Summary
O presente protocolo descreve uma ressecção padronizada de tumores cerebrais em roedores através de uma abordagem minimamente invasiva com um sistema integrado de preservação de tecidos. Esta técnica tem implicações para espelhar com precisão o padrão de cuidado em roedores e outros modelos animais.
Abstract
O presente protocolo descreve um paradigma padronizado para ressecção do tumor cerebral de roedores e preservação de tecidos. Na prática clínica, a ressecção máxima do tumor é o tratamento padrão de cuidados para a maioria dos tumores cerebrais. No entanto, os modelos de tumor cerebral pré-clínicos mais disponíveis atualmente não incluem ressecção, ou utilizam modelos de ressecção cirúrgica que consomem tempo e levam a morbidade, mortalidade ou variabilidade experimental significativas pós-operatórias. Além disso, a realização da ressecção em roedores pode ser assustadora por várias razões, incluindo a falta de ferramentas cirúrgicas ou protocolos clinicamente comparáveis e a ausência de uma plataforma estabelecida para coleta padronizada de tecidos. Este protocolo destaca o uso de um dispositivo de ressecção multifuncional e não ablativo e um sistema integrado de preservação de tecidos adaptado da versão clínica do dispositivo. O dispositivo aplicado no presente estudo combina sucção tífica e uma lâmina cilíndrica na abertura para precisamente sondar, cortar e tecido de sucção. O dispositivo de ressecção minimamente invasivo executa suas funções através do mesmo orifício de rebarba usado para a implantação inicial do tumor. Essa abordagem minimiza alterações na anatomia regional durante cirurgias de biópsia ou ressecção e reduz o risco de perda significativa de sangue. Esses fatores reduziram significativamente o tempo de operação (<2 min/animal), melhoraram a sobrevivência animal pós-operatória, reduziram a variabilidade em grupos experimentais e resultaram em alta viabilidade de tecidos e células ressecadas para análises futuras. Este processo é facilitado por uma velocidade da lâmina de ~1.400 ciclos/min, o que permite a colheita de tecidos em um sistema fechado estéril que pode ser preenchido com uma solução fisiológica de escolha. Dada a importância emergente de estudar e modelar com precisão o impacto da cirurgia, preservação e rigorosa análise comparativa de amostras de ressecção de tumores regionalizadas e terapêuticas fornecidas por intra-cavidade, este protocolo único ampliará as oportunidades de explorar questões sem resposta sobre o manejo perioperatório e a descoberta terapêutica para pacientes com tumor cerebral.
Introduction
Glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e agressivo em adultos. Apesar dos recentes avanços na neurocirurgia, no desenvolvimento de medicamentos direcionados e na radioterapia, a taxa de sobrevivência de 5 anos para pacientes com GBM é inferior a 5%, uma estatística que não melhorou significativamente em mais de três décadas1. Por isso, há necessidade de estratégias de tratamento mais eficazes.
Para desenvolver novas terapias, torna-se cada vez mais evidente que os protocolos de investigação precisam (1) utilizar modelos preclínicos traduzíveis que recapitulem com precisão a heterogeneidade e microambiente tumoral, (2) espelham o regime terapêutico padrão utilizado em pacientes com GBM, que atualmente inclui cirurgia, radioterapia e quimioterapia, e (3) explicam a diferença entre núcleo ressecado e residual, que atualmente inclui cirurgia, radioterapia e quimioterapia, e (3) explicam a diferença entre núcleo ressecado e residual, residual, tecidos tumorais invasivos 2,3,4,5. No entanto, a maioria dos modelos de tumor cerebral pré-clínicos atualmente disponíveis não implementam ressecção cirúrgica ou utilizam modelos de ressecção cirúrgica que são relativamente demorados, levando a uma quantidade significativa de perda de sangue ou falta de padronização. Além disso, a realização da ressecção de tumores cerebrais de roedores pode ser desafiadora devido à falta de ferramentas ou protocolos cirúrgicos clinicamente comparáveis e à ausência de uma plataformaestabelecida 6 para coleta sistemática de tecidos (Tabela 1).
