Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Een pijplijn om de structuren en signaalroutes van sfingosine-1-fosfaatreceptoren te onderzoeken

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64054
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1, 1, 1
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University
* These authors contributed equally

Summary

S1P oefent zijn diverse fysiologische effecten uit via de S1P-receptoren (S1PR's) subfamilie. Hier wordt een pijplijn beschreven om de structuren en functie van S1PR's uit te leggen.

Abstract

Lysofosfolipiden (LPL's) zijn bioactieve lipiden die sfingosine-1-fosfaat (S1P), lysofosfatidisch zuur, enz. Omvatten. S1P, een metabolisch product van sfingolipiden in het celmembraan, is een van de best gekarakteriseerde LPL's die een verscheidenheid aan cellulaire fysiologische reacties reguleert via signaalroutes gemedieerd door sfingosine 1-fosfaatreceptoren (S1PR's). Dit impliceerde dat het S1P-S1PR-signaleringssysteem een opmerkelijk potentieel therapeutisch doelwit is voor aandoeningen, waaronder multiple sclerose (MS), auto-immuunziekten, kanker, ontsteking en zelfs COVID-19. S1PR's, een kleine subset van de klasse A G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) familie, zijn samengesteld uit vijf subtypen: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 en S1PR5. Het gebrek aan gedetailleerde structurele informatie belemmert echter de ontdekking van geneesmiddelen gericht op S1PR's. Hier pasten we de cryo-elektronenmicroscopiemethode toe om de structuur van het S1P-S1PR-complex op te lossen en het mechanisme van activering, selectieve medicijnherkenning en G-eiwitkoppeling op te helderen met behulp van celgebaseerde functionele assays. Andere lysofosfolipidereceptoren (LPLRs) en GPCR's kunnen ook worden bestudeerd met behulp van deze strategie.

Introduction

Sfingosine-1-fosfaat (S1P), een metabolisch product van sfingolipiden in het celmembraan, is een alomtegenwoordig lysofosfatidisch signaalmolecuul dat verschillende biologische activiteiten omvat, waaronder lymfocytenhandel, vasculaire ontwikkeling, endotheelintegriteit en hartslag 1,2,3. S1P oefent zijn diverse fysiologische effecten uit via vijf S1P-receptorsubtypen (S1PR's 1-5); S1PR's worden aangetroffen in een verscheidenheid aan weefsels en vertonen unieke voorkeuren voor downstream G-eiwitten 4,5. S1PR1 is voornamelijk gekoppeld aan het Gi-eiwit, dat vervolgens de cAMP-productie remt; S1PR2 en S1PR3 zijn gekoppeld aan Gi, Gq en G12/13, en S1PR4 en S1PR5 transduce signaal via Gi en G12/136.

S1P-S1PR-signalering is een cruciaal therapeutisch doelwit voor meerdere ziekten, waaronder auto-immuunziekten7, ontsteking8, kanker9 en zelfs COVID-1910. In 2010 werd fingolimod (FTY720) gelicentieerd als een eersteklas medicijn gericht op S1PR's voor de behandeling van recidief multiple sclerose (MS)11. Het is echter in staat om zich te binden aan alle S1PRRs behalve S1PR2, terwijl niet-specifieke binding aan S1PR3 resulteert in oedeem van de hersenschors, vasculaire en bronchiale vernauwing en longepitheellekkage12. Als alternatieve strategie voor het verhogen van de therapeutische selectiviteit zijn subtype-specifieke liganden voor de receptor geproduceerd. Siponimod (BAF312) werd in 2019 goedgekeurd voor de recidief MS behandeling13; het richt zich effectief op S1PR1 en S1PR5, terwijl het geen affiniteit heeft met S1PR3 en minder bijwerkingen vertoont in de klinische praktijk14. In 2020 heeft de Amerikaanse Food and Drug Administration ozanimod goedgekeurd voor MS-therapie15. Er is gemeld dat ozanimod een 25-voudig grotere selectiviteit heeft voor S1PR1 dan voor S1PR516. Met name in de context van de huidige COVID-19-pandemie is ontdekt dat agonisten die gericht zijn op S1PR's kunnen worden gebruikt om COVID-19 te behandelen met behulp van immunomodulerende therapietechnieken17. In vergelijking met fingolimod heeft de ozanimod superioriteit getoond in het verlagen van de symptomen bij COVID-19-patiënten en ondergaat nu klinische onderzoeken10. Inzicht in de structurele basis en functie van S1PR's legt een belangrijke basis voor het ontwikkelen van een medicijn dat zich selectief richt op S1PR's18.

Veel technieken worden gebruikt om de structurele informatie van biomacromolecules te onderzoeken, waaronder röntgenkristallografie, nucleaire magnetische resonantie (NMR) en elektronenmicroscopie (EM). Vanaf maart 2022 zijn er meer dan 180.000 structuren gedeponeerd op de Protein Databank (PDB), en de meeste daarvan zijn opgelost door röntgenkristallografie. Echter, met de eerste bijna-atomaire resolutiestructuur van TPRV1 (3,4 Å-resolutie) gerapporteerd door Yifan Cheng en David Julius in 201319, is cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) een mainstream techniek geworden voor eiwitstructuren, en het totale aantal EM PDB-structuren was meer dan 10.000. De kritieke doorbraakgebieden zijn de ontwikkeling van nieuwe camera's voor beeldvorming die bekend staan als directe elektronendetectiecamera's en nieuwe beeldverwerkingsalgoritmen. Cryo-EM heeft in het afgelopen decennium een revolutie teweeggebracht in de structuurbiologie en op structuur gebaseerde geneesmiddelenontdekking20. Omdat het begrijpen hoe macromoleculaire complexen hun gecompliceerde rollen in de levende cel vervullen een centraal thema is in de biologische wetenschappen, heeft cryo-EM het potentieel om conformaties van dynamische moleculaire complexen te onthullen, met name voor transmembraaneiwitten21. G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn de grootste superfamilie van transmembraaneiwitten en de doelen van meer dan 30% van de momenteel op de markt gebrachte geneesmiddelen22. De ontwikkeling van cryo-EM heeft bijgedragen aan een uitbarsting van hoge-resolutie structuren van GPCR-G eiwitcomplexen, waardoor structurele bepaling mogelijk is voor 'hardnekkige' doelen die nog steeds niet toegankelijk zijn voor röntgenkristallografische analyse in medicijnontwerp23. Daarom biedt de cryo-EM-toepassing een kans om de driedimensionale structuur van GPCR's te bepalen in bijna-inheemse omstandigheden bij bijna atomaire resolutie24. Vooruitgang in cryo-EM maakt het mogelijk om mechanistische onderbouwing van GPCR-stimulatie of -remming te visualiseren, en verder voordeel bij het ontdekken van de nieuwe bindingsplaatsen voor GPCR-gerichte medicijncreatie25.

