Summary
Den nuværende protokol beskriver en standardiseret resektion af hjernetumorer hos gnavere gennem en minimalt invasiv tilgang med et integreret vævsbevaringssystem. Denne teknik har konsekvenser for nøjagtigt at afspejle standarden for pleje i gnavere og andre dyremodeller.
Abstract
Den nuværende protokol beskriver et standardiseret paradigme for resektion af gnaverhjernetumorer og vævsbevarelse. I klinisk praksis er maksimal tumorresektion standardbehandling for de fleste hjernetumorer. Imidlertid inkluderer de fleste aktuelt tilgængelige prækliniske hjernetumormodeller enten ikke resektion eller bruger kirurgiske resektionsmodeller, der er tidskrævende og fører til betydelig postoperativ sygelighed, dødelighed eller eksperimentel variabilitet. Derudover kan udførelse af resektion hos gnavere være skræmmende af flere grunde, herunder mangel på klinisk sammenlignelige kirurgiske værktøjer eller protokoller og fraværet af en etableret platform for standardiseret vævsindsamling. Denne protokol fremhæver brugen af en multifunktionel, ikke-ablativ resektionsanordning og et integreret vævsopbevaringssystem tilpasset den kliniske version af enheden. Den anordning, der anvendes i denne undersøgelse, kombinerer justerbar sugning og et cylindrisk blad ved åbningen for præcist at sondere, skære og suge væv. Den minimalt invasive resektionsanordning udfører sine funktioner via det samme burrhul, der anvendes til den indledende tumorimplantation. Denne tilgang minimerer ændringer i regional anatomi under biopsi- eller resektionsoperationer og reducerer risikoen for betydeligt blodtab. Disse faktorer reducerede signifikant den operative tid (<2 min/dyr), forbedrede postoperativ dyreoverlevelse, lavere variabilitet i eksperimentelle grupper og resulterer i høj levedygtighed af resekterede væv og celler til fremtidige analyser. Denne proces lettes af en vingehastighed på ~1.400 cyklusser/min., hvilket gør det muligt at høste væv i et sterilt lukket system, der kan fyldes med en fysiologisk løsning efter eget valg. I betragtning af den nye betydning af at studere og nøjagtigt modellere virkningen af kirurgi, bevarelse og streng sammenlignende analyse af regionaliserede tumorresektionsprøver og intra-hulrumsleverede terapier, vil denne unikke protokol udvide mulighederne for at udforske ubesvarede spørgsmål om perioperativ styring og terapeutisk opdagelse for hjernetumorpatienter.
Introduction
Glioblastom (GBM) er den mest almindelige og aggressive primære hjernetumor hos voksne. På trods af nylige fremskridt inden for neurokirurgi, målrettet lægemiddeludvikling og strålebehandling er den 5-årige overlevelsesrate for GBM-patienter mindre end 5%, en statistik, der ikke er signifikant forbedret i over tre årtier1. Derfor er der behov for mere effektive behandlingsstrategier.
For at udvikle nye terapier bliver det mere og mere tydeligt, at undersøgelsesprotokoller skal (1) udnytte oversættelige prækliniske modeller, der nøjagtigt rekapitulerer tumorheterogeniteten og mikromiljøet, (2) afspejler det standard terapeutiske regime, der anvendes til patienter med GBM, som i øjeblikket inkluderer kirurgi, strålebehandling og kemoterapi, og (3) tegner sig for forskellen mellem resekteret kerne og restprodukt, invasivt tumorvæv 2,3,4,5. Imidlertid implementerer de fleste af de aktuelt tilgængelige prækliniske hjernetumormodeller enten ikke kirurgisk resektion eller bruger kirurgiske resektionsmodeller, der er relativt tidskrævende, hvilket fører til en betydelig mængde blodtab eller manglende standardisering. Desuden kan udførelse af resektion af gnaverhjernetumorer være udfordrende på grund af mangel på klinisk sammenlignelige kirurgiske værktøjer eller protokoller og fraværet af en etableret platform6 til systematisk vævsindsamling (tabel 1).
