S1P oefent zijn diverse fysiologische effecten uit via de S1P-receptoren (S1PR's) subfamilie. Hier wordt een pijplijn beschreven om de structuren en functie van S1PR's uit te leggen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een pijplijn om de structuren en signaalroutes van sfingosine-1-fosfaatreceptoren te onderzoeken
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lysofosfolipiden (LPL's) zijn bioactieve lipiden die sfingosine-1-fosfaat (S1P), lysofosfatidisch zuur, enz. Omvatten. S1P, een metabolisch product van sfingolipiden in het celmembraan, is een van de best gekarakteriseerde LPL's die een verscheidenheid aan cellulaire fysiologische reacties reguleert via signaalroutes gemedieerd door sfingosine 1-fosfaatreceptoren (S1PR's). Dit impliceerde dat het S1P-S1PR-signaleringssysteem een opmerkelijk potentieel therapeutisch doelwit is voor aandoeningen, waaronder multiple sclerose (MS), auto-immuunziekten, kanker, ontsteking en zelfs COVID-19. S1PR's, een kleine subset van de klasse A G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) familie, zijn samengesteld uit vijf subtypen: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 en S1PR5. Het gebrek aan gedetailleerde structurele informatie belemmert echter de ontdekking van geneesmiddelen gericht op S1PR's. Hier pasten we de cryo-elektronenmicroscopiemethode toe om de structuur van het S1P-S1PR-complex op te lossen en het mechanisme van activering, selectieve medicijnherkenning en G-eiwitkoppeling op te helderen met behulp van celgebaseerde functionele assays. Andere lysofosfolipidereceptoren (LPLRs) en GPCR's kunnen ook worden bestudeerd met behulp van deze strategie.
Inleiding
Sfingosine-1-fosfaat (S1P), een metabolisch product van sfingolipiden in het celmembraan, is een alomtegenwoordig lysofosfatidisch signaalmolecuul dat verschillende biologische activiteiten omvat, waaronder lymfocytenhandel, vasculaire ontwikkeling, endotheelintegriteit en hartslag 1,2,3. S1P oefent zijn diverse fysiologische effecten uit via vijf S1P-receptorsubtypen (S1PR's 1-5); S1PR's worden aangetroffen in een verscheidenheid aan weefsels en vertonen unieke voorkeuren voor downstream G-eiwitten 4,5. S1PR1 is voor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Zuivering van het S1PR-G eiwitcomplex
- Om het menselijke S1PRRs-G-eiwitcomplex te zuiveren, kloont u de cDA's van S1PR1 zonder C-terminale residuen 338-382, de wild-type S1PR3, S1PR5 afgekapt met 345-398 bij C-terminus, en de wild-type Gi1 in de pFastBac1-vector en de cDNA's van het wildtype Gβ1 en Gγ2 in de pFastBacdual-vector (Materiaaltabel).
OPMERKING: Alle constructen voor S1PR's bevatten ook de hemagglutinine (HA) signaalsequentie gevolgd door een Flag epitoop tag op de N-terminus en een 10x zijn tag op C-terminus. Ook werd een synthetische DNA-sequentie (Table of Materials) voor het vertalen van ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Alvorens het monster van het S1PR-Gi-complex in te vriezen, moet het gezuiverde monster worden gescheiden door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en geanalyseerd met gelfiltratiechromatografie. Figuur 2 toont het S1PR3-Gi complex als voorbeeld. De piekfractie van het homogene GPCR-G-eiwitcomplex bevond zich meestal op ~10,5 ml van de grootte-uitsluitingschromatografie (figuur 2A). SDS-pagina analyse van het S1PR3-Gi complex (Figuur 2B<.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een primaire pijplijn voor het bepalen van de structuren van S1PR's door cryo-EM en het meten van de activeringspotentie van S1PR's door Gi-gemedieerde cAMP-remmingstest. Sommige stappen zijn cruciaal voor het succes van het experiment.
