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Cancer Research

कैम-Delam परख कैंसर कोशिकाओं के Delamination और आक्रमण क्षमता परिमाणित द्वारा मेटास्टेटिक गुण स्कोर करने के लिए

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/64025
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Umeå Centre for Molecular Medicine, Umeå University, 2Department of Histology and Embryology, Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences

Summary

कैम-डेलम परख कैंसर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए अपेक्षाकृत तेज, आसान, और सस्ता है। इस विधि का उपयोग मेटास्टेसिस गठन को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र को उजागर करने और दवा की स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है। मानव ट्यूमर के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक अनुकूलित परख व्यक्तिगत कैंसर उपचार के लिए एक नैदानिक विधि हो सकती है।

Abstract

कैंसर से संबंधित मौतों का प्रमुख कारण मेटास्टेसिस गठन है (यानी, जब कैंसर कोशिकाएं प्राथमिक ट्यूमर से दूर के अंगों में फैलती हैं और माध्यमिक ट्यूमर बनाती हैं)। Delamination, बेसल लामिना और तहखाने झिल्ली के क्षरण के रूप में परिभाषित, प्रारंभिक प्रक्रिया है कि transmigration और अन्य ऊतकों और अंगों के लिए कैंसर कोशिकाओं के प्रसार की सुविधा है. कैंसर कोशिकाओं की delamination क्षमता स्कोरिंग इन कोशिकाओं की मेटास्टैटिक क्षमता का संकेत होगा।

हमने एक मानकीकृत विधि विकसित की है, पूर्व ओवो सीएएम-डेलम परख, कल्पना करने और कैंसर कोशिकाओं की क्षमता को निर्धारित करने के लिए delaminate और आक्रमण करने के लिए, जिससे मेटास्टैटिक आक्रामकता का आकलन करने में सक्षम हो सकता है। संक्षेप में, सीएएम-डेलम विधि में भ्रूण के दिन 10 में चिक कोरियोएलेंटोइक झिल्ली (सीएएम) पर सिलिकॉन के छल्ले में कैंसर कोशिकाओं को सीडिंग करना शामिल है, इसके बाद घंटों से कुछ दिनों तक इनक्यूबेशन है। कैम-डेलम परख में चिक भ्रूण इनक्यूबेशन के दौरान एक आंतरिक ह्यूमिडिफाइड चैंबर का उपयोग शामिल है। इस उपन्यास दृष्टिकोण ने भ्रूण के अस्तित्व को 10% -50% से 80% -90% तक बढ़ा दिया, जिसने विभिन्न सीएएम assays में कम भ्रूण जीवित रहने की दर के साथ पिछली तकनीकी समस्याओं को हल किया।

अगला, संबंधित कैंसर सेल क्लस्टर के साथ सीएएम नमूनों को अलग- थलग, तय और जमे हुए थे। अंत में, क्रायोस्टेट-सेक्शन्ड नमूनों को इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके तहखाने की झिल्ली क्षति और कैंसर सेल आक्रमण के लिए कल्पना और विश्लेषण किया गया था। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने के लिए डिज़ाइन की गई विभिन्न ज्ञात मेटास्टैटिक और गैर-मेटास्टैटिक कैंसर सेल लाइनों का मूल्यांकन करके, सीएएम-डेलम मात्रात्मक परिणामों से पता चला है कि डीलैमिनेशन क्षमता पैटर्न मेटास्टैटिक आक्रामकता को दर्शाते हैं और इसे चार श्रेणियों में स्कोर किया जा सकता है। इस परख के भविष्य के उपयोग, मेटास्टैटिक आक्रामकता के एक संकेत के रूप में delamination क्षमता परिमाणित करने के अलावा, आणविक तंत्र है कि delamination, आक्रमण, माइक्रोमेटास्टेसिस के गठन को नियंत्रित, और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में परिवर्तन को उजागर करने के लिए है।

Introduction

कैंसर रोगियों में मृत्यु दर का लगभग 90% कैंसर मेटास्टेसिस के परिणामों के कारण होता है, जो शरीर के अन्य हिस्सों में माध्यमिक ट्यूमर का गठन है जहां से कैंसर मूल रूप से उत्पन्न हुआथा। इसलिए, ट्यूमर मेटास्टेसिस के गठन को दबाने के लिए संभावित लक्ष्यों को खोजने के लिए मेटास्टैटिक से संबंधित तंत्र की पहचान करना महत्वपूर्ण है। इसके बाद, मॉडल प्रणालियों की आवश्यकता होती है जिसमें मेटास्टैटिक प्रक्रिया का मूल्यांकन किया जा सकता है।

मेटास्टेसिस के दौरान, कैंसर कोशिकाएं उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरती हैं, एक सामान्य सेलुलर प्रक्रिया जिसमें उपकला कोशिकाएं अपने पालन और ध्रुवीयता गुणों को खो देती हैं और इसके बजाय एक आक्रामक मेसेनकाइमल चरित्र 2 प्राप्त करतीहैं। Delamination EMT प्रक्रिया का हिस्सा है और तहखाने झिल्ली में लैमिनिन की गिरावट शामिल है, जो कैंसर कोशिकाओं के लिए प्राथमिक ट्यूमर छोड़ने और अन्य ऊतकों पर आक्रमण करने के लिए एक शर्त है। मेटास्टेसिस गठन के दौरान अपरेगुलेटेड होने वाले प्रमुख कारकों में मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज (एमएमपी), एडम (एक डिस्इंटर्जिन और मेटलोप्रोटीनेज), एडमटीएस (थ्रोम्बोस्पॉन्डिन रूपांकनों के साथ एडम), और झिल्ली-प्रकार के एमएमपी (एमटी-एमएमपी) 3,4 शामिल हैं। ये कारक लैमिनिन जैसे अणुओं को नीचा दिखाते हैं, जो सेल माइग्रेशन और आक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए सभी तहखाने झिल्ली में व्यक्त किया जाता है।

एक निषेचित चिक अंडे की कोरियोएल्लांटोइक झिल्ली (सीएएम) एक प्रकार की तहखाने की झिल्ली है। निषेचित चूजे के अंडे का उपयोग मेटास्टैटिक मॉडल के रूप में किया गया है, जिसमें कैंसर कोशिकाओं को एक्स्ट्राम्ब्रियोनिक सीएएम पर बीज दिया गया है और बाद में चूजे के भ्रूण में मेटास्टेसिस गठनदेखा गया है। इसके अलावा, विवो माउस मेटास्टैटिक मॉडल में अक्सर उपयोग किया जाता है, जिसमें कैंसर कोशिकाओं को चूहों में प्रत्यारोपित किया जाता है और विभिन्न अंगों में मेटास्टेसिस का विश्लेषण किया जाताहै। यह दृष्टिकोण समय लेने वाला, महंगा है, और जानवरों के लिए असुविधा पैदा कर सकता है। इसे संबोधित करने के लिए, हमने सीएएम-डेलम परख विकसित किया है, कैंसर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक आक्रामकता का मूल्यांकन करने के लिए एक तेज और सस्ता मॉडल। इस मॉडल में, चिक सीएएम (जैसे, delamination क्षमता) को नीचा दिखाने के लिए कैंसर कोशिकाओं की क्षमता को मेसेनकाइम में संभावित कैंसर सेल आक्रमण के साथ जोड़ा जाता है और मेटास्टैटिक आक्रामकता के माप के रूप में उपयोग किया जाता है।

