Summary
本协议描述了通过具有集成组织保存系统的微创方法对啮齿动物脑肿瘤进行标准化切除。该技术对于准确反映啮齿动物和其他动物模型中的护理标准具有意义。
Abstract
本协议描述了啮齿动物脑肿瘤切除和组织保存的标准化范式。在临床实践中，最大程度的肿瘤切除术是大多数脑肿瘤的标准治疗。然而，目前大多数可用的临床前脑肿瘤模型要么不包括切除术，要么使用手术切除模型，这些模型非常耗时，并导致显着的术后发病率、死亡率或实验变异性。此外，由于多种原因，对啮齿动物进行切除可能令人生畏，包括缺乏临床上可比的手术工具或方案以及缺乏标准化组织采集的既定平台。该协议强调了多功能，非消融性切除装置和根据该设备的临床版本改编的集成组织保存系统的使用。本研究所应用的装置在孔径处结合了可调抽吸和圆柱形叶片，以精确地探测、切割和抽吸组织。微创切除装置通过用于初始肿瘤植入的相同毛刺孔 执行 其功能。这种方法最大限度地减少了活检或切除手术期间区域解剖结构的改变，并降低了大量失血的风险。这些因素显着减少了手术时间（<2分钟/只动物），改善了术后动物的存活率，降低了实验组的变异性，并导致切除的组织和细胞的高活力，以供将来的分析。该过程由~1，400个循环/分钟的刀片速度促进，这允许将组织收获到无菌封闭系统中，该系统可以填充所选的生理溶液。鉴于研究和准确建模手术的影响、区域化肿瘤切除标本的保存和严格比较分析以及腔内递送疗法的重要性，这一独特的方案将扩大探索有关脑肿瘤患者围手术期管理和治疗发现的未解答问题的机会。
Introduction
胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见和最具侵袭性的原发性脑肿瘤。尽管最近在神经外科、靶向药物开发和放射治疗方面取得了进展，但GBM患者的5年生存率低于5%，这一统计数据在三十多年来没有显着改善1。因此，需要更有效的治疗策略。
为了开发新疗法，越来越明显的是，研究方案需要（1）利用可翻译的临床前模型来准确概括肿瘤异质性和微环境，（2）反映GBM患者使用的标准治疗方案，目前包括手术，放疗和化疗，以及（3）解释切除的核心和残留之间的差异， 侵袭性肿瘤组织2，3，4，5。然而，目前可用的大多数临床前脑肿瘤模型要么不实施手术切除，要么使用相对耗时的手术切除模型，导致大量失血或缺乏标准化。此外，由于缺乏临床上可比的手术工具或方案，并且缺乏用于系统组织收集的既定平台6，因此进行啮齿动物脑肿瘤切除可能具有挑战性（表1）。
本协议旨在描述使用多功能非消融性微创切除系统（MIRS）和集成组织保存系统（TPS）的啮齿动物脑肿瘤切除和组织保存的标准化范式（图1）。预计这种独特的技术将提供一个标准化的平台，可用于GBM和其他类型的脑肿瘤模型的临床前研究的各种研究。研究脑肿瘤治疗或诊断方式的研究人员可以实施该协议，以实现他们的研究中的标准化切除。
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Protocol
所有动物研究均获得马里兰大学和约翰霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。C57BL / 6雌性小鼠，6-8周龄，用于本研究。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。遵守了所有生物安全2级（BSL-2）规定，包括使用口罩、手套和防护服。
1.初始颅内肿瘤植入
- 在研究的初始阶段，颅内向每只小鼠注射悬浮在4μL磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）中的100，000个细胞（GL261鼠胶质瘤细胞系），深度为2.5mm，遵循先前发表的报告7。
- 在肿瘤植入后8 9天使用体内成像系统量化每只小鼠中的肿瘤信号。
注意：如果需要，根据肿瘤负荷将小鼠分层为两组。在本研究中，两组分别为：（1）肿瘤负荷相对较小的小鼠（平均生物发光信号= 5.5e+006 ± 0.1e+006光子/s，n = 10）和（2）肿瘤负荷相对较大的小鼠（平均生物发光信号= 1.69e+007 ± 0.2e + 007光子/ s，n = 10），（p < 0.05，曼惠特尼检验）9。 - 将每个组划分为两个可比较的子组。
