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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64054
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1, 1, 1
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University
* These authors contributed equally

Summary

S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen über die Unterfamilie der S1P-Rezeptoren (S1PRs). Hier wird eine Pipeline beschrieben, um die Strukturen und Funktionen von S1PRs zu erläutern.

Abstract

Lysophospholipide (LPLs) sind bioaktive Lipide, die Sphingosin-1-phosphat (S1P), Lysophosphatidsäure usw. enthalten. S1P, ein Stoffwechselprodukt von Sphingolipiden in der Zellmembran, ist eines der am besten charakterisierten LPLs, das eine Vielzahl von zellulären physiologischen Reaktionen über Signalwege reguliert, die durch Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptoren (S1PRs) vermittelt werden. Dies implizierte, dass das S1P-S1PRs-Signalsystem ein bemerkenswertes potenzielles therapeutisches Ziel für Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS), Autoimmunerkrankungen, Krebs, Entzündungen und sogar COVID-19 ist. S1PRs, eine kleine Untergruppe der GPCR-Familie (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren) der Klasse A, bestehen aus fünf Subtypen: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 und S1PR5. Der Mangel an detaillierten Strukturinformationen behindert jedoch die Wirkstoffentdeckung, die auf S1PRs abzielt. Hier haben wir die Kryo-Elektronenmikroskopie-Methode angewendet, um die Struktur des S1P-S1PRs-Komplexes aufzuklären, und den Mechanismus der Aktivierung, selektiven Wirkstofferkennung und G-Protein-Kopplung mithilfe zellbasierter funktioneller Assays aufgeklärt. Andere Lysophospholipidrezeptoren (LPLRs) und GPCRs können ebenfalls mit dieser Strategie untersucht werden.

Introduction

Sphingosin-1-phosphat (S1P), ein Stoffwechselprodukt von Sphingolipiden in der Zellmembran, ist ein ubiquitäres lysophosphatidisches Signalmolekül, das verschiedene biologische Aktivitäten umfasst, einschließlich Lymphozytentransport, vaskuläre Entwicklung, endotheliale Integrität und Herzfrequenz 1,2,3. S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen durch fünf S1P-Rezeptor-Subtypen (S1PRs 1-5); S1PRs kommen in einer Vielzahl von Geweben vor und zeigen einzigartige Präferenzen für nachgeschaltete G-Proteine 4,5. S1PR1 ist primär mit dem Gi-Protein gekoppelt, das anschließend die cAMP-Produktion hemmt; S1PR2 und S1PR3 sind mit Gi, Gq und G12/13 gekoppelt, und S1PR4 und S1PR5 übertragen Signale über Gi und G12/136.

Die S1P-S1PR-Signalübertragung ist ein kritisches therapeutisches Ziel für mehrere Krankheiten, darunter Autoimmunerkrankungen7, Entzündungen8, Krebs9 und sogar COVID-1910. Im Jahr 2010 wurde Fingolimod (FTY720) als First-in-Class-Medikament gegen S1PRs zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS)11 zugelassen. Es ist jedoch in der Lage, an alle S1PRs außer S1PR2 zu binden, während eine unspezifische Bindung an S1PR3 zu Ödemen der Großhirnrinde, Gefäß- und Bronchialverengung und Lungenepithelleckage führt12. Als alternative Strategie zur Erhöhung der therapeutischen Selektivität wurden subtypspezifische Liganden für den Rezeptor hergestellt. Siponimod (BAF312) wurde 2019 für die rezidivierende MS-Behandlung zugelassen13; Es zielt effektiv auf S1PR1 und S1PR5 ab, während es keine Affinität zu S1PR3 hat und in der klinischen Praxis weniger Nebenwirkungen aufweist14. Im Jahr 2020 genehmigte die US-amerikanische Food and Drug Administration Ozanimod für die MS-Therapie15. Es wurde berichtet, dass Ozanimod eine 25-fach höhere Selektivität für S1PR1 als für S1PR516 aufweist. Insbesondere wurde im Zusammenhang mit der aktuellen COVID-19-Pandemie entdeckt, dass agonistische Medikamente, die auf S1PRs abzielen, zur Behandlung von COVID-19 unter Verwendung immunmodulatorischer Therapietechniken eingesetzt werden können17. Im Vergleich zu Fingolimod hat Ozanimod eine Überlegenheit bei der Senkung der Symptome bei COVID-19-Patienten gezeigt und befindet sich nun in klinischen Studien10. Das Verständnis der strukturellen Basis und Funktion von S1PRs legt eine wichtige Grundlage für die Entwicklung eines Medikaments, das selektiv auf S1PRs18 abzielt.