Den nuværende protokol har til formål at beskrive et standardiseret paradigme for resektion af gnaverhjernetumorer og vævsbevarelse ved hjælp af et multifunktionelt ikke-ablativt minimalt invasivt resektionssystem (MIRS) og et integreret vævsbevaringssystem (TPS) (figur 1). Det forventes, at denne unikke teknik vil give en standardiseret platform, der kan bruges i forskellige undersøgelser i præklinisk forskning til GBM og andre typer hjernetumormodeller. Forskere, der undersøger terapeutiske eller diagnostiske modaliteter for hjernetumorer, kan implementere denne protokol for at opnå en standardiseret resektion i deres studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Maryland og Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 hunmus, 6-8 uger, blev anvendt til denne undersøgelse. Musene blev hentet fra kommercielle kilder (se Materialetabel). Alle biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) regler blev fulgt, herunder brugen af masker, handsker og kjoler.
1. Indledende intrakraniel tumorimplantation
- I den indledende fase af undersøgelsen injiceres hver mus intrakranielt med 100.000 celler (GL261 murine gliomcellelinje) suspenderet i 4 μL fosfatbufferet saltvand (1x PBS) til en dybde på 2,5 mm efter den tidligere offentliggjorte rapport7.
- Kvantificer tumorsignalet i hver mus ved hjælp af in vivo-billeddannelsessystemet 8 9 dage efter tumorimplantation.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, stratificer musene i to grupper baseret på tumorbyrde. I denne undersøgelse var de to grupper: (1) mus med relativt lille tumorbyrde (gennemsnitligt bioluminescerende signal = 5,5e + 006 ± 0,1e + 006 fotoner / s, n = 10) og (2) mus med relativt stor tumorbyrde (gennemsnitligt bioluminescerende signal = 1,69e + 007 ± 0,2e + 007 fotoner / s, n = 10), (p < 0,05, Mann-Whitney test)9. - Opdel hver gruppe i to sammenlignelige undergrupper.
BEMÆRK: I denne undersøgelse var de to undergrupper: ubehandlede mus (n = 5) og mus med tumorer, der gennemgår kirurgisk resektion ved hjælp af MIRS (n = 5), (p > 0,05, Mann-Whitney-test)9. - Fra resektionsdagen skal du spore tumorprogressionen ved hjælp af in vivo-billeddannelsessystemet med en frekvens baseret på tumorvækstmønsteret.
BEMÆRK: For GL261-cellelinjen skal du spore tumorprogressionen på resektionsdagen og derefter hver 3-6 dage.
2. Tumorresektion ved hjælp af MIRS
- Anæstetik musen ved hjælp af en isofluran-O2 gasblanding i et induktionskammer eller intraperitoneal injektion af xylazin/ketaminopløsning.
- Hvis du bruger gasbedøvelsesmidlet, skal du indstille gasstrømningshastigheden til 1,0 ml / min og fordamperen til 2,0% for anæstesiinduktion, hvilket typisk kræver 3-5 minutter i kammeret (se Materialetabel).
- Hvis du bruger det injicerbare bedøvelsesmiddel, skal du bedøve musene ved at injicere 0,2 ml bedøvelsesopløsning (80-100 mg / kg ketamin og 10-12,5 mg / kg xylazin, se Materialetabel) intraperitonealt.
- Vurder dyret for tilstrækkelig sedation ved at klemme tåen. Påfør oftalmisk salve på øjnene for at undgå tørhed i hornhinden. Administrer et smertestillende middel (0,03-0,06 mg/kg buprenorphin subkutant) før proceduren.
- Placer musen på den stereotaktiske ramme (se Materialetabel), når fuld sedation er bekræftet.
BEMÆRK: Hvis du bruger gasbedøvelsesmidlet, skal du placere musens næse i en næsekegle, hvor den fortsat vil modtage isofluran-O 2-blandingen under proceduren (1,5%). - Fjern den forrige hæfteklammer, og fjern derefter håret enten med en hårfjerningscreme eller ved barbering. Desinficer huden med skiftende cyklusser af en chlorhexidin / betadinbaseret skrubbe og alkohol. Derefter oprettes et 1 cm langsgående midterlinjesnit langs det tidligere kirurgiske ar ved hjælp af en steril skalpel.
- Fastgør MIRS-håndstykket til den stereotaktiske arm gennem sceneadapteren/håndstykkeholderen for at opnå øget stabilitet og præcision.
- Konfigurer MIRS-maskinen (se Materialetabel) ved hjælp af følgende indstillinger (Figur 1).
- Sæt netledningen på bagpanelet i netledningsstikket. Tænd eller sluk for strømmen til systemet ved at skifte (1 = ON, 0 = OFF).
