Summary
Het huidige protocol beschrijft een gestandaardiseerde resectie van hersentumoren bij knaagdieren door middel van een minimaal invasieve aanpak met een geïntegreerd weefselbehoudsysteem. Deze techniek heeft implicaties voor het nauwkeurig spiegelen van de zorgstandaard in knaagdier- en andere diermodellen.
Abstract
Het huidige protocol beschrijft een gestandaardiseerd paradigma voor resectie van hersentumoren bij knaagdieren en weefselbehoud. In de klinische praktijk is maximale tumorresectie de standaardbehandeling voor de meeste hersentumoren. De meeste momenteel beschikbare preklinische hersentumormodellen bevatten echter geen resectie of gebruiken chirurgische resectiemodellen die tijdrovend zijn en leiden tot significante postoperatieve morbiditeit, mortaliteit of experimentele variabiliteit. Bovendien kan het uitvoeren van resectie bij knaagdieren om verschillende redenen ontmoedigend zijn, waaronder een gebrek aan klinisch vergelijkbare chirurgische hulpmiddelen of protocollen en de afwezigheid van een gevestigd platform voor gestandaardiseerde weefselverzameling. Dit protocol benadrukt het gebruik van een multifunctioneel, niet-ablatief resectieapparaat en een geïntegreerd weefselconserveringssysteem dat is aangepast aan de klinische versie van het apparaat. Het apparaat dat in de huidige studie wordt toegepast, combineert afstembare zuigkracht en een cilindrisch blad bij de opening om nauwkeurig weefsel te tasten, te snijden en te zuigen. Het minimaal invasieve resectieapparaat voert zijn functies uit via hetzelfde braamgat dat wordt gebruikt voor de initiële tumorimplantatie. Deze aanpak minimaliseert veranderingen in de regionale anatomie tijdens biopsie- of resectieoperaties en vermindert het risico op aanzienlijk bloedverlies. Deze factoren verminderden de operatietijd (<2 min/dier) aanzienlijk, verbeterden de overleving van postoperatieve dieren, lagere variabiliteit in experimentele groepen en resulteren in een hoge levensvatbaarheid van gereseceerde weefsels en cellen voor toekomstige analyses. Dit proces wordt vergemakkelijkt door een messnelheid van ~ 1.400 cycli / min, waardoor weefsels kunnen worden geoogst in een steriel gesloten systeem dat kan worden gevuld met een fysiologische oplossing naar keuze. Gezien het opkomende belang van het bestuderen en nauwkeurig modelleren van de impact van chirurgie, behoud en rigoureuze vergelijkende analyse van geregionaliseerde tumorresectiemonsters en intra-cavity-afgeleverde therapeutica, zal dit unieke protocol de mogelijkheden uitbreiden om onbeantwoorde vragen over perioperatief beheer en therapeutische ontdekking voor hersentumorpatiënten te verkennen.
Introduction
Glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende en agressieve primaire hersentumor bij volwassenen. Ondanks recente vooruitgang in neurochirurgie, gerichte medicijnontwikkeling en bestralingstherapie, is de 5-jaarsoverleving voor GBM-patiënten minder dan 5%, een statistiek die in meer dan drie decennia niet significant is verbeterd1. Daarom is er behoefte aan effectievere behandelingsstrategieën.
Om nieuwe therapieën te ontwikkelen, wordt het steeds duidelijker dat onderzoeksprotocollen (1) vertaalbare preklinische modellen moeten gebruiken die de tumorheterogeniteit en micro-omgeving nauwkeurig samenvatten, (2) het standaard therapeutische regime weerspiegelen dat wordt gebruikt bij patiënten met GBM, dat momenteel chirurgie, radiotherapie en chemotherapie omvat, en (3) rekening houden met het verschil tussen gereseceerde kern en rest, invasieve tumorweefsels 2,3,4,5. De meeste van de momenteel beschikbare preklinische hersentumormodellen implementeren echter geen chirurgische resectie of gebruiken chirurgische resectiemodellen die relatief tijdrovend zijn, wat leidt tot een aanzienlijke hoeveelheid bloedverlies of geen standaardisatie. Bovendien kan het uitvoeren van resectie van hersentumoren bij knaagdieren een uitdaging zijn vanwege een gebrek aan klinisch vergelijkbare chirurgische hulpmiddelen of protocollen en de afwezigheid van een gevestigd platform6 voor systematische weefselverzameling (tabel 1).
