Summary
CAM-Delam-analysen for å evaluere den metastatiske kapasiteten til kreftceller er relativt rask, enkel og billig. Metoden kan brukes til å avdekke molekylære mekanismer som regulerer metastasedannelse og for legemiddelscreening. En optimalisert analyse for å analysere menneskelige tumorprøver kan være en klinisk metode for personlig kreftbehandling.
Abstract
Hovedårsaken til kreftrelaterte dødsfall er metastasedannelse (dvs. når kreftceller sprer seg fra primærsvulsten til fjerne organer og danner sekundære svulster). Delaminering, definert som nedbrytning av basal lamina og kjellermembran, er den første prosessen som letter transmigrasjon og spredning av kreftceller til andre vev og organer. Å skåre delamineringskapasiteten til kreftceller vil indikere det metastatiske potensialet til disse cellene.
Vi har utviklet en standardisert metode, ex ovo CAM-Delam-analysen, for å visualisere og kvantifisere kreftcellenes evne til å delaminere og invadere, og dermed kunne vurdere metastatisk aggressivitet. Kort sagt inkluderer CAM-Delam-metoden såing av kreftceller i silikonringer på kylling chorioallantoic membranen (CAM) på embryonal dag 10, etterfulgt av inkubasjon fra timer til noen dager. CAM-Delam-analysen inkluderer bruk av et internt fuktet kammer under kyllingembryoinkubasjon. Denne nye tilnærmingen økte embryooverlevelsen fra 10% -50% til 80% -90%, som løste tidligere tekniske problemer med lave embryooverlevelsesrater i forskjellige CAM-analyser.
Deretter ble CAM-prøvene med tilhørende kreftcelleklynger isolert, fikset og frosset. Til slutt ble kryostat-seksjonerte prøver visualisert og analysert for kjellermembranskader og kreftcelleinvasjon ved hjelp av immunhiokjemi. Ved å evaluere ulike kjente metastatiske og ikke-metastatiske kreftcellelinjer designet for å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP), viste CAM-Delam kvantitative resultater at delamineringskapasitetsmønstrene reflekterer metastatisk aggressivitet og kan scores i fire kategorier. Fremtidig bruk av denne analysen, bortsett fra kvantifisering av delamineringskapasitet som en indikasjon på metastatisk aggressivitet, er å avdekke de molekylære mekanismene som kontrollerer delaminering, invasjon, dannelse av mikrometastaser og endringer i tumormikromiljøet.
Introduction
Omtrent 90% av dødeligheten hos kreftpasienter skyldes konsekvensene av kreftmetastase, som er dannelsen av sekundære svulster i andre deler av kroppen hvor kreften opprinnelig stammer fra1. Det er derfor viktig å identifisere metastatiske relaterte mekanismer for å finne potensielle mål for å undertrykke dannelsen av tumormetastaser. Deretter er det behov for modellsystemer der den metastatiske prosessen kan evalueres.
Under metastase gjennomgår kreftceller epitelial-til-mesenchymal overgang (EMT), en normal cellulær prosess der epitelceller mister sin overholdelse og polaritetsegenskaper og i stedet får en invasiv mesenchymal karakter2. Delaminering er en del av EMT-prosessen og innebærer nedbrytning av laminin i kjellermembranen, noe som er en forutsetning for at kreftceller skal forlate den primære svulsten og invadere andre vev. De viktigste faktorene som er oppregulert under metastasedannelse inkluderer matrisemetalloproteinaser (MMPer), ADAM (en disintergin og metalloproteinase), ADAMTS (ADAM med trombospondinmotiver) og membran-type MMPs (MT-MMPs)3,4. Disse faktorene forringer molekyler som laminin, som uttrykkes i alle kjellermembraner, for å lette cellemigrasjon og invasjon.
Den chorioallantoic membranen (CAM) av et befruktet kyllingegg er en type kjellermembran. Befruktede kyllingegg har blitt brukt som metastatiske modeller, der kreftceller har blitt sådd på den ekstraembryoniske CAM og senere metastasedannelse observert i kyllingembryoene5. Videre brukes in vivo mus metastatiske modeller ofte, hvor kreftceller implanteres i musene og metastaser i ulike organer analyseres6. Denne tilnærmingen er tidkrevende, dyr og kan forårsake ubehag for dyrene. For å løse dette har vi utviklet CAM-Delam-analysen, en raskere og billigere modell for å evaluere den metastatiske aggressiviteten til kreftceller. I denne modellen kombineres kreftcellenes evne til å forringe kyllingkameraet (f.eks. delamineringskapasiteten) med potensiell kreftcelleinvasjon i mesenchymet og brukes som måling av metastatisk aggressivitet.