- Indsæt den ene ende af nitrogenslangen (leveres med konsollen) i hanbeslaget på konsollens bagpanel. Drej forbindelsesmøtrikken med uret for at stramme forbindelsen.
BEMÆRK: Den modsatte ende af slangen skal tilsluttes nitrogentilførslen. - Før slangen fastgøres til nitrogenforsyningen, skal du kontrollere, at forsyningstrykket ikke overstiger 100 psig, hvilket er det indgangsforsyningstryk, der anbefales til konsollen.
BEMÆRK: Konsollen genererer sin egen ambition, når den aktiveres af fodpedalen, når nitrogenet er leveret til konsollen. - Fastgør låget på vakuumporten, og forsegl det for at undgå lækage i vakuumsystemet. Eventuelle lækager i aspirationssystemet vil påvirke MIRS-konsollens ydeevne.
- Hvis aspirationen er under 17 under opsætning eller priming, skal du kontrollere, at aspirationsknappen på forsiden af konsollen er indstillet til det maksimale niveau (100), sikre, at der ikke er lækage i aspirationssystemet, og bekræfte, at nitrogentilførselsforsyningstrykket er korrekt.
- For at forbinde fodpedalen til konsollen skal du indsætte det grå fodpedalstik i den grå beholder, indtil den klikker og passer på plads.
BEMÆRK: Fodpedalstikket tilsluttes konsollen i en retning, og den er tastet. - For at forbinde håndstykket til konsollen skal du indsætte det blå håndstykkestik i dets blå beholder, indtil det klikker og passer på plads.
BEMÆRK: Håndstykkestikket opretter forbindelse til konsollen i én retning, og det er indtastet. - Prime hvert håndstykke, før du bruger systemet ved at aspirere steril væske fra en lille skål ind i åbningen, gennem slangen og håndstykket og derefter ind i beholderen for at sikre, at indersiden af slangen og håndstykket smøres for at reducere vævsokklusionerne.
- Forbered dig på aspiration alene eller aspiration med skæring ved at vælge den passende tilstand på konsollens frontpanel. Start med at bruge fodpedalen.
- Indsæt 23 G MIRS-kanylen i burrhullet til en dybde på 2,5 mm.
- Start resektionsprocessen ved at trykke på fodpedalen, der er forbundet med kanylen. Udfør en fuld cyklus (360 °) eller mere af resektion ved hjælp af kontrolknappen i håndstykket.
BEMÆRK: Jo flere cyklusser der udføres, jo mere volumen af tumorvæv resekteres. - Når resektionsprocessen er afsluttet, trækkes 23 G MIRS-kanylen ud af burrhullet og bruger 5 ml 1x PBS til at skylle slangen og løsne eventuelt resterende affald.
- Fjern musen fra den stereotaktiske ramme, og luk såret med en hæftemaskine eller 4-0 sutureringsmateriale (se Materialetabel).
- Placer musen på en varmepude eller under et opvarmningslys under genopretning fra anæstesi, før den returneres til buret.
- Når eksperimentet er afsluttet, renses kanylen via skylning. Skift med afkølet medie og luft for at "skubbe" alt det resekterede væv tilbage til opsamlingsbeholderen. Fjern opsamlingsbeholderen fra systemet, og afslut med den medfølgende hætte.
- Efter at have gennemført trin 2.12, skal du placere kanylens distale spids i 3% H2O2 og anvende sugning ved 24-25 i Hg for at fylde sugeledningen tilbage til sugeopsamlingsbeholderen og lade stå i 60-90 s. Skyl med steril mediepulserende luft og medier intermitterende.
- Overvåg musene for eventuelle neurologiske tegn (unormale uregelmæssige bevægelser eller anfald) efter proceduren.
- Afliv musene med alvorlige neurologiske svækkelser (bliv sløv, har et sløvt udseende, bøjet ryg eller har uregelmæssige bevægelser).
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev 200 mg/kg af en kommercielt tilgængelig eutanasiopløsning (se Materialetabel) brugt til at aflive hver mus.
3. Vævsindsamling via TPS
- Tumorprøven nedsænkes i en vævskulturskål indeholdende et RBC-lysismedium (se Materialetabel) i 5 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Vævet høstet fra MIRS til TPS vil primært være i form af enkeltceller sammen med små bidder af væv. - Placer et 70 μm filter (se Materialetabel) på et 50 ml konisk rør, og brug et stempel af en 5 ml sprøjte til at føre tumorprøven gennem filteret.
- Med en overførselspipette skal du bruge RPMI-1640-mediet til at lette passagen af celler og enhver vævsmasse gennem filteret.
- Centrifuge ved 428 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten med en pipette.
- Hver prøve genudsættes i 5 ml fremstillet RPMI-1640-medium.
- For at øge vævets levedygtighed, især hvis store vævsstykker visualiseres ved første indtryk, tilsættes de krævede mængder enzymcocktail (indeholdende DNAse I, collagenase IV, dispase, Papain og EDTA, se Materialetabel) til hver prøve. Brug hvirvelstrømmen til at blande opløsningerne.
BEMÆRK: Trin 3.6 er valgfrit. Sammensætningen af enzymcocktailen (for et samlet volumen på 5 ml/prøve): 300 μL DNAse I grade II, 150 μL collagenase/dispase (spalter fibronectin, collagenase IV, I og nonpolære aminosyrer), 250 μL Papain (uspecifik protease) og 6 μL 0,5 M EDTA. - Prøverne anbringes i en shaker-inkubator, der er indstillet til 200 omdr./min., 37 °C i 20 min.
- Efter 20 minutter drejes prøverne ved 428 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Filtrer enkeltceller gennem en 70 μm cellesi og drej ned ved 274 x g i 3 minutter ved 4 °C. Udfør cellelevedygtighedsanalyse10 med Trypan Blue og Hemocytometer (se Materialetabel).
BEMÆRK: Dag 0 levedygtighed varierer fra 30% -70% og øges betydeligt inden for 2-3 dage. - Fortsæt til trin 4, 5 eller 6, afhængigt af den nødvendige levedygtighedstest.
4. Voksende celler i vedhængende kultur
- I en certificeret laminær flowhætte resuspenderes pelleten i serumholdigt klæbende medium (såsom DMEM, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S) opløsning) og pladeceller i en klæbende cellekolbe.
- Cellerne opretholdes i et kontrolleret inkuberet miljø (37 °C, 5 % CO2).
5. Voksende celler i suspensionskultur (neurosfærer)
- I en certificeret laminær flowhætte resuspenderes pelleten i serumfri komplet stamcellemedium11 og plade i en ophængskolbe.
- Oprethold cellerne i et kontrolleret inkuberet miljø (37 °C, 5% CO 2) i2-3 dage for at tillade neurosfæredannelse.
- Efter visualisering af neurosfærerne i kulturmediet skal du bruge Trypsin-EDTA eller Accutase (se Materialetabel) for at opnå enkeltcellesuspensioner til passaging.
BEMÆRK: Så længe der udvises særlig omhu under høsten, og der anvendes passende medier, der understøtter neurale stamceller, skal stamcellerne i det høstede væv danne neurosfærer inden for få dage.
6. Forberedelse af celler til reimplantation
- Pelleten resuspenderes i en koncentration på 100.000 levende celler pr. 4 μL 1x PBS.
- Indsprøjt straks i naive mus ved hjælp af den intrakranielle tumorimplantationsmetode (trin 1).
7. Histologisk analyse
- Umiddelbart efter resektion ekstraheres og fikseres hjernerne i 4% paraformaldehyd (PFA) i 24 timer12.
- Overfør hjernerne til en 30% saccharoseopløsning, indtil de er mættet med saccharose (nedsænket ned til bunden af beholderen).
- Overfør hjernen til en 70% ethanolopløsning.
- Udfør indlejring af paraffinblok, sektionering og standard hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning efter tidligere offentliggjort rapport13.
BEMÆRK: Tykkelsen af hver sektion taget til farvning var 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgisk resektion ved hjælp af MIRS resulterer i et signifikant fald i tumorbyrden
I gruppen med en mindre tumorbyrde var det gennemsnitlige baseline bioluminescerende signal 5,5e + 006 fotoner / s ± 0,2e + 006 i undergruppen, der gennemgik resektion. Efter resektion faldt det gennemsnitlige bioluminescerende signal til 3,09e+006 fotoner/s ± 0,3e+006, (p <0,0001, Mann-Whitney-test)9 (figur 2). Det bioluminescerende signal steg i de følgende par dage, indtil musene blev aflivet. Tilsvarende var det gennemsnitlige baseline bioluminescerende signal i gruppen med en større tumorbyrde 1,68e + 007 fotoner / s ± 0,1e + 007 i undergruppen, der gennemgik resektion. Efter resektion faldt det gennemsnitlige bioluminescerende signal til 5,19e+006 fotoner/s ± 0,2e+006, (p <0,0001, Mann-Whitney-test)9. Det bioluminescerende signal steg i de følgende par dage, indtil musene blev aflivet.
Resektion ved hjælp af MIRS kan justeres for det ønskede resektionsvolumen
Ved præ-resektionsbilleddannelse af syngeneiske CT2A-tumorer kan tumoren generelt identificeres som en heterogen masse på podningsstedet med forstyrret parenkymal arkitektur og peritumoralt ødem og blødning indikeret af heterogene områder af T2-vægtet (T2w) hypo- og hyperintensitet. Nålesporet, der anvendes til stereotaktisk tumorcelleinjektion, kan identificeres på T2w MR-scanninger14.
Resektionshulrummet kan identificeres ved MR-scanninger efter resektion T2w som et stort rundt hypointenst område på tumorpodningsstedet (figur 3). Resektionsproceduren forårsagede ikke signifikant blodtab eller forstyrrelse af den omgivende hjernearkitektur. I nogle tilfælde akkumuleres væske i resektionshulrummet. Som vist i figur 4 steg resektionsvolumenet betydeligt fra 9,4 mm 3 for en rotation af skæreåbningen til 23,2 mm3 for to rotationer (p = 0,0117), hvilket gjorde det muligt at justere volumenresektion for at optimere til en kendt tumorbelastning.
Tumorresektion ved hjælp af MIRS fører til en 7-dages forlængelse i medianoverlevelsen af tumorbærende mus uden at fremkalde neurologiske tegn
Som vist i figur 5 var der en forlængelse i overlevelsen af mus, der gennemgik kirurgisk resektion i begge grupper med små (6 dage) og store (7 dage) tumorer. I gruppen med en mindre tumorbyrde var medianoverlevelsen af kontrolundergruppen 16 dage, mens medianoverlevelsen for den undergruppe, der gennemgik resektion, var 22 dage (p = 0,0044). Tilsvarende var medianoverlevelsen af kontrolundergruppen i gruppen med en større tumorbyrde 12 dage, mens medianoverlevelsen for den undergruppe, der gennemgik resektion, var 19 dage (p = 0,0043). Derudover viste ingen af musene, der gennemgik resektion ved hjælp af MIRS, tegn på neurologisk skade efter proceduren. Dette indikerer, at MIRS kan opnå sikker resektion.
Det resekterede væv, der anvender MIRS, har høj in vitro- og in vivo-levedygtighed
Celler ekstraheret fra det resekterede væv blev filtreret, kvantificeret og resuspenderet i det relevante medium (figur 6), før der blev udført in vitro- eller in vivo-levedygtighedsforsøg. For at undersøge cellernes in vitro levedygtighed og for at bekræfte resektion af tumoren og ikke normal hjerneparenchyma blev celler dyrket i suspensionskultur. Neurosfæredannelse, en indikator for tumorinitieringspotentiale, forekom med minimal vævsbehandling efter resektion. Dette antydede, at MIRS-platformen høstede godt dissocieret væv og havde minimal indvirkning på det resekterede vævs sundhed og levedygtighed. Prøver taget direkte fra TPS til lysmikroskopi syntes primært at være i form af enkeltceller sammen med tilstedeværelsen af et par små stykker væv. Dag 0 levedygtighed varierede fra 30% -70% (dette repræsenterer levedygtigheden efter at have passeret prøven gennem et 70 μm filter og før plettering). Resektionsanordningen har en skæreåbning, der kan rotere 360 ° på resektionssondens akse, hvilket muliggør resektion af koncentriske vævsvolumener. I gennemsnit kan 2-3 millioner celler høstes med en 360 ° drejning af skæreåbningen, ca. 7 millioner celler med to omdrejninger, og i alt 12-14 millioner celler kan opnås med tre 360 ° drejninger af skæreåbningen. Efter plettering i suspensionskolber indeholdende serumfrit komplet stamcellemedium var neurosfærer synlige ved lysmikroskopi på dag 2 og med det blotte øje ved dag 7 (figur 7).