Het huidige protocol heeft tot doel een gestandaardiseerd paradigma te beschrijven voor de resectie en weefselconservering van hersentumoren bij knaagdieren met behulp van een multifunctioneel niet-ablatief minimaal invasief resectiesysteem (MIRS) en een geïntegreerd weefselconserveringssysteem (TPS) (figuur 1). Verwacht wordt dat deze unieke techniek een gestandaardiseerd platform zal bieden dat kan worden gebruikt in verschillende onderzoeken in preklinisch onderzoek voor GBM en andere soorten hersentumormodellen. Onderzoekers die therapeutische of diagnostische modaliteiten voor hersentumoren onderzoeken, kunnen dit protocol implementeren om een gestandaardiseerde resectie in hun studies te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierstudies werden goedgekeurd door de Universiteit van Maryland en de Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 vrouwelijke muizen, 6-8 weken oud, werden gebruikt voor deze studie. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen). Alle bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) voorschriften werden gevolgd, inclusief het gebruik van maskers, handschoenen en jassen.
1. Initiële implantatie van intracraniële tumoren
- Injecteer in de beginfase van het onderzoek elke muis intracranieel met 100.000 cellen (GL261 murine glioom cellijn) gesuspendeerd in 4 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) tot een diepte van 2,5 mm na het eerder gepubliceerde rapport7.
- Kwantificeer het tumorsignaal in elke muis met behulp van het in vivo beeldvormingssysteem8 9 dagen na tumorimplantatie.
OPMERKING: Stratificeer indien nodig de muizen in twee groepen op basis van tumorlast. In deze studie waren de twee groepen: (1) muizen met een relatief kleine tumorlast (gemiddeld bioluminescent signaal = 5,5e+006 ± 0,1e+006 fotonen/s, n = 10) en (2) muizen met een relatief grote tumorlast (gemiddeld bioluminescent signaal = 1,69e+007 ± 0,2e+007 fotonen/s, n = 10), (p < 0,05, Mann-Whitney test)9. - Verdeel elke groep in twee vergelijkbare subgroepen.
OPMERKING: In deze studie waren de twee subgroepen: onbehandelde muizen (n = 5) en muizen met tumoren die chirurgische resectie ondergingen met behulp van de MIRS (n = 5), (p > 0,05, Mann-Whitney-test)9. - Vanaf de dag van de resectie volgt u de tumorprogressie met behulp van het in vivo beeldvormingssysteem met een frequentie op basis van het tumorgroeipatroon.
OPMERKING: Voor de GL261-cellijn volgt u de tumorprogressie op de dag van de resectie en vervolgens om de 3-6 dagen.
2. Tumorresectie met MIRS
- Verdoof de muis met behulp van een isofluraan-O2 gasmengsel in een inductiekamer of intraperitoneale injectie van xylazine/ketamine-oplossing.
- Als u het gasanestheticum gebruikt, stelt u het gasdebiet in op 1,0 ml / min en de verdamper op 2,0% voor anesthesie-inductie, meestal vereist u 3-5 minuten in de kamer (zie materiaaltabel).
- Als u het injecteerbare anestheticum gebruikt, verdoof de muizen dan door 0,2 ml anesthetische oplossing (80-100 mg / kg ketamine en 10-12,5 mg / kg xylazine, zie materiaaltabel) intraperitoneaal te injecteren.
- Beoordeel het dier op voldoende sedatie door in de teen te knijpen. Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Dien een pijnstillend middel (0,03-0,06 mg/kg buprenorfine subcutaan) toe voorafgaand aan de procedure.
- Plaats de muis op het stereotactische frame (zie Materiaaltabel) zodra de volledige sedatie is bevestigd.
OPMERKING: Als u het gasanestheticum gebruikt, plaatst u de neus van de muis in een neuskegel waar deze tijdens de procedure het isofluraan-O2-mengsel blijft ontvangen (1,5%). - Verwijder het vorige nietje en verwijder het haar met een ontharingscrème of door te scheren. Desinfecteer de huid met afwisselende cycli van een scrub op basis van chloorhexidine /betadine en alcohol. Maak vervolgens met behulp van een steriel scalpel een longitudinale middenlijnincisie van 1 cm langs het vorige chirurgische litteken.
- Bevestig het MIRS-handstuk aan de stereotactische arm via de podiumadapter/handstukhouder voor meer stabiliteit en precisie.
- Stel de MIRS-machine in (zie Materiaaltabel) met behulp van de volgende instellingen (figuur 1).
- Steek het netsnoer op het achterpaneel in het netsnoerrecipiënt. Schakel de stroom naar het systeem in of uit door te schakelen (1 = AAN, 0 = UIT).
- Steek het ene uiteinde van de stikstofslang (meegeleverd met de console) in de mannelijke fitting op het achterpaneel van de console. Draai de verbindingsmoer met de klok mee om de verbinding aan te draaien.
OPMERKING: Het andere uiteinde van de slang moet worden aangesloten op de stikstoftoevoer. - Voordat u de slang aan de stikstoftoevoer bevestigt, controleert u of de voedingsdruk niet hoger is dan 100 psig, wat de aanbevolen ingangsvoedingsdruk is voor de console.
OPMERKING: De console genereert zijn eigen aspiratie wanneer deze wordt geactiveerd door het voetpedaal zodra de stikstof aan de console is geleverd. - Bevestig het deksel van de vacuümpoort en sluit deze af om lekkage in het vacuümsysteem te voorkomen. Eventuele lekken in het afzuigsysteem hebben invloed op de prestaties van de MIRS-console.
- Als de aspiratie tijdens het instellen of primen lager is dan 17, controleert u of de aanzuigknop aan de voorkant van de console op het maximale niveau (100) is ingesteld, controleert u of er geen lekkage in het aanzuigsysteem is en controleert u of de toevoerdruk van de stikstofinvoer correct is.
- Om het voetpedaal op de console aan te sluiten, plaatst u de grijze voetpedaalconnector in de grijze houder totdat deze klikt en in positie past.
OPMERKING: De voetpedaalconnector maakt in één richting verbinding met de console en deze is met de toets verbonden. - Om het handstuk op de console aan te sluiten, steekt u de blauwe handstukconnector in de blauwe houder totdat deze klikt en in positie past.
OPMERKING: De handstukconnector maakt in één richting verbinding met de console en deze is ingetoetst. - Primeer elk handstuk voordat u het systeem gebruikt door steriele vloeistof uit een kleine kom in de opening, door de buis en het handstuk en vervolgens in de bus te zuigen om ervoor te zorgen dat de binnenkant van de buis en het handstuk worden gesmeerd om de weefselocclusies te verminderen.
- Bereid je voor op aspiratie alleen of aspiratie met snijden door de juiste modus op het voorpaneel van de console te selecteren. Initieer met het voetpedaal.
- Steek de 23 G MIRS canule in het braamgat tot een diepte van 2,5 mm.
- Start het resectieproces door het voetpedaal in te drukken dat is aangesloten op de canule. Voer één volledige cyclus (360°) of meer resectie uit met behulp van de bedieningsknop in het handstuk.
OPMERKING: Hoe meer cycli worden uitgevoerd, hoe meer volume tumorweefsel wordt gereseceerd. - Zodra het resectieproces is voltooid, trekt u de 23 G MIRS-canule uit het braamgat en gebruikt u 5 ml 1x PBS om de slang door te spoelen en eventuele resterende restresten te verwijderen.
- Verwijder de muis uit het stereotactische frame en sluit de wond met een nietmachine of 4-0 hechtmateriaal (zie Materiaaltabel).
- Plaats de muis op een verwarmingskussen of onder een verwarmend licht tijdens het herstel van de anesthesie voordat u hem terugbrengt naar de kooi.
- Nadat het experiment is voltooid, reinigt u de canule via spoelen. Wissel af met gekoelde media en lucht om al het gereseceerde weefsel terug te "duwen" naar de opvangbus. Verwijder de opvangbus uit het systeem en sluit af met de meegeleverde dop.
- Plaats na het voltooien van stap 2.12 de distale punt van de canule in 3% H2O2 en zuig op 24-25 in Hg om de zuigleiding terug naar de zuigbus te vullen en laat 60-90 s staan. Spoel met steriele media die lucht pulseren en media met tussenpozen.
- Controleer de muizen op neurologische symptomen (abnormale onregelmatige bewegingen of epileptische aanvallen) na de procedure.
- Euthanasie de muizen met ernstige neurologische stoornissen (lethargisch worden, een gaunt uiterlijk hebben, achterovergebogen of onregelmatige bewegingen hebben).
OPMERKING: Voor deze studie werd 200 mg/kg van een in de handel verkrijgbare euthanasie-oplossing (zie Materiaaltabel) gebruikt om elke muis te euthanaseren.
3. Weefselverzameling via TPS
- Dompel het tumormonster onder in een weefselkweekschaal met een RBC-lysismedium (zie Materiaaltabel) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het weefsel dat uit de MIRS in de TPS wordt geoogst, zal voornamelijk in de vorm van enkele cellen zijn, samen met kleine stukjes weefsel. - Plaats een filter van 70 μm (zie Materiaaltabel) op een conische buis van 50 ml en gebruik een zuiger van een spuit van 5 ml om het tumormonster door het filter te laten gaan.