注意：在本研究中，两个亚组是：未经治疗的小鼠（n = 5）和使用MIRS（n = 5）进行手术切除的肿瘤小鼠（p > 0.05，曼-惠特尼试验）9。 - 从切除当天开始，使用 体内 成像系统以基于肿瘤生长模式的频率跟踪肿瘤进展。
注意：对于GL261细胞系，在切除当天跟踪肿瘤进展，然后每3-6天跟踪一次。
2. 使用MIRS切除肿瘤
- 在诱导室或腹膜内注射甲苯噻嗪/氯胺酮溶液中使用异氟烷-O2 气体混合物麻醉小鼠。
- 如果使用气体麻醉剂，请将气体流速设置为 1.0 mL/min，将蒸发器设置为 2.0% 以进行麻醉诱导，通常需要在腔室中 3-5 分钟（见 材料表）。
- 如果使用注射麻醉剂，则通过腹膜内注射0.2mL麻醉溶液（80-100mg / kg氯胺酮和10-12.5mg / kg甲苯噻嗪，参见 材料表）麻醉小鼠。
- 通过捏住脚趾来评估动物是否有足够的镇静作用。将眼药膏涂抹在眼睛上，以避免角膜干燥。手术前给予镇痛药（0.03-0.06 mg / kg丁丙诺啡皮下注射）。
- 确认完全镇静后，将鼠标放在立体定向框架上（见 材料表）。
注意：如果使用气体麻醉剂，请将鼠标的鼻子放在鼻锥中，在手术过程中它将继续接受异氟烷-O2 混合物（1.5%）。 - 去除以前的订书钉，然后用脱毛膏或剃须去除头发。用氯己定/甜菜碱磨砂膏和酒精交替循环对皮肤进行消毒。然后，使用无菌手术刀，沿着先前的手术疤痕创建一个 1 厘米的纵向中线切口。
- 通过载物台适配器/手机支架将MIRS手机连接到立体定向臂，以提高稳定性和精度。
- 使用以下设置设置MIRS机器（参见 材料表）（图1）。
- 将后面板上设置的电源线插入电源线插座。通过切换打开或关闭系统电源（1 = 开，0 = 关）。
- 将氮气软管（随控制台提供）的一端插入控制台后面板上的公接头。顺时针旋转连接螺母以拧紧连接。
注意： 软管的另一端需要连接到氮气供应。 - 在将软管连接到氮气供应之前，请确认供应压力不超过 100 psig，这是控制台推荐的输入供应压力。
注意：一旦向控制台提供氮气，控制台将在脚踏板激活时产生自己的吸气。 - 盖上真空口的盖子并将其密封，以避免真空系统中的任何泄漏。吸液系统的任何泄漏都会影响MIRS控制台的性能。
- 如果在设置或启动期间吸气低于 17，请检查控制台前面的吸气旋钮是否设置为最大水平 （100），确保吸气系统中没有泄漏，并确认氮气输入供应压力正确。
- 要将脚踏板连接到主机，请将灰色脚踏板连接器插入其灰色插座，直到其发出咔嗒声并安装到位。
注意： 脚踏板连接器以一个方向连接到控制台，并且是键控的。 - 要将手机连接到主机，请将蓝色听筒接头插入其蓝色插座，直到其发出咔嗒声并安装到位。
注：手机接头以一个方向连接到主机，并且是键控的。 - 在使用系统之前，将无菌液体从小碗吸入孔中，通过管路和手机，然后进入罐中，以确保管子和手机的内部得到润滑以减少组织闭塞。
- 通过在控制台前面板上选择适当的模式，为单独抽吸或切割抽吸做好准备。使用脚踏板启动。
- 将 23 G MIRS 插管插入毛刺孔，深度为 2.5 mm。
- 通过踩下连接到套管的脚踏板来启动切除过程。使用手机中的控制旋钮进行一个完整的周期 （360°） 或更长时间的切除。
注意：执行的周期越多，切除的肿瘤组织体积就越大。 - 切除过程完成后，从毛刺孔中取出 23 G MIRS 插管，并使用 5 mL 的 1x PBS 冲洗管路并清除任何残留碎屑。
- 将鼠标从立体定向框架中取出，并用吻合器或4-0缝合材料闭合伤口（参见 材料表）。
- 在麻醉恢复期间，将鼠标放在加热垫上或温暖的灯光下，然后将其放回笼子。
- 实验完成后， 通过冲洗清除 套管。与冷却介质和空气交替，将所有切除的组织“推”回收集罐。从系统中取出收集罐，并用提供的盖子盖上盖子。
- 完成步骤2.12后，将套管的远端尖端放入3%H2O2 中，并在Hg中以24-25的吸力将吸力管填充回抽吸罐中，静置60-90秒。用间歇性脉冲空气和培养基的无菌培养基冲洗。
- 在手术后监测小鼠的任何神经系统体征（异常不稳定的运动或癫痫发作）。
- 对患有严重神经损伤的小鼠实施安乐死（变得昏昏欲睡，外观憔悴，驼背或动作不稳定）。
注意：对于本研究，使用200mg / kg市售安乐死溶液（见 材料表）对每只小鼠实施安乐死。
3. 通过 TPS 采集 组织
- 将肿瘤样品浸入含有RBC裂解培养基（参见 材料表）的组织培养皿中，在室温下5分钟。