O presente protocolo visa descrever um paradigma padronizado para ressecção do tumor cerebral de roedores e preservação do tecido utilizando um sistema de ressecção minimamente invasivo não ablativo multifuncional (MIRS) e um sistema integrado de preservação de tecidos (TPS) (Figura 1). Espera-se que essa técnica única forneça uma plataforma padronizada que possa ser utilizada em diversos estudos em pesquisas pré-científicas para GBM e outros tipos de modelos de tumor cerebral. Pesquisadores que investigam modalidades terapêuticas ou diagnósticas para tumores cerebrais podem implementar esse protocolo para alcançar uma ressecção padronizada em seus estudos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os estudos em animais foram aprovados pela Universidade de Maryland e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins. Foram utilizados para o presente estudo camundongos C57BL/6, de 6 a 8 semanas de idade. Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Todos os regulamentos de Biossegurança Nível 2 (BSL-2) foram seguidos, incluindo o uso de máscaras, luvas e vestidos.
1. Implantação inicial de tumor intracraniano
- Na fase inicial do estudo, intracranianamente injete cada rato com 100.000 células (gl261 linha de células glioma murine) suspensas em 4 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato (1x PBS) a uma profundidade de 2,5 mm após o relatório publicado anteriormente7.
- Quantifique o sinal tumoral em cada camundongo usando o sistema de imagem in vivo 8 9 dias após a implantação do tumor.
NOTA: Se necessário, estratifique os camundongos em dois grupos com base na carga tumoral. No presente estudo, os dois grupos foram: (1) camundongos com carga tumoral relativamente pequena (sinal bioluminescente médio = 5,5e+006 ± 0,1e+006 fótons/s, n = 10) e (2) camundongos com carga tumoral relativamente grande (sinal bioluminescente médio = 1,69e+007 ± 0,2e+007 fótons/s, n = 10), (p < 0,05, teste de Mann-Whitney)9. - Divida cada grupo em dois subgrupos comparáveis.
NOTA: Neste estudo, os dois subgrupos foram: camundongos não tratados (n = 5) e camundongos com tumores submetidos à ressecção cirúrgica utilizando o MIRS (n = 5), (p > 0,05, teste de Mann-Whitney)9. - A partir do dia da ressecção, acompanhe a progressão do tumor utilizando o sistema de imagem in vivo em uma frequência baseada no padrão de crescimento do tumor.
NOTA: Para a linha celular GL261, acompanhe a progressão do tumor no dia da ressecção e, em seguida, a cada 3-6 dias.
2. Ressecção tumoral usando MIRS
- Anestesiar o camundongo usando uma mistura de gás isoflurano-O2 em uma câmara de indução ou injeção intraperitoneal de solução de xilazina/cetamina.
- Se usar o anestésico a gás, defina a vazão do gás para 1,0 mL/min e o vaporizador para 2,0% para indução de anestesia, normalmente exigindo 3-5 min na câmara (ver Tabela de Materiais).
- Se usar o anestésico injetável, anestesia os camundongos injetando 0,2 mL de solução anestésico (80-100 mg/kg de cetamina e 10-12,5 mg/kg de xilazina, ver Tabela de Materiais) intraperitonetalmente.
- Avalie o animal para sedação adequada, beliscando o dedo do dedo do sol. Aplique pomada oftalmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea. Administrar um analgésico (0,03-0,06 mg/kg buprenorfina subcutânea) antes do procedimento.
- Coloque o mouse sobre o quadro estereotático (ver Tabela de Materiais) uma vez confirmada a sedação completa.
NOTA: Se usar o anestésico gasoso, coloque o nariz do camundongo em um cone de nariz onde ele continuará a receber a mistura isoflurane-O2 durante o procedimento (1,5%). - Retire o grampo anterior e remova o cabelo com um creme depilatório ou raspando. Desinfete a pele com ciclos alternados de um esfoliante à base de clorexidina/betadina e álcool. Em seguida, usando um bisturi estéril, crie uma incisão longitudinal de 1 cm ao longo da cicatriz cirúrgica anterior.
- Conecte a peça de mão MIRS ao braço estereotático através do suporte do adaptador/peça de mão para maior estabilidade e precisão.
- Configure a máquina MIRS (ver Tabela de Materiais) usando as seguintes configurações (Figura 1).
- Insira o conjunto do cabo de alimentação no painel traseiro no recipiente do cabo de alimentação. Ligue ou desligue a energia do sistema por toggling (1 = ON, 0 = OFF).