- Gebruik met een transferpipet de RPMI-1640-media om het passeren van cellen en eventuele weefselmassa door het filter te vergemakkelijken.
- Centrifugeer bij 428 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg met een pipet.
- Resuspendeer elk monster in 5 ml bereid RPMI-1640 medium.
- Om de levensvatbaarheid van het weefsel te vergroten, vooral als grote weefselbrokken worden gevisualiseerd bij de eerste indruk, voegt u de vereiste volumes van de enzymcocktail (met DNAse I, collagenase IV, dispase, Papaïne en EDTA, zie Materiaaltabel) toe aan elk monster. Gebruik de vortex om de oplossingen te mengen.
OPMERKING: Stap 3.6 is optioneel. De samenstelling van de enzymcocktail (voor een totaal volume van 5 ml/monster): 300 μL DNAse I graad II, 150 μL Collagenase/Dispase (splits fibronectine, collagenase IV, I en niet-polaire aminozuren), 250 μL papaïne (niet-specifiek protease) en 6 μL 0,5 M EDTA. - Plaats de monsters in een shaker incubator ingesteld op 200 rpm, 37 °C gedurende 20 min.
- Draai na 20 minuten de monsters op 428 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Filtreer enkele cellen door een celzeef van 70 μm en draai af bij 274 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Voer cel levensvatbaarheidsanalyse10 uit met Trypan Blue en Hemocytometer (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De levensvatbaarheid van dag 0 varieert van 30% -70% en neemt binnen 2-3 dagen aanzienlijk toe. - Ga verder met stap 4, 5 of 6, afhankelijk van de benodigde levensvatbaarheidstest.
4. Cellen kweken in aanhangcultuur
- Resuspenseer de pellet in een gecertificeerd laminair stromingskapje in serumbevattend aanhangend medium (zoals DMEM, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S)-oplossing) en plaatcellen in een hechte celkolf.
- Houd de cellen in een gecontroleerde geïncubeerde omgeving (37 °C, 5% CO2).
5. Cellen kweken in suspensiecultuur (neurosferen)
- Resuspenseer de pellet in een gecertificeerde laminaire stromingskap in serumvrij volledig stamcelmedium11 en plaat in een suspensiekolf.
- Houd de cellen gedurende 2-3 dagen in een gecontroleerde geïncubeerde omgeving (37 °C, 5% CO2) om neurosfeervorming mogelijk te maken.
- Na visualisatie van de neurosferen in het kweekmedium, gebruikt u Trypsine-EDTA of Accutase (zie Materiaaltabel) om eencellige suspensies te verkrijgen voor passaging.
OPMERKING: Zolang speciale zorg wordt besteed tijdens de oogst en geschikte media-ondersteunende neurale stamcellen worden gebruikt, moeten de stamcellen in het geoogste weefsel binnen enkele dagen neurosferen vormen.
6. Cellen voorbereiden voor herplanting
- Resuspendeer de pellet in een concentratie van 100.000 levende cellen per 4 μL 1x PBS.
- Injecteer onmiddellijk in naïeve muizen met behulp van de intracraniale tumorimplantatiemethode (stap 1).
7. Histologische analyse
- Onmiddellijk na resectie, extraheer en fixeer de hersenen in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 24 h12.
- Breng de hersenen over naar een 30% sucrose-oplossing totdat ze verzadigd zijn met sucrose (verzonken tot op de bodem van de container).
- Breng de hersenen over naar een 70% ethanoloplossing.
- Voer paraffineblokinbedding, sectie en standaard hematoxyline- en eosinekleuring (H &E) uit na eerder gepubliceerd rapport13.
OPMERKING: De dikte van elke sectie die voor kleuring werd genomen, was 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chirurgische resectie met behulp van de MIRS resulteert in een significante afname van de tumorlast
In de groep met een kleinere tumorlast was het gemiddelde baseline bioluminescente signaal 5,5e+006 fotonen/s ± 0,2e+006 in de subgroep die resectie onderging. Na resectie daalde het gemiddelde bioluminescentiesignaal tot 3,09e+006 fotonen/s ± 0,3e+006, (p <0,0001, Mann-Whitney-test)9 (Figuur 2). Het bioluminescente signaal nam in de volgende dagen toe totdat de muizen werden geëuthanaseerd. Evenzo was in de groep met een grotere tumorlast het gemiddelde baseline bioluminescentiesignaal 1,68e +007 fotonen / s ± 0,1e + 007 in de subgroep die resectie onderging. Na resectie daalde het gemiddelde bioluminescente signaal tot 5,19e+006 fotonen/s ± 0,2e+006, (p <0,0001, Mann-Whitney-test)9. Het bioluminescente signaal nam in de volgende dagen toe totdat de muizen werden geëuthanaseerd.