Vertrouwend op de enorme vooruitgang van cryo-EM-technologie, hebben we structuren van gekwelde S1PR1-, S1PR3- en S1PR5-Gi-signaleringscomplexen geïdentificeerd die onlangs26,27 zijn. Bij mensen worden S1PR's gevonden in verschillende weefsels en vertonen ze unieke voorkeuren voor downstream G-eiwitten 4,5. S1PR1 wordt voornamelijk gekoppeld aan het Gi-eiwit, dat vervolgens de productie van 3′,5′-cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) remt. S1PR3 en S1PR5 kunnen ook worden gekoppeld aan Gi 6,28. Omdat Gi-gekoppelde receptoractivering de productie van cAMP29 vermindert, werd een Gi-inhibitie cAMP-test geïntroduceerd om cAMP-remmingseffecten te meten voor het vastleggen van functionele veranderingen26,27. Met behulp van een gemuteerde versie van Photinus pyralis luciferase waarin een cAMP-bindende eiwitgroep is ingebracht, biedt deze cAMP-test een eenvoudige en betrouwbare methode voor het monitoren van GPCR-activiteit door veranderingen in intracellulaire cAMP-concentratie30. Het is een gevoelige en niet-radioactieve functionele test en kan worden toegepast om de real-time downstream signalering van een breed scala aan GPCR's te monitoren voor het ontdekken van geneesmiddelen31.

Hier wordt een samenvatting gegeven van de kritieke methoden voor het oplossen van de activerings- en medicijnherkenningsmodi van S1PR's, voornamelijk inclusief cryo-EM-manipulaties en een Gi-inhibition cAMP-test. Dit artikel is bedoeld als uitgebreide experimentele leidraad voor verdere verkenningen van de structuren en functies van GPCR's.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Zuivering van het S1PR-G eiwitcomplex

  1. Om het menselijke S1PRRs-G-eiwitcomplex te zuiveren, kloont u de cDA's van S1PR1 zonder C-terminale residuen 338-382, de wild-type S1PR3, S1PR5 afgekapt met 345-398 bij C-terminus, en de wild-type Gi1 in de pFastBac1-vector en de cDNA's van het wildtype Gβ1 en Gγ2 in de pFastBacdual-vector (Materiaaltabel).
    OPMERKING: Alle constructen voor S1PR's bevatten ook de hemagglutinine (HA) signaalsequentie gevolgd door een Flag epitoop tag op de N-terminus en een 10x zijn tag op C-terminus. Ook werd een synthetische DNA-sequentie (Table of Materials) voor het vertalen van T4-lysozym (T4L) ingebracht in de N-terminus van S1PR's om receptorexpressie en -zuivering te vergemakkelijken.
  2. Bereiding van het baculovirus dat codeert voor S1PR's, Gi1 en Gβ1γ2
    1. Voeg de recombinante vectoren toe aan 50 μL DH5α competente Escherichia coli (E. coli), bewaard in een buis van 1,5 ml bij -80 °C, en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
    2. Schok de cellen bij 42 °C gedurende 90 s, breng ze onmiddellijk over op het ijs en koel ze gedurende 2 minuten.
    3. Schud de tube gedurende 3-5 uur bij 37 °C na suppletie met 300 μL lysogene bouillon (LB) medium. Breng 100 μL cellen naar de LB-agarplaat en incubeer bij 37 °C door 48 uur in het donker te blijven.
    4. Ent de witte kolonie in 5 ml LB-medium met 50 μg / ml kanamycine, 10 μg / ml tetracycline en 7 μg / ml gentamicine, en kweek bij 37 ° C gedurende 16 uur.
    5. Isoleer het recombinante bacmide met de plasmide miniprep kit (Tabel van Materialen) volgens de instructies van de fabrikant, voor het produceren van het P0 baculovirus.
      OPMERKING: Voor gebruik werd het gezuiverde bacmide geanalyseerd door PCR met pUC/M13 voorwaartse en omgekeerde primers. Voor de PCR, aantal cycli = 30 cycli, smelttemperatuur = 58 °C en verlengingstijd = 1 min per 1 Kb.
    6. Bereid P0 baculovirus zoals beschreven in een eerder protocol32.
      1. Kweek de sf9-cellen (ESF921-medium) in zesputtenplaten en controleer of de cellen zich in de logfase bevinden (1,0-1,5 x 106 cellen /ml).
      2. Verdun 8 μL baculovirustransfectiereagens in 100 μL grace's medium en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verdun 10 μg van het recombinante bacmide in 100 μL van Grace's medium en meng voorzichtig. Combineer het verdunde bacmide met verdund baculovirustransfectiereagens, meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Voeg het mengsel (bacmide en reagens) toe aan de cellen (stap 1.2.6.1) en verguld ze gedurende 3 uur bij 27 °C.
      4. Verwijder het medium van de Grace en vervang het door 2 ml ESF921 celkweekmedium. Plaats de zesputtenplaten op 27 °C en verzamel ESF921-celkweekmedium na 5 dagen na transfectie.