- Insira uma extremidade da mangueira de nitrogênio (fornecida com o console) no encaixe masculino no painel traseiro do console. Gire a porca de conexão no sentido horário para apertar a conexão.
NOTA: A extremidade oposta da mangueira precisa ser conectada ao suprimento de nitrogênio. - Antes de fixar a mangueira à fonte de nitrogênio, confirme que a pressão de alimentação não excede 100 psig, que é a pressão de alimentação recomendada para o console.
NOTA: O console gerará sua própria aspiração quando ativado pelo pedal do pé uma vez que o nitrogênio tenha sido fornecido ao console. - Fixar a tampa da porta de vácuo e selá-la para evitar qualquer vazamento no sistema de vácuo. Qualquer vazamento no sistema de aspiração afetará o desempenho do console MIRS.
- Se a aspiração estiver abaixo de 17 durante a configuração ou escoramento, verifique se o botão de aspiração na parte frontal do console está definido no nível máximo (100), certifique-se de que não há vazamento no sistema de aspiração e confirme se a pressão de fornecimento de entrada de nitrogênio está correta.
- Para conectar o pedal do pé ao console, insira o conector do pedal do pé cinza em seu recipiente cinza até que ele clique e se encaixe na posição.
NOTA: O conector do pedal do pé se conecta ao console em uma orientação, e ele é chaveado. - Para conectar a peça de mão ao console, insira o conector azul da peça de mão em seu recipiente azul até que ele clique e se encaixe na posição.
NOTA: O conector da peça de mão se conecta ao console em uma orientação, e é digitado. - Prime cada peça de mão antes de usar o sistema aspirando fluido estéril de uma tigela pequena para a abertura, através da tubulação e peça de mão, e, em seguida, para o recipiente para garantir que o interior da tubulação e peça de mão são lubrificados para reduzir as oclusãos teciduais.
- Prepare-se para aspiração sozinho ou aspiração com corte selecionando o modo apropriado no painel frontal do console. Inicie usando o pedal do pé.
- Insira a cânula MIRS de 23 G no orifício da rebarba a uma profundidade de 2,5 mm.
- Inicie o processo de ressecção deprimindo o pedal do pé conectado à cânula. Realize um ciclo completo (360°) ou mais de ressecção usando o botão de controle na peça de mão.
NOTA: Quanto mais ciclos realizados, maior o volume de tecido tumoral ressecado. - Uma vez que o processo de ressecção esteja concluído, retire a cânula MIRS de 23 G do orifício da rebarba e use 5 mL de PBS 1x para lavar a tubulação e desalojar quaisquer detritos residuais.
- Remova o mouse da estrutura estereotática e feche a ferida com um grampeador ou material de sutura 4-0 (ver Tabela de Materiais).
- Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento ou sob uma luz de aquecimento durante a recuperação da anestesia antes de devolvê-lo à sua gaiola.
- Depois que o experimento estiver completo, purgue a cânula através da descarga. Alternar com mídia gelada e ar para "empurrar" todo o tecido ressecado de volta para o recipiente de coleta. Remova o recipiente de coleta do sistema e retire-o com a tampa fornecida.
- Após completar a etapa 2.12, coloque a ponta distal da cânula em 3% H2O2 e aplique sucção em 24-25 em Hg para preencher a linha de sucção de volta ao recipiente de coleta de sucção e deixe ficar para 60-90 s. Lave com mídia estéril pulsando ar e mídia intermitentemente.
- Monitore os camundongos para obter sinais neurológicos (movimentos erráticos anormais ou convulsões) após o procedimento.
- Eutanize os camundongos com graves prejuízos neurológicos (torne-se letárgico, tenha uma aparência magro, curvado para trás ou tenha movimentos erráticos).
NOTA: Para o presente estudo, foram utilizados 200 mg/kg de uma solução de eutanásia comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) para eutanásia de cada rato.
3. Coleta de tecidos via TPS
- Mergulhe a amostra de tumor em um prato de cultura tecidual contendo um meio de lise RBC (ver Tabela de Materiais) por 5 min a temperatura ambiente.
NOTA: O tecido colhido do MIRS no TPS será principalmente na forma de células únicas, juntamente com pequenos pedaços de tecido. - Coloque um filtro de 70 μm (ver Tabela de Materiais) em um tubo cônico de 50 mL e use um êmbolo de uma seringa de 5 mL para passar a amostra do tumor através do filtro.
