabajo de huevos.
NOTA: Evite mantener las células cancerosas preparadas en hielo durante demasiado tiempo. Las células cancerosas preparadas deben colocarse en el CAM dentro de los 15-25 minutos.
6. Siembra de las células cancerosas en el CAM
NOTA: Use guantes y una máscara facial para evitar la contaminación.
- En el día 10 de incubación, saque las cámaras humidificadas internas con los huevos incubados sin cáscara de la incubadora.
NOTA: Se puede utilizar aproximadamente el 90% del número inicial de los huevos incubados; ver Figura 2. - Abra la cámara humidificada interna y coloque hasta seis anillos de silicona en el CAM con fórceps esterilizados.
NOTA: Evite colocar los anillos de silicona cerca uno del otro o cerca de vasos sanguíneos más grandes. - Mezcle la suspensión de células cancerosas mediante pipeteo para obtener una distribución uniforme de las células cancerosas y agregue 20 μL (1 × 106 células) de la suspensión de células cancerosas preparada dentro de un anillo de silicona (Figura 1E). Al agregar las células, mantenga la punta de la pipeta por encima del CAM para asegurarse de no dañar la membrana.
NOTA: De acuerdo con los hallazgos anteriores7, se pueden sembrar diferentes células cancerosas en anillos separados en el mismo CAM. - Cierre la cámara humidificada interna y colóquela en la incubadora de huevos.
7. Aislamiento del CAM con células cancerosas asociadas
- Después de 14 h, 1.5 días, 2.5 días y 3.5 días de incubación, saque aproximadamente siete cámaras humidificadas internas y abra las tapas una a la vez.
- Con un par de tijeras, diseccionar las células cancerosas cultivadas unidas a la CAM (las llamadas muestras CAM-Delam) cortando fuera del anillo de silicona (Figura 1F).
- Transfiera inmediatamente la muestra aislada de CAM-Delam utilizando fórceps al 4% de paraformaldehído (PFA) en un tampón de fosfato (PB) de 0,1 M en una placa de Petri para la fijación del tejido. Mantener en hielo o a 4 °C durante 1 h.
NOTA: Conservar la solución de PFA al 4% a 4 °C durante un máximo de 5 días. PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Cuando manipule polvo de PFA y soluciones de PFA, use una campana de humos y use una máscara facial y guantes. Evite inhalar vapores de polvo o solución. Siga las instrucciones del fabricante. - Decapitar los embriones de pollo y desecharlos como residuos biológicos en contenedores específicos.
- Retire la solución de PFA al 4% y agregue sacarosa al 30% en 0,1 M pb a las muestras de CAM-Delam y equilibre a 4 °C durante 1 h.
- Bajo un microscopio de disección, retire cuidadosamente el anillo de silicona con fórceps. Con un par de tijeras, corte la muestra de CAM-Delam en forma rectangular con las células cancerosas en el medio (Figura 1G).
- Con un par de fórceps, transfiera las muestras de CAM-Delam al medio de sección congelado en una placa de Petri para eliminar el exceso de sacarosa y luego a incrustar moldes en el medio de sección congelado.
- Bajo un microscopio de disección, coloque la muestra CAM-Delam en forma de U en dirección vertical en los moldes de incrustación utilizando cualquier instrumento similar a una aguja (Figura 1G).
- Congele y almacene las muestras de CAM-Delam a -80 °C.
8. Seccionamiento de muestras CAM-Delam
- Seccione las muestras CONGELADAS de CAM-Delam a 10 μm en 5-6 diapositivas consecutivas mediante crioseccionación.
- Guarde los portaobjetos con secciones a -80 °C o úselos directamente para la tinción inmunohistoquímica.
9. Tinción inmunohistoquímica
- Lleve los portaobjetos de -80 °C a RT durante 5 minutos antes de iniciar el inmunoprotocolo.
- Haga una línea con un marcador hidrofóbico en las diapositivas donde terminan las secciones. Déjalos secar durante unos minutos.
- Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada (H2O) y cubra las secciones con ~ 200-500 μL de solución bloqueadora (suero fetal de ternero al 10% y azida de sodio al 0.1% en solución salina tamponada tris con Triton X-100 al 0.1% [TBST]) e incube durante 15-30 min.
NOTA: A partir de este paso, no deje que las diapositivas se sequen en ningún momento. - Vierta la solución de bloqueo y reemplácela con 100-150 μL del anticuerpo primario de interés diluido en la solución de bloqueo e incube ON a 4 ° C. Preferiblemente use anticuerpos anti-laminina-111 de conejo para definir la lámina basal junto con un marcador de células cancerosas, si no usa GFP u otras líneas celulares de cáncer marcadas con fluorescencia.