注意：从MIRS收获到TPS的组织将主要以单细胞的形式以及小块组织的形式出现。 - 将70μm过滤器（参见 材料表）放在50mL锥形管上，并使用5mL注射器的柱塞使肿瘤样品通过过滤器。
- 使用移液器，使用 RPMI-1640 培养基促进细胞和任何组织团块通过过滤器。
- 在4°C下以428× g 离心5分钟。 用移液管弃去上清液。
- 将每个样品重悬于5 mL制备的RPMI-1640培养基中。
- 为了提高组织活力，特别是如果在初始印象中可以看到大块组织块，则向每个样品中添加所需体积的酶混合物（包含DNAse I，胶原酶IV，分散酶，木瓜蛋白酶和EDTA，参见 材料表）。使用涡旋混合溶液。
注意：步骤 3.6 是可选的。酶混合物的组成（总体积为 5 mL/样品）：300 μL DNA se I 级 II、150 μL 胶原酶/分散酶（切割纤连蛋白、胶原酶 IV、I 和非极性氨基酸）、250 μL 木瓜蛋白酶（非特异性蛋白酶）和 6 μL 0.5 M EDTA。 - 将样品置于设置为200rpm，37°C的摇床培养箱中20分钟。
- 20分钟后，在4°C下以428× g 旋转样品5分钟。 弃去上清液。
- 通过70μm细胞过滤器过滤单个细胞，并在4°C下以274× g 旋转3分钟。 用台盼蓝和血细胞计数器进行细胞活力分析10 （见 材料表）。
注意：第 0 天的活力范围为 30%-70%，并在 2-3 天内显着增加。 - 继续执行步骤 4、5 或 6，具体取决于所需的可行性测试。
4. 贴壁培养中的细胞生长
- 在经过认证的层流罩中，将沉淀重悬于含血清的贴壁培养基（例如 DMEM、10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素 （P/S） 溶液）中，并将细胞平板放在贴壁细胞瓶中。
- 将细胞保持在受控的孵育环境（37°C，5%CO2）中。
5. 悬浮培养物（神经球）中的生长细胞
- 在经过认证的层流罩中，将沉淀重悬于无血清完整干细胞培养基11 中，并接种在悬浮瓶中。
- 将细胞在受控的孵育环境（37°C，5%CO 2）中维持2-3天，以使神经球形成。
- 在培养基中可视化神经球后，使用胰蛋白酶-EDTA或Accutase（参见 材料表）获得用于传代的单细胞悬液。
注意：只要在收获过程中特别小心并使用支持神经干细胞的适当培养基，收获组织中的干细胞必须在几天内形成神经球。
6. 准备细胞进行再植入
- 以每 4 μL 1x PBS 100，000 个活细胞的浓度重悬沉淀。
- 立即使用颅内肿瘤植入方法（步骤1）注射到幼稚小鼠中。
7. 组织学分析
- 切除后立即将大脑提取并固定在4%多聚甲醛（PFA）中24小时12。
- 将大脑转移到30%蔗糖溶液中，直到它们被蔗糖饱和（沉入容器底部）。
- 将大脑转移到70%乙醇溶液中。
- 按照先前发表的报告13 进行石蜡块包埋、切片和标准苏木精和伊红 （H&E） 染色。
注意：用于染色的每个切片的厚度为10μm。
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Representative Results
使用MIRS进行手术切除可显著降低肿瘤负荷
在肿瘤负荷较小的组中，接受切除的亚组中的平均基线生物发光信号为5.5e+006光子/秒±0.2e+006。切除后，平均生物发光信号降至3.09e+006光子/秒±0.3e+006，（p <0.0001，曼-惠特尼检验）9 （图2）。生物发光信号在接下来的几天内增加，直到小鼠被安乐死。同样，在肿瘤负荷较大的组中，接受切除的亚组中的平均基线生物发光信号为1.68e + 007光子/s±0.1e + 007。切除后，平均生物发光信号降至5.19e+006光子/秒±0.2e+006，（p <0.0001，曼-惠特尼检验）9。生物发光信号在接下来的几天内增加，直到小鼠被安乐死。
使用MIRS的切除可以根据所需的切除体积进行调整
在同系 CT2A 肿瘤的切除前成像中，肿瘤通常可识别为接种部位的异质性肿块，实质结构破坏，肿瘤周围水肿和出血由 T2 加权 （T2w） 低信号和高信号的异质区域指示。用于立体定向肿瘤细胞注射的针迹可以在T2w MRI扫描14上识别。