Om het S1PR-Gi-complex te zuiveren, moet meer aandacht worden besteed aan de kwaliteit van het virus en de gezondheid van sf9-cellen . De expressie van de receptor is dramatisch verminderd in arme sf9-cellen . De gezond.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
De gegevens van het S1PR-Gi-complex werden geoogst in het West China Cryo-EM Center in Sichuan University en Cryo-EM Center in de Southern University of Science and Technology (SUSTech) en verwerkt in het Duyu High-Performance Computing Center in Sichuan University. Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation of China (32100965 tot L.C., 32100988 tot W.Y., 31972916 tot Z.S.) en het fulltime Postdoctoraal Onderzoeksfonds van Sichuan University (2021SCU12003 tot L.C.)
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.05% trypsin-EDTA | GIBCO | Cat# 25300054 | |
| 0.22 µM filter | Thermo Fisher Scientific | Cat# 42213-PS | |
| 100 kDa cut-off concentrator | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88533 | |
| 6-well plate | Corning | Cat# 43016 | |
| 96-well plate | Corning | Cat# 3917 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Cat# 9087-70-1 | |
| Apyrase | NEB | Cat# M0398S | |
| Baculovirus transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10362100 | Voor de bereiding van P0-baculovirus |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | Cat# B6506 | |
| CHO-K1 | ATCC | N/A | |
| CHS | Sigma-Aldrich | Cat# C6512 | |
| CryoSPARC | Punjani, A., et al.,2017 | https://cryosparc.com/ | |
| DH5α competent E.coli | Thermo Fisher Scientific | Cat# EC0112 | |
| D-Luciferin-Potassium Salt | Sigma- Aldrich | Cat# 50227 | |
| DMSO | Sigma- Aldrich | Cat# D2438 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | Cat# S311-500 | |
| ESF921 cell culture medium | Expression Systems | Cat# 96-001 | |
| Excel | microsoft | N/A | |
| F12 medium | Invitrogen | Cat# 11765 | |
| FBS | Cell Box | Cat# SAG-01U-02 | |
| Flag resin | Sigma- Aldrich | Cat# A4596 | |
| Forskolin | APExBIO | Cat# B1421 | |
| Gctf | Zhang, 2016 | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | |
| GDN | Anatrace | Cat# GDN101 | |
| Gel filtration column | GE healthcare | Cat# 28990944 | |
| Gen5 3.11 | BIO-TEK | N/A | |
| Gentamicin | Solarbio | Cat# L1312 | |
| GloSensor cAMP assay kit | Promega | Cat# E1291 | Gi-remming cAMP-assaykit |
| GloSensor plasmid | Promega | Cat# E2301 | Sensorplasmid |
| Grace’s medium | GIBCO | Cat# 11595030 | |
| GraphPad Prism 8 | Graphpad | N/A | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88284 | |
| HEPES | Sigma- Aldrich | Cat# H4034 | |
| jetPRIME Reagent | Polyplus Transfection | Cat# 114-15 | transfectie reagens |
| Janamycin | Solarbio | Cat# K1030 | |
| LB medium | Invitrogen | Cat# 12780052 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | Cat# L2884 | |
| LMNG | Anatrace | Cat# NG310 | |
| MotionCor2 | (Zheng et al., 2017) | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | |
| NanoCab | Thermo Fisher Scientific | Cat# 1121822 | |
| PBS | Invitrogen | Cat# 14190-144 | |
| pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs | GenScript | N/A | |
| pFastBac1-Gαi | GenScript | N/A | |
| pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 | GenScript | N/A | |
| pFastBacdual-Gβ1γ2 | GenScript | N/A | |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | Cat# K210003 | Voor de bereiding van plasmiden en P0-baculovirus |
| Q5 site-Directed Mutagenesis kit | NEB | Cat# E0554S | Voor de bereiding van plasmiden |
| Quantifoil | Quantifoil | Cat# 251448 | |
| RELION-3.1 | (Zivanov et al., 2018) | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion | |
| S1PRs cDNA | addgene | N/A | |
| scFv16 | Invitrogen | Cat# 703976 | |
| Sf9 | Expression Systems | N/A | |
| Siponimod | Selleck | Cat# S7179 | |
| sodium cholate | Sigma-Aldrich | Cat# C1254 | |
| Synergy H1 microplate reader | BIO-TEK | N/A | |
| Synthetic T4L DNA (sequence) | N/A | N/A | Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac |
| TCEP | Thermo Fisher Scientific | Cat# 77720 | |
| Tetracycline | Solarbio | Cat# T8180 | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A |
Referenties
- Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
- Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