For at undersøge in vivo levedygtighed blev ekstraherede celler intrakranielt implanteret i naive C57BL/6 mus (n = 8 mus, 100.000 levende celler/mus). Tumorvækst blev bekræftet ved hjælp af in vivo-billeddannelsessystemet . Tumorsignalet fortsatte med at stige, indtil alle dyr blev aflivet på dag 14 efter tumorimplantation (median overlevelse på 11 dage).
Det repræsentative H&E-vævsafsnit (figur 3B) indeholder et klart, cirkulært resektionshulrum med en kant af blodprodukter (dyb pink), betændelse og resterende tumorceller (mørke lilla celler). Makroskopisk er de resterende tumorceller mesenkymale og infiltrative og udviser omfattende perivaskulær invasion og spredning. Mikroskopisk blev markerede nukleare atypier og mitotiske figurer identificeret. Tumorassocierede makrofager blev også identificeret omkring områder med infarktvæv og mikroblødninger. Vævsarkitektur i den omgivende hjerneparenchym syntes ikke at være forstyrret.
Figur 1: Opsætning af MIRS-system . (A) Minimalt invasivt resektionssystem (MIRS) til hjernetumor i gnavermodeller med et integreret vævsbevaringssystem. (B) Frontpanel på MIRS-konsollen. 1 = Systemeffekt, 2 = fodpedal, 3 = Prime-knap, 4 = Aspiration, 5 = Aspirationsniveaukontrolskive, 6 = Aspirationsniveauindikator, 7 = Håndstykke, 8 = Cutter Activable-knap. (C) Bagpanel på MIRS-konsollen. 1 = Netledningsstik, 2 = afbryder, 3 = nitrogenforsyningsindgang. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ændringer i den gennemsnitlige tumorbyrde hos mus med ubehandlede tumorer versus mus, der gennemgår resektion af tumorer af MIRS. (A) Mus med lille baseline tumorbyrde og (B) mus med stor baseline tumorbyrde (p < 0,0001, SD ≤0,3e + 006 i alle grupper på hvert tidspunkt og for lille til at blive vist på grafen). Dyr bukkede enten under for tumorbyrde eller blev aflivet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: MR- og H&E-analyse. (A) T2-vægtede hjerne-MR-billeder før og efter resektion og (B) et repræsentativt H&E-farvet koronalt hjerneafsnit, der viser et klart, cirkulært resektionshulrum med en kant af blodprodukter (dybrosa), betændelse og resterende tumorceller (mørke lilla celler). MR-billeder og H&E-sektioner blev opnået umiddelbart efter resektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Bestemmelse af tumorresektionsvolumen. De gennemsnitlige mængder beregnet ud fra MR-billeder af resektionshulrum oprettet med en vs. to rotationer af skæreåbningen, n = 4 pr. gruppe. p = 0,01, tosidet T-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kaplan-Meier-kurver for mus med ubehandlede tumorer versus mus, der gennemgår resektion af tumorer af MIRS . (A) Mus med lille baseline tumorbyrde. (B) Mus med stor baseline tumorbyrde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Levedygtighedstest af de resekterede tumorceller . (A) Repræsentative lysmikroskopibilleder af væv høstet med MIRS på dag 0 ved 20x. (B) Kaplan-Meier-kurve, der beskriver overlevelse af mus efter intrakraniel implantation af celler høstet fra resekteret væv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Dannelse af neurosfærer. Repræsentative lysmikroskopibilleder af neurosfærer genereret fra resekteret væv på dag 2 efter resektion ved (A) 20x og (B) 10x og på dag 7 efter resektion ved (C) 20x og (D) 10x. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Minimalt invasivt resektionssystem | Historisk resektion | |||
| Operativ tid og færdigheder | Minimal driftstid (<2 min for hvert dyr). Minimale færdigheder er nødvendige. | Kirurgisk tid er ikke standardiseret, og kirurgisk erfaring med små dyr og mikrokirurgi er gavnlig. | ||
| Blodtab | Minimal | Uforudsigelig | ||
| Standardiseret resektionsvolumen | Resektionsvolumen bestemt/justeret af antallet af rotationer i resektionsværktøjet | Volumen varierer meget mellem | ||
Tabel 1: Sammenligning mellem det minimalt invasive resektionssystem (MIRS) og historiske kirurgiske resektionsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumorresektion er en hjørnesten i neurokirurgiske onkologiske behandlingsplaner for både lavkvalitets og højkvalitets hjernetumorer. Cytoreduktion og debulking af tumoren korrelerer med forbedret neurologisk funktion og samlet overlevelse hos patienter med hjernetumorer 1,2,5,6. Selvom protokoller til kirurgisk resektion tidligere er beskrevet i gnavermodeller, har disse protokoller lidt af flere begrænsninger, der kan forvirre de genererede resultater og den samlede oversættelighed af den prækliniske model. For eksempel har tidligere rapporterede kirurgiske resektionsprotokoller inkluderet en kraniotomi med 3-4 små burrhuller for at skabe en knogleklap og derefter dygtig sondring og differentiering af tumorens farve og konsistens sammenlignet med normalt hjernevæv6. Disse protokoller er tidskrævende og kræver, at forskningspersonalet har avancerede færdigheder i at udnytte det kirurgiske mikroskop, håndtere kirurgiske instrumenter, identificere tumorgrænserne vedrørende det omgivende normale hjernevæv og opnå tilstrækkelig homeostase. Sådanne procedurer fører ofte til betydeligt blodtab og dyredød. Derudover kan det være udfordrende at opnå standardiseret resektion med sammenlignelige mængder tumorvæv resekteret på tværs af forskellige dyr i samme eksperiment. Denne kontinuitet og ensartethed bliver mere udfordrende med flere medarbejdere, der udfører proceduren.
I modsætning hertil fjerner MIRS-protokollen, der er beskrevet her, disse begrænsninger (tabel 1). Den nuværende protokol kræver en minimalt invasiv tilgang gennem det samme burrhul, der anvendes til indledende tumorimplantation. Som beskrevet i protokolafsnittet kan resektionsværktøjet installeres på en stereotaktisk ramme, der muliggør nøjagtig indsættelse af kanylen i tumorhulen. Bladets hastighed og antallet af udførte resektionscyklusser kan let justeres gennem et håndstykke, der bruges af forskningspersonalet til at kontrollere mængden af tumor, der resekteres på en standardiseret måde uden at forårsage en betydelig mængde blodtab.
Som nævnt i resultaterne viste musene, der gennemgik resektion med MIRS-enheden, langvarig overlevelse sammenlignet med kohorten af mus med ikke-resekterede tumorer. Dette sammen med dataene viser, at tumorbyrden blev signifikant reduceret i den resekterede gruppe sammenlignet med den ikke-resekterede kontrolgruppe, hvilket indikerer, at MIRS-enheden effektivt debulker tumoren med minimal forstyrrelse af omgivende sunde hjernevæv. I dagene efter resektion udviklede tumorbyrden sig støt på grund af tilstedeværelsen af en resterende tumor og den infiltrative karakter af CT-2A-tumorcellelinjen. MIRS-modellen kan således replikere debulkingprocessen for infiltrative tumortyper, som kan følges med kemoterapi eller strålebehandling for bedre at afspejle behandlingsregimen i humane hjernetumorbehandlingsprotokoller15,16,17.
Som det er tilfældet med enhver sugeanordning, kan tilstopning af aspirationsslangen være en af begrænsningerne i MIRS-systemet. Dette kan forekomme på grund af ophobning af tørt væv eller blod under eller efter brug af maskinen. For at undgå dette anbefales det straks ved afslutningen af hver resektionssession at rense håndstykkekanylen ved at skylle med kølede medier skiftevis med luft for at "skubbe" alt det resekterede væv til opsamlingsbeholderen efterfulgt af skylning med 3%H2O2. Dette vil fange alt det væv, der er erhvervet under resektionen, og sikre, at der ikke forbliver nogen i kanylen eller slangen. Hvis systemet ikke suger /skærer, kan det desuden skyldes, at håndstykket ikke er tilsluttet, resektionskanyleskæreren ikke er tændt, aspirationsledningen fra konsollen ikke er tilsluttet beholderen, beholderlåget er ikke stramt, eller fodpedalen er ikke tilsluttet.
Hertil kommer, at mens vi har vist, at MIRS kan bruges til effektiv og standardiseret resektion med høj in vitro og in vivo levedygtighed af det resekterede væv, opfordres fremtidige undersøgelser til yderligere at undersøge andre facetter af implementering af sådanne systemer i hjernetumorforskning. Disse omfatter undersøgelse af virkningen af resektionsprocessen på de molekylære og cellulære komponenter i tumormassen og tumormikromiljøet. Derudover er der behov for undersøgelser for at bekræfte, at det resekterede væv ved hjælp af MIRS-enheden rekapitulerer forældretumoren15.