切除腔可以在切除后的T2w MRI扫描中识别为肿瘤接种部位的大圆形低信号区域（图3）。切除手术没有导致明显的失血或周围大脑结构的破坏。在某些情况下，液体积聚在切除腔中。如图4所示，切除体积从切割孔径旋转一次的9.4 mm 3显着增加到两次旋转的23.2 mm3（p = 0.0117），允许调整体积切除以优化已知的肿瘤负荷。
使用MIRS切除肿瘤导致荷瘤小鼠的中位生存期延长7天，而不会诱发任何神经系统体征
如图5所示，在小（6天）和大（7天）肿瘤的两组中，接受手术切除的小鼠的存活期延长。在肿瘤负荷较小的组中，对照亚组的中位生存期为16天，而接受切除的亚组的中位生存期为22天（p = 0.0044）。同样，在肿瘤负荷较大的组中，对照亚组的中位生存期为12天，而接受切除的亚组的中位生存期为19天（p = 0.0043）。此外，使用MIRS进行切除的小鼠在手术后均未显示出任何神经损伤的迹象。这表明MIRS可以实现安全切除。
使用MIRS切除的组织具有很高 的体外 和 体内 活力
在进行体外或体内活力实验之前，将从切除组织中提取的细胞进行过滤、定量并重悬于适当的培养基中（图6）。为了检查细胞的体外活力并确认肿瘤切除而不是正常脑实质，细胞在悬浮培养物中生长。神经球形成是肿瘤起始潜力的指标，在切除后组织处理最少的情况下发生。这表明MIRS平台收获了分离良好的组织，对切除组织的健康和活力的影响最小。从TPS直接到光学显微镜的样本似乎主要以单细胞的形式存在，并且存在一些小块组织。第0天的活力范围为30%-70%（这表示样品通过70μm过滤器后和电镀前的活力）。切除装置有一个切割孔，可以在切除探头的轴上旋转360°，允许切除同心组织体积。平均而言，切割孔径一次360°旋转可收获2-300万个细胞，旋转两圈可收获约700万个细胞，切割孔径3次360°旋转可收获12-1400万个细胞。在含有无血清完全干细胞培养基的悬浮瓶中接种后，在第2天通过光学显微镜观察神经球，在第7天通过肉眼可见神经球（图7）。
为了检查 体内 活力，将提取的细胞颅内植入幼稚的C57BL / 6小鼠（n = 8只小鼠，100，000个活细胞/小鼠）。使用 体内 成像系统确认肿瘤生长。肿瘤信号继续增加，直到所有动物在肿瘤植入后第14天被安乐死（中位生存期为11天）。
代表性的H&E组织切片（图3B）包含一个透明的圆形切除腔，边缘有血液制品（深粉红色），炎症和残留肿瘤细胞（深紫色细胞）。宏观上，残余肿瘤细胞具有间充质性和浸润性，表现出广泛的血管周围侵袭和增殖。在显微镜下，鉴定出明显的核异型性和有丝分裂图。在梗死组织和微出血区域周围也发现了肿瘤相关的巨噬细胞。周围脑实质的组织结构似乎没有受到干扰。
图 1：MIRS 系统设置。 （A）具有集成组织保存系统的啮齿动物模型中用于脑肿瘤的微创切除系统（MIRS）。（B） MIRS 控制台的前面板。1 = 系统电源，2 = 脚踏板，3 = 主按钮，4 = 吸气，5 = 吸液液位控制拨盘，6 = 吸液液位指示器，7 = 手机，8 = 刀具启用按钮。（C） MIRS 控制台的后面板。1 = 电源线插座，2 = 断路器，3 = 氮气供应输入。请点击此处查看此图的大图。
图2：未经治疗的肿瘤小鼠与接受MIRS肿瘤切除 的小鼠的平均肿瘤负荷的变化。 （A）基线肿瘤负荷小的小鼠和（B）基线肿瘤负荷大的小鼠（p < 0.0001，SD ≤0.3e + 006在每个时间点在所有组中，太小而无法显示在图表上）。动物要么死于肿瘤负担，要么被安乐死。 请点击此处查看此图的大图。
图3：MRI和H&E分析。 （A）切除前和切除后的T2加权脑MRI图像和（B）代表性的H&E染色冠状脑切片，显示一个清晰的圆形切除腔，边缘有血液制品（深粉红色），炎症和残留肿瘤细胞（深紫色细胞）。切除后立即获得MRI图像和H&E切片。 请点击此处查看此图的大图。
图4：肿瘤切除体积的测定。 根据 MRI 图像计算出的平均体积 1 与切割孔径旋转两次，每组n = 4。 p = 0.01，双尾 T 检验。 请点击此处查看此图的大图。
图5：未经治疗的肿瘤小鼠与接受MIRS肿瘤切除的小鼠的Kaplan-Meier曲线 。 （A）基线肿瘤负荷小的小鼠。（B）基线肿瘤负荷大的小鼠。 请点击此处查看此图的大图。
图6：切除肿瘤细胞的活力测试 。 （A）第0天在20x用MIRS收获的组织的代表光学显微镜图像。 （B）Kaplan-Meier曲线描述了从切除组织中收获的细胞颅内植入后小鼠的存活率。 请点击此处查看此图的大图。