      5. Centrifugeer bij 500 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten om de cellen en het vuil te verwijderen. Breng het supernatant over in buizen van 2 ml. Dit is de P0 baculovirus stam.
    7. Isoleer P1-virusvoorraad
      1. Breng 30 ml sf9-cellen over in een conische fles, kweek bij 27 °C met schudden bij 270 rpm en controleer of de cellen een logfase bereiken (1,0-1,5 x 106 cellen /ml).
      2. Voeg 2 ml P0-virusbouillon toe aan de fles en schud gedurende 4 dagen bij 27 °C bij 27 rpm.
      3. Breng de cellen over in een buis van 50 ml, centrifugeer bij 1.800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de cellen en het vuil te verwijderen en breng het supernatant over in buizen van 50 ml. Dit is de P1 baculovirus stam.
    8. Baculovirale voorraad versterken
      1. Herhaal stap 1.2.7 met 50 ml sf9-cellen in de logfase (1,0-1,5 x 106 cellen/ml) en 1 ml P1-voorraad.
      2. Bewaar de resulterende P2 baculovirus voorraad bij 4 °C en bescherm deze tegen licht.
        OPMERKING: Versterk het baculovirus niet voor onbepaalde tijd, omdat de schadelijke mutanten bij elke passage werden geproduceerd.
  3. Expressie van S1PR's-G eiwitcomplex
    1. Kweek sf9 insectencellen om 2,5 x 106 cellen / ml dichtheid te bereiken, co-infecteren met het P2 baculovirus dat codeert voor S1PR's, Gi1 en Gβ1γ2 bij een volumeverhouding van 1: 2: 1, en kweek opnieuw bij 27 ° C gedurende 48 uur.
    2. Verzamel de cellen door ze gedurende 15 minuten te centrifugeren bij 700 x g bij 4 °C, vries ze in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C voor gebruik.
  4. Eiwitzuivering
    1. Ontdooi de celpellet verkregen in stap 1.3 bij kamertemperatuur en resuspensieer deze vervolgens in lysisbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2) aangevuld met 100 μg/ml benzamidine, 100 μg/ml leupeptine, 100 μg/ml aprotinine, 25 mU/ml apyrase en 10 μM agonist. Roer de celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om de vorming van het S1PRs-G-eiwitcomplex te induceren.
      OPMERKING: Apyrase is een ATP-difosfohydrolase. Het katalyseert de verwijdering van het gammafosfaat uit ATP en het bètafosfaat uit ADP.
    2. Breng de oplossing over in de buizen, centrifugeer op 70.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant voorzichtig. Resuspendeer de pellet in oplosbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 0,5% (w/v) LMNG, 0,1% (w/v) CHS, 1% (w/v) natrium cholaat, 10% (v/v) glycerol).
    3. Breng de suspensie over in een glazen Dounce en homogeniseer de pellet volledig. Voeg 10 μM agonist, 4 mg scFv16, 100 μg/ml benzamidine, 100 μg/ml leupeptine, 100 μg/ml aprotinine en 25 mU/ml apyrase toe aan de suspensie en roer gedurende 2 uur op 4 °C.
      OPMERKING: De stappen van het homogeniseren van de pellets zijn cruciaal voor de productie van het GPCR-G-eiwitcomplex.
    4. Breng de oplossing over in de buizen en centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    5. Breng de vlaghars vooraf in evenwicht met de wasbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 10 μM agonist, 0,0375% (w/v) LMNG, 0,0125% (w/v) GDN, 0,01% (w/v) CHS).
    6. Breng het supernatant over in de buizen en incubeer met de vlaghars bij 4 °C gedurende 2 uur.
    7. Laad het bovenstaande mengsel op de glazen kolom en was de kolom met 50 ml wasbuffer aangevuld met 100 μg/ml benzamidine, 100 μg/ml leupeptine en 100 μg/ml aprotinine.
    8. Eluteer de kolom met 10 ml van de elutiebuffer met 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 200 μg/ml Flag peptide, 10 μM agonist, 0,0375% (w/v) LMNG, 0,0125% (w/v) GDN, 0,01% (w/v) CHS, 100 μg/ml benzamidine, 100 μg/ml leupeptine en 100 μg/ml aprotinine.
    9. Verzamel het S1PRs-G eiwitcomplex en concentreer het tot 1 ml met behulp van een 100 kDa cut-off concentrator bij 1.300 x g bij 4 °C. Filtreer door een filter van 0,22 μM en centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de aggregaten te verwijderen.
    10. Laad het S1PR-G-eiwitcomplex op een gelfiltratiekolom met grootte-uitsluitingschromatografie (SEC), vooraf in evenwicht gebracht met de SEC-buffer met 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 μM-agonist, 100 Μm TCEP, 0,00375% (w/v) LMNG, 0,00125% (g/v) GDN en 0,001% (w/v) CHS bij een stroomsnelheid van 0,5 ml/min bij 4 °C.
    11. Verzamel de piekfracties en concentreer met behulp van een 100 kDa cut-off concentrator bij 1.300 x g bij 4 °C voor cryo-EM.