- Com uma pipeta de transferência, use a mídia RPMI-1640 para facilitar a passagem de células e qualquer massa tecidual através do filtro.
- Centrifugar a 428 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante por uma pipeta.
- Resuspend cada amostra em 5 mL de meio RPMI-1640 preparado.
- Para aumentar a viabilidade tecidual, especialmente se grandes pedaços de tecido forem visualizados na impressão inicial, adicione os volumes necessários do coquetel enzimático (contendo DNAse I, colagenase IV, dispase, Papain e EDTA, consulte Tabela de Materiais) a cada amostra. Use o vórtice para misturar as soluções.
NOTA: O passo 3.6 é opcional. A composição do coquetel enzimánico (para um volume total de 5 mL/amostra): 300 μL de DNAse I Grau II, 150 μL de Colagenase/Dispase (cleaves fibronectin, colagenase IV, I e aminoácidos não poluar), 250 μL de Papain (protease não específica) e 6 μL de 0,5 M EDTA. - Coloque as amostras em uma incubadora de shaker situada a 200 rpm, 37 °C por 20 min.
- Após 20 min, gire as amostras a 428 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Filtre células únicas através de um coador de células de 70 μm e gire a 274 x g por 3 min a 4 °C. Realizar análise de viabilidadecelular 10 com Trypan Blue e Hemocytómetro (ver Tabela de Materiais).
NOTA: A viabilidade do dia 0 varia de 30%a 70% e aumenta significativamente dentro de 2-3 dias. - Prossiga para as etapas 4, 5 ou 6, dependendo do teste de viabilidade necessário.
4. Células em crescimento na cultura aderente
- Em uma capa de fluxo laminar certificada, resuspenque a pelota em meio aderente contendo soro (como DMEM, 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/streptomicina (P/S) e células de placa em um frasco de células aderentes.
- Manter as células em ambiente controlado incubado (37 °C, 5% DE CO2).
5. Células em crescimento na cultura de suspensão (neurosferas)
- Em uma capa de fluxo laminar certificada, resuspenque a pelota em célula-tronco completa sem soromeio 11 e placa em um frasco de suspensão.
- Manter as células em um ambiente controlado incubado (37 °C, 5% CO2) por 2-3 dias para permitir a formação da neurosfera.
- Após a visualização das neurosferas no meio de cultura, use Trypsin-EDTA ou Accutase (ver Tabela de Materiais) para obter suspensões unicelulares para a passagem.
NOTA: Enquanto os cuidados especiais são tomados durante a colheita e a mídia apropriada que suporta células-tronco neurais é usada, as células-tronco no tecido colhido devem formar neurosferas dentro de alguns dias.
6. Preparando células para reimplantação
- Resuspend a pelota a uma concentração de 100.000 células vivas por 4 μL de 1x PBS.
- Injete imediatamente em camundongos ingênuos usando o método de implantação do tumor intracraniano (passo 1).
7. Análise histológica
- Imediatamente após a ressecção, extraia e fixa os cérebros em 4% de paraformaldeído (PFA) por 24h12.
- Transfira os cérebros para uma solução de 30% de sacarose até que estejam saturados com sacarose (afundado até o fundo do recipiente).
- Transfira os cérebros para uma solução de 70% de etanol.
- Realize a incorporação de blocos de parafina, secção e hematoxilina padrão e eosina (H&E) após o relatório publicado anteriormente13.
NOTA: A espessura de cada seção tomada para coloração foi de 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A ressecção cirúrgica utilizando o MIRS resulta em uma diminuição significativa da carga tumoral
No grupo com menor carga tumoral, o sinal bioluminescente médio da linha de base foi de 5,5e+006 fótons/s ± 0,2e+006 no subgrupo submetido à ressecção. Após a ressecção, o sinal bioluminescente médio diminuiu para 3,09e+006 fótons/s ± 0,3e+006, (p <0.0001, teste de Mann-Whitney)9 (Figura 2). O sinal bioluminescente aumentou nos dias seguintes até que os camundongos foram eutanizados. Da mesma forma, no grupo com maior carga tumoral, o sinal bioluminescente médio da linha de base foi de 1,68e+007 fótons/s ± 0,1e+007 no subgrupo que passou por ressecção. Após a ressecção, o sinal bioluminescente médio diminuiu para 5,19e+006 fótons/s ± 0,2e+006, (p <0.0001, teste de Mann-Whitney)9. O sinal bioluminescente aumentou nos dias seguintes até que os camundongos foram eutanizados.