图7：神经球的形成。 在（A）20x和（B）10x切除后第2天以及（C）20x和（D）10x切除后第7天从切除组织生成的神经球的代表性光学显微镜图像。 请点击此处查看此图的大图。
| 微创切除系统 | 历史切除术 | |||
| 操作时间和技能 | 最短手术时间（每只动物<2分钟）。所需的技能最少。 | 手术时间不规范，小动物和显微手术的手术经验是有益的。 | ||
| 失血 | 极小 | 不可预知的 | ||
| 标准化切除体积 | 切除体积由切除工具的旋转次数决定/调整 | 不同科目的音量差异很大 | ||
表1：微创切除系统（MIRS）与历史手术切除模型之间的比较。
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Discussion
肿瘤切除术是低级别和高级别脑肿瘤神经外科肿瘤治疗计划的基石。肿瘤的细胞减灭和减瘤与脑肿瘤患者的神经功能和总生存期的改善相关1，2，5，6。尽管手术切除方案之前已在啮齿动物模型中描述过，但这些方案存在一些局限性，可能会混淆生成的结果和临床前模型的整体可转化性。例如，先前报道的手术切除方案包括开颅手术，带有3-4个小毛刺孔以产生骨瓣，然后与正常脑组织相比熟练地区分和区分肿瘤的颜色和一致性6。这些方案非常耗时，需要研究人员在利用手术显微镜、处理手术器械、识别周围正常脑组织的肿瘤边界以及实现足够的体内平衡方面具有先进的技能。这种手术通常会导致大量失血和动物死亡。此外，在同一实验中，在不同动物上切除相当体积的肿瘤组织，实现标准化切除可能具有挑战性。随着多个人员执行程序，这种连续性和统一性变得更加具有挑战性。
相比之下，此处描述的MIRS协议消除了这些限制（表1）。本方案需要通过用于初始肿瘤植入的相同毛刺孔的微创方法。如协议部分所述，切除工具可以安装在立体定向框架上，允许将套管准确插入肿瘤腔。刀片的速度和执行的切除周期数可以通过研究人员使用的手机轻松调整，以标准化的方式控制切除的肿瘤体积，而不会引起大量失血。
如结果所述，与未切除肿瘤的小鼠队列相比，使用MIRS装置切除的小鼠表现出更长的生存期。这与数据一起表明，与未切除的对照组相比，切除组的肿瘤负荷显着降低，这表明MIRS装置有效地减瘤肿瘤，对周围健康脑组织的干扰最小。此外，在切除后的几天内，由于残留肿瘤的存在和CT-2A肿瘤细胞系的浸润性质，肿瘤负荷稳步发展。因此，MIRS模型可以复制浸润性肿瘤类型的减瘤过程，可以随后使用化疗药物或放射疗法，以更紧密地反映人脑肿瘤治疗方案中的治疗方案15，16，17。
与任何抽吸装置一样，吸液管堵塞可能是MIRS系统的局限性之一。这可能是由于在使用机器期间或之后干组织或血液的积聚而发生的。为避免这种情况，在每次切除结束时，建议立即用冷介质与空气交替冲洗以将所有切除的组织“推动”到收集罐中，然后用3%H2O2冲洗。这将捕获切除过程中获得的所有组织，并确保没有残留在套管或导管中。此外，如果系统未吸气/切割，这可能是因为手机未插入、切除套管切割器未打开、控制台的吸气管未连接到罐、罐盖不紧或脚踏板未插入。
此外，虽然我们已经证明MIRS可用于有效和标准化的切除，具有切除组织的 高体外 和 体内 活力，但鼓励未来的研究进一步研究在脑肿瘤研究中实施此类系统的其他方面。这些包括检查切除过程对肿瘤肿块和肿瘤微环境的分子和细胞成分的影响。此外，需要研究来证实使用MIRS装置切除的组织概括了亲本肿瘤15。
总之，描述了一种微创方法的方案，用于啮齿动物脑肿瘤模型中的标准化手术切除，该模型与集成和自动化的组织保存系统相结合。该协议为建立高度转化和预测性的临床前脑肿瘤研究模型铺平了道路。该协议的未来应用可能包括调查脑肿瘤的不同治疗或诊断方式的临床前研究，这些研究可以实施该协议以实现标准化切除。
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Disclosures