Viele Techniken werden verwendet, um die Strukturinformationen von Biomakromolekülen zu untersuchen, einschließlich Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz (NMR) und Elektronenmikroskopie (EM). Mit Stand März 2022 sind mehr als 180.000 Strukturen in der Protein Databank (PDB) hinterlegt, von denen die meisten durch Röntgenkristallographie aufgelöst wurden. Mit der ersten nahezu atomaren Auflösungsstruktur von TPRV1 (3,4 Å Auflösung), die Yifan Cheng und David Julius 201319 berichteten, ist die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu einer Mainstream-Technik für Proteinstrukturen geworden, und die Gesamtzahl der EM-PDB-Strukturen betrug mehr als 10.000. Die entscheidenden Durchbruchsbereiche sind die Entwicklung neuer Kameras für die Bildgebung, die als direkte Elektronendetektionskameras bekannt sind, und neue Bildverarbeitungsalgorithmen. Kryo-EM hat die Strukturbiologie und die strukturbasierte Wirkstoffforschung in den letzten zehn Jahren revolutioniert20. Da das Verständnis, wie makromolekulare Komplexe ihre komplizierten Rollen in der lebenden Zelle erfüllen, ein zentrales Thema in den biologischen Wissenschaften ist, hat Kryo-EM das Potenzial, Konformationen dynamischer Molekülkomplexe aufzudecken, insbesondere für Transmembranproteine21. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Superfamilie von Transmembranproteinen und die Ziele von mehr als 30% der derzeit vermarkteten Arzneimittel22. Die Entwicklung von Kryo-EM hat zu einem Ausbruch hochauflösender Strukturen von GPCR-G-Proteinkomplexen beigetragen, was die Strukturbestimmung für "hartnäckige" Ziele ermöglicht, die für die röntgenkristallographische Analyse im Arzneimitteldesign noch nicht zugänglich sind23. Daher bietet die Kryo-EM-Anwendung die Möglichkeit, die dreidimensionale Struktur von GPCRs unter nahezu nativen Bedingungen mit nahezu atomarer Auflösung zu bestimmen24. Fortschritte in der Kryo-EM ermöglichen es, mechanistische Grundlagen der GPCR-Stimulation oder -Hemmung zu visualisieren und weitere Vorteile bei der Aufdeckung der neuartigen Bindungsstellen für die GPCR-zielgerichtete Arzneimittelherstellungzu erzielen 25.

Gestützt auf die enormen Fortschritte der Kryo-EM-Technologie haben wir kürzlich Strukturen von gequälten S1PR1-, S1PR3- und S1PR5-Gi-Signalkomplexen identifiziert26,27. Beim Menschen werden S1PRs in verschiedenen Geweben gefunden und zeigen einzigartige Präferenzen für nachgeschaltete G-Proteine 4,5. S1PR1 ist primär mit dem Gi-Protein gekoppelt, das anschließend die Produktion von 3′,5′-zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) hemmt. S1PR3 und S1PR5 können auch mit Gi 6,28 gekoppelt werden. Da die Gi-gekoppelte Rezeptoraktivierung die Produktion von cAMP29 verringert, wurde ein Gi-Inhibition cAMP-Assay eingeführt, um cAMP-Hemmungseffekte zur Erfassung funktioneller Veränderungen zu messen26,27. Unter Verwendung einer mutierten Version von Photinus pyralis luciferase, in die ein cAMP-bindendes Proteinteil eingefügt wurde, bietet dieser cAMP-Assay eine einfache und zuverlässige Methode zur Überwachung der GPCR-Aktivität durch Änderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration30. Es handelt sich um einen empfindlichen und nicht radioaktiven funktionellen Assay, der zur Überwachung der nachgeschalteten Echtzeitsignalisierung einer Vielzahl von GPCRs für die Wirkstoffforschung eingesetzt werdenkann 31.