Afslutningsvis beskrives en protokol med en minimalt invasiv tilgang til standardiseret kirurgisk resektion i en gnaverhjernetumormodel, der er kombineret med et integreret og automatiseret vævsbevaringssystem. Denne protokol baner vejen for etablering af meget translationelle og prædiktive prækliniske hjernetumorforskningsmodeller. Fremtidige anvendelser af denne protokol kan potentielt omfatte prækliniske undersøgelser, der undersøger forskellige terapeutiske eller diagnostiske modaliteter for hjernetumorer, som kan implementere denne protokol for at opnå en standardiseret resektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BT har forskningsmidler fra NIH og er medejer af Accelerating Combination Therapies*, og Ashvattha Therapeutics Inc. har licenseret et af hendes patenter. GW har NIH-finansiering (R01NS107813). HB er lønnet konsulent for Insightec og formand for selskabets Medical Advisory Board. Denne ordning er blevet gennemgået og godkendt af Johns Hopkins University efter dets politik for interessekonflikter. HB har forskningsmidler fra NIH, Johns Hopkins University og filantropi og er konsulent for CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* og Nurami Medical*. (*omfatter egenkapital eller optioner).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
| 200 proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | CoStar | 4487 | |
| 70 micron filter | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| Anesthesia System | Patterson Scientific | 78935903 | |
| Anesthesic Gas Waste Container | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Bench protector underpad | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6, 6-8 week old mice | Charles River Laboratories | Strain Code 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 media | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM media | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Euthanasia solution | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| Formalin | Invitrogen | INV-28906 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| Induction Chamber | Patterson Scientific | 78933388 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Isoflurane Vaporizer | Patterson Scientific | 78916954 | |
| Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield Microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Microinjection Unit | Kopf | 5001 | |
| Micromotor drill | Foredom | F210418 | |
| MRI system | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI Scanner | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| Progesterone | Sigma | P-8783 | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic Frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Suture, vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 culture flask | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
References
- Mineo, J. F., et al. Prognosis factors of survival time in patients with glioblastoma multiforme: a multivariate analysis of 340 patients. Acta Neurochirurgica. 149 (3), 245-252 (2007).
- Miyai, M., et al. Current trends in mouse models of glioblastoma. Journal of Neuro-Oncology. 135 (3), 423-432 (2017).
- Raj, D., Agrawal, P., Gaitsch, H., Wicks, E., Tyler, B. Pharmacological strategies for improving the prognosis of glioblastoma. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 22 (15), 2019-2031 (2021).
- Alomari, S., et al. Drug repurposing for Glioblastoma and current advances in drug delivery-a comprehensive review of the literature. Biomolecules. 11 (12), 1870 (2021).
- Serra, R., et al. Combined intracranial Acriflavine, temozolomide and radiation extends survival in a rat glioma model. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics : Official Journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 170, 179-186 (2022).
- Tang, B., Foss, K., Lichtor, T., Phillips, H., Roy, E.
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Lachin, J. M.
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods in Molecular Biology. 740, 7-12 (2011).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of Glioblastoma stem cells. Journal of Visualized Experiments. (131), e56176 (2018).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 2: Volumetric strain fields and local contrast changes. Journal of Neuroscience Methods. 365, 109385 (2022).
- Connolly, N. P., et al. Elevated fibroblast growth factor-inducible 14 expression transforms proneural-like gliomas into more aggressive and lethal brain cancer. GLIA. 69 (9), 2199-2214 (2021).
- Stall, B., et al. Comparison of T2 and FLAIR imaging for target delineation in high grade gliomas. Radiation Oncology. 5, 5 (2010).
- Das, A., et al. Establishing a standardized method for the effective intraoperative collection and biological preservation of brain tumor tissue samples using a novel tissue preservation system: a pilot study. World Neurosurgery. , (2022).
- Zusman, E., et al. Tissues harvested using an automated surgical approach confirm molecular heterogeneity of Glioblastoma and enhance specimen's translational research value. Frontiers in Oncology. 9, (2019).
- McLaughlin, N., et al. Side-cutting aspiration device for endoscopic and microscopic tumor removal. Journal of Neurological Surgery Part B. 73 (1), 11-20 (2012).
