S1P udøver sine forskellige fysiologiske virkninger gennem S1P-receptorer (S1PRs) underfamilien. Her beskrives en rørledning for at forklare strukturerne og funktionen af S1PR’er.
Lysophospholipider (LPL’er) er bioaktive lipider, der inkluderer sphingosin-1-phosphat (S1P), lysophosphatidinsyre osv. S1P, et metabolisk produkt af sphingolipider i cellemembranen, er en af de bedst karakteriserede LPL’er, der regulerer en række cellulære fysiologiske reaktioner via signalveje medieret af sphingosin-1-phosphatreceptorer (S1PR’er). Dette implicerede, at S1P-S1PRs signalsystem er et bemærkelsesværdigt potentielt terapeutisk mål for lidelser, herunder multipel sklerose (MS), autoimmune lidelser, kræft, betændelse og endda COVID-19. S1PR’er, en lille delmængde af klasse A G-proteinkoblet receptor (GPCR) familien, består af fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 og S1PR5. Manglen på detaljerede strukturelle oplysninger hindrer imidlertid lægemiddelopdagelsen rettet mod S1PR’er. Her anvendte vi kryo-elektronmikroskopimetoden til at løse strukturen af S1P-S1PRs-komplekset og belyste mekanismen for aktivering, selektiv lægemiddelgenkendelse og G-proteinkobling ved hjælp af cellebaserede funktionelle assays. Andre lysophospholipidreceptorer (LPLR’er) og GPCR’er kan også undersøges ved hjælp af denne strategi.
Sphingosin-1-phosphat (S1P), et metabolisk produkt af sphingolipider i cellemembranen, er et allestedsnærværende lysophosphatid signalmolekyle, der involverer forskellige biologiske aktiviteter, herunder lymfocythandel, vaskulær udvikling, endotelintegritet og puls 1,2,3. S1P udøver sine forskellige fysiologiske virkninger gennem fem S1P-receptorundertyper (S1PR’er 1-5); S1PR’er findes i en række væv og udviser unikke præferencer for downstream G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært koblet med Gi-proteinet, som efterfølgende hæmmer cAMP-produktionen; S1PR2 og S1PR3 er koblet med Gi, Gq og G12/13, og S1PR4 og S1PR5 transduce signal gennem Gi og G12/136.
S1P-S1PR-signalering er et kritisk terapeutisk mål for flere sygdomme, herunder autoimmune lidelser7, betændelse8, kræft9 og endda COVID-1910. I 2010 blev fingolimod (FTY720) licenseret som et førsteklasses lægemiddel rettet mod S1PR’er til behandling af tilbagefald multipel sklerose (MS)11. Det er imidlertid i stand til at binde til alle S1PR’er undtagen S1PR2, mens uspecifik binding til S1PR3 resulterer i ødem i hjernebarken, vaskulær og bronchial indsnævring og lungeepitellækage12. Som en alternativ strategi til at øge terapeutisk selektivitet er subtypespecifikke ligander til receptoren blevet produceret. Siponimod (BAF312) blev godkendt i 2019 til behandling med tilbagefald af MS13; det er effektivt rettet mod S1PR1 og S1PR5, mens det ikke har nogen affinitet for S1PR3 og udviser færre bivirkninger i klinisk praksis14. I 2020 godkendte den amerikanske Food and Drug Administration ozanimod til MS-terapi15. Det er blevet rapporteret, at ozanimod har en 25 gange større selektivitet for S1PR1 end for S1PR516. Især i forbindelse med den nuværende COVID-19-pandemi er det blevet opdaget, at agonistlægemidler rettet mod S1PR’er kan bruges til behandling af COVID-19 ved hjælp af immunmodulerende terapiteknikker17. I sammenligning med fingolimod har ozanimod vist overlegenhed med hensyn til at sænke symptomer hos COVID-19-patienter og gennemgår nu kliniske forsøg10. Forståelse af det strukturelle grundlag og funktionen af S1PR’er lægger et væsentligt fundament for at udvikle et lægemiddel, der selektivt er målrettet mod S1PR’er18.