2. Elektronenmicroscopie om de S1PR-structuur op te lossen

  1. Dataverzameling
    1. Om de cryo-EM-roosters voor te bereiden, houdt u 300-mesh Au R1.2/ 1.3-roosters gedurende 10 s en gloeiafvoer gedurende 60 s bij 15 mA met behulp van een gloeiontladingsreinigingssysteem.
    2. Voer monsterverglazing uit zoals eerder beschreven33,34. Stel in de dompelbevriezingsconsole de temperatuur in op 4 °C en de relatieve vochtigheid op 100% voor de werkomgeving van de kamer. Gebruik blotkracht voor 0, wachttijd van 0 s, blottijd van 2 of 3 s en afvoertijd van 0 s. Het vereist meestal slechts 3 μL van het monster in concentraties van 5-10 mg / ml voor enkelvoudige vitrificatie.
    3. Klem en laad rasters in automatische rasterassemblage, laad automatische rasterassemblage in Nanocab en laad Nanocab in de microscoop met autoloader zoals eerder beschreven35. Scherm sample kwaliteit met EPU2 software34. Meestal waren de verzamelde gegevens op het gebied van geschikte ijsdikte beter.
    4. Verzamel cryo-EM-gegevens zoals eerder in detail beschreven35. Stel voor de S1P-receptor de onscherpteverschuiving in tussen -1,0 μm en -1,8 μm met de blootstellingselektronendosis van 50-65 e-/Å2. Verzamel voor de S1PR1-Gi-complexen automatisch filmstack met behulp van EPU2-software in de telmodus met de K2-detector bij een totale belichtingstijd van 2 s, een opnamesnelheid van vijf onbewerkte frames per seconde en een totale dosis van 56 e-/Å2 om 35 frames per stapel te produceren.
      OPMERKING: Meestal zijn er meer dan 5.000 films nodig om de receptorstructuur opnieuw op te bouwen.
  2. De gegevens verwerken met behulp van een combinatie van RELION36 en cryoSPARC37 om een ideale cryo-EM dichtheidskaart te verkrijgen. Gebruik RELION-3.1_gpu_ompi4 om de gegevens in eerste instantie te verwerken, waarbij vergelijkbare bewerkingen worden uitgevoerd als eerder beschreven34.
    1. Voer in de Linux-systeemterminal de bovenliggende map van de map voor gegevensopslag in.
    2. Voer het relion-commando in de terminal in om de RELION grafische gebruikersinterface (GUI) te openen.
      OPMERKING: Als dit de eerste keer is dat een RELION GUI in deze map is geopend, verschijnt er een promptvenster; klik op Ja.
    3. Klik op Importeren in de functiebalk aan de rechterkant van de RELION GUI om de onbewerkte gegevens in de RELION te importeren.
      1. Selecteer in de optie Films/microfoons Ja voor Raw-films/micrografieën importeren?, voer het gegevenspad in het veld Raw-invoerbestanden in (jokertekens worden aanbevolen) en selecteer Ja voor Zijn deze films met meerdere frames?. Voer de pixelgrootte van films in het veld Pixelgrootte (Angstrom), de bedrijfsspanning van de microscoop (in kV) in het veld Spanning (kV) en de sferische aberratie van de microscoop in het veld Sferische aberratie (mm). Dit zijn de parameters die werden vastgelegd op het moment van gegevensverzameling.
      2. Wijzig in de optie Actief de wachtrijnaam op basis van de server waarop het programma wordt uitgevoerd (andere functies moeten deze parameter ook wijzigen). Laat de andere parameters op de standaardwaarden staan die door RELION zijn ingesteld. Ten slotte, wanneer alle parameters correct zijn gedetecteerd, klikt u op UITVOEREN! om het programma uit te voeren.
    4. Gebruik de bewegingscorrectiefunctie voor de uitlijning van alle frames38.
      1. Klik in de I/O-optie op Bladeren en kies de uitvoer van de importfunctie met de naam movies.star als invoer van het STAR-bestand van invoerfilms. Voer de dosis per frame in het veld Dosis per frame (e/A2) in, dat gelijk is aan de totale dosis gedeeld door het aantal frames. Selecteer Nee bij Save sum of power spectra?.
      2. Voer in de optie Beweging 250 in voor B-factor, 5,5 voor Aantal patches X,Y en 2 voor Groepsframes (zorg voor de dosis groep >3). Als er tijdens de verzamelperiode geen gain-reference-afbeelding is gegenereerd, is een gain-referentieafbeelding nodig die kan worden verkregen door een leeg rastergebied te verwerven. Selecteer Nee voor Eigen implementatie van RELION gebruiken? en voer de map met het uitvoerbare bestand van MOTIONCOR239in het uitvoerbare veld MOTIONCOR2 in.
      3. Kies in de optie Actief het juiste MPI- en threadnummer op basis van de rekenkracht van de server; hier werden MPI = 8 en draden = 3 gebruikt.
    5. Gebruik de CTF-schattingsfunctie voor het moduleren van het cryo-EM-beeld van verglaasd monster40. Klik in de I/O-optie op Bladeren en kies de uitvoer van Motion cor met de naam gecorrigeerde micrographs.star als invoer van het STAR-bestand van invoerfilms. Selecteer in de optie Gctf in plaats daarvan Ja voor UseGctf?.
    6. Gebruik de subsetselectiefunctie om micrografieën met de waarde rlnCtfMaxResolutin >4 te verwijderen.
      1. Klik in de I/O-optie op Bladeren rechts van OR selecteer uit micrographs.star en kies de uitvoer van CtfFind met de naam micrographs_ctf.star als invoer. Selecteer in de optie Subset ja voor Selecteren op basis van metagegevenswaarden? en voer 4 in voor de maximale metagegevenswaarde om slechte gegevens te verwijderen.
    7. Handmatig kiezen: kies handmatig enkele afbeeldingen voor de voorlopige keuze en classificatie.
      1. Klik in de I/O-optie op Bladeren en kies micrographs_selected.star uit de vorige map Selecteren (stap 2.2.6) als invoer.
      2. Klik op RUN! (er verschijnt een venster). Klik op Bestand in de linkerbovenhoek van het nieuwe venster en klik op Selectie omkeren om de selectie van alle afbeeldingen te annuleren. Vink het meest linkse selectievak in de overeenkomstige rij van elk item aan en klik op kiezen om de afbeeldingen te controleren en ~ 500 goede afbeeldingen te selecteren. Klik op Bestand > Selectie opslaan om de geselecteerde afbeeldingen op te slaan en het venster te sluiten.
    8. Auto-picking: geautomatiseerde deeltjesverzamelsoftwarepakketten zijn nuttig en krachtig41.