Hier wird eine Zusammenfassung der kritischen Methoden zur Auflösung der Aktivierungs- und Arzneimittelerkennungsmodi von S1PRs gegeben, hauptsächlich einschließlich Kryo-EM-Manipulationen und eines Gi-Inhibition cAMP-Assays. Dieser Artikel zielt darauf ab, umfassende experimentelle Leitlinien für weitere Untersuchungen der Strukturen und Funktionen von GPCRs bereitzustellen.

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Protocol

1. Reinigung des S1PRs-G-Proteinkomplexes

  1. Um den humanen S1PRs-G-Proteinkomplex zu reinigen, klonen Sie die cDNAs von S1PR1 ohne C-terminale Reste 338-382, den Wildtyp S1PR3, S1PR5 abgeschnitten mit 345-398 am C-Terminus und den Wildtyp Gi1 in den pFastBac1-Vektor und die cDNAs des Wildtyps Gβ1 und Gγ2 in den pFastBacdual Vektor (Table of Materials).
    HINWEIS: Alle Konstrukte für S1PRs enthalten auch die Hämagglutinin (HA)-Signalsequenz, gefolgt von einem Flag-Epitop-Tag am N-Terminus und einem 10-fachen his-Tag am C-Terminus. Außerdem wurde eine synthetische DNA-Sequenz (Table of Materials) zur Übersetzung von T4-Lysozym (T4L) in den N-Terminus von S1PRs eingefügt, um die Rezeptorexpression und -reinigung zu erleichtern.
  2. Herstellung des Baculovirus, das für S1PRs, Gi1 und Gβ1γ2 kodiert
    1. Die rekombinanten Vektoren werden zu 50 μL DH5α-kompetentem Escherichia coli (E. coli) gegeben, das in einem 1,5-ml-Röhrchen bei -80 °C gelagert wird, und 30 min auf Eis inkubiert.
    2. Die Zellen 90 s lang bei 42 °C hitzeschocken, sofort auf das Eis überführen und 2 min kühlen.
    3. Schütteln Sie das Röhrchen bei 37 °C für 3-5 h nach Zugabe mit 300 μL Lysogeny Bouillon (LB) Medium. 100 μL Zellen in die LB-Agarplatte geben und bei 37 °C unter Dunkelhaltung 48 h inkubieren.
    4. Die weiße Kolonie wird in 5 ml LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin und 7 μg/ml Gentamicin und 16 h bei 37 °C kultiviert.
    5. Isolieren Sie das rekombinante Bacmid mit dem Plasmid-Miniprep-Kit (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Herstellung des P0-Baculovirus.
      HINWEIS: Vor der Verwendung wurde das gereinigte Bacmid mittels PCR mit pUC/M13 Forward- und Reverse-Primern analysiert. Für die PCR: Anzahl der Zyklen = 30 Zyklen, Schmelztemperatur = 58 °C und Verlängerungszeit = 1 min pro 1 Kb.
    6. Bereiten Sie das P0-Baculovirus wie in einem früheren Protokoll32 beschrieben vor.
      1. Kulturieren Sie die sf9-Zellen (ESF921 medium) in Sechs-Well-Platten und überprüfen Sie, ob sich die Zellen in der Log-Phase befinden (1,0-1,5 x 106 Zellen/ml).
      2. 8 μL Baculovirus-Transfektionsreagenz in 100 μL Grace-Medium verdünnen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Verdünnen Sie 10 μg des rekombinanten Bacmid in 100 μL des Grace-Mediums und mischen Sie vorsichtig. Kombinieren Sie das verdünnte Bacmid mit einem verdünnten