Mange teknikker bruges til at undersøge de strukturelle oplysninger om biomacromolecules, herunder røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonans (NMR) og elektronmikroskopi (EM). Fra marts 2022 er der mere end 180.000 strukturer deponeret på Protein Databank (PDB), og de fleste af dem er blevet løst ved røntgenkrystallografi. Men med den første næsten-atomare opløsningsstruktur af TPRV1 (3.4 Å-opløsning) rapporteret af Yifan Cheng og David Julius i 201319 er kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) blevet en almindelig teknik til proteinstrukturer, og det samlede antal EM PDB-strukturer var mere end 10.000. De kritiske gennembrudsområder er udviklingen af nye kameraer til billeddannelse kendt som direkte elektrondetekteringskameraer og nye billedbehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolutioneret strukturbiologi og strukturbaseret lægemiddelopdagelse i det sidste årti20. Da forståelse af, hvordan makromolekylære komplekser opfylder deres komplicerede roller i den levende celle, er et centralt tema i biologiske videnskaber, har cryo-EM potentialet til at afsløre konformationer af dynamiske molekylære komplekser, især for transmembranproteiner21. G-protein koblede receptorer (GPCR’er) er den største superfamilie af transmembranproteiner og målene for mere end 30% af de aktuelt markedsførte lægemidler22. Udviklingen af cryo-EM har bidraget til et udbrud af højopløsningsstrukturer af GPCR-G-proteinkomplekser, hvilket muliggør strukturel bestemmelse for ‘uhåndterlige’ mål, der stadig ikke er tilgængelige for røntgenkrystallografisk analyse i lægemiddeldesign23. Derfor giver cryo-EM-applikationen en chance for at bestemme den tredimensionelle struktur af GPCR’er under næsten indfødte forhold ved tæt på atomopløsning24. Fremskridt inden for cryo-EM gør det muligt at visualisere mekanistiske underlag for GPCR-stimulering eller -hæmning og yderligere fordele ved at afdække de nye bindingssteder for GPCR-målrettet lægemiddelskabelse25.
Baseret på de enorme fremskridt inden for cryo-EM-teknologi har vi identificeret strukturer af forpinte S1PR1-, S1PR3- og S1PR5-Gi-signalkomplekser for nylig26,27. Hos mennesker findes S1PR’er i forskellige væv og udviser unikke præferencer for downstream G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært kombineret med Gi-proteinet, som efterfølgende hæmmer produktionen af 3′,5′-cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP). S1PR3 og S1PR5 er også i stand til at koble med Gi 6,28. Da Gi-koblet receptoraktivering nedsætter produktionen af cAMP29, blev der introduceret et Gi-hæmning cAMP-assay til måling af cAMP-hæmningseffekter til indfangning af funktionelle ændringer26,27. Ved hjælp af en mutant version af Photinus pyralis luciferase, hvor en cAMP-bindende proteindel er indsat, tilbyder dette cAMP-assay en enkel og pålidelig metode til overvågning af GPCR-aktivitet gennem ændringer i intracellulær cAMP-koncentration30. Det er et følsomt og ikke-radioaktivt funktionelt assay og kan anvendes til at overvåge realtids downstream-signalering af en lang række GPCR’er til lægemiddelopdagelsesformål31.
Her gives et resumé af de kritiske metoder til løsning af aktiverings- og lægemiddelgenkendelsesmetoderne for S1PR’er, primært inklusive kryo-EM-manipulationer og et Gi-hæmnings-cAMP-assay. Denne artikel har til formål at give omfattende eksperimentel vejledning til yderligere udforskninger af GPCR’ernes strukturer og funktioner.
Denne protokol beskriver en primær rørledning til bestemmelse af strukturerne af S1PR’er ved kryo-EM og måling af aktiveringsstyrken af S1PR’er ved Gi-medieret cAMP-hæmningsassay. Nogle trin er afgørende for eksperimentets succes.
For at rense S1PRs-Gi-komplekset bør virusets kvalitet og sf9-cellernes sundhed lægges større vægt på. Ekspressionen af receptoren reduceres dramatisk i dårlige sf9-celler . Sf9-cellernes sundhed blev vurderet ved at måle deres …
The authors have nothing to disclose.