      1. Klik in de I/O-optie op Bladeren rechts van Micrografieën invoeren voor autopick en kies micrographs_selected.star uit de vorige ManualPick-map (stap 2.2.7) als invoer. Het Laplacian-of-Gaussian-algoritme wordt in het begin gebruikt, dus selecteer Ja voor OR: gebruik Laplacian-of-Gaussian.
      2. Stel in de laplacische optie Min.diameter voor LoG-filter (A) in op 80 en Max.diameter voor LoG-filter (A) op 130. Stel in de optie Autopicking de minimale interdeeltjesafstand (A) in op 65 en selecteer Ja voor GPU-versnelling gebruiken als GPU toegankelijk is.
    9. Extraheer deeltjes voor de volgende stappen.
      1. Klik in de I/O-optie op Bladeren rechts van het STAR-micrografiebestand en kies de micrographs_selected.star uit stap 2.2.6. Klik op Bladeren rechts van invoercoördinaten en kies de cords_suffix_autopick.star uit stap 2.2.8.
      2. Selecteer in de optie Extract de optie Ja voor Deeltjes opnieuw schalen en stel de grootte opnieuw schalen (pixels) in op 128 om latere stappen te versnellen.
    10. 2D-classificatie voor voorlopige classificatie van deeltjes
      1. Klik in de I/O-optie op Bladeren rechts van het STAR-bestand met invoerafbeeldingen en kies de particles.star uit stap 2.2.9. Stel in de optie Optimalisatie het aantal klassen in op 100 en maskerdiameter (A) op 140.
      2. Stel in de optie Berekenen het aantal gepoolde deeltjes in op 10, voer de map in die zich op een snelle lokale schijf bevindt (bijvoorbeeld een SSD-schijf) in het veld Deeltje naar krasmap kopiëren en selecteer Ja voor GPU-versnelling gebruiken? voor een hogere verwerkingssnelheid.
    11. Subsetselectie voor het selecteren van goede 2D-resultaten als sjablonen om deeltjes te kiezen
      1. Klik in de I/O-optie op Bladeren rechts van Klassen selecteren van model.star en kies de uitvoer van stap 2.2.10 met de naam run_it025_model.star als invoer. Klik op RUN!. Vink in het pop-upvenster Afbeeldingen sorteren op en Sorteren omkeren aan en klik op Weergeven!.
      2. Kies goede representatieve 2D-resultaten als referentie voor referentie van de autoselectiefunctie .
        OPMERKING: De geselecteerde resultaten zijn rood verpakt. De goede en slechte 2D-classificatieresultaten worden later weergegeven.
      3. Klik met de rechtermuisknop en selecteer Geselecteerde klassen opslaan.
    12. Gebruik de sjabloon voor de tweede ronde van auto-picking. Klik in de I/O-optie op Bladeren rechts van Microfoto's invoeren voor autopick en kies micrographs_selected.star uit stap 2.2.6. Klik op Bladeren rechts van 2D-referenties, kies class_averages.star uit stap 2.2.11 en selecteer Nee voor OR: gebruik Laplacian-of-Gaussian.
    13. Voer de deeltjesextractie opnieuw uit met coord_suffix_autopick.star uit stap 2.2.12 en micrographs_selected.ster uit stap 2.2.6.
    14. Voer de 2D-classificatie opnieuw uit met particles.star uit stap 2.2.13.
    15. Voer de selectie van de subset opnieuw uit met run_it025_optimiser.star uit stap 2.2.14.
      OPMERKING: Alle 2D-afbeeldingen met duidelijke contouren en juiste vormen moeten worden gekozen.
    16. Voer deeltjesextractie als volgt uit. Klik in de I/O-optie op Bladeren rechts van het STAR-bestand voor micrografie, kies de micrographs_selected.star uit stap 2.2.6 en selecteer Ja voor OF geraffineerde deeltjes opnieuw extraheren?. Klik op Bladeren rechts van het STAR-bestand Geraffineerde deeltjes en kies de particles.star uit stap 2.2.15.
    17. 3D initieel model en het genereren van een referentiekaart: Klik in de I/O-optie op Bladeren rechts van het STAR-bestand invoerafbeeldingen en kies de particles.star uit stap 2.2.16. Stel Aantal klassen in op 1 en Maskerdiameter (A) op 140 in de optie Optimalisatie .
    18. 3D-classificatie en het genereren van een voorlopige 3D-kaart: Klik in de I/O-optie op Bladeren rechts van het STAR-bestand invoerafbeeldingen en kies de particles.star uit stap 2.2.16. Klik op Bladeren rechts van referentiekaart en kies de initial_model.mrc uit stap 2.2.17. Stel Aantal klassen in op 4-6 en Maskerdiameter (A) op 140 in de optie Optimalisatie .
    19. Maskergeneratie: Selecteer goede 3D-kaart(en) uit stap 2.2.17 als invoer in de I/O-optie . Stel de drempel voor initiële binarisatie in op 0,05 (aanpassen op basis van de uitvoer), Breid de binaire toewijzing uit naar 3 en voeg de zachte rand van dit aantal pixels toe aan 8 in de optie Masker .
    20. Gebruik cryoSPARC voor de volgende verwerking.
    21. Maak een nieuwe werkruimte en klik op Job Builder voor de eerste taak.
    22. Als u de deeltjesstapel wilt importeren, voert u het deeltjespad (stap 2.2.16) in het veld Deeltjesmetapad en het pad van de film (stap 2.2.16) in het veld Deeltjesgegevenspad in.
      OPMERKING: De parameters Accelerating Voltage (kV), Spherical Aberration (mm) en Pixel Size (Angstrom) zijn hetzelfde als voorheen. AmplitudeContrast (fractie) waarde is 0,1.
    23. Importeer 3D-volumes door het pad van het beste 3D-volume in stap 2.2.18 in te voeren in het volumegegevenspad en Kaart te selecteren voor Type volume dat wordt geïmporteerd.
    24. Importeer het masker door het maskerpad (stap 2.2.19) in het volumegegevenspad in te voeren en Masker te selecteren voor Type volume dat wordt geïmporteerd.
    25. Niet-uniforme verfijning: Neem de uitgangen van stap 2.2.22, 2.2.23 en 2.2.24 als invoer.
      OPMERKING: Deze functie is zeer nuttig voor membraaneiwitten.
      1. Sleep de uitvoer van stap 2.2.22 (imported_particles) als de invoer van deeltjes (deeltjes) van niet-uniforme verfijning,de uitvoer van stap 2.2.23 (imported_volume_1) als invoer van het volume (volume) van niet-uniforme verfijning en uitvoer van stap 2.2.24 (imported_mask_1) als invoer van het masker (masker) van niet-uniforme verfijning.
        OPMERKING: Soms kunnen betere resultaten worden bereikt zonder masker.
      2. Klik op Wachtrij om de verwerking te starten.
    26. Voer stap 2.2.18-2.2.25 uit voor betere resultaten. Door de bovenstaande verwerkingsreeks kan een goede resolutie S1PR-Gi 3D-kaart worden verkregen.