वर्तमान लेख, पिछले प्रकाशन7 के आधार पर, विस्तार से सीएएम-डेलम परख का वर्णन करता है, निषेचित लड़की अंडे से निपटने, कैंसर सेल संस्कृति और सीडिंग, विच्छेदन, और सीएएम नमूनों के विश्लेषण से, कैंसर कोशिकाओं की delamination क्षमता के स्कोरिंग के लिए चार श्रेणियों में: बरकरार, परिवर्तित, क्षतिग्रस्त, और आक्रमण। हम यह भी कैसे इस परख delamination प्रक्रिया को विनियमित आणविक तंत्र निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के उदाहरण देते हैं.

Protocol

संक्षेप में, चित्रा 1 CAM-Delam परख में समग्र चरणों को सारांशित करता है। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल 30 सुसंस्कृत निषेचित चिकन अंडे पर आधारित है और दो अलग-अलग कैंसर सेल लाइनों के उपयोग को तीन छल्ले / अंडे में अलग-अलग बीज दिया गया है और चार समय बिंदुओं पर विश्लेषण किया गया है।

1. अंडा इनक्यूबेशन

  1. एक स्थानीय हैचरी से निषेचित लड़की के अंडे का उपयोग करें, जो 90% से अधिक निषेचन की गारंटी देता है
    नोट: अंडे को कमरे के तापमान (आरटी) पर 4 दिनों से अधिक समय तक संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए था। स्वीडन में, भ्रूण मुर्गियों के प्रयोगात्मक उपयोग के लिए नैतिक अनुमति केवल भ्रूण दिवस (ई) 14 और उससे आगे से आवश्यक है।
  2. यदि आवश्यक हो, तो ध्यान से एक सूखे कागज तौलिया या पानी में गीले का उपयोग करके अंडे पर किसी भी गंदगी या पंखों को यांत्रिक रूप से पोंछ दें।
  3. उपयोग से पहले (हर बार) 70% इथेनॉल के साथ अंडे के इनक्यूबेटर को साफ और निष्फल करें।
  4. अंडे ट्रे में अंडे की वांछित संख्या रखें और 70% आर्द्रता के साथ 37.5-38 डिग्री सेल्सियस पर एक अंडे के इनक्यूबेटर में क्षैतिज रूप से चिक अंडे को इनक्यूबेट करें। इसे इनक्यूबेशन दिन 0 (चित्रा 1A) के रूप में विचार करें।

2. नाव, प्लास्टिक बक्से, और विच्छेदन उपकरणों वजन की तैयारी

  1. पारदर्शी टोपी के साथ 30 वजन नौकाओं और 30 छोटे प्लास्टिक बक्से (~ 0.4 एल) को निष्फल करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें।
  2. वजन नौकाओं और बक्से को रात भर (ऑन) एक लैमिनर हुड में सुखाएं और इनक्यूबेशन दिन 3 पर आगे के उपयोग तक एक बंद प्लास्टिक बॉक्स में स्टोर करें।
  3. आसुत या विआयनीकृत एच 2 ओ प्रति 30 इनक्यूबेटेड अंडे के2एल को निष्फल करें।
  4. कैंची के दो जोड़े और संदंश के तीन जोड़े 70% इथेनॉल छिड़काव करके निष्फल करें। उपकरणों को एयर-ड्राई करें और फिर उन्हें इनक्यूबेशन दिन 3 तक एक निष्फल बॉक्स में स्टोर करें।
    नोट: ये क्रियाएँ (चरण 2.1-2.4) इनक्यूबेशन दिन 3 से पहले किसी भी दिन की जा सकती हैं। संदूषण से बचने के लिए दस्ताने का उपयोग करें।

3. अंडे खोलने और आंतरिक humidified कक्ष के लिए स्थानांतरण

नोट: संदूषण से बचने के लिए दस्ताने और एक फेस मास्क का उपयोग करें।

  1. निष्फल प्लास्टिक के बक्से के लिए स्टरलाइज्ड एच2ओ के लगभग 50 मिलीलीटर जोड़ें। बंद ढक्कन के साथ पानी से भरे बक्से रखें, संदूषण से बचने के लिए, उपयोग करने तक आरटी पर।
  2. इनक्यूबेशन दिन 3 पर, कैंची के तेज हिस्से का उपयोग करके अंडे के छिलके को क्रैक करें और खोल में एक सीधा उद्घाटन काटें।
  3. मैन्युअल रूप से एक वजन नाव पर अंडे के छिलके को तोड़ दें और वजन नाव (चित्रा 1 बी) में अंडे की सफेदी, जर्दी और इसके संलग्न स्वस्थ भ्रूण को इकट्ठा करें। एक धड़कते दिल, बरकरार जर्दी, और प्रयोग के लिए विकसित रक्त वाहिकाओं के साथ एक बरकरार भ्रूण की तलाश करें (इनक्यूबेट किए गए अंडे का >95%)। एक विकृत भ्रूण, धड़कते दिल के बिना एक भ्रूण, एक टूटी हुई अंडे की जर्दी, या क्षतिग्रस्त जर्दी रक्त वाहिकाओं के साथ अंडे को छोड़ दें।
  4. धीरे से एक आंतरिक humidified कक्ष में वजन नाव हस्तांतरण.
    नोट:: चरण 3.2.-3.4., संदूषण से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके काम करें, और यदि संभव हो, तो एक लैमिनर हुड का उपयोग करें।
  5. अंडे इनक्यूबेटर में आंतरिक humidified कक्ष इनक्यूबेट (चित्रा 1C).
  6. उपयोग किए जाने से पहले अंडे इनक्यूबेटर में दिन 3 से दिन 10 तक शेल-कम अंडे को संस्कृति करें (चरण 3.6 देखें), और जब आवश्यक हो, तो 70% आर्द्रता बनाए रखने के लिए इनक्यूबेटर में पानी जोड़ें।
  7. मृत भ्रूण या दूषित शेल-कम अंडे के लिए पारदर्शी प्लास्टिक ढक्कन के माध्यम से हर दिन आंतरिक ह्यूमिडिफाइड कक्षों की जांच करें, और उन्हें इनक्यूबेटर से हटा दें।