Dataene fra S1PRs-Gi-komplekset blev høstet på West China Cryo-EM Center i Sichuan University og Cryo-EM Center ved Southern University of Science and Technology (SUSTech) og behandlet på Duyu High-Performance Computing Center i Sichuan University. Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation of China (32100965 til L.C., 32100988 til W.Y., 31972916 til ZS) og fuldtids postdoc-forskningsfond ved Sichuan University (2021SCU12003 til L.C.)
0.05% trypsin-EDTA | GIBCO | Cat# 25300054 | |
0.22 µM filter | Thermo Fisher Scientific | Cat# 42213-PS | |
100 kDa cut-off concentrator | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88533 | |
6-well plate | Corning | Cat# 43016 | |
96-well plate | Corning | Cat# 3917 | |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | Cat# 9087-70-1 | |
Apyrase | NEB | Cat# M0398S | |
Baculovirus transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10362100 | For the preparation of P0 baculovirus |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | Cat# B6506 | |
CHO-K1 | ATCC | N/A | |
CHS | Sigma-Aldrich | Cat# C6512 | |
CryoSPARC | Punjani, A., et al.,2017 | https://cryosparc.com/ | |
DH5α competent E.coli | Thermo Fisher Scientific | Cat# EC0112 | |
D-Luciferin-Potassium Salt | Sigma- Aldrich | Cat# 50227 | |
DMSO | Sigma- Aldrich | Cat# D2438 | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | Cat# S311-500 | |
ESF921 cell culture medium | Expression Systems | Cat# 96-001 | |
Excel | microsoft | N/A | |
F12 medium | Invitrogen | Cat# 11765 | |
FBS | Cell Box | Cat# SAG-01U-02 | |
Flag resin | Sigma- Aldrich | Cat# A4596 | |
Forskolin | APExBIO | Cat# B1421 | |
Gctf | Zhang, 2016 | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | |
GDN | Anatrace | Cat# GDN101 | |
Gel filtration column | GE healthcare | Cat# 28990944 | |
Gen5 3.11 | BIO-TEK | N/A | |
Gentamicin | Solarbio | Cat# L1312 | |
GloSensor cAMP assay kit | Promega | Cat# E1291 | Gi-inhibition cAMP assay kit |
GloSensor plasmid | Promega | Cat# E2301 | Sensor plasmid |
Grace’s medium | GIBCO | Cat# 11595030 | |
GraphPad Prism 8 | Graphpad | N/A | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88284 | |
HEPES | Sigma- Aldrich | Cat# H4034 | |
jetPRIME Reagent | Polyplus Transfection | Cat# 114-15 | transfection reagent |
Janamycin | Solarbio | Cat# K1030 | |
LB medium | Invitrogen | Cat# 12780052 | |
Leupeptin | Sigma-Aldrich | Cat# L2884 | |
LMNG | Anatrace | Cat# NG310 | |
MotionCor2 | (Zheng et al., 2017) | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | |
NanoCab | Thermo Fisher Scientific | Cat# 1121822 | |
PBS | Invitrogen | Cat# 14190-144 | |
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs | GenScript | N/A | |
pFastBac1-Gαi | GenScript | N/A | |
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 | GenScript | N/A | |
pFastBacdual-Gβ1γ2 | GenScript | N/A | |
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | Cat# K210003 | For the preparation of plasmids and P0 baculovirus |
Q5 site-Directed Mutagenesis kit | NEB | Cat# E0554S | For the preparation of plasmids |
Quantifoil | Quantifoil | Cat# 251448 | |
RELION-3.1 | (Zivanov et al., 2018) | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion | |
S1PRs cDNA | addgene | N/A | |
scFv16 | Invitrogen | Cat# 703976 | |
Sf9 | Expression Systems | N/A | |
Siponimod | Selleck | Cat# S7179 | |
sodium cholate | Sigma-Aldrich | Cat# C1254 | |
Synergy H1 microplate reader | BIO-TEK | N/A | |
Synthetic T4L DNA (sequence) | N/A | N/A | Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac |
TCEP | Thermo Fisher Scientific | Cat# 77720 | |
Tetracycline | Solarbio | Cat# T8180 | |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A |