3. S1PR's-Gi gemedieerde cAMP-remmingstest

OPMERKING: Het S1PR-Gi gemedieerde cAMP-remmingsexperiment was verdeeld in verschillende delen en de volgende zijn gedetailleerde experimentele procedures. Het experimentele principe en het algemene experimentele proces zijn weergegeven in de vorm van een stroomschema in figuur 1.

  1. Plasmiden constructie
    1. Sub-kloon de cDNA's van wild-type S1PR1, S1PR3 en S1PR5 in de vector pcDNA3.1+ met een HA-signaalsequentie gevolgd door een Flag-tag op het N-terminus (Tabel van Materialen).
      OPMERKING: Mutaties voor alle receptoren werden gegenereerd met behulp van de mutagenesekit (Tabel van Materialen).
  2. Bereiding van het plasmide
    1. Voeg de recombinante pcDNA3.1+ vectoren of het sensorplasmide (materiaaltabel) toe aan 50 μL DH5α competente Escherichia coli (E. coli) opgeslagen in een buis van 1,5 ml bij -80 °C afzonderlijk, en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Schok de cellen bij 42 °C gedurende 90 s, breng ze onmiddellijk over op het ijs en koel ze gedurende 2 minuten.
      OPMERKING: Het sensorplasmide dat wordt geleverd door de Gi-inhibition cAMP-testkit (Table of Materials) brengt een gemodificeerd luciferase-gen tot expressie dat is gefuseerd met een cAMP-bindingsdomein en verhoogt de luminescentieactiviteit wanneer cAMP wordt gebonden.
    2. Schud de tube gedurende 1 uur bij 37 °C na suppletie met 300 μL lysogene bouillon (LB) medium. Breng 100 μL cellen naar de LB-agarplaat en incubeer bij 37 °C door 48 uur in het donker te blijven. Ent de witte kolonie in 5 ml LB-medium met 100 μg/ml ampicilline en kweek bij 37 °C gedurende 16 uur.
    3. Isoleer DNA met behulp van de plasmide miniprep kit (Tabel van Materialen) volgens de instructies van de fabrikant; het plasmide had een concentratie van meer dan 350 ng/μL met een waarde van A260/A280 tussen 1,7 en 1,9.
  3. Celkweek
    1. Leg de CHO-K1 cellen in een petrischaaltje van 10 cm, kweek ze in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en oogst ze wanneer de monolaag op 80%-90% samenvloeiing staat.
    2. Aspirateer het groeimedium van de CHO-K1-cellen, voeg 4 ml 0,05% trypsine-EDTA voorverwarmd bij 37 °C voorzichtig toe aan de petrischaal en incubeer gedurende 15 s. Voeg vervolgens 4 ml groeimedium toe, bestaande uit F12-medium + 10% FBS.
    3. Maak de cellen los van het oppervlak van de petrischaal door zachtjes te zwaaien en op de zijkant van de petrischaal te tikken. Vul een conische buis met celsuspensie. Roer en pipetteer langzaam om celklonters voorzichtig te verwijderen.
    4. Centrifugeer cellen bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, adem supernatant op en reanimeer met 3 ml PBS. Herhaal deze stap.
    5. Bepaal het celnummer met de hemacytometer en centrifugeer cellen bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Aspirate PBS buffer en resuspend CHO-K1 cellen met 3 ml groeimedium bestaande uit F12 medium en 10% FBS.
    7. Voeg 2 ml van het groeimedium bestaande uit F12-medium en 10% FBS toe aan elke put van de zesputtenplaat en zaai 150 μL celsuspensie in elke put om de cellen op de dichtheid van 1,5 x 105 cellen / ml te houden. Incubeer de zesputtenplaat in een weefselkweekincubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende ongeveer 24 uur.
  4. Voorbijgaande transfectie
    1. Verdun 2 μg DNA (stap 3.2.3) in 200 μL transfectiereagensbuffer (materiaaltabel). Meng door 10 s te vortexen en kort te draaien voor gebruik.
      OPMERKING: Hier bevat de 2 μg DNA 0,5 μg receptorvector (S1PR1, S1PR3 of S1PR5) en 1,5 μg sensorplasmide.
    2. Voeg 4 μL van het transfectiereagens (materiaaltabel), vortex gedurende 10 s toe en draai kort voor gebruik. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Laat langzaam 200 μL transfectiemengsel in elke put (met CHO-K1-cellen) vallen om gelijkmatig te verdelen. Schud de zes-wells plaat voorzichtig om een grondige menging te garanderen.
    4. Vervang het transfectiemedium na 4-6 uur door het celgroeimedium bestaande uit F12-medium + 10% FBS en breng de zesputtenplaat terug naar de incubator.
    5. Oogst cellen 24-48 h na transfectie.
      1. Vergist de CHO-K1 cellen op de put met 500 μL 0,05% trypsine-EDTA (voorverwarmd bij 37 °C) gedurende 15 s en voeg 1 ml groeimedium toe bestaande uit F12-medium + 10% FBS. Maak de cellen los van het putoppervlak door te schommelen en zachtjes op de zijkant van de put te tikken.
      2. Breng celsuspensie over naar een conische buis en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet het supernatant af en oogst de getransfecteerde cellen.
        OPMERKING: Controleer vóór de fluorescentiesignaalbepaling de celoppervlakexpressieniveaus van receptoren door ELISA zoals eerder beschreven26.
  5. Equilibratie met D-Luciferine-kaliumzout (Tabel van Materialen)
    1. Suspensie de geoogste cellen (24-48 uur na transfectie) onmiddellijk met 3 ml testbuffer (d.w.z. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 10 mM HEPES pH 7,4), met een extra 3% v/v verdunning van het D-Luciferine-kaliumzout.
    2. Voeg 90 μL celsuspensie toe per putje van een 96-well plaat met behulp van een meerkanaals pipet en meng voorzichtig.
    3. Incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Fluorescentiesignaalbepaling
    1. Bereid van tevoren 10 mM stamoplossingen van Siponimod opgelost in DMSO en maak een seriële verdunning met behulp van HBSS-buffer met 25 μM forskoline vóór ligandstimulatie.
      OPMERKING: Met uitzondering van de controlegroep zonder ligand, hebben de resterende een concentratiegradiëntbereik van 10-11-10-5 mol / L.
    2. Stimuleer met 10 μL (per putje) agonistenoplossing in verschillende concentraties gedurende 30 min.
    3. Tel de luminescentiesignalen op een microplaatlezer met behulp van de bijbehorende softwareparameters (Materiaaltabel) als volgt. Selecteer Luminescentie voor detectiemethode, Eindpunt voor leestype en luminescentievezel voor optiektype. Stel de Optics Gain in op 255.
      OPMERKING: Elke meting werd herhaald in ten minste drie onafhankelijke experimenten, elk in drievoud.
    4. Verkrijg de waarden van het fluorescentiesignaal, importeer de gegevens in een spreadsheetprogramma en verwerk de gegevens met behulp van de niet-lineaire regressie (curve fit) dosis-responsfunctie.

Figure 1
Figuur 1: Schematische illustratie van het experiment. Een gedetailleerde stapsgewijze handleiding voor experimentele opzet en uitvoering. Kortom, de receptor en gemodificeerd luciferase werden tijdelijk samen tot expressie gebracht in CHO-K1-cellen door de receptor en sensorplasmide in de cellen te transfecteren met transfectiereagens. De cellen werden gesuspendeerd in HBSS-oplossing met D-Luciferine-kaliumzout, het luciferasesubstraat, en na 24 uur in een 96-wellsplaat gezaaid. Om permeatie in de cellen mogelijk te maken, moet D-luciferine vooraf in evenwicht worden gebracht met de cellen. Het oxidatieve enzym luciferase transformeert luciferine in oxyluciferine en straalt licht uit. Het gemodificeerde luciferase daarentegen genereert alleen licht via een chemische reactie wanneer het gebonden is aan cAMP, en de intensiteit van het licht heeft een positieve associatie met cAMP-niveaus in cellen. De niveaus van cAMP werden gereguleerd met GPCR geactiveerd door agonist. Gi-gekoppelde receptoren verlaagden de niveaus van cAMP, waardoor de toevoeging van forskoline nodig was om de adenylylcyclase in het Gi-inhibition cAMP-experiment te activeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alvorens het monster van het S1PR-Gi-complex in te vriezen, moet het gezuiverde monster worden gescheiden door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en geanalyseerd met gelfiltratiechromatografie. Figuur 2 toont het S1PR3-Gi complex als voorbeeld. De piekfractie van het homogene GPCR-G-eiwitcomplex bevond zich meestal op ~10,5 ml van de grootte-uitsluitingschromatografie (figuur 2A). SDS-pagina analyse van het S1PR3-Gi complex (Figuur 2B) onthult vier banden die overeenkomen met de theoretische banden van S1PR3, Gαi, Gβ en scFv16, en suggereert dus dat het complex met succes werd gezuiverd. De receptorband werd vaak diffuus gevonden als gevolg van verschillende gradaties van modificatie (glycosylering of palmitoylering), en de band van Gγ werd niet gevonden.