Resectie met behulp van de MIRS kan worden aangepast voor het gewenste volume resectie
In pre-resectie beeldvorming van syngeneïsche CT2A-tumoren kan de tumor over het algemeen worden geïdentificeerd als een heterogene massa op de inentingsplaats met verstoorde parenchymale architectuur en peritumoraal oedeem en bloeding aangegeven door heterogene gebieden van T2-gewogen (T2w) hypo- en hyperintensiteit. De naaldspoor die wordt gebruikt voor stereotactische tumorcelinjectie kan worden geïdentificeerd op T2w MRI-scans14.
De resectieholte kan op post-resectie T2w MRI-scans worden geïdentificeerd als een groot rond hypointense-gebied op de tumorinentingsplaats (figuur 3). De resectieprocedure veroorzaakte geen significant bloedverlies of verstoring van de omliggende hersenarchitectuur. In sommige gevallen hoopte zich vocht op in de resectieholte. Zoals te zien is in figuur 4, nam het resectievolume aanzienlijk toe van 9,4 mm3 voor één rotatie van de snijopening tot 23,2 mm3 voor twee rotaties (p = 0,0117), waardoor volumeresectie kon worden aangepast om te optimaliseren voor een bekende tumorbelasting.
Tumorresectie met behulp van de MIRS leidt tot een verlenging van 7 dagen in de mediane overleving van tumordragende muizen zonder neurologische symptomen te veroorzaken
Zoals te zien is in figuur 5, was er een verlenging in de overleving van muizen die chirurgische resectie ondergingen in beide groepen met kleine (6 dagen) en grote (7 dagen) tumoren. In de groep met een kleinere tumorlast was de mediane overleving van de controlesubgroep 16 dagen, terwijl de mediane overleving van de subgroep die resectie onderging 22 dagen was (p = 0,0044). Evenzo was in de groep met een grotere tumorlast de mediane overleving van de controlesubgroep 12 dagen, terwijl de mediane overleving van de subgroep die resectie onderging 19 dagen was (p = 0,0043). Bovendien vertoonde geen van de muizen die resectie ondergingen met behulp van de MIRS enig teken van neurologisch letsel na de procedure. Dit geeft aan dat het MIRS een veilige resectie kan bereiken.
Het gereseceerde weefsel met behulp van de MIRS heeft een hoge in vitro en in vivo levensvatbaarheid
Cellen geëxtraheerd uit het gereseceerde weefsel werden gefilterd, gekwantificeerd en geresuspendeerd in het juiste medium (figuur 6) voordat in vitro of in vivo levensvatbaarheidsexperimenten werden uitgevoerd. Om de in vitro levensvatbaarheid van de cellen te onderzoeken en de resectie van de tumor te bevestigen en niet van normaal hersenparenchym, werden cellen gekweekt in suspensiecultuur. Neurosfeervorming, een indicator voor tumorinitiatiepotentieel, trad op met minimale weefselverwerking na resectie. Dit suggereerde dat het MIRS-platform goed gedissocieerd weefsel oogstte en een minimale impact had op de gezondheid en levensvatbaarheid van het gereseceerde weefsel. Monsters die rechtstreeks van de TPS naar lichtmicroscopie werden genomen, bleken voornamelijk in de vorm van enkele cellen te zijn, samen met de aanwezigheid van een paar kleine stukjes weefsel. De levensvatbaarheid van dag 0 varieerde van 30% -70% (dit vertegenwoordigt de levensvatbaarheid na het passeren van het monster door een filter van 70 μm en vóór het plateren). Het resectieapparaat heeft een snijopening die 360° op de as van de resectiesonde kan draaien, waardoor de resectie van concentrische weefselvolumes mogelijk is. Gemiddeld kunnen 2-3 miljoen cellen worden geoogst met één draai van 360 ° van de snijopening, ongeveer 7 miljoen cellen met twee draaien en een totaal van 12-14 miljoen cellen kunnen worden verkregen met drie 360 ° -draaiingen van de snijopening. Na beplating in suspenkolven met serumvrij volledig stamcelmedium waren neurosferen zichtbaar door lichtmicroscopie op dag 2 en met het blote oog op dag 7 (figuur 7).
Om de in vivo levensvatbaarheid te onderzoeken, werden geëxtraheerde cellen intracranieel geïmplanteerd in naïeve C57BL/6-muizen (n = 8 muizen, 100.000 levende cellen/muizen). Tumorgroei werd bevestigd met behulp van het in vivo beeldvormingssysteem. Het tumorsignaal bleef toenemen totdat alle dieren werden geëuthanaseerd op dag 14 na de implantatie van de tumor (mediane overleving van 11 dagen).
De representatieve H&E-weefselsectie (figuur 3B) bevat een heldere, cirkelvormige resectieholte met een rand van bloedproducten (dieproze), ontstekings- en resterende tumorcellen (donkerpaarse cellen). Macroscopisch gezien zijn de resterende tumorcellen mesenchymaal van aard en infiltratief, met uitgebreide perivasculaire invasie en proliferatie. Microscopisch werden gemarkeerde nucleaire atypie en mitotische figuren geïdentificeerd. Tumor-geassocieerde macrofagen werden ook geïdentificeerd rond gebieden van infarctweefsel en microhemorrhages. Weefselarchitectuur in het omringende hersenparenchym bleek niet verstoord.
Figuur 1: MIRS-systeemopstelling. (A) Minimaal invasief resectiesysteem (MIRS) voor hersentumor in knaagdiermodellen met een geïntegreerd weefselconserveringssysteem. (B) Voorpaneel van MIRS console. 1 = Systeemvermogen, 2 = Voetpedaal, 3 = Prime-knop, 4 = Aspiratie, 5 = Aspiratieniveaubedieningsknop, 6 = Aspiratieniveau-indicator, 7 = Handstuk, 8 = Knop voor het inschakelen van de cutter. (C) Achterpaneel van mirs console. 1 = Netsnoerhouder, 2 = Stroomonderbreker, 3 = Stikstoftoevoeringang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Veranderingen in de gemiddelde tumorlast bij muizen met onbehandelde tumoren versus muizen die resectie van tumoren ondergaan door MIRS. (A) Muizen met een kleine baseline tumorlast en (B) muizen met een grote baseline tumorlast (p < 0,0001, SD ≤0,3e+006 in alle groepen op elk tijdstip en te klein om op grafiek te worden weergegeven). Dieren bezweken aan tumorbelasting of werden geëuthanaseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: MRI en H&E analyse. (A) Pre- en post-resectie T2-gewogen MRI-beelden van de hersenen en (B) een representatieve H&E-gekleurde coronale hersensectie met een heldere, cirkelvormige resectieholte met een rand van bloedproducten (dieproze), ontsteking en resterende tumorcellen (donkerpaarse cellen). MRI-beelden en H&E-secties werden onmiddellijk na resectie verkregen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bepaling van het tumorresectievolume. De gemiddelde volumes berekend op basis van MRI-beelden van resectieholtes gemaakt met één vs. twee rotaties van de snijopening, n = 4 per groep. p = 0,01, tweezijdige T-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kaplan-Meier-curven van muizen met onbehandelde tumoren versus muizen die resectie van tumoren ondergaan door MIRS. (A) Muizen met een kleine basistumorlast. (B) Muizen met een grote basistumorlast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Levensvatbaarheidstest van de gereseceerde tumorcellen. (A) Representatieve lichtmicroscopiebeelden van weefsel geoogst met MIRS op dag 0 bij 20x. (B) Kaplan-Meier-curve die de overleving van muizen beschrijft na intracraniële implantatie van cellen geoogst uit gereseceerd weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Vorming van neurosferen. Representatieve lichtmicroscopiebeelden van neurosferen gegenereerd uit gereseceerd weefsel op dag 2 na resectie bij (A) 20x en (B) 10x, en op dag 7 post-resectie bij (C) 20x en (D) 10x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Minimaal invasief resectiesysteem | Historische resectie | |||
| Operationele tijd en vaardigheden | Minimale operatietijd (<2 min voor elk dier). Minimale vaardigheden nodig. | Chirurgische tijd is niet gestandaardiseerd en chirurgische ervaring met kleine dieren en microchirurgie is gunstig. | ||
| Bloedverlies | Minimaal | Onvoorspelbaar | ||
| Gestandaardiseerd resectievolume | Resectievolume bepaald/aangepast aan het aantal rotaties van het resectiegereedschap | Volume varieert sterk tussen onderwerpen | ||
Tabel 1: Vergelijking tussen het minimaal invasieve resectiesysteem (MIRS) en historische chirurgische resectiemodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumorresectie is een hoeksteen van neurochirurgische oncologische behandelplannen voor zowel laaggradige als hooggradige hersentumoren. Cytoreductie en debulking van de tumor correleren met verbeterde neurologische functie en algehele overleving bij patiënten met hersentumoren 1,2,5,6. Hoewel protocollen voor chirurgische resectie eerder zijn beschreven in knaagdiermodellen, hebben deze protocollen geleden aan verschillende beperkingen die de gegenereerde resultaten en de algehele vertaalbaarheid van het preklinische model kunnen verstoren. Eerder gerapporteerde chirurgische resectieprotocollen omvatten bijvoorbeeld een craniotomie met 3-4 kleine braamgaten om een botflap te creëren en vervolgens vakkundig onderscheid en differentiatie van de kleuring en consistentie van de tumor in vergelijking met normaal hersenweefsel6. Deze protocollen zijn tijdrovend en vereisen dat het onderzoekspersoneel geavanceerde vaardigheden heeft in het gebruik van de chirurgische microscoop, het hanteren van chirurgische instrumenten, het identificeren van de tumorgrenzen met betrekking tot het omliggende normale hersenweefsel en het bereiken van adequate homeostase. Dergelijke procedures leiden vaak tot aanzienlijk bloedverlies en dierensterfte. Bovendien kan het een uitdaging zijn om gestandaardiseerde resectie te bereiken met vergelijkbare volumes tumorweefsel gereseceerd over verschillende dieren in hetzelfde experiment. Deze continuïteit en uniformiteit wordt uitdagender met meerdere medewerkers die de procedure uitvoeren.
Het hier beschreven MIRS-protocol daarentegen verwijdert deze beperkingen (tabel 1). Het huidige protocol vereist een minimaal invasieve aanpak door hetzelfde braamgat dat wordt gebruikt voor de initiële tumorimplantatie. Zoals beschreven in de protocolsectie, kan de resectietool worden geïnstalleerd op een stereotactisch frame dat het mogelijk maakt om de canule nauwkeurig in de tumorholte in te brengen. De snelheid van het mes en het aantal uitgevoerde resectiecycli kunnen eenvoudig worden aangepast via een handstuk dat door het onderzoekspersoneel wordt gebruikt om het volume van de tumor gereseceerd op een gestandaardiseerde manier te regelen zonder een aanzienlijke hoeveelheid bloedverlies te veroorzaken.
Zoals opgemerkt in de resultaten, vertoonden de muizen die resectie ondergingen met het MIRS-apparaat een verlengde overleving in vergelijking met het cohort muizen met niet-gereseceerde tumoren. Dit, samen met de gegevens, toont aan dat de tumorlast aanzienlijk was verminderd in de gereseceerde groep in vergelijking met de niet-gereseceerde controlegroep, wat aangeeft dat het MIRS-apparaat de tumor effectief debult met minimale verstoring van omliggende gezonde hersenweefsels. Verder vorderde in de dagen na resectie de tumorlast gestaag door de aanwezigheid van een resterende tumor en de infiltratieve aard van de CT-2A tumorcellijn. Het MIRS-model kan dus het debulkingproces van infiltratieve tumortypen repliceren, dat kan worden gevolgd met chemotherapeutica of bestralingstherapie om het behandelingsregime in de behandelingsprotocollen voor menselijke hersentumoren beter te weerspiegelen 15,16,17.
Zoals het geval is met elk zuigapparaat, kan verstopping van de aspiratiebuis een van de beperkingen van het MIRS-systeem zijn. Dit kan optreden als gevolg van de ophoping van droog weefsel of bloed tijdens of na het gebruik van de machine. Om dit te voorkomen, wordt onmiddellijk aan het einde van elke sessie van resecties het reinigen van de draagcanule aanbevolen door te spoelen met gekoelde media afgewisseld met lucht om al het gereseceerde weefsel naar de opvangbus te "duwen", gevolgd door spoelen met 3% H2O2. Dit vangt al het weefsel op dat tijdens de resectie is verkregen en zorgt ervoor dat er geen in de canule of slang achterblijft. Bovendien, als het systeem niet aspirateert / snijdt, kan dit zijn omdat het handstuk niet is aangesloten, de resectie canule cutter niet is ingeschakeld, de aspiratielijn van de console niet is aangesloten op de bus, het deksel van de bus niet strak is of het voetpedaal niet is aangesloten.
Bovendien, terwijl we hebben aangetoond dat de MIRS kan worden gebruikt voor effectieve en gestandaardiseerde resectie met hoge in vitro en in vivo levensvatbaarheid van het gereseceerde weefsel, worden toekomstige studies aangemoedigd om andere facetten van het implementeren van dergelijke systemen in hersentumoronderzoek verder te onderzoeken. Deze omvatten het onderzoeken van de impact van het resectieproces op de moleculaire en cellulaire componenten van de tumormassa en de micro-omgeving van de tumor. Bovendien zijn studies nodig om te bevestigen dat het gereseceerde weefsel met behulp van het MIRS-apparaat de ouderlijke tumor recapituuleert15.
Concluderend wordt een protocol van een minimaal invasieve aanpak beschreven voor gestandaardiseerde chirurgische resectie in een knaagdierhersentumormodel dat is gekoppeld aan een geïntegreerd en geautomatiseerd weefselconserveringssysteem. Dit protocol effent het pad naar het opzetten van zeer translationele en voorspellende preklinische hersentumoronderzoeksmodellen. Toekomstige toepassingen van dit protocol kunnen mogelijk preklinische studies omvatten die verschillende therapeutische of diagnostische modaliteiten voor hersentumoren onderzoeken die dit protocol kunnen implementeren om een gestandaardiseerde resectie te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BT heeft onderzoeksfinanciering van NIH en is mede-eigenaar van Accelerating Combination Therapies*, en Ashvattha Therapeutics Inc. heeft een van haar patenten in licentie gegeven. GW heeft NIH-financiering (R01NS107813). HB is een betaalde consultant van Insightec en voorzitter van de Medische Adviesraad van het bedrijf. Deze regeling is herzien en goedgekeurd door de Johns Hopkins University in het kader van haar beleid inzake belangenconflicten. HB heeft onderzoeksfinanciering van NIH, Johns Hopkins University en filantropie en is consultant voor CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* en Nurami Medical*. (*inclusief aandelen of opties).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
| 200 proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | CoStar | 4487 | |
| 70 micron filter | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| Anesthesia System | Patterson Scientific | 78935903 | |
| Anesthesic Gas Waste Container | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Bench protector underpad | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6, 6-8 week old mice | Charles River Laboratories | Strain Code 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 media | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM media | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Euthanasia solution | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| Formalin | Invitrogen | INV-28906 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| Induction Chamber | Patterson Scientific | 78933388 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Isoflurane Vaporizer | Patterson Scientific | 78916954 | |
| Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield Microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Microinjection Unit | Kopf | 5001 | |
| Micromotor drill | Foredom | F210418 | |
| MRI system | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI Scanner | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| Progesterone | Sigma | P-8783 | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic Frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Suture, vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 culture flask | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
References
- Mineo, J. F., et al. Prognosis factors of survival time in patients with glioblastoma multiforme: a multivariate analysis of 340 patients. Acta Neurochirurgica. 149 (3), 245-252 (2007).
- Miyai, M., et al. Current trends in mouse models of glioblastoma. Journal of Neuro-Oncology. 135 (3), 423-432 (2017).
- Raj, D., Agrawal, P., Gaitsch, H., Wicks, E., Tyler, B. Pharmacological strategies for improving the prognosis of glioblastoma. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 22 (15), 2019-2031 (2021).
- Alomari, S., et al. Drug repurposing for Glioblastoma and current advances in drug delivery-a comprehensive review of the literature. Biomolecules. 11 (12), 1870 (2021).
- Serra, R., et al. Combined intracranial Acriflavine, temozolomide and radiation extends survival in a rat glioma model. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics : Official Journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 170, 179-186 (2022).
- Tang, B., Foss, K., Lichtor, T., Phillips, H., Roy, E.
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Lachin, J. M.
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods in Molecular Biology. 740, 7-12 (2011).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of Glioblastoma stem cells. Journal of Visualized Experiments. (131), e56176 (2018).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 2: Volumetric strain fields and local contrast changes. Journal of Neuroscience Methods. 365, 109385 (2022).
- Connolly, N. P., et al. Elevated fibroblast growth factor-inducible 14 expression transforms proneural-like gliomas into more aggressive and lethal brain cancer. GLIA. 69 (9), 2199-2214 (2021).
- Stall, B., et al. Comparison of T2 and FLAIR imaging for target delineation in high grade gliomas. Radiation Oncology. 5, 5 (2010).
- Das, A., et al. Establishing a standardized method for the effective intraoperative collection and biological preservation of brain tumor tissue samples using a novel tissue preservation system: a pilot study. World Neurosurgery. , (2022).
- Zusman, E., et al. Tissues harvested using an automated surgical approach confirm molecular heterogeneity of Glioblastoma and enhance specimen's translational research value. Frontiers in Oncology. 9, (2019).
- McLaughlin, N., et al. Side-cutting aspiration device for endoscopic and microscopic tumor removal. Journal of Neurological Surgery Part B. 73 (1), 11-20 (2012).