4. सिलिकॉन के छल्ले की तैयारी

  1. सिलिकॉन के छल्ले तैयार करने के लिए, क्रमशः 4 मिमी और 5 मिमी के आंतरिक और बाहरी व्यास के साथ एक सिलिकॉन ट्यूब को काटें, क्रमशः ~ 1 मिमी मोटाई में, अधिमानतः एक पेपर कटर (चित्रा 1 डी) का उपयोग करके।
  2. सिलिकॉन के छल्ले को छोटी कांच की बोतलों (चित्रा 1 डी) में स्थानांतरित करें, धातु की पन्नी के साथ कवर करें, और उन्हें आटोक्लेव या इसी तरह का उपयोग करके निष्फल करें।
    नोट: अप्रयुक्त सिलिकॉन के छल्ले के बार-बार ऑटोक्लेविंग से बचें जो दूषित हो सकते हैं, क्योंकि इस तरह के उपचार से झिल्ली से जुड़ने के लिए सिलिकॉन के छल्ले की क्षमता को कम कर देता है, छल्ले के बाहर कैंसर सेल / कोलेजन / आरपीएमआई समाधान के बाद के रिसाव के साथ।
  3. बाँझ सिलिकॉन के छल्ले को RT पर स्टोर करें.
    नोट: यह चरण इनक्यूबेशन दिन 10 से पहले किसी भी दिन किया जा सकता है।

5. कैंसर कोशिकाओं की तैयारी

नोट: सेल संस्कृति माध्यम, ट्रिप्सिन और 1x पीबीएस जैसे समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं और कोशिकाओं में जोड़ने से पहले पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए। हीटिंग के बाद, बोतलों को 70% इथेनॉल में कुल्ला करें और उपयोग से पहले सूखा लें।

  1. 5% (v / v) CO2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में प्रासंगिक संस्कृति माध्यम में रुचि की कैंसर सेल लाइनों को संस्कृति करें।
    नोट: यहाँ, U251-GFP ग्लियोब्लास्टोमा और PC-3U-GFP प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को पूर्ण RPMI मध्यम-RPMI माध्यम में 10% (v / v) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% (v / v) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पीएस) के साथ पूरक किया गया था।
  2. कैंसर कोशिकाओं की संस्कृति की योजना बनाएं ताकि लगभग 50 × 106 कैंसर कोशिकाएं सीएएम-डेलम परख के इनक्यूबेशन दिन 10 पर कटाई के लिए तैयार हों।
  3. सेल कल्चर माध्यम को हर 2-3 दिनों में बदलें, या जब मध्यम रंग गुलाबी से नारंगी / पीले रंग में बदल जाता है।
  4. वैकल्पिक: CoCl2 के साथ कैंसर कोशिकाओं का इलाज करके हाइपोक्सिया को प्रेरित करने के लिए सेल कटाई से 1 दिन पहले delamination पर आणविक यांत्रिक प्रभावों की जांच करने के लिए।
    सावधानी: CoCl2 मध्यम विषाक्तता है. एक धुएं हुड में देखभाल के साथ संभाल, और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    1. प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्टरलाइज्ड आसुत एच 2 0 के 10 मिलीलीटर में 0.0258 ग्राम को भंग करके ताजा20एमएम CoCl2 स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, 20 mM CoCl 2 स्टॉक समाधान के250 μL को RPMI माध्यम के 25 mL में 1% (v / v) PS (लेकिन FBS के बिना) प्रति 15 सेमी व्यास सेल संस्कृति डिश के साथ पूरक मिश्रण करें। भंवर धीरे से.
    3. सेल संस्कृति व्यंजन से पूर्ण RPMI माध्यम निकालें।
    4. निष्फल 1x PBS 2x के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    5. 200 μM CoCl 2 सेल ट्रिप्सिनाइजेशन के साथ RPMI माध्यम के25 mL जोड़ें (चरण 5.6 देखें)।
  5. अंडे इनक्यूबेशन दिन 10 पर, एक कोलेजन / RPMI मिश्रण (अनुपात 1: 3) का 1 मिलीलीटर तैयार करें, जिसमें प्रकार I कोलेजन (5 मिलीग्राम / एमएल) के 250 μL और सेल कल्चर आरपीएमआई माध्यम के 750 μL 10% FBS और 1% (v / v) PS के साथ पूरक होते हैं। कोलेजन / RPMI-मिश्रण को बर्फ पर रखें।
  6. पहले सेल संस्कृति माध्यम को हटाकर कोशिकाओं को अलग करने और 1x पीबीएस के साथ 2x धोने के लिए कैंसर कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्रिप्सिनाइज़ करें।
  7. ट्रिप्सिन समाधान (0.05%) प्रति 15 सेमी व्यास सेल संस्कृति पकवान के 3 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं के अलग होने तक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 2-3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अलग की गई कोशिकाओं को देखने के लिए एक टेबल-टॉप, उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो शेष संकुल या संलग्न कोशिकाओं को हटाने के लिए फ्लास्क के किनारे को धीरे से टैप करें।
  8. प्रत्येक सेल संस्कृति डिश में पूर्ण RPMI माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें और सभी सेल संस्कृति व्यंजनों से सेल निलंबन को 50 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें।
  9. एक सेल काउंटर का उपयोग कर मृत कोशिकाओं से जीवित अंतर करने के लिए Trypan ब्लू बहिष्करण विधि द्वारा कैंसर कोशिकाओं की गणना करें। 0.4% ट्रिपैन नीले दाग के 10 μL के लिए सेल निलंबन के 10 μL जोड़ें। कुछ बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नमूने को मिलाएं, और फिर सेल काउंटर में नमूना स्लाइड में प्रति कक्ष सेल मिश्रण के 10 μL लोड करें। कक्ष संख्या/एमएल को सत्यापित करने के लिए सेल गिनती 3x को दोहराएँ.
  10. गणना और सही मात्रा सेल संस्कृति निलंबन जिसमें 50 x 106 लाइव कैंसर कोशिकाएं होती हैं, जो 500 × ग्राम पर 50 mL ट्यूब में 5 मिनट के लिए होती हैं ।
  11. supernatant त्यागें और कोलेजन / RPMI मिश्रण के 1 mL के साथ सेल गोली मिश्रण. चूंकि कोलेजन एक जिलेटिनस सामग्री है, इसलिए बुलबुले के गठन में कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए कोशिकाओं को 1 एमएल पिपेट के साथ बहुत धीरे-धीरे और सावधानी से मिलाएं।
  12. तैयार सेल सस्पेंशन को बर्फ पर रखें और इसे अंडे के काम करने वाले क्षेत्र में लाएं।
    नोट: तैयार कैंसर कोशिकाओं को बहुत लंबे समय तक बर्फ पर रखने से बचें। तैयार कैंसर कोशिकाओं को 15-25 मिनट के भीतर सीएएम पर रखा जाना चाहिए।