A ressecção usando o MIRS pode ser ajustada para o volume desejado de ressecção
Na imagem pré-secção de tumores ct2A síndicos, o tumor pode ser geralmente identificado como uma massa heterogênea no local de inoculação com arquitetura parenchymal interrompida e edema peritumoral e hemorragia indicada por áreas heterogêneas de hipo-e-intensidade t2w (T2w). A pista da agulha usada para injeção de células tumorais estereotáticas pode ser identificada em ressonâncias magnéticas T2w14.
A cavidade de ressecção pode ser identificada em ressonâncias magnéticas t2w pós-ressecção como uma grande área de hipointense redondo no local da inoculação do tumor (Figura 3). O procedimento de ressecção não causou perda significativa de sangue ou interrupção da arquitetura cerebral circundante. Em alguns casos, o fluido acumulado na cavidade de ressecção. Como mostrado na Figura 4, o volume de ressecção aumentou significativamente de 9,4 mm3 para uma rotação da abertura de corte para 23,2 mm3 para duas rotações (p = 0,0117), permitindo ajuste da ressecção de volume para otimizar para uma carga tumoral conhecida.
A ressecção tumoral usando o MIRS leva a um prolongamento de 7 dias na sobrevida mediana de camundongos portadores de tumores sem induzir quaisquer sinais neurológicos
Como mostrado na Figura 5, houve um prolongamento na sobrevivência de camundongos submetidos à ressecção cirúrgica em ambos os grupos com tumores pequenos (6 dias) e grandes (7 dias). No grupo com menor carga tumoral, a sobrevida mediana do subgrupo controle foi de 16 dias, enquanto a sobrevida mediana do subgrupo submetido à ressecção foi de 22 dias (p = 0,0044). Da mesma forma, no grupo com maior carga tumoral, a sobrevida mediana do subgrupo controle foi de 12 dias, enquanto a sobrevida mediana do subgrupo submetido à ressecção foi de 19 dias (p = 0,0043). Além disso, nenhum dos camundongos submetidos à ressecção usando o MIRS mostrou qualquer sinal de lesão neurológica após o procedimento. Isso indica que o MIRS pode obter uma ressecção segura.
O tecido ressecado que utiliza o MIRS tem alta viabilidade in vitro e in vivo
As células extraídas do tecido ressecado foram filtradas, quantificadas e resuspensadas no meio apropriado (Figura 6) antes de realizar experimentos de viabilidade in vitro ou in vivo . Para examinar a viabilidade in vitro das células e confirmar a ressecção do tumor e não o parenchyma cerebral normal, as células foram cultivadas na cultura de suspensão. A formação da neurosfera, um indicador para o potencial de iniciação tumoral, ocorreu com o processamento mínimo de tecidos pós-ressecção. Isso sugere que a plataforma MIRS colheu tecido bem dissociado e teve impacto mínimo na saúde e viabilidade do tecido ressecado. Amostras colhidas diretamente do TPS para microscopia leve pareciam ser principalmente na forma de células únicas, juntamente com a presença de alguns pequenos pedaços de tecido. A viabilidade do dia 0 variou de 30%a 70% (isso representa a viabilidade depois de passar a amostra através de um filtro de 70 μm e antes do revestimento). O dispositivo de ressecção possui uma abertura de corte que pode girar 360° no eixo da sonda de ressecção, permitindo a ressecção de volumes de tecido concêntrico. Em média, 2-3 milhões de células podem ser colhidas com uma curva de 360° da abertura de corte, aproximadamente 7 milhões de células com duas voltas, e um total de 12-14 milhões de células podem ser obtidas com três voltas de 360° da abertura de corte. Após o revestimento em frascos de suspensão contendo meio de células-tronco completas sem soro, as neurosferas foram visíveis por microscopia de luz no dia 2 e a olho nu até o dia 7 (Figura 7).
Para examinar a viabilidade in vivo , as células extraídas foram intracranianamente implantadas em camundongos ingênuos C57BL/6 (n = 8 camundongos, 100.000 células vivas/camundongos). O crescimento do tumor foi confirmado usando o sistema de imagem in vivo . O sinal tumoral continuou a aumentar até que todos os animais foram eutanizados até o dia 14 pós implantação do tumor (sobrevida mediana de 11 dias).