NOTA: Aquí, también se utilizó un factor anti-von Willebrand de conejo para detectar vasos sanguíneos en el CAM. - Prepare tres cubetas de vidrio llenas de tampón TBST.
- Vierta la solución primaria de anticuerpos, transfiera los portaobjetos a las cubetas de vidrio y lave al menos 3 veces durante 5 minutos cada una en TBST.
- Retire el exceso de TBST del portaobjetos y del área de barrera hidrofóbica con un pañuelo de papel blando.
- Cubra el portaobjetos con 100-150 μL de un anticuerpo fluorescente secundario adecuado diluido en solución bloqueadora combinada con 4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI) e incube en la oscuridad a RT durante 1 h.
- Vierta la solución secundaria de anticuerpos, transfiera los portaobjetos a las cubetas de vidrio y lave al menos 3 veces durante 5 minutos cada una en TBST.
- Retire el exceso de TBST del portaobjetos y del área de barrera hidrofóbica con un pañuelo de papel blando.
- Monte las diapositivas colocando 1-2 gotas de medio de montaje fluorescente en la diapositiva y coloque suavemente una cubierta de vidrio, evitando burbujas de aire.
- Deje que los portaobjetos se sequen durante al menos 1 h a 4 °C antes de analizarlos, y guarde los portaobjetos a 4 °C.
10. Puntuación de imágenes de microscopía y delaminación
- Fotografíe las secciones utilizando un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara digital, preferiblemente con un aumento de 10x (Figura 1H).
- Analice las secciones utilizando las siguientes categorías de puntuación CAM-Delam (Figura 3):
- Busque lámina basal intacta sin alteraciones visibles.
- Busque lámina basal alterada pero no dañada.
- Busque lámina basal dañada sin invasión celular.
- Busque lámina basal dañada con invasión celular.
Representative Results
La Figura 1 presenta los pasos clave en el ensayo CAM-Delam7. El uso de cámaras humidificadas internas (Figura 1C) mejoró significativamente la tasa de supervivencia de los embriones de pollitos desde <50% hasta el 90% en el día de incubación 10 y desde ~ 15% hasta 80% en el día de incubación 13 (Figura 2).
Figura 1: Pasos clave del ensayo CAM-Delam. (A) Incubar huevos de gallina fertilizados horizontalmente sin rotación. (B,C) En el día 3 de incubación, rompa los huevos y colóquelos en botes de pesaje estériles (B), y coloque los botes en una cámara humidificada interna para una incubación adicional (C). (D) Preparar anillos de silicona. (E) El día 10 de incubación, coloque los anillos de silicona en el CAM y siembre 1 x 106 células cancerosas dentro de los anillos con una pipeta. (F,G) En diferentes puntos de tiempo (horas a días), diseccionar el CAM con células cancerosas adheridas, (F) fijar en PFA, tratar con sacarosa, colocar en medio de sección congelado, (G) y congelar en -80 ° C. (H) Un ejemplo de un CAM seccionado con células cancerosas GFP + asociadas (verde) y tinción inmunohistoquímica de laminina (rojo). Barras de escala = 2 mm (E,F), 1 mm (G) y 100 μm (H). Esta cifra es de Palaniappan et al.7. Abreviaturas: CAM = membrana corioalantoica; PFA = paraformaldehído; GFP = proteína fluorescente verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Supervivencia del embrión de pollo en relación con el método de incubación. (A,B) En el día 10 de incubación, la supervivencia del embrión de pollo en hc internos se duplicó (valor medio 89,33; N = 105) en comparación con la incubación en placas de Petri (A; valor medio 40; N = 64) y cámaras no humidificadas (B; valor medio 48,67; N = 46). (C,D) En el día 13 de incubación, todavía se observó una alta tasa de supervivencia utilizando HC (valor medio 81,67; N = 105), mientras que se observó una disminución importante en la supervivencia embrionaria utilizando DP (C; valor medio 11,33; N = 64), y N-HC (D; valor medio 18,33; N = 46). La significación estadística se probó mediante una prueba t de dos colas no apareadas. Las barras de error indican la desviación estándar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Esta cifra fue modificada a partir de Palaniappan et al.7. Abreviaturas: HC = cámara humidificada; PD = placas de Petri; N-HC = cámara no humidificada; E X = Día de incubación X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los análisis de diferentes líneas celulares cancerosas que expresan GFP (glioblastoma U251, próstata PC-3U, colon SW620 y pulmón A549) utilizando este protocolo fueron reportados previamente por Palaniappan et al.7. Los resultados del ensayo CAM-Delam incluyen diferencias en la morfología de la lámina basal, detectada por laminina, y la invasión de células cancerosas, definidas como células que han cruzado la capa de lámina basal de pollitos en la capa mesodérmica de pollitos (Figura 3). Estos resultados muestran que la capacidad de las células cancerosas para degradar la lámina basal e invadir el mesénquima se puede calificar en una de cuatro categorías: 1) lámina basal intacta sin alteraciones visibles (Figura 3B), 2) lámina basal alterada pero no dañada (Figura 3C), 3) lámina basal dañada sin invasión celular (Figura 3D) y 4) lámina basal dañada con invasión celular (Figura 3E) ). Otra observación fue que, cuando las células cancerosas causaron una lámina basal alterada o dañada, el CAM también se engrosó con un aumento de la formación de vasos sanguíneos, definido por la tinción de anticuerpos contra el Factor de von Willebrand, que se sintetiza en los vasos sanguíneos8 (Figura 4C-H). Estos dos fenotipos, un CAM engrosado y una mayor formación de vasos sanguíneos, no se observaron cuando el CAM estaba intacto (Figura 4A, B).
Figura 3: Puntuación CAM-Delam. (A-E) Ejemplo de puntuación CAM-Delam basado en la integridad de la lámina basal CAM, visualizada por antilaminina (rojo) y la posible invasión de células cancerosas que expresan GFP (verde). (A) Controlar la CAM sin células cancerosas. (B-E) En las respuestas a las células cancerosas, se pueden calificar cuatro categorías que describen la morfología de la lámina basal: (B) laminina intacta, (C) laminina alterada pero no dañada (indicada por un asterisco), (D) laminina dañada pero sin invasión de células cancerosas (flechas), laminina dañada con invasión celular (puntas de flecha). Barra de escala = 100 μm (A-E). Esta cifra es de Palaniappan et al.7. Abreviaturas: CAM = membrana corioalantoica; GFP = proteína fluorescente verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación del engrosamiento de CAM y la formación de vasos sanguíneos. (A-H) Un ejemplo de visualización del engrosamiento de CAM y la formación de vasos sanguíneos, detectado por el factor anti-Von Willebrand (rojo), en respuesta a la lámina de varios tipos de células cancerosas. (A,B) Controle la CAM sin células cancerosas. (C,D) En respuesta a una línea celular de cáncer no metastásica (calificada como Intacta), no se detectó un engrosamiento evidente del mesénquima o un aumento de la formación de vasos sanguíneos. (E-H) En respuesta a las células cancerosas metastásicas que resultaron en Laminina alterada o dañada, el mesénquima se engrosó (indicado por puntas de flecha dobles) y se observó un aumento de la formación de vasos sanguíneos (indicado por flechas). Barra de escala = 100 μm. Esta cifra fue modificada a partir de Palaniappan et al.7. Abreviaturas: CAM = membrana corioalantoica; GFP = proteína fluorescente verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El glioblastoma U251 y las células de cáncer de próstata PC-3U son dos ejemplos de líneas celulares de cáncer con capacidades de delaminación completamente diferentes (Figura 5). Las células PC-3U indujeron laminina dañada después de 1,5 días, con una invasión clara después de 2,5 días (Figura 5A). En contraste, las células U251 solo indujeron alteraciones menores de laminina después de 1.5-3.5 días, pero nunca causaron ningún daño visible a la laminina (Figura 5B).
Figura 5: Visualización de la capacidad de delaminación de las células cancerosas de próstata (PC-3U) y glioblastoma (U251 ). (A) Las células PC-3U indujeron una alteración menor de la laminina después de 14 h, daño de la laminina después de 1,5 días (flecha) y el inicio de la invasión después de 2,5 días, que se incrementó después de 3,5 días (puntas de flecha). (B) Las células U251 causaron una alteración menor de la laminina después de 1.5-3.5 días. Los paneles de la derecha muestran gráficos que representan la puntuación CAM-Delam. El eje y indica el número de muestras y el eje x indica los puntos temporales de cultivo. Barra de escala = 100 μm (A,B). Esta cifra fue modificada a partir de Palaniappan et al.7. Abreviaturas: CAM = membrana corioalantoica; GFP = proteína fluorescente verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El ensayo CAM-Delam se puede utilizar para definir los mecanismos moleculares que regulan el proceso de delaminación. Un ejemplo es el uso del tratamiento con CoCl2 para inducir hipoxia con o sin la combinación de metaloproteinasas de matriz inhibidoras (MMP) utilizando el inhibidor amplio de MMP GM6001 (Figura 6). Después del tratamiento con CoCl2 , las células cancerosas no metastásicas U251 adquirieron la capacidad de inducir delaminación y células invasivas, que se suprimió cuando el tratamiento con CoCl2 se combinó con el inhibidor de MMP GM6001 (Figura 6). Por lo tanto, el ensayo CAM-Delam puede ser útil para definir moléculas y vías moleculares que afectan el proceso de delaminación.
Figura 6: Patrones de delaminación en respuesta a células U251 expuestas a CoCl2 solas o junto con un inhibidor de MMP. (A-C) Células U251 cultivadas durante 3,5 días en el CAM durante diversas condiciones. (A) Las células U251 cultivadas solas no indujeron ningún daño a la laminina. (B) Células U251 cultivadas preexpuestas a CoCl2 (24 h) antes del lavado y la siembra celular en el CAM indujeron daño por laminina e invasión celular. (C) El pretratamiento con un inhibidor de MMP de amplio espectro GM6001 (durante 1 h), seguido de la exposición a CoCl2 (24 h) antes de lavar y sembrar células U251 en el CAM, suprimió el efecto del tratamiento con CoCl2 y no se detectó daño obvio por laminina o invasión de células cancerosas. Barra de escala = 100 μm (A-C). Los paneles (B) y (C) son de Palaniappan et al.7. Abreviaturas: CAM = membrana corioalantoica; GFP = proteína fluorescente verde; CoCl2 = cloruro de cobalto; MMP = metaloproteinasa de matriz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este artículo describe el ensayo CAM-Delam para evaluar la agresividad metastásica de las células cancerosas, determinada mediante la puntuación de modulaciones de la lámina basal y la posible invasión celular en el mesénquima en un período de horas a unos pocos días. Un problema técnico previo para varios ensayos CAM ha sido la baja supervivencia de los embriones de pollo. Este problema se resolvió mediante la introducción del uso de una cámara humidificada interna durante la incubación del embrión, lo que aumentó la supervivencia embrionaria del 10%-50% al 80%-90%7. Por lo tanto, el uso de una cámara humidificada interna puede ser valioso en los ensayos CAM en general, así como en otros experimentos ex ovo pollitos.
Los puntos de tiempo de puntuación presentados a las 14 h, 1,5 días, 2,5 días y 3,5 días después de sembrar 1 x 106 células cancerosas en el CAM se basan en el desarrollo riguroso de métodos utilizando seis líneas celulares de cáncer diferentes y son suficientes para distinguir el rango de capacidades de no delaminación a deslaminación con invasión de líneas celulares de cáncer. Se sugiere un uso mínimo de cuatro huevos con tres anillos en cada punto de tiempo y por línea celular, y esto debe repetirse al menos una vez o de acuerdo con los diseños experimentales y los requisitos estadísticos. Una ventaja del ensayo CAM-Delam es obtener resultados informativos sobre la capacidad de delaminación de las células cancerosas en unos pocos días para estimar la agresividad de las células cancerosas y el riesgo potencial de formación de metástasis. La entrega rápida de resultados se facilita mediante el monitoreo de la degradación de la lámina basal debido a las células cancerosas invasoras y los microtumores / brotes tumorales posteriores y metástasis de órganos. Tradicionalmente, los modelos CAM se han utilizado para analizar la formación de metástasis en órganos, que tarda alrededor de 2 semanas en determinarse9. Mediante el uso de siete líneas celulares de cáncer diferentes, hemos verificado previamente7 que la puntuación de delaminación está relacionada con la capacidad de las células cancerosas para formar metástasis en modelos de roedores 10,11,12,13,14, lo que respalda el valor predictivo del ensayo CAM-Delam. Además, los modelos de ratón requieren un tiempo aún más largo, de varias semanas a meses, antes de que se puedan examinar las metástasis15,16. En resumen, este ensayo CAM-Delam desarrollado, centrado en puntuar la capacidad de delaminación y no en examinar la formación tumoral posterior en el embrión de pollito, es, por lo tanto, un buen complemento para la invasión CAM de pollo existente y los modelos de tumores de ratón.
Una limitación en el ensayo CAM-Delam puede ser la visualización poco clara de la lámina basal si las propias células cancerosas expresan laminina. Si es así, se podrían utilizar otros marcadores que indiquen la lámina basal, como la E-cadherina7. Otros estudios de invasión CAM han utilizado colágeno tipo IV para visualizar el CAM y la pancitoqueratina y vimentina para identificar células cancerosas invasoras y la formación de microtumores/brotes tumorales17,18.
La delaminación es un proceso celular normal, tanto durante el desarrollo como más adelante en la vida, que hace posible que las células salgan de un epitelio y migren a otros tejidos. Ejemplos de células delaminantes durante el desarrollo son la cresta neural y las neuronas pioneras olfativas19,20; más adelante en la vida, la cicatrización de heridas depende de la delaminación21. Durante el cáncer, este proceso se regula al alza en las células equivocadas y / o en el momento equivocado. Por lo tanto, el método CAM-Delam puede ser útil para desentrañar los mecanismos moleculares que regulan la delaminación, lo que sería de importancia tanto para el conocimiento biológico básico como para el de la enfermedad. Tales estudios de delaminación incluirían agregar factores de interés a las células cancerosas sembradas en el CAM o estudiar células cancerosas modificadas genéticamente. Un ejemplo presentado aquí es el pretratamiento con CoCl2 de la línea celular no metastásica U251 para inducir hipoxia, lo que conduce a la inducción de una capacidad agresiva metastásica que podría ser suprimida por un inhibidor de MMP de amplio espectro. Por lo tanto, encontrar moléculas clave que controlen la delaminación aumenta la posibilidad de diseñar inhibidores para suprimir este proceso. En relación con esto, otro uso potencial para el protocolo CAM-Delam es en la detección de drogas para la supresión de la delaminación y la invasión celular. Además, en la clínica, la evaluación de la gravedad del cáncer es un componente crítico para el diagnóstico, la planificación del tratamiento y la atención. Actualmente, el sistema de estadificación TNM (T, tamaño del tumor; N, ganglio: si el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos; M, metástasis a distancia) se utiliza para evaluar la gravedad del cáncer22. El ensayo CAM-Delam define un enfoque innovador para evaluar la agresividad de las células cancerosas y el riesgo potencial de formación de metástasis y podría ser un complemento útil para el sistema de estadificación TNM. Cabe destacar que la estadificación TNM se basa en el análisis de muestras de tejido fijo, mientras que un posible enfoque clínico CAM-Delam examinaría el tejido fresco o recién congelado en combinación con técnicas para revivir células congeladas23.
Disclosures
Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los siguientes investigadores de la Universidad de Umeå por su ayuda con líneas celulares y anticuerpos relevantes contra el cáncer: L. Carlsson (anticuerpo del factor von Willebrand), J. Gilthorpe (U251) y M. Landström (PC-3U). También agradecemos a Hauke Holthusen en el laboratorio de Gilthorpe por la generación de la línea celular estable HEK293-TLR-AAVS1. El trabajo en el laboratorio Gunhaga fue apoyado por la Fundación Sueca del Cáncer (18 0463), Umeå Biotech Incubator, Norrlands Cancerforskningsfond, el Consejo Sueco de Investigación (2017-01430) y la Facultad de Medicina de la Universidad de Umeå.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
| Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
| Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
| Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
| Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
| Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| MATERIALS | |||
| anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
| anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
| anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
| Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
| Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
| Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
| Plastic box | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
| RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
| Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
| SOLUTIONS | |||
| Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
| PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
| Mix and use immediately | |||
| Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
| FBS 50 mL |
|||
| Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
| Store at 4 °C | |||
| PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
| NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
| add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
| Store in RT | |||
| PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
| 0.2 M PB 50 mL |
|||
| Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
| heat to 60 °C in water bath | |||
| add 5 M NaOH 25 µL |
|||
| Stir to dissolve the PFA powder | |||
| Store at 4 °C | |||
| TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
| 150mM NaCI 30 mL |
|||
| 0,1% Triton X-100 10 mL |
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| H2O (MQ) 900 mL |
|||
| Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
| 10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
| 10 mL in total, Store at 4 °C |
References
- Vasantharajan, S. S., et al. The epigenetic landscape of circulating tumour cells. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).
- Itoh, Y. Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations. Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).
- Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis. BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).
- Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies. Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells. Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).
- Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P.
- Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells. Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).
- Jia, Y., et al. Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer. Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).
- Liu, B., et al. RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling. Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).
- Qin, T., et al. Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer. Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
- Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model. Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).
- Liu, M., et al. The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Steinmann, S., et al. DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells. Cell Death & Disease. 10 (12), 895 (2019).
- Andrieu, C., et al. MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity. Development. 147 (7), (2020).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers. Differentiation. 110, 8-16 (2019).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Pineros, M., et al. Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information. The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).
- Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