6. कैम पर कैंसर कोशिकाओं सीडिंग

नोट: संदूषण से बचने के लिए दस्ताने और एक फेस मास्क का उपयोग करें।

  1. दिन 10 इनक्यूबेशन पर, इनक्यूबेटर से इनक्यूबेटेड शेल-कम अंडे के साथ आंतरिक ह्यूमिडिफाइड कक्षों को बाहर निकालें।
    नोट: इनक्यूबेटेड अंडे की प्रारंभिक संख्या का लगभग 90% उपयोग किया जा सकता है; चित्र 2 देखें।
  2. आंतरिक humidified कक्ष खोलें और स्टरलाइज़्ड संदंश का उपयोग कर CAM पर छह सिलिकॉन के छल्ले तक रखें।
    नोट: सिलिकॉन के छल्ले को एक दूसरे के पास या बड़ी रक्त वाहिकाओं के करीब रखने से बचें।
  3. कैंसर कोशिकाओं का एक भी वितरण प्राप्त करने के लिए पिपेटिंग द्वारा कैंसर सेल निलंबन को मिलाएं, और एक सिलिकॉन रिंग (चित्रा 1 ई) के अंदर तैयार कैंसर सेल निलंबन के 20 μL (1 × 10 6 कोशिकाओं) को जोड़ें। कोशिकाओं को जोड़ते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए कि झिल्ली को नुकसान न पहुंचे, कैम के ऊपर पिपेट टिप रखें।
    नोट: पिछलेनिष्कर्षों 7 के अनुसार, विभिन्न कैंसर कोशिकाओं को एक ही सीएएम पर अलग-अलग छल्ले में बीज दिया जा सकता है।
  4. आंतरिक humidified कक्ष को बंद करें और इसे अंडे इनक्यूबेटर में रखें।

7. संबंधित कैंसर कोशिकाओं के साथ सीएएम का अलगाव

  1. 14 घंटे, 1.5 दिन, 2.5 दिन और 3.5 दिनों के इनक्यूबेशन के बाद, लगभग सात आंतरिक ह्यूमिडिफाइड कक्षों को बाहर निकालें और एक समय में एक ढक्कन खोलें।
  2. कैंची की एक जोड़ी के साथ, सिलिकॉन रिंग (चित्रा 1 एफ) के बाहर काटकर सीएएम (तथाकथित सीएएम-डेलम नमूने) से जुड़ी सुसंस्कृत कैंसर कोशिकाओं को विच्छेदित करें।
  3. ऊतक के निर्धारण के लिए पेट्री डिश में 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी) में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) में संदंश का उपयोग करके अलग-थलग सीएएम-डेलम नमूने को तुरंत स्थानांतरित करें। बर्फ पर या 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: 4% PFA समाधान को अधिकतम 5 दिनों के लिए 4 °C पर संग्रहीत करें। सावधानी: पीएफए विषाक्त है। पीएफए पाउडर और पीएफए समाधानों को संभालते समय, एक धुएं के हुड का उपयोग करें और फेस मास्क और दस्ताने पहनें। इनहेलिंग पाउडर या समाधान वाष्प से बचें। निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  4. चिकन भ्रूण को नष्ट करना और विशिष्ट डिब्बे में जैविक अपशिष्ट के रूप में त्यागना।
  5. 4% पीएफए समाधान निकालें और सीएएम-डेलम नमूनों में 0.1 एम पीबी में 30% सुक्रोज जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संतुलित करें।
  6. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, संदंश का उपयोग करके सिलिकॉन रिंग को सावधानीपूर्वक हटा दें। कैंची की एक जोड़ी के साथ, बीच में कैंसर कोशिकाओं के साथ एक आयताकार आकार में सीएएम-डेलम नमूने को काटें (चित्रा 1 जी)।
  7. संदंश की एक जोड़ी के साथ, अतिरिक्त सुक्रोज को हटाने के लिए और फिर जमे हुए अनुभाग माध्यम में मोल्ड्स को एम्बेड करने के लिए पेट्री डिश में जमे हुए अनुभाग माध्यम में सीएएम-डेलम नमूनों को स्थानांतरित करें।
  8. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, CAM-Delam नमूने को किसी भी सुई जैसे उपकरण (चित्रा 1 G) का उपयोग करके एम्बेडिंग मोल्ड्स में एक ऊर्ध्वाधर दिशा में एक ऊर्ध्वाधर दिशा में यू-आकार में रखें।
  9. CAM-Delam नमूनों को -80 °C पर फ्रीज और स्टोर करें।

8. कैम-डेलम नमूने अनुभाग

  1. क्रायोसेक्शनिंग का उपयोग करके लगातार स्लाइड पर 5-6 पर 10 μm पर जमे हुए CAM-Delam नमूनों को अनुभाग करें।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस पर अनुभागों के साथ स्लाइड्स को स्टोर करें या सीधे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग के लिए उपयोग करें।

9. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला

  1. इम्युनोप्रोटोकॉल शुरू करने से पहले स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस से आरटी तक लाएं।
  2. स्लाइड पर एक हाइड्रोफोबिक मार्कर के साथ एक पंक्ति बनाएं जहां अनुभाग समाप्त होते हैं। उन्हें कुछ मिनटों के लिए सूखने दें।
  3. स्लाइड्स को एक ह्यूमिडिफाइड (एच2ओ) कक्ष में रखें और ब्लॉकिंग समाधान के ~ 200-500 μL के साथ वर्गों को कवर करें (10% भ्रूण बछड़ा सीरम और 0.1% सोडियम एज़ाइड में ट्राइस-बफ़र्ड खारा में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 [टीबीएसटी]) और 15-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट:: इस चरण के बाद से, स्लाइड किसी भी समय सूखने न दें।
  4. ब्लॉकिंग समाधान को बंद करें और इसे ब्लॉकिंग समाधान में पतला ब्याज के प्राथमिक एंटीबॉडी के 100-150 μL के साथ बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अधिमानतः एक कैंसर सेल मार्कर के साथ बेसल लामिना को परिभाषित करने के लिए खरगोश एंटी-लैमिनिन -111 एंटीबॉडी का उपयोग करें, यदि जीएफपी या अन्य फ्लोरोसेंट-टैग किए गए कैंसर सेल लाइनों का उपयोग नहीं कर रहे हैं।
    नोट: यहां, सीएएम में रक्त वाहिकाओं का पता लगाने के लिए एक खरगोश एंटी-वॉन विलेब्रांड फैक्टर का भी उपयोग किया गया था।
  5. TBST बफर से भरे तीन ग्लास क्यूवेट तैयार करें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को डालें, स्लाइड को ग्लास क्यूवेट में स्थानांतरित करें, और टीबीएसटी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए कम से कम 3x धोएं।
  7. स्लाइड से अतिरिक्त TBST निकालें और एक नरम कागज ऊतक के साथ हाइड्रोफोबिक बाधा क्षेत्र से।
  8. एक उपयुक्त माध्यमिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के 100-150 μL के साथ स्लाइड को कवर करें जो 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) के साथ संयुक्त ब्लॉकिंग समाधान में पतला हो जाता है और 1 घंटे के लिए आरटी में अंधेरे में इनक्यूबेट करता है।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान को डालें, स्लाइड को ग्लास क्यूवेट में स्थानांतरित करें, और टीबीएसटी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए कम से कम 3x धोएं।
  10. स्लाइड से अतिरिक्त TBST निकालें और एक नरम कागज ऊतक के साथ हाइड्रोफोबिक बाधा क्षेत्र से।
  11. स्लाइड पर फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम की 1-2 बूँदें डालकर स्लाइड्स को माउंट करें, और धीरे से एक ग्लास कवरस्लिप रखें, हवा के बुलबुले से बचें।
  12. विश्लेषण करने से पहले स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए सूखने दें, और स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस स्टोर करें।

10. माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और delamination स्कोरिंग

  1. एक डिजिटल कैमरे से सुसज्जित एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वर्गों की तस्वीर, अधिमानतः 10x आवर्धन (चित्रा 1H) पर.
  2. निम्न CAM-Delam स्कोरिंग श्रेणियों (चित्रा 3) का उपयोग कर अनुभागों का विश्लेषण करें:
    1. दृश्यमान परिवर्तन के बिना बरकरार बेसल लामिना की तलाश करें।
    2. परिवर्तित लेकिन undamaged बेसल लामिना के लिए देखो.
    3. सेल आक्रमण के बिना क्षतिग्रस्त बेसल लामिना की तलाश करें।
    4. सेल आक्रमण के साथ क्षतिग्रस्त बेसल लामिना की तलाश करें।

Representative Results

चित्रा 1 सीएएम-डेलम परख 7 में महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत करताहै. आंतरिक humidified कक्षों (चित्रा 1C) के उपयोग ने इनक्यूबेशन दिन 10 में 90% तक <50% से चूजे के भ्रूण की जीवित रहने की दर में काफी सुधार किया और इनक्यूबेशन दिन 13 (चित्रा 2) में ~ 15% से 80% तक।

Figure 1
चित्रा 1: CAM-Delam परख के प्रमुख कदम. (ए) रोटेशन के बिना क्षैतिज रूप से निषेचित चिकन अंडे इनक्यूबेट. (B, C) इनक्यूबेशन के तीसरे दिन, अंडों को क्रैक करें और उन्हें बाँझ वजन वाली नौकाओं (बी) में रखें, और नावों को आगे के इनक्यूबेशन (सी) के लिए एक आंतरिक ह्यूमिडिफाइड चैंबर में रखें। (d) सिलिकॉन के छल्ले तैयार करें। (ई) इनक्यूबेशन के 10 वें दिन, कैम पर सिलिकॉन के छल्ले रखें, और बीज 1 x 106 कैंसर कोशिकाओं को एक पिपेट का उपयोग करके छल्ले के अंदर रखें। (F,G) अलग-अलग समय बिंदुओं (घंटों से दिनों तक) पर, संलग्न कैंसर कोशिकाओं के साथ सीएएम को विच्छेदित करें, (एफ) पीएफए में ठीक करें, सुक्रोज के साथ इलाज करें, जमे हुए अनुभाग माध्यम में स्थिति, (जी) और -80 डिग्री सेल्सियस में फ्रीज करें (एच) संबंधित जीएफपी + कैंसर कोशिकाओं (हरे) और लैमिनिन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग (लाल) के साथ एक खंडित सीएएम का एक उदाहरण। स्केल सलाखों = 2 मिमी (ई, एफ), 1 मिमी (जी), और 100 μm (एच)। यह आंकड़ा पलनिअप्पन एट अल.7 का है। संक्षेप: CAM = chorioallantoic झिल्ली; PFA = paraformaldehyde; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इनक्यूबेशन विधि के संबंध में चिकन भ्रूण अस्तित्व( A,B) इनक्यूबेशन दिन 10 पर, आंतरिक HCs में चिकन भ्रूण उत्तरजीविता दोगुनी हो गई (औसत मान 89.33); एन = 105) पेट्री व्यंजन (ए; माध्य मान 40) में इनक्यूबेशन की तुलना में; N = 64) और गैर-humidified कक्षों (B; माध्य मान 48.67; एन = 46)। (C,D) इनक्यूबेशन दिन 13 पर, एक उच्च जीवित रहने की दर अभी भी एचसी (औसत मूल्य 81.67) का उपयोग करके देखी गई थी; एन = 105), जबकि भ्रूण के अस्तित्व में एक बड़ी कमी पीडी (सी; औसत मूल्य 11.33) का उपयोग करके देखी गई थी; N = 64), और N-HC (D; माध्य मान 18.33; एन = 46)। सांख्यिकीय महत्व का परीक्षण एक अनपेयर्ड दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001. इस आंकड़े को पलनिअप्पन एट अल.7 से संशोधित किया गया था। संक्षेप: HC = humidified कक्ष; पीडी = पेट्री व्यंजन; N-HC = गैर-humidified कक्ष; E X = इनक्यूबेशन दिन X. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीएफपी (U251 ग्लियोब्लास्टोमा, पीसी -3यू प्रोस्टेट, SW620 बृहदान्त्र, और A549 फेफड़े) को व्यक्त करने वाली विभिन्न कैंसर सेल लाइनों का विश्लेषण पहले पलानिअप्पन एट अल.7 द्वारा सूचित किया गया था। सीएएम-डेलम परख के परिणामों में बेसल लामिना के आकारिकी में अंतर शामिल हैं, जो लैमिनिन द्वारा पता लगाया गया है, और कैंसर सेल आक्रमण, कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है जो चिक मेसोडर्मल परत (चित्रा 3) में चिक बेसल लामिना परत को पार कर चुके हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि बेसल लामिना को नीचा दिखाने और मेसेनकाइम पर आक्रमण करने के लिए कैंसर कोशिकाओं की क्षमता को चार श्रेणियों में से एक में स्कोर किया जा सकता है: 1) दृश्यमान परिवर्तनों के बिना बरकरार बेसल लामिना (चित्रा 3 बी), 2) परिवर्तित लेकिन अप्रभावित बेसल लामिना (चित्रा 3 सी), 3) सेल आक्रमण के बिना क्षतिग्रस्त बेसल लामिना (चित्रा 3 डी), और 4) सेल आक्रमण के साथ क्षतिग्रस्त बेसल लामिना (चित्रा 3 ई) ). एक और अवलोकन यह था कि, जब कैंसर कोशिकाओं ने एक परिवर्तित या क्षतिग्रस्त बेसल लामिना का कारण बना, तो सीएएम को रक्त वाहिका गठन की वृद्धि के साथ भी गाढ़ा किया गया था, जिसे वॉन विलेब्रांड के कारक के खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला द्वारा परिभाषित किया गया था, जिसे रक्त वाहिकाओं8 (चित्रा 4 सी-एच) में संश्लेषित किया जाता है। ये दो फेनोटाइप, एक गाढ़ा कैम और रक्त वाहिकाओं के गठन में वृद्धि, जब सीएएम बरकरार था तो नहीं देखा गया था (चित्रा 4ए, बी)।

Figure 3
चित्रा 3: CAM-Delam स्कोरिंग. (A-E) एक CAM-Delam स्कोरिंग उदाहरण CAM बेसल लामिना की अखंडता के आधार पर, एंटी-लैमिनिन (लाल) द्वारा कल्पना की गई, और GFP-व्यक्त कैंसर कोशिकाओं (हरे रंग) के संभावित आक्रमण द्वारा कल्पना की गई। (ए) कैंसर कोशिकाओं के बिना सीएएम को नियंत्रित करें। (B-E) कैंसर कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं में, बेसल लामिना की आकृति विज्ञान का वर्णन करने वाली चार श्रेणियों को स्कोर किया जा सकता है: (बी) बरकरार लैमिनिन, (सी) परिवर्तित लेकिन अक्षतिग्रस्त लैमिनिन (एक तारांकन चिह्न द्वारा इंगित), (डी) क्षतिग्रस्त लैमिनिन लेकिन कैंसर सेल आक्रमण (तीर) के बिना, सेल आक्रमण (एरोहेड्स) के साथ क्षतिग्रस्त लैमिनिन। स्केल बार = 100 μm (A-E)। यह आंकड़ा पलनिअप्पन एट अल.7 का है। संक्षेप: CAM = chorioallantoic झिल्ली; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सीएएम मोटा होना और रक्त वाहिका गठन का मूल्यांकन। (A-H) सीएएम मोटा होना और रक्त वाहिका गठन के विज़ुअलाइज़ेशन का एक उदाहरण, एंटी-वॉन विलेब्रांड फैक्टर (लाल) द्वारा पता लगाया गया, विभिन्न कैंसर सेल प्रकारों के लामिना के जवाब में। (A, B) कैंसर कोशिकाओं के बिना सीएएम को नियंत्रित करें। (C,D) एक गैर-मेटास्टैटिक कैंसर सेल लाइन (बरकरार के रूप में स्कोर) के जवाब में, मेसेनकाइम का कोई स्पष्ट मोटा होना या रक्त वाहिका गठन में वृद्धि का पता नहीं चला था। (E-H) मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं के जवाब में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तित या क्षतिग्रस्त लैमिनिन होता है, मेसेनकाइम को गाढ़ा किया गया था (डबल एरोहेड्स द्वारा इंगित किया गया था) और रक्त वाहिका गठन में वृद्धि देखी गई थी (तीर द्वारा इंगित किया गया था)। स्केल बार = 100 μm. इस आंकड़े को पलनिअप्पन एट अल.7 से संशोधित किया गया था। संक्षेप: CAM = chorioallantoic झिल्ली; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

U251 ग्लियोब्लास्टोमा और पीसी -3 यू प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाएं पूरी तरह से अलग-अलग डीलैमिनेशन क्षमताओं के साथ कैंसर सेल लाइनों के दो उदाहरण हैं (चित्रा 5)। पीसी -3 यू कोशिकाओं ने 1.5 दिनों के बाद क्षतिग्रस्त लैमिनिन को प्रेरित किया, 2.5 दिनों के बाद स्पष्ट आक्रमण के साथ (चित्रा 5 ए)। इसके विपरीत, U251 कोशिकाओं ने केवल 1.5-3.5 दिनों के बाद लैमिनिन के मामूली परिवर्तनों को प्रेरित किया, लेकिन कभी भी लैमिनिन (चित्रा 5 बी) को कोई दृश्यमान क्षति नहीं हुई।

Figure 5
चित्रा 5: प्रोस्टेट (PC-3U) और ग्लियोब्लास्टोमा (U251) कैंसर कोशिकाओं की delamination क्षमता का विज़ुअलाइज़ेशन. (A) PC-3U कोशिकाओं ने 14 घंटे के बाद लैमिनिन के मामूली परिवर्तन को प्रेरित किया, 1.5 दिनों (तीर) के बाद लैमिनिन की क्षति, और 2.5 दिनों के बाद आक्रमण की शुरुआत, जिसे 3.5 दिनों (एरोहेड्स) के बाद बढ़ाया गया था। (बी) यू 251 कोशिकाओं ने 1.5-3.5 दिनों के बाद लैमिनिन के मामूली परिवर्तन का कारण बना। सही पैनल कैम-डेलम स्कोरिंग का प्रतिनिधित्व करने वाले ग्राफ़ दिखाते हैं। y-अक्ष नमूनों की संख्या को इंगित करता है, और x-अक्ष संस्कृति के समय बिंदुओं को इंगित करता है। स्केल बार = 100 μm (A,B). इस आंकड़े को पलनिअप्पन एट अल.7 से संशोधित किया गया था। संक्षेप: CAM = chorioallantoic झिल्ली; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

CAM-Delam परख का उपयोग आणविक तंत्र को परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है जो delamination प्रक्रिया को विनियमित करते हैं। एक उदाहरण व्यापक एमएमपी अवरोधक GM6001 (चित्रा 6) का उपयोग करके मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेस (एमएमपी) को बाधित करने के संयोजन के साथ या बिना हाइपोक्सिया को प्रेरित करने के लिए CoCl2 उपचार का उपयोग है। CoCl2 उपचार के बाद, U251 गैर-मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं ने delamination और आक्रामक कोशिकाओं को प्रेरित करने की क्षमता हासिल की, जिसे दबा दिया गया था जब CoCl2 उपचार को एमएमपी अवरोधक GM6001 (चित्रा 6) के साथ जोड़ा गया था। इस प्रकार, सीएएम-डेलम परख उपयोगी हो सकता है जब अणुओं और आणविक मार्गों को परिभाषित किया जाता है जो कि delamination प्रक्रिया को प्रभावित करते हैं।

Figure 6
चित्रा 6: U251 कोशिकाओं के जवाब में Delamination पैटर्न अकेले CoCl2 के संपर्क में या एक एमएमपी अवरोधक के साथ एक साथ। (A-C) U251 कोशिकाओं विभिन्न स्थितियों के दौरान सीएएम पर 3.5 दिनों के लिए सुसंस्कृत. (A) अकेले सुसंस्कृत U251 कोशिकाओं ने लैमिनिन को कोई नुकसान नहीं पहुंचाया। (बी) संवर्धित U251 कोशिकाओं को कैम प्रेरित लैमिनिन क्षति और सेल आक्रमण परधोने और सेल सीडिंग से पहले CoCl 2 (24 h) के लिए preexposed। (सी) एक व्यापक स्पेक्ट्रम एमएमपी अवरोधक GM6001 (1 ज के लिए) के साथ pretreatment, CAM परU251 कोशिकाओं को धोने और सीडिंग से पहले CoCl 2 एक्सपोजर (24 ज) के बाद, CoCl2 उपचार के प्रभाव को दबा दिया, और कोई स्पष्ट लैमिनिन क्षति या कैंसर सेल आक्रमण का पता नहीं चला। स्केल बार = 100 μm (ए-सी)। पैनल (बी) और (सी) पलनिअप्पन एट अल.7 से हैं। संक्षेप: CAM = chorioallantoic झिल्ली; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; CoCl2 = कोबाल्ट क्लोराइड; एमएमपी = मैट्रिक्स metaloproteinase। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह पेपर कैंसर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक आक्रामकता का मूल्यांकन करने के लिए सीएएम-डेलम परख का वर्णन करता है, जो कुछ दिनों के लिए घंटों की अवधि के भीतर मेसेनकाइम में बेसल लामिना मॉड्यूलेशन और संभावित सेल आक्रमण को स्कोर करके निर्धारित किया जाता है। विभिन्न सीएएम assays के लिए एक पिछली तकनीकी समस्या चूजे भ्रूण के कम अस्तित्व रहा है. इस मुद्दे को भ्रूण इनक्यूबेशन के दौरान एक आंतरिक ह्यूमिडिफाइड चैंबर के उपयोग को पेश करके हल किया गया था, जिसने भ्रूण के अस्तित्व को 10% -50% से 80% -90% 7 तक बढ़ा दिया था। एक आंतरिक humidified कक्ष का उपयोग, इसलिए, सामान्य रूप से सीएएम-assays में मूल्यवान हो सकता है, साथ ही साथ अन्य पूर्व ovo लड़की प्रयोगों में भी।

सीएएम पर 1 x 106 कैंसर कोशिकाओं को सीडिंग करने के बाद 14 घंटे, 1.5 दिन, 2.5 दिन, और 3.5 दिनों पर प्रस्तुत स्कोरिंग समय अंक छह अलग-अलग कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करके कठोर विधि विकास पर आधारित हैं और कैंसर सेल लाइनों की सीमा को अलग करने के लिए पर्याप्त हैं। प्रत्येक समय बिंदु और प्रति सेल लाइन में तीन छल्ले के साथ चार अंडों का न्यूनतम उपयोग सुझाया गया है, और इसे कम से कम एक बार या प्रयोगात्मक डिजाइन और सांख्यिकीय आवश्यकताओं के अनुसार दोहराया जाना चाहिए। सीएएम-डेलम परख का एक लाभ कैंसर कोशिकाओं की आक्रामकता और मेटास्टेसिस गठन के लिए संभावित जोखिम का अनुमान लगाने के लिए कुछ दिनों के भीतर कैंसर कोशिकाओं की delamination क्षमता के बारे में जानकारीपूर्ण परिणाम प्राप्त कर रहा है। परिणामों के तेजी से वितरण को हमलावर कैंसर कोशिकाओं और बाद के माइक्रोट्यूमर / ट्यूमर कलियों और अंग मेटास्टेसिस के कारण बेसल लामिना के क्षरण की निगरानी करके सुविधाजनक बनाया जाता है। परंपरागत रूप से, सीएएम मॉडल का उपयोग अंग मेटास्टेसिस के गठन का विश्लेषण करने के लिए किया गया है, जिसे निर्धारित करने में लगभग 2 सप्ताह लगतेहैं। सात अलग-अलग कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करके, हमने पहलेसत्यापित किया है कि delamination स्कोरिंग कैंसर कोशिकाओं की क्षमता से जुड़ा हुआ है कृंतक मॉडल 10,11,12,13,14 में मेटास्टेसिस बनाने के लिए, जो सीएएम-डेलम परख के पूर्वानुमानित मूल्य का समर्थन करता है। इसके अलावा, माउस मॉडल को एक और भी लंबे समय की आवश्यकता होती है, कई हफ्तों से महीनों तक, इससे पहले कि मेटास्टेसिस कीजांच की जा सके 15,16। संक्षेप में, इस विकसित CAM-Delam परख, स्कोरिंग delamination क्षमता पर ध्यान केंद्रित और लड़की भ्रूण में बाद में ट्यूमर गठन की जांच पर नहीं, इसलिए, मौजूदा चिकन कैम आक्रमण और माउस ट्यूमर मॉडल के लिए एक अच्छा पूरक है.

सीएएम-डेलम परख में एक सीमा बेसल लामिना के अस्पष्ट दृश्य हो सकता है अगर कैंसर कोशिकाएं स्वयं लैमिनिन व्यक्त करती हैं। यदि हां, तो बेसल लामिना को इंगित करने वाले अन्य मार्कर, जैसे कि ई-कैडरिन, का उपयोग किया जा सकताहै 7। अन्य सीएएम आक्रमण अध्ययनों ने कैम और पैन-साइटोकेराटिन और विमेंटिन की कल्पना करने के लिए टाइप IV कोलेजन का उपयोग किया है ताकि हमलावर कैंसर कोशिकाओं की पहचान की जा सके और माइक्रोट्यूमर / ट्यूमर कलियोंके गठन को 17,18 किया जा सके।