A seção representativa de tecido H&E (Figura 3B) contém uma cavidade de ressecção clara e circular com uma borda de produtos sanguíneos (rosa profundo), inflamação e células tumorais residuais (células roxas escuras). Macroscopicamente, as células tumorais residuais são mesenquimais na natureza e infiltrativas, exibindo extensa invasão e proliferação perivascular. Microscopicamente, foram identificadas atypia nuclear marcada e figuras mitóticas. Macrófagos associados ao tumor também foram identificados em áreas de tecido infartado e microhemorrhages. A arquitetura tecidual no cérebro circundante parenchyma não parecia estar perturbada.
Figura 1: Configuração do sistema MIRS. (A) Sistema de ressecção minimamente invasivo (MIRS) para tumor cerebral em modelos de roedores com um sistema integrado de preservação de tecidos. (B) Painel frontal do console MIRS. 1 = Potência do sistema, 2 = Pedal do pé, 3 = Botão Prime, 4 = Aspiração, 5 = Mostrador de Controle de Nível de Aspiração, 6 = Indicador de Nível de Aspiração, 7 = Peça de mão, 8 = Botão de Habilitação do Cortador. (C) Painel traseiro do console MIRS. 1 = Recipiente do cabo de alimentação, 2 = Disjuntor, 3 = Entrada de Fornecimento de Nitrogênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mudanças na carga tumoral média em camundongos com tumores não tratados versus camundongos submetidos à ressecção de tumores por MIRS. (A) Camundongos com pequena carga tumoral de linha de base e (B) camundongos com grande carga tumoral de linha de base (p < 0,0001, SD ≤0,3e+006 em todos os grupos em cada ponto de tempo e pequeno demais para ser exibido no gráfico). Os animais sucumbiram à carga tumoral ou foram eutanásiados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de ressonância magnética e H&E. (A) Imagens de ressonância magnética cerebral ponderadas pré e pós-ressecção T2 e (B) uma seção representativa do cérebro coronal manchada de H&E mostrando uma cavidade de ressecção clara e circular com uma borda de produtos sanguíneos (rosa profundo), inflamação e células tumorais residuais (células roxas escuras). Imagens de ressonância magnética e seções de H&E foram obtidas imediatamente após a ressecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Determinação do volume de ressecção do tumor. Os volumes médios calculados a partir de imagens de ressonância magnética de cavidades de ressecção criadas com um vs. duas rotações da abertura de corte, n = 4 por grupo. p = 0,01, teste T de duas caudas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Curvas kaplan-meier de camundongos com tumores não tratados versus camundongos submetidos à ressecção de tumores por MIRS. (A) Camundongos com pequena carga tumoral de linha de base. (B) Camundongos com grande carga tumoral de linha de base. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Teste de viabilidade das células tumorais resseccionadas. (A) Imagens representativas de microscopia leve do tecido colhido com MIRS no dia 0 em 20x. (B) Curva Kaplan-Meier descrevendo a sobrevivência de camundongos após implantação intracraniana de células colhidas a partir de tecido ressecado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Formação de neurosferas. Imagens representativas de microscopia leve de neurosferas geradas a partir de tecido ressecado no dia 2 pós-ressecção em (A) 20x e (B) 10x, e no dia 7 pós-ressecção em (C) 20x e (D) 10x. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Sistema de ressecção minimamente invasivo | Ressecção Histórica | |||
| Tempo e habilidades operacionais | Tempo mínimo de operação (<2 min para cada animal). Habilidades mínimas necessárias. | O tempo cirúrgico não é padronizado e a experiência cirúrgica com animais de pequeno porte e a microcirurgia é benéfica. | ||
| Perda de sangue | Mínimo | Imprevisível | ||
| Volume padronizado de ressecção | Volume de ressecção determinada/ajustada pelo número de rotações da ferramenta de ressecção | O volume varia muito entre os sujeitos | ||