Den nåværende artikkelen, basert på en tidligere publikasjon7, beskriver CAM-Delam-analysen i detalj, fra befruktet kyllingegghåndtering, kreftcellekultur og såing, avhandling og analyser av CAM-prøver, til skåring av delamineringskapasiteten til kreftceller i fire kategorier: intakt, endret, skadet og invasjon. Vi gir også eksempler på hvordan denne analysen kan brukes til å bestemme molekylære mekanismer som regulerer delamineringsprosessen.
Protocol
Kort sagt oppsummerer figur 1 de generelle trinnene i CAM-Delam-analysen. Protokollen nedenfor er basert på 30 kultiverte befruktede kyllingegg og bruk av to forskjellige kreftcellelinjer frøs separat i tre ringer / egg og analyseres på fire tidspunkter.
1. Egg inkubasjon
- Bruk befruktede kyllingegg fra et lokalt klekkeri, som garanterer over 90% befruktning
MERK: Eggene skulle ikke ha vært lagret i mer enn 4 dager ved romtemperatur (RT). I Sverige er etisk tillatelse til eksperimentell bruk av embryonale kyllinger bare nødvendig fra embryonal dag (E) 14 og utover. - Om nødvendig, tørk forsiktig av smuss eller fjær på eggene ved hjelp av et tørt papirhåndkle eller vått i vann.
- Rengjør og steriliser egginkubatoren med 70% etanol før bruk (hver gang).
- Legg ønsket antall egg i eggbrett og inkuber kyllingeggene horisontalt i en egginkubator ved 37,5-38 °C med 70% fuktighet. Se på dette som inkubasjonsdag 0 (figur 1A).
2. Utarbeidelse av veiebåt, plastbokser og disseksjonsinstrumenter
- Bruk 70 % etanol til å sterilisere 30 veiebåter og 30 små plastbokser (~0,4 L) med gjennomsiktige hetter.
- Tørk veiebåtene og boksene i en laminær hette over natten (ON) og oppbevar den i en lukket plastboks inntil videre bruk på inkubasjonsdagen 3.
- Steriliser 2 L destillert eller deionisert H2O per 30 inkuberte egg.
- Steriliser to par saks og tre par tang ved å sprøyte 70% etanol. Lufttørk instrumentene og oppbevar dem deretter i en sterilisert boks til inkubasjonsdagen 3.
MERK: Disse handlingene (trinn 2.1-2.4) kan gjøres når som helst før inkubasjonsdagen 3. Bruk hansker for å unngå forurensning.
3. Åpne eggene og overfør til det indre fuktede kammeret
MERK: Bruk hansker og munnbind for å unngå forurensning.
- Tilsett ca. 50 ml sterilisert H2O i de steriliserte plastboksene. Oppbevar de vannfylte boksene med lukkede lokk, for å unngå forurensning, ved RT til bruk.
- På inkubasjonsdagen 3, knekk eggeskallet ved hjelp av den skarpe delen av saksen og kutt en rett åpning i skallet.
- Åpne eggeskallet manuelt over en veiebåt og samle eggehviten, eggeplommen og det vedlagte sunne embryoet i veiebåten (figur 1B). Se etter et intakt embryo med et bankende hjerte, intakt eggeplomme og utviklede blodkar for eksperimentet (>95% av de inkuberte eggene). Kast egg med et misformet embryo, et embryo uten et bankende hjerte, en ødelagt eggeplomme eller skadede eggeplommeblodkar.
- Overfør veiebåten forsiktig til et internt fuktet kammer.
MERK: For trinn 3.2.-3.4., arbeid så raskt som mulig for å unngå forurensning, og bruk om mulig en laminær hette. - Inkuber det indre fuktede kammeret i egginkubatoren (figur 1C).
- Kultur de skallfrie eggene fra dag 3 til dag 10 i egginkubatoren før de brukes (se trinn 3.6.), og tilsett om nødvendig vann til inkubatoren for å opprettholde 70% fuktighet.
- Kontroller de indre fuktede kamrene gjennom det gjennomsiktige plastlokket for døde embryoer eller forurensede skallløse egg hver dag, og fjern dem fra inkubatoren.