Delamination एक सामान्य सेलुलर प्रक्रिया है, दोनों विकास के दौरान और बाद में जीवन में, जो कोशिकाओं के लिए एक उपकला छोड़ने और अन्य ऊतकों में स्थानांतरित करने के लिए संभव बनाता है। विकास के दौरान delaminating कोशिकाओं के उदाहरण तंत्रिका शिखा और घ्राण अग्रणी न्यूरॉन्स19,20 हैं; बाद में जीवन में, घाव भरने delamination21 पर निर्भर है. कैंसर के दौरान, यह प्रक्रिया गलत कोशिकाओं में और / या गलत समय पर अनियमित होती है। इस प्रकार, सीएएम-डेलम विधि आणविक तंत्र को उजागर करने के लिए उपयोग की जा सकती है जो कि डेलैमिनेशन को विनियमित करती है, जो बुनियादी जैविक और रोग ज्ञान दोनों के लिए महत्वपूर्ण होगी। इस तरह के delamination अध्ययनों में सीएएम पर सीड किए गए कैंसर कोशिकाओं में रुचि के कारकों को जोड़ना या आनुवंशिक रूप से संशोधित कैंसर कोशिकाओं का अध्ययन करना शामिल होगा। यहां प्रस्तुत एक उदाहरण हाइपोक्सिया को प्रेरित करने के लिए गैर-मेटास्टैटिक सेल लाइन U251 काCoCl 2 pretreatment है, जो एक मेटास्टैटिक आक्रामक क्षमता के प्रेरण की ओर जाता है जिसे व्यापक स्पेक्ट्रम एमएमपी अवरोधक द्वारा दबाया जा सकता है। इस प्रकार, डीलेमिनेशन को नियंत्रित करने वाले प्रमुख अणुओं को खोजने से इस प्रक्रिया को दबाने के लिए अवरोधकों को डिजाइन करने की संभावना बढ़ जाती है। इसके संबंध में, सीएएम-डेलम प्रोटोकॉल के लिए एक और संभावित उपयोग डेलैमिनेशन और सेल आक्रमण के दमन के लिए दवा स्क्रीनिंग में है। इसके अलावा, क्लिनिक में, कैंसर की गंभीरता का मूल्यांकन निदान, योजना उपचार और देखभाल के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है। वर्तमान में, टीएनएम स्टेजिंग सिस्टम (टी, ट्यूमर का आकार; एन, नोड-चाहे कैंसर लिम्फ नोड्स में फैल गया हो; एम, दूर के मेटास्टेसिस) का उपयोग कैंसर की गंभीरता का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है22। CAM-Delam परख कैंसर कोशिकाओं की आक्रामकता और मेटास्टेसिस गठन के लिए संभावित जोखिम का मूल्यांकन करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण को परिभाषित करता है और टीएनएम स्टेजिंग सिस्टम के लिए एक उपयोगी पूरक हो सकता है। उल्लेखनीय यह है कि टीएनएम स्टेजिंग निश्चित ऊतक नमूनों के विश्लेषण पर आधारित है, जबकि एक संभावित नैदानिक सीएएम-डेलम दृष्टिकोण जमे हुए कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने के लिए तकनीकों के साथ संयोजन में ताजा या ताजा जमे हुए ऊतककी जांच करेगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

हम प्रासंगिक कैंसर सेल लाइनों और एंटीबॉडी के साथ उनकी मदद के लिए Umeå University में निम्नलिखित शोधकर्ताओं को धन्यवाद देते हैं: एल कार्लसन (वॉन विलेब्रांड फैक्टर एंटीबॉडी), जे गिलथोर्पे (U251), और एम लैंडस्ट्रॉम (पीसी -3 यू)। हम HEK293-TLR-AAVS1 स्थिर सेल लाइन की पीढ़ी के लिए Gilthorpe प्रयोगशाला में Hauke Holthusen को भी धन्यवाद देते हैं। Gunhaga प्रयोगशाला में काम स्वीडिश कैंसर फाउंडेशन (18 0463), Umeå बायोटेक इनक्यूबेटर, Norrlands Cancerforskningsfond, स्वीडिश अनुसंधान परिषद (2017-01430), और Umeå विश्वविद्यालय में चिकित्सा संकाय द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen
Cryostat HM 505 E, Microm
Digital camera Nikon DS-Ri1
Dissection Microscope Leica M10 For CAM-sample dissection and positioning in molds
Egg incubator Fiem Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use
Epifluorescence microscope Nikon Eclipse, E800 Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion.
Fine forceps Many sources are available Must be sterilized before use
Freezer -80 °C Thermo Fisher Scientific 8600 Series Model 817CV
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 For cell culture work
Scissors (small) Many sources are available Must be sterilized before use
MATERIALS
anti-Laminin-111 Sigma-Aldrich L9393 Primary anti-rabbit antibody (1:400)
anti-rabbit Cy3 Jackson Immuno Research 111-165-003 Secondary antibody (1:400)
anti-von Willebrand Factor DAKO P0226 Primary antibody (1:100)

Cobalt(II) chloride		 Sigma-Aldrich 232696-5G CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400)
Fertilized chicken eggs Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden Any local egg supplyer
Fetal bovine serum Life Technologies 10500-064
Fluorescence mounting medium Allent Technologie S302380-2 Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C
Glass chambers for silicon rings Many sources are available We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. 
Glass coverslips VWR International 631-0165
GM6001 MMP Inhibitor Sigma-Aldrich CC1010
Microscope slides for immunohistochemistry Fisher Scientific 10149870
NEG-50 frozen medium Cellab 6506
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing.

Peel-A-Way Embedding Molds		 Polysciences 18985
Penicillin–streptomycin Gibco 15070063
Petri dishes Sarstedt 83.3903 15 cm in diameter for cell culture
Plastic box Esclain
PureCol EZ Gel Collagen Cellsystems 5074-35ML 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations.
RPMI medium Thermo Fisher Scientific 21875034
Silicon rings VWR International 228-1580 Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings.
Trypan blue Fisher Scientific T10282
Trypsin Life Technologi 15400054 0.50%
Weighing boats VWR International 611-0094
SOLUTIONS
Collagen-RPMI media mixture (1 mL) Compelete RPMI Media
750 µL
         PureCol EZ Gel Collagen
250 µL
         Mix and use immediately
Complete RPMI media (500 mL) RPMI Media
445 mL
         FBS
50 mL
         Penicillin–streptomycin
5mL
         Store at 4 °C
PB (0.2 M; 1 000 mL) Na2HPO4 (MW 141.76)
21.9 g
         NaH2PO4 (MW 137.99)
6.4 g
         add deionized water up to final volume of 1000ml
         Store in RT
PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) Deionized water
50 mL
         0.2 M PB
50 mL
         Paraformaldehyde (PFA)
4g
         heat to 60 °C in water bath
         add 5 M NaOH
25 µL
         Stir to dissolve the PFA powder
         Store at 4 °C
TBST (1 000 mL) 50mM Tris pH 7,4
50 mL
         150mM NaCI
30 mL
         0,1% Triton X-100
10 mL
         H2O (MQ)
900 mL
Trypsin (0.05 %; 10 mL) 1x PBS
9 mL
         10x Trypsin (0.5 %)
1 mL
         10 mL in total, Store at 4 °C

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 184
कैम-Delam परख कैंसर कोशिकाओं के Delamination और आक्रमण क्षमता परिमाणित द्वारा मेटास्टेटिक गुण स्कोर करने के लिए
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Green, T., Šlekienė, L.,… More

Green, T., Šlekienė, L., Gunhaga, L. CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (184), e64025, doi:10.3791/64025 (2022).

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