Tabela 1: Comparação entre o sistema de ressecção minimamente invasivo (MIRS) e os modelos históricos de ressecção cirúrgica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A ressecção tumoral é uma pedra angular dos planos de tratamento de oncologia neurocirúrgica para tumores cerebrais de baixo grau e de alto grau. A citoredução e a debulição do tumor se correlacionam com a melhora da função neurológica e a sobrevida geral em pacientes com tumores cerebrais 1,2,5,6. Embora os protocolos de ressecção cirúrgica tenham sido descritos anteriormente em modelos de roedores, esses protocolos têm sofrido de várias limitações que podem confundir os resultados gerados e a tradução geral do modelo pré-clínico. Por exemplo, protocolos de ressecção cirúrgica relatados anteriormente incluíram uma craniotomia com 3-4 pequenos orifícios de rebarba para criar um retalho ósseo e, em seguida, distinção hábil e diferenciação da coloração e consistência do tumor em comparação com o tecido cerebral normal6. Esses protocolos são demorados e exigem que o pessoal da pesquisa tenha habilidades avançadas na utilização do microscópio cirúrgico, manuseio de instrumentos cirúrgicos, identificação das bordas tumorais relativas ao tecido cerebral normal circundante e obtenção de homeostase adequada. Tais procedimentos muitas vezes levam a perda significativa de sangue e morte animal. Além disso, pode ser desafiador alcançar a ressecção padronizada com volumes comparáveis de tecido tumoral ressecado em diferentes animais no mesmo experimento. Essa continuidade e uniformidade se tornam mais desafiadoras com múltiplos funcionários realizando o procedimento.
Em contraste, o protocolo MIRS descrito aqui remove essas limitações (Tabela 1). O presente protocolo requer uma abordagem minimamente invasiva através do mesmo orifício de rebarba usado para implantação inicial do tumor. Conforme detalhado na seção de protocolo, a ferramenta de ressecção pode ser instalada em um quadro estereotático que permite a inserção precisa da cânula na cavidade tumoral. A velocidade da lâmina e o número de ciclos de ressecção realizados podem ser facilmente ajustados através de uma peça de mão usada pelo pessoal da pesquisa para controlar o volume de tumor ressecado de forma padronizada sem causar uma quantidade significativa de perda de sangue.
Como observado nos resultados, os camundongos submetidos à ressecção com o dispositivo MIRS demonstraram sobrevida prolongada em comparação com a coorte de camundongos com tumores não ressecados. Isso, juntamente com os dados, mostra que a carga tumoral foi significativamente reduzida no grupo ressecado em comparação com o grupo controle não ressecado, indicando que o dispositivo MIRS efetivamente desesboca o tumor com perturbação mínima para os tecidos cerebrais saudáveis circundantes. Além disso, nos dias seguintes à ressecção, a carga tumoral progrediu constantemente devido à presença de um tumor residual e à natureza infiltrada da linha celular tumoral CT-2A. O modelo MIRS pode, assim, replicar o processo de debulking dos tipos de tumores infiltrativos, que podem ser seguidos com quimioterápicos ou radioterapia para espelhar mais de perto o regime de tratamento nos protocolos de tratamento de tumores cerebrais humanos 15,16,17.
Como é o caso de qualquer dispositivo de sucção, o entupimento do tubo de aspiração pode ser uma das limitações do sistema MIRS. Isso pode ocorrer devido ao acúmulo de tecido seco ou sangue durante ou após o uso da máquina. Para evitar isso, imediatamente no final de cada sessão de ressecções, a purga da cânula da peça de mão é recomendada por lavagem com mídia resfriada alternando com ar para "empurrar" todo o tecido ressecado para o recipiente de coleta, seguido de descarga com 3% H2O2. Isso capturará todo o tecido adquirido durante a ressecção e garantirá que nenhum permanece na cânula ou tubo. Além disso, se o sistema não estiver aspirando/cortando, isso pode ser porque a peça de mão não está conectada, o cortador de cânula de ressecção não está ligado, a linha de aspiração do console não está conectada ao recipiente, a tampa do recipiente não está apertada, ou o pedal do pé não está conectado.
Além disso, embora tenhamos demonstrado que o MIRS pode ser usado para ressecção eficaz e padronizada com alta viabilidade in vitro e in vivo do tecido ressecado, estudos futuros são encorajados a investigar ainda mais outras facetas da implementação desses sistemas na pesquisa de tumores cerebrais. Estes incluem examinar o impacto do processo de ressecção nos componentes moleculares e celulares da massa tumoral e do microambiente tumoral. Além disso, estudos são necessários para confirmar que o tecido ressecado usando o dispositivo MIRS recapitula o tumor parental15.
Em conclusão, um protocolo de uma abordagem minimamente invasiva é descrito para ressecção cirúrgica padronizada em um modelo de tumor cerebral roedor que é acoplado a um sistema integrado e automatizado de preservação de tecidos. Este protocolo abre o caminho para estabelecer modelos de pesquisa de tumores cerebrais pré-clínicos altamente translacionais e preditivos. Aplicações futuras deste protocolo podem potencialmente incluir estudos pré-clínicos investigando diferentes modalidades terapêuticas ou diagnósticas para tumores cerebrais que podem implementar este protocolo para alcançar uma ressecção padronizada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BT tem financiamento de pesquisa da NIH e é coproprietária da Accelerating Combination Therapies*, e a Ashvattha Therapeutics Inc. licenciou uma de suas patentes. GW tem financiamento nih (R01NS107813). A HB é consultora paga da Insightec e presidente do Conselho Consultivo Médico da empresa. Este acordo foi revisado e aprovado pela Universidade Johns Hopkins após suas políticas de conflito de interesses. A HB tem financiamento de pesquisa da NIH, Johns Hopkins University, e filantropia e é consultora da CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* e Nurami Medical*. (*inclui equidade ou opções).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
| 200 proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | CoStar | 4487 | |
| 70 micron filter | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| Anesthesia System | Patterson Scientific | 78935903 | |
| Anesthesic Gas Waste Container | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Bench protector underpad | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6, 6-8 week old mice | Charles River Laboratories | Strain Code 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 media | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM media | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Euthanasia solution | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| Formalin | Invitrogen | INV-28906 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| Induction Chamber | Patterson Scientific | 78933388 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Isoflurane Vaporizer | Patterson Scientific | 78916954 | |
| Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield Microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Microinjection Unit | Kopf | 5001 | |
| Micromotor drill | Foredom | F210418 | |
| MRI system | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI Scanner | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| Progesterone | Sigma | P-8783 | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic Frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Suture, vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 culture flask | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
References
- Mineo, J. F., et al. Prognosis factors of survival time in patients with glioblastoma multiforme: a multivariate analysis of 340 patients. Acta Neurochirurgica. 149 (3), 245-252 (2007).
- Miyai, M., et al. Current trends in mouse models of glioblastoma. Journal of Neuro-Oncology. 135 (3), 423-432 (2017).
- Raj, D., Agrawal, P., Gaitsch, H., Wicks, E., Tyler, B. Pharmacological strategies for improving the prognosis of glioblastoma. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 22 (15), 2019-2031 (2021).
- Alomari, S., et al. Drug repurposing for Glioblastoma and current advances in drug delivery-a comprehensive review of the literature. Biomolecules. 11 (12), 1870 (2021).
- Serra, R., et al. Combined intracranial Acriflavine, temozolomide and radiation extends survival in a rat glioma model. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics : Official Journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 170, 179-186 (2022).
- Tang, B., Foss, K., Lichtor, T., Phillips, H., Roy, E.
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Lachin, J. M.
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods in Molecular Biology. 740, 7-12 (2011).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of Glioblastoma stem cells. Journal of Visualized Experiments. (131), e56176 (2018).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 2: Volumetric strain fields and local contrast changes. Journal of Neuroscience Methods. 365, 109385 (2022).
- Connolly, N. P., et al. Elevated fibroblast growth factor-inducible 14 expression transforms proneural-like gliomas into more aggressive and lethal brain cancer. GLIA. 69 (9), 2199-2214 (2021).
- Stall, B., et al. Comparison of T2 and FLAIR imaging for target delineation in high grade gliomas. Radiation Oncology. 5, 5 (2010).
- Das, A., et al. Establishing a standardized method for the effective intraoperative collection and biological preservation of brain tumor tissue samples using a novel tissue preservation system: a pilot study. World Neurosurgery. , (2022).
- Zusman, E., et al. Tissues harvested using an automated surgical approach confirm molecular heterogeneity of Glioblastoma and enhance specimen's translational research value. Frontiers in Oncology. 9, (2019).
- McLaughlin, N., et al. Side-cutting aspiration device for endoscopic and microscopic tumor removal. Journal of Neurological Surgery Part B. 73 (1), 11-20 (2012).