Figure 2
Figuur 2: Analyse van eiwitzuiveringsresultaten (A) Gelfiltratiechromatogram dat de piekfractie toont die overeenkomt met het eiwit. (B) SDS-pagina gel elektroforese patroon. Dit cijfer is aangepast van referentie27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De complexe fracties van het S1PR3-Gi-complex werden verzameld en geconcentreerd voor elektronenmicroscopie. De procedures voor en representatieve resultaten van rasterverglazing en monsterscreening werden eerder besproken34. Een stroomdiagram (figuur 3) wordt gepresenteerd om een hoge resolutiestructuur van het S1PR-G-eiwitcomplex te verkrijgen met behulp van twee verschillende verwerkingsplatforms: RELION-3 en cryoSPARC v3.

Figure 3
Figuur 3: Gegevensverwerkingsworkflow van de pFTY720-gebonden S1PR3-Gi-scFv16-complexen. Cryo-EM dataverwerking flowchart van het pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16 complex wordt getoond. Representatieve cryo-EM micrograaf auto-picking, 2D-classificatiegemiddelden, 3D-reconstructies en niet-uniforme verfijning van het pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16-complex worden weergegeven in de figuur. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Films werden eerst geïmporteerd naar RELION-3 en vervolgens werden bewegingscorrectie en CTF-schatting uitgevoerd om gemiddelde micrografieën te genereren. Door deeltjes te plukken en iteratieve 2D-classificatie werden betere deeltjes verkregen voor verdere verwerking. Het is van cruciaal belang om deeltjes te selecteren met goed gedefinieerde 2D-klassen die duidelijk de secundaire structurele informatie van het S1PR3-Gi-complex vertegenwoordigen (figuur 4A), omdat deeltjes van slechte kwaliteit de volgende verwerkingsstadia kunnen belemmeren (figuur 4B), wat resulteert in een reconstructie met een lagere resolutie. Met behulp van 3D-classificatie werden de deeltjes verder geclassificeerd om ruisdeeltjes uit te sluiten, verschillende mogelijke conformaties te onderscheiden en meerdere 3D-reconstructies op te leveren. Uiteindelijk werd een S1PR3-Gi complexe EM-kaart (figuur 5A) geproduceerd met een goede resolutie via Fourier Shell Correlation (FSC) (figuur 5B), door middel van niet-uniforme verfijning.

Figure 4
Figuur 4: 2D-klassen selecteren. (A,B) Resultaten van 2D-classificatie. (A) Selecteer 2D-klassegemiddelden met goed gedefinieerde klassen voor verdere verwerking, en (B) verwerp gedeeltelijke deeltjes of deeltjes met een lage resolutie en ruis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Hoge resolutiestructuur van het pFTY720-gebonden S1PR3-Gi-scFv16-complexen. (A) De hoge-resolutiestructuur van het pFTY720-gebonden S1PR3-complex vertoont goed gedefinieerde cryo-EM-dichtheid die S1PR3- en Gi-eiwitstructuurelementen vertegenwoordigt. (B) Gold-standard Fourier shell correlation (FSC) curve voor pFTY720- gebonden S1PR3-Gi complex. Dit cijfer is aangepast van referentie27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Door de structuren van het S1PR-G-eiwitcomplex op te lossen met cryo-EM, hebben we het mechanisme van activering, selectieve medicijnherkenning en G-eiwitkoppeling opgehelderd met behulp van functionele assays in de cel. De Gi-inhibitie cAMP-test meet de veranderingen in het niveau van cAMP-concentratie in cellen (figuur 1) en werd vaak gebruikt om de activeringspotentie van receptoren in combinatie met Gs of Gi te valideren.

De concentratieverhouding van receptor tot sensorplasmide in het experimentele systeem is cruciaal voor experimentele levensvatbaarheid. Dus om functionele analyse effectief en nauwkeurig uit te voeren, moet men een plasmideconcentratieverhouding kiezen met een maximale E-maxwaarde. In dit experiment werden drie concentratieverhoudingen (1:1, 1:3 en 1:9) van receptor tot sensorplasmide onderzocht. De resultaten toonden aan dat een maximale Emax-waarde werd verkregen wanneer de concentratieverhouding van receptor tot sensorplasmide 1:3 was (figuur 6).

Figure 6
Figuur 6: Het effect van verschillende concentratieverhoudingen van S1PR3 tot sensorplasmide op de vensterperiode werd onderzocht in de CHO-K1-cellijn. Gegevens worden gepresenteerd als het middel ± SEM van drie onafhankelijke experimenten die in drievoud worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naast de concentratieverhouding van de receptor tot het Sensorplasmide, waren ook de cellijnen die in dit experiment werden gebruikt belangrijk. Er was geen wezenlijk verschil tussen HEK293 en CHO-K1 cellijnen voor de meeste receptoren. CHO-K1-cellijnen hadden daarentegen een realistischer algemene curve dan HEK293-cellen voor S1PR3 (figuur 7). Daarom werden CHO-K1-cellen gekozen voor de functionele experimentverificatie van S1PR3.

Figure 7
Figuur 7: Het effect van verschillende concentratieverhoudingen van S1PR3 tot sensorplasmide op de vensterperiode werd onderzocht in de HEK293-cellijn. Gegevens worden gepresenteerd als het middel ± SEM van drie onafhankelijke experimenten die in drievoud worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een primaire pijplijn voor het bepalen van de structuren van S1PR's door cryo-EM en het meten van de activeringspotentie van S1PR's door Gi-gemedieerde cAMP-remmingstest. Sommige stappen zijn cruciaal voor het succes van het experiment.