4. Fremstilling av silikonringer
- For å forberede silikonringer, kutt et silikonrør med en indre og ytre diameter på henholdsvis 4 mm og 5 mm, i ~ 1 mm tykkelse, helst ved hjelp av en papirkutter (figur 1D).
- Overfør silikonringene til små glassflasker (figur 1D), dekk med metallfolie, og steriliser dem ved hjelp av en autoklav eller lignende.
MERK: Unngå gjentatt autoklavering av ubrukte silikonringer som kan være forurenset, siden slik behandling reduserer kapasiteten til silikonringene for å feste seg til membranen, med etterfølgende lekkasje av kreftcellen / kollagen / RPMI-løsningen utenfor ringene. - Oppbevar de sterile silikonringene på RT.
MERK: Dette trinnet kan gjøres når som helst før inkubasjonsdagen 10.
5. Fremstilling av kreftceller
MERK: Løsninger som cellekulturmedium, trypsin og 1x PBS lagres ved 4 °C og skal varmes opp til 37 °C i et vannbad før de legges til cellene. Etter oppvarming, skyll flaskene i 70% etanol og tørk før bruk.
- Kultur kreftcellelinjene av interesse for det aktuelle kulturmediet i en cellekulturinkubator ved 37 °C i nærvær av 5 % (v/v) CO2.
MERK: Her ble U251-GFP glioblastom og PC-3U-GFP prostatakreftceller dyrket i komplett RPMI medium-RPMI medium supplert med 10% (v / v) foster bovint serum (FBS) og 1% (v / v) penicillin-streptomycin (PS). - Planlegg kulturen av kreftceller slik at ca 50 × 106 kreftceller er klare til høsting på inkubasjonsdag 10 av CAM-Delam-analysen.
- Endre cellekulturmediet hver 2-3 dager, eller når middels farge endres fra rosa til oransje/gul.
- Valgfritt: Induser hypoksi ved å behandle kreftcellene med CoCl2 for å undersøke de molekylære mekanistiske effektene på delaminering 1 dag før cellehøsting.
FORSIKTIG: CoCl2 har moderat toksisitet. Håndter forsiktig i en avtrekkshette, og følg produsentens anvisninger.- Forbered fersk 20 mM CoCl2 lagerløsning ved å oppløse 0,0258 g i 10 ml sterilisert destillert H20 i et 15 ml konisk rør innpakket med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys.
- I et 50 ml konisk rør blander du 250 μL av 20 mM CoCl2-lagerløsningen i 25 ml RPMI-medium supplert med 1% (v / v) PS (men uten FBS) per 15 cm diameter cellekulturrett. Virvel forsiktig.
- Fjern det komplette RPMI-mediet fra cellekulturrettene.
- Vask cellene med sterilisert 1x PBS 2x.
- Tilsett 25 ml RPMI-medium med 200 μM CoCl 2-cellers trypsinisering (se trinn 5.6).
- På egginkubasjonsdag 10, lag 1 ml kollagen/RPMI-blanding (forhold 1:3), som inneholder 250 μL kollagen (5 mg/ml) og 750 μL cellekultur RPMI medium supplert med 10% FBS og 1% (v/v) PS. Hold kollagen/RPMI-blandingen på is.
- Prøv kreftcellene for å isolere cellene ved først å fjerne cellekulturmediet og vaske 2x med 1x PBS.
- Tilsett 3 ml trypsinoppløsning (0,05%) per 15 cm diameter cellekulturrett og inkuber i 2-3 min i en cellekulturinkubator til cellene løsner. Bruk et tabelltopp, invertert mikroskop for å se de frittliggende cellene. Trykk forsiktig på siden av kolben for å løsne gjenværende grupperte eller vedlagte celler.
- Inaktiver trypsin ved å legge til 5 ml komplett RPMI-medium til hver cellekulturrett og samle cellefjæringen fra alle cellekulturretter i et 50 ml rør.
- Tell kreftcellene ved Trypan Blue-eksklusjonsmetoden for å skille levende fra døde celler ved hjelp av en celleteller. Tilsett 10 μL av celleopphenget til 10 μL 0,4% trypan blå flekk. Bland prøven ved å pipettere opp og ned et par ganger, og last deretter 10 μL av celleblandingen per kammer inn i prøveskuffen i celletelleren. Gjenta celletelling 3x for å bekrefte cellenummeret/ml.
- Beregn og sentrifuger riktig volumcellekulturfjæring som inneholder 50 x 106 levende kreftceller i et 50 ml rør ved 500 × g i 5 min.
- Kast supernatanten og bland cellepelleten med 1 ml kollagen/RPMI-blanding. Siden kollagen er et gelatinøst materiale, bland cellene veldig sakte og forsiktig med en 1 ml pipette for å unngå å miste celler i dannelsen av bobler.
- Hold den forberedte cellefjæringen på is og ta den med til eggarbeidsområdet.
MERK: Unngå å holde de tilberedte kreftcellene på is for lenge. De tilberedte kreftcellene må plasseres på CAM innen 15-25 min.
6. Såing av kreftcellene på CAM
MERK: Bruk hansker og munnbind for å unngå forurensning.
- På inkubasjonsdagen 10, ta ut de indre fuktede kamrene med de inkuberte skallfrie eggene fra inkubatoren.
MERK: Omtrent 90% av det opprinnelige nummeret på de inkuberte eggene kan brukes; se figur 2. - Åpne det innvendige fuktede kammeret og plasser opptil seks silikonringer på KAMMEN ved hjelp av steriliserte tang.
MERK: Unngå å plassere silikonringene i nærheten av hverandre eller i nærheten av større blodårer. - Bland kreftcellefjæringen ved pipettering for å få en jevn fordeling av kreftceller, og tilsett 20 μL (1 × 106 celler) av den tilberedte kreftcellefjæringen inne i en silikonring (figur 1E). Når du legger til cellene, hold pipettespissen over KAMMEN for å sikre at du ikke skader membranen.
MERK: Ifølge tidligere funn7 kan forskjellige kreftceller såres i separate ringer på samme CAM. - Lukk det indre fuktede kammeret og legg det i egginkubatoren.
7. Isolering av CAM med tilhørende kreftceller
- Etter 14 timer, 1,5 dager, 2,5 dager og 3,5 dager inkubasjon, ta ut omtrent syv interne fuktede kamre og åpne lokkene en om gangen.
- Med en saks dissekerer du de kultiverte kreftcellene som er festet til CAM (såkalte CAM-Delam-prøver) ved å kutte utenfor silikonringen (figur 1F).
- Overfør umiddelbart den isolerte CAM-Delam-prøven ved hjelp av tang til 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffer (PB) i en Petri-tallerken for fiksering av vevet. Hold på is eller ved 4 °C i 1 time.
MERK: Oppbevar 4 % PFA-oppløsning ved 4 °C i maksimalt 5 dager. FORSIKTIG: PFA er giftig. Ved håndtering av PFA-pulver og PFA-løsninger, bruk en avtrekkshette og bruk munnbind og hansker. Unngå innånding av pulver eller løsningsdamp. Følg produsentens instruksjoner. - Decapitate kyllingembryoene og kast som biologisk avfall i spesifikke beholdere.
- Fjern 4% PFA-oppløsningen og tilsett 30% sukrose i 0,1 M PB til CAM-Delam-prøvene og likevekt ved 4 °C i 1 time.
- Fjern silikonringen forsiktig ved hjelp av tang under et disseksjonsmikroskop. Med en saks kutter du CAM-Delam-prøven i rektangulær form med kreftcellene i midten (figur 1G).
- Med et par tang overfører du CAM-Delam-prøvene til frossent seksjonsmedium i en Petri-tallerken for å fjerne overflødig sukrose og deretter til å legge inn former i frossent seksjonsmedium.
- Under et disseksjonsmikroskop plasserer du CAM-Delam-prøven i en U-form i vertikal retning i innbyggingsformene ved hjelp av et nållignende instrument (figur 1G).
- Frys og oppbevar CAM-Delam-prøvene ved −80 °C.
8. Seksjonering av CAM-Delam-prøver
- Del de frosne CAM-Delam-prøvene på 10 μm på 5-6 påfølgende lysbilder ved hjelp av kryosectioning.
- Oppbevar lysbildene med seksjoner ved −80 °C eller bruk dem direkte til immunhiistokjemifarging.
9. Immunohistokjemi farging
- Ta med lysbildene fra −80 °C til RT i 5 minutter før du starter immunoprotokolen.
- Lag en linje med en hydrofob markør på lysbildene der inndelingene slutter. La dem tørke i noen minutter.
- Plasser lysbildene i et fuktet (H2O) kammer og dekk seksjonene med ~ 200-500 μL blokkeringsløsning (10% fosterkalvserum og 0,1% natriumazid i Tris-bufret saltvann med 0,1% Triton X-100 [TBST]) og inkuber i 15-30 min.
MERK: La ikke skliene tørke når som helst fra dette trinnet og utover. - Hell av blokkeringsløsningen og erstatt den med 100-150 μL av det primære antistoffet av interesse fortynnet i blokkeringsløsningen og inkuber PÅ ved 4 °C. Bruk helst kanin anti-laminin-111 antistoff for å definere basal lamina sammen med en kreftcellemarkør, hvis du ikke bruker GFP eller andre fluorescerende merkede kreftcellelinjer.
MERK: Her ble også en kanin anti-von Willebrand Factor brukt til å oppdage blodårer i CAM. - Forbered tre glass cuvettes fylt med TBST buffer.
- Hell av den primære antistoffløsningen, overfør lysbildene til glassgroddene, og vask minst 3x i 5 min hver i TBST.
- Fjern overflødig TBST fra lysbildet og fra det hydrofobe barriereområdet med et mykt papirvev.
- Dekk lysbildet med 100-150 μL av et egnet sekundært fluorescerende antistoff fortynnet i blokkeringsløsning kombinert med 4',6-diamidino-2-fenylindol, dihydrochloride (DAPI) og inkubere i mørket ved RT i 1 time.
- Hell av den sekundære antistoffløsningen, overfør lysbildene til glassgroddene, og vask minst 3x i 5 min hver i TBST.
- Fjern overflødig TBST fra lysbildet og fra det hydrofobe barriereområdet med et mykt papirvev.
- Monter lysbildene ved å sette 1-2 dråper fluorescerende monteringsmedium på lysbildet, og legg forsiktig en glassdekslelip, unngå luftbobler.
- La skliene tørke i minst 1 time ved 4 °C før du analyserer, og oppbevar lysbildene 4 °C.
10. Mikroskopi bildebehandling og delaminering scoring
- Fotografier seksjonene ved hjelp av et epifluorescensmikroskop utstyrt med et digitalt kamera, helst ved 10x forstørrelse (figur 1H).
- Analyser delene ved hjelp av følgende CAM-Delam-poengkategorier (figur 3):
- Se etter intakt basal lamina uten synlige endringer.
- Se etter endret, men uskadet basal lamina.
- Se etter skadet basal lamina uten celleinvasjon.
- Se etter skadet basal lamina med celleinvasjon.
Representative Results
Figur 1 viser viktige trinn i CAM-Delam-analysen7. Bruken av interne fuktede kamre (figur 1C) forbedret overlevelsesraten til kyllingembryoene betydelig fra <50% opp til 90% ved inkubasjonsdag 10 og fra ~ 15% opp til 80% ved inkubasjonsdag 13 (figur 2).
Figur 1: Viktige trinn i CAM-Delam-analysen. (A) Inkuber befruktede kyllingegg horisontalt uten rotasjon. (B,C) På dag 3 av inkubasjon, knekk eggene og legg dem i sterile veiebåter (B), og plasser båtene i et internt fuktet kammer for videre inkubasjon (C). (D) Klargjør silikonringer. (E) På dag 10 av inkubasjon, plasser silikonringene på CAM, og frø 1 x 106 kreftceller inne i ringene ved hjelp av en pipette. (F,G) På forskjellige tidspunkter (timer til dager), spre CAM med vedlagte kreftceller, (F) fikse i PFA, behandle med sukrose, posisjon i frossen seksjon medium, (G) og fryse i -80 °C. (H) Et eksempel på en seksjonert CAM med tilhørende GFP + kreftceller (grønn) og laminin immunhiistokjemi farging (rød). Skalastenger = 2 mm (E, F), 1 mm (G) og 100 μm (H). Denne figuren er fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: CAM = chorioallantoic membran; PFA = paraformaldehyd; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overlevelse av kyllingembryo i forhold til inkubasjonsmetode. (A,B) På inkubasjonsdagen 10 doblet overlevelsen av kyllingebryo i interne HCer (gjennomsnittsverdi 89,33; N = 105) sammenlignet med inkubasjon i Petri retter (A; gjennomsnittlig verdi 40; N = 64) og ikke-fuktede kamre (B; gjennomsnittsverdi 48,67; N = 46). (C,D) På inkubasjonsdagen 13 ble det fortsatt observert en høy overlevelsesrate ved bruk av HC (gjennomsnittlig verdi 81,67; N = 105), mens en stor reduksjon i embryooverlevelse ble lagt merke til ved hjelp av PD (C; gjennomsnittlig verdi 11,33; N = 64) og N-HC (D; gjennomsnittsverdi 18,33; N = 46). Statistisk signifikans ble testet ved hjelp av en uparret to-tailed t-test. Feilfeltene angir standardavviket. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Denne figuren ble modifisert fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: HC = fuktet kammer; PD = Petri retter; N-HC = ikke-fuktet kammer; E X = Inkubasjonsdag X. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Analyser av ulike kreftcellelinjer som uttrykker GFP (U251 glioblastom, PC-3U prostata, SW620 kolon og A549 lunge) ved hjelp av denne protokollen ble rapportert tidligere av Palaniappan et al.7. Resultatene fra CAM-Delam-analysen inkluderer forskjeller i morfologi av basal lamina, oppdaget av laminin og kreftcelleinvasjon, definert som celler som har krysset kylling basal lamina-laget inn i kyllingens mesodermale lag (figur 3). Disse resultatene viser at kreftcellenes kapasitet til å forringe basal lamina og invadere mesenchymet kan scores i en av fire kategorier: 1) intakt basal lamina uten synlige endringer (figur 3B), 2) endre basal lamina (figur 3C), 3) skadet basal lamina uten celleinvasjon (figur 3D) og 4) skadet basal lamina med celleinvasjon (figur 3E ). En annen observasjon var at når kreftceller forårsaket en endret eller skadet basal lamina, ble CAM også tykkere med en økning av blodkardannelse, definert ved antistofffarging mot von Willebrands faktor, som syntetiseres i blodårene8 (figur 4C-H). Disse to fenotypene, en fortykket CAM og økt dannelse av blodårer, ble ikke observert når CAM var intakt (figur 4A,B).
Figur 3: CAM-Delam-scoring. (A-E) Et CAM-Delam-scoringseksempel basert på integriteten til CAM basal lamina, visualisert av anti-laminin (rød) og potensiell invasjon av GFP-uttrykkende kreftceller (grønn). (A) Kontrollere CAM uten kreftceller. (B-E) I svarene på kreftceller kan fire kategorier som beskriver morfologien til basal lamina scores: (B) intakt laminin, (C) endret, men uskadet laminin (indikert av en stjerne), (D) skadet laminin, men uten kreftcelleinvasjon (piler), skadet laminin med celleinvasjon (pilspisser). Skalastang = 100 μm (A-E). Denne figuren er fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: CAM = chorioallantoic membran; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Evaluering av CAM-fortykning og blodkardannelse. (A-H) Et eksempel på visualisering av CAM-fortykning og blodkardannelse, oppdaget av anti-Von Willebrand Factor (rød), som svar på lamina av ulike kreftcelletyper. (A,B) Kontroller CAM uten kreftceller. (C,D) Som svar på en ikke-metastatisk kreftcellelinje (scoret som Intakt), ble det ikke påvist noen tydelig fortykning av mesenchymet eller økt blodkardannelse. (E-H) Som svar på metastatiske kreftceller som resulterte i endret eller skadet Laminin, ble mesenchymet tykkere (indikert med doble pilspisser) og økt blodkardannelse ble observert (indikert med piler). Skalastang = 100 μm. Denne figuren ble modifisert fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: CAM = chorioallantoic membran; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
U251 glioblastom og PC-3U prostatakreftceller er to eksempler på kreftcellelinjer med helt forskjellig delaminasjonskapasitet (figur 5). PC-3U-celler induserte skadet laminin etter 1,5 dager, med klar invasjon etter 2,5 dager (figur 5A). U251-celler induserte derimot bare mindre endringer av laminin etter 1,5-3,5 dager, men forårsaket aldri synlige skader på laminin (figur 5B).
Figur 5: Visualisering av delamineringskapasiteten til prostata (PC-3U) og glioblastom (U251) kreftceller. (A) PC-3U-celler induserte mindre endring av laminin etter 14 timer, skade på laminin etter 1,5 dager (pil), og initiering av invasjon etter 2,5 dager, som ble økt etter 3,5 dager (pilspisser). (B) U251-celler forårsaket mindre endring av laminin etter 1,5-3,5 dager. De riktige panelene viser grafer som representerer CAM-Delam-scoringen. Y-aksen angir antall prøver, og x-aksen angir tidspunktene for kulturen. Skalastang = 100 μm (A, B). Denne figuren ble modifisert fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: CAM = chorioallantoic membran; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
CAM-Delam-analysen kan brukes til å definere molekylære mekanismer som regulerer delamineringsprosessen. Et eksempel er bruk av CoCl2-behandling for å indusere hypoksi med eller uten kombinasjonen av hemmende matrisemetalloproteinaser (MMP) ved hjelp av den brede MMP-hemmeren GM6001 (figur 6). Etter CoCl2-behandling fikk U251 ikke-metastatiske kreftceller evnen til å indusere delaminering og invasive celler, som ble undertrykt da CoCl2-behandlingen ble kombinert med MMP-hemmer gm6001 (figur 6). Dermed kan CAM-Delam-analysen være nyttig når du definerer molekyler og molekylære veier som påvirker delamineringsprosessen.
Figur 6: Delamineringsmønstre som svar på U251-celler eksponert for CoCl2 alene eller sammen med en MMP-hemmer. (A-C) U251 celler dyrket i 3,5 dager på CAM under ulike forhold. (A) U251 celler dyrket alene induserte ingen skade på laminin. (B) Dyrkede U251-celler som er preeksponert for CoCl2 (24 h) før vask og cellesåing på CAM-indusert lamininskade og celleinvasjon. (C) Forbehandling med en bredspektret MMP-hemmer GM6001 (i 1 t), etterfulgt av CoCl2-eksponering (24 h) før vask og såing av U251-celler på CAM, undertrykte effekten av CoCl2-behandlingen, og ingen åpenbar lamininskade eller kreftcelleinvasjon ble oppdaget. Skalastang = 100 μm (A-C). Paneler (B) og (C) er fra Palaniappan et al.7. Forkortelser: CAM = chorioallantoic membran; GFP = grønt fluorescerende protein; CoCl2 = koboltklorid; MMP = matrisemetalloproteinase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne artikkelen beskriver CAM-Delam-analysen for å evaluere den metastatiske aggressiviteten til kreftceller, bestemt av å score basale laminamoduleringer og potensiell celleinvasjon i mesenchymet innen en periode på timer til noen dager. Et tidligere teknisk problem for ulike CAM-analyser har vært den lave overlevelsen av kyllingembryoer. Dette problemet ble løst ved å introdusere bruken av et internt fuktet kammer under embryoinkubasjon, noe som økte embryooverlevelsen fra 10% -50% til 80% -90%7. Bruken av et internt fuktet kammer kan derfor være verdifullt i CAM-analyser generelt, så vel som i andre ex ovo chick eksperimenter.
Den presenterte scoringstidspoengene på 14 timer, 1,5 dager, 2,5 dager og 3,5 dager etter sådd 1 x 106 kreftceller på CAM er basert på streng metodeutvikling ved hjelp av seks forskjellige kreftcellelinjer og er tilstrekkelige til å skille området fra ikke-delaminerende til deaminerende-med-invasjonskapasitet av kreftcellelinjer. En minimumsbruk av fire egg med tre ringer i hver per tidspunkt og per cellelinje foreslås, og dette bør gjentas minst en gang eller i henhold til eksperimentelle design og statistiske krav. En fordel med CAM-Delam-analysen er å oppnå informative resultater angående delamineringskapasiteten til kreftceller innen få dager for å estimere aggressiviteten til kreftceller og potensiell risiko for metastasedannelse. Rask levering av resultater forenkles ved å overvåke nedbrytningen av basal lamina på grunn av de invaderende kreftcellene og de påfølgende mikrotumorene / tumorknoppene og organmetastasene. Tradisjonelt har CAM-modeller blitt brukt til å analysere dannelsen av organmetastaser, noe som tar rundt 2 uker å bli bestemt9. Ved å bruke syv forskjellige kreftcellelinjer har vi tidligere bekreftet7 at delamineringsscoring er knyttet til kreftcellenes evne til å danne metastaser i gnagermodeller 10,11,12,13,14, som støtter den prediktive verdien av CAM-Delam-analysen. Videre krever musemodeller en enda lengre tid, flere uker opp til måneder, før metastaser kan undersøkes15,16. Kort sagt, denne utviklede CAM-Delam-analysen, fokusert på å score delamineringskapasitet og ikke på å undersøke senere tumordannelse i kyllingembryoet, er derfor et godt supplement til eksisterende kylling CAM-invasjon og musesvulstmodeller.
En begrensning i CAM-Delam-analysen kan være den uklare visualiseringen av basal lamina hvis kreftcellene selv uttrykker laminin. I så fall kan andre markører som indikerer basal lamina, for eksempel E-kadherin, brukes7. Andre CAM-invasjonsstudier har brukt type IV kollagen for å visualisere CAM og pan-cytokeratin og vimentin for å identifisere invaderende kreftceller og dannelsen av mikrotumorer / tumorknopper17,18.
Delaminering er en normal cellulær prosess, både under utvikling og senere i livet, noe som gjør det mulig for celler å forlate et epitel og migrere til andre vev. Eksempler på delaminerende celler under utvikling er nevral kam og olfaktoriske banebrytende nevroner 19,20; Senere i livet er sårheling avhengig av delaminering21. Under kreft er denne prosessen oppregulert i feil celler og / eller til feil tid. Dermed kan CAM-Delam-metoden være til nytte for å avdekke de molekylære mekanismene som regulerer delaminering, noe som vil være av betydning for både grunnleggende biologisk og sykdomskunnskap. Slike delamineringsstudier vil omfatte å legge til faktorer av interesse for kreftcellene som er sådd på CAM eller studere genetisk modifiserte kreftceller. Et eksempel som presenteres her er CoCl 2-forbehandling av den ikke-metastatiske cellelinjen U251 for å indusere hypoksi, noe som fører til induksjon av en metastatisk aggressiv kapasitet som kan undertrykkes av en bredspektret MMP-hemmer. Dermed øker det muligheten for å designe inhibitorer for å undertrykke denne prosessen ved å finne viktige molekyler som kontrollerer delaminering. I forhold til dette er en annen potensiell bruk for CAM-Delam-protokollen i narkotikascreening for undertrykkelse av delaminering og celleinvasjon. Videre er evalueringen av kreft alvorlighetsgrad en kritisk komponent for diagnose, planleggingsbehandling og omsorg på klinikken. For tiden er TNM-iscenesettelsessystemet (T, tumorstørrelse; N, node-om kreften har spredt seg til lymfeknuter; M, fjern metastase) brukes til å evaluere alvorlighetsgraden av kreft22. CAM-Delam-analysen definerer en innovativ tilnærming for å evaluere aggressiviteten til kreftceller og potensiell risiko for metastaserdannelse og kan være et nyttig supplement til TNM-iscenesettelsessystemet. Bemerkelsesverdig er at TNM iscenesettelse er basert på analyser av faste vevsprøver, mens en potensiell klinisk CAM-Delam-tilnærming vil undersøke friskt eller ferskfryst vev i kombinasjon med teknikker for å gjenopplive frosne celler23.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker følgende forskere ved Umeå Universitet for deres hjelp med relevante kreftcellelinjer og antistoffer: L. Carlsson (von Willebrand Factor antistoff), J. Gilthorpe (U251) og M. Landström (PC-3U). Vi takker også Hauke Holthusen i Gilthorpe-laboratoriet for genereringen av hek293-TLR-AAVS1 stabil cellelinje. Arbeidet i Gunhaga-laboratoriet ble støttet av Den svenske kreftstiftelsen (18 0463), Umeå Biotech Incubator, Norrlands Cancerforskningsfond, Det svenske forskningsrådet (2017-01430) og Det medisinske fakultet ved Umeå Universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
| Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
| Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
| Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
| Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
| Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| MATERIALS | |||
| anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
| anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
| anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
| Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
| Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
| Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
| Plastic box | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
| RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
| Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
| SOLUTIONS | |||
| Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
| PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
| Mix and use immediately | |||
| Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
| FBS 50 mL |
|||
| Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
| Store at 4 °C | |||
| PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
| NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
| add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
| Store in RT | |||
| PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
| 0.2 M PB 50 mL |
|||
| Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
| heat to 60 °C in water bath | |||
| add 5 M NaOH 25 µL |
|||
| Stir to dissolve the PFA powder | |||
| Store at 4 °C | |||
| TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
| 150mM NaCI 30 mL |
|||
| 0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
| H2O (MQ) 900 mL |
|||
| Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
| 10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
| 10 mL in total, Store at 4 °C |
References
- Vasantharajan, S. S., et al. The epigenetic landscape of circulating tumour cells. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).
- Itoh, Y. Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations. Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).
- Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis. BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).
- Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies. Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells. Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).
- Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P.
- Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells. Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).
- Jia, Y., et al. Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer. Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).
- Liu, B., et al. RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling. Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).
- Qin, T., et al. Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer. Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
- Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model. Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).
- Liu, M., et al. The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Steinmann, S., et al. DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells. Cell Death & Disease. 10 (12), 895 (2019).
- Andrieu, C., et al. MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity. Development. 147 (7), (2020).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers. Differentiation. 110, 8-16 (2019).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Pineros, M., et al. Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information. The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).
- Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