BT拥有NIH的研究资金，并且是加速联合疗法*的共同所有者，Ashvattha Therapeutics Inc.已授权她的一项专利。GW拥有NIH资金（R01NS107813）。HB是Insightec的付费顾问，也是公司医疗顾问委员会主席。约翰霍普金斯大学根据其利益冲突政策审查和批准了这一安排。HB拥有NIH，约翰霍普金斯大学和慈善机构的研究资金，并且是CraniUS，Candel Therepeutics，Inc.，Accelerating Combined Therapies*，Catalio Nexus Fund II，LLC*，LikeMinds，Inc*，Galen Robotics，Inc.*和Nurami Medical*的顾问。（*包括股票或期权）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
| 200 proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | CoStar | 4487 | |
| 70 micron filter | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| Anesthesia System | Patterson Scientific | 78935903 | |
| Anesthesic Gas Waste Container | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Bench protector underpad | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6, 6-8 week old mice | Charles River Laboratories | Strain Code 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 media | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM media | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Euthanasia solution | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| Formalin | Invitrogen | INV-28906 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| Induction Chamber | Patterson Scientific | 78933388 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Isoflurane Vaporizer | Patterson Scientific | 78916954 | |
| Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield Microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Microinjection Unit | Kopf | 5001 | |
| Micromotor drill | Foredom | F210418 | |
| MRI system | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI Scanner | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| Progesterone | Sigma | P-8783 | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic Frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Suture, vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 culture flask | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
References
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