Om het S1PR-Gi-complex te zuiveren, moet meer aandacht worden besteed aan de kwaliteit van het virus en de gezondheid van sf9-cellen . De expressie van de receptor is dramatisch verminderd in arme sf9-cellen . De gezondheid van sf9-cellen werd beoordeeld door hun diameter te meten. De gezonde sf9-cel heeft een diameter van ongeveer 15 μm. De opbrengst van het S1PR-Gi-complex wordt beïnvloed door de volumeverhouding van de receptor-, Gi- en Gβγ-virussen die kunnen worden overwonnen door het S1PR-G-eiwitcomplex in vitro samen te stellen42. Bovendien zijn GPCR-G-eiwitcomplexen niet altijd stabiel, en daarom is de NanoBiT-strategie ontwikkeld en vaak toegepast om het complex43 te stabiliseren.

De kwaliteit van het monster is de basis voor alles in het cryo-EM experiment. Een aggregatie- of dissociatiefenomeen is vaak waargenomen bij specimenscreening. Sommige benaderingen kunnen nuttig zijn bij de stabilisatie van gpcr-g-eiwitcomplexen. De C-terminusresiduen van S1PR's kunnen monsteraggregatie veroorzaken in het S1PR-Gi-complexproject26. De signaalroutetest moet worden gebruikt om een aanvaardbaar C-terminaal uiteinde voor S1PR's26,27 te selecteren. De concentratie van de LMNG is de tweede meest essentiële factor; overmatige wasmiddelconcentraties kunnen het GPCR-G-eiwitcomplex stabiliseren, maar ze kunnen ook de resolutie ervan verminderen, terwijl lage concentraties het tegenovergestelde kunnen doen. Het cruciale aspect bij het stabiliseren van het complex is een optimale wasmiddelconcentratie die zo laag mogelijk is. Bovendien kan de concentratie van het monster af en toe van invloed zijn op de hoeveelheid verzamelde gegevens. Bij het vitrificeren van een monster maken we vaak een gradiënt. Bij gegevensverwerking is de keuze van algoritmen in deeltjesselectie en 2D- of 3D-classificatie belangrijk voor het oplossen van de S1PR's-G-eiwitcomplexen, met name voor het modelleren van de liganden en ECL's; de dichtheid van ECL's werd continu gevonden in de S1PR1-structuur opgelost in de literatuur beschreven door Shian Liu et al.42 en werd discontinu gevonden in S1PR5-structuren26. Hoewel er geen universele oplossing voor dit probleem is voor alle GPCR-complexen, moet elke strategie die de EM-dichtheidskaart verbetert, worden geprobeerd. De cruciale stappen voor vitrificatie, gegevensverzameling en beeldverwerking werden eerder beschreven34,44.

Een test is nodig om de activerings- of remmingspotentie van S1PR-liganden te evalueren nadat de structuren van S1PR's zijn bepaald door cryo-EM. Er kunnen tal van benaderingen worden gebruikt. Gi-inhibitie cAMP assay evalueert receptor activatie potentie door het monitoren van veranderingen in cAMP niveaus in cellen veroorzaakt door agonisten regelmatig. a) Celkweek, b) transfectie, c) de molverhouding van plasmidereceptor (of mutaties) en sensorplasmide, en d) de keuze van het celtype zijn allemaal cruciaal voor een succesvol experiment. De gezondheid van de cellen kan de transfectie-efficiëntie en receptor- of sensorexpressie beïnvloeden, wat een aanzienlijke invloed kan hebben op de signaal-ruisverhouding van het experiment. Cellen zijn over het algemeen gezond na 20 generaties, hoewel dit niet altijd het geval is. Het is van cruciaal belang om altijd de toestand van de cellen in de gaten te houden. De trypsineverteringsperiode tijdens de celpassage moet strak worden beheerd omdat de toestand van de cel in de loop van de tijd een aanzienlijke impact heeft. Transfectiereagentia beïnvloeden de receptorexpressie in verschillende celtypen en er moet een geschikt celmerk worden geselecteerd. De molverhouding van plasmidereceptor tot sensorplasmide in de Gi-inhibitie cAMP-test moet worden geoptimaliseerd. We kiezen vaak een reeks molverhoudingen tussen receptor en sensorplasmide en identificeren de hoogste variatie in fluorescentie-intensiteit om gegevensnauwkeurigheid te garanderen voor Gi-inhibitie cAMP-assay met receptormutanten.

Sommige andere testen worden gebruikt om cellulaire cAMP-niveaus te controleren in verschillende monstertypen, zoals ELISA-test45 en NanoBiT46. De cAMP ELISA-test wordt gebruikt om de hoeveelheid cAMP te meten die gebonden is aan het specifieke antilichaam. Het cAMP-specifieke antilichaam wordt verankerd op een microtiterplaat en de peroxidase cAMP-tracer concurreert met cAMP voor binding met het antilichaam. De hoeveelheid van de peroxidase cAMP-tracer die aan de plaat is gebonden, wordt gemeten met behulp van fluorometrische tests die omgekeerd evenredig is met de hoeveelheid cAMP. In 2007 ontwikkelden Jiang et al. een methode om de niveaus van cAMP in vivo kwantitatief en snel te monitoren met behulp van Bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET) technologie (cAMP sensor met behulp van YFP-Epac-RLuc)46. NanoBiT-gebaseerde cAMP-test past de cAMP-sensor LgBiT-Epac-SmBiT toe, die YFP en Rluc vervangt door respectievelijk LgBiT en SmBiT, en wordt gebruikt om de dissociatie van het G-eiwit heterotrimeer of koppeling tussen de receptor en G-eiwit heterotrimeer te meten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De gegevens van het S1PR-Gi-complex werden geoogst in het West China Cryo-EM Center in Sichuan University en Cryo-EM Center in de Southern University of Science and Technology (SUSTech) en verwerkt in het Duyu High-Performance Computing Center in Sichuan University. Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation of China (32100965 tot L.C., 32100988 tot W.Y., 31972916 tot Z.S.) en het fulltime Postdoctoraal Onderzoeksfonds van Sichuan University (2021SCU12003 tot L.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O'Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Tags

Biochemie Nummer 184
Een pijplijn om de structuren en signaalroutes van sfingosine-1-fosfaatreceptoren te onderzoeken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia,… More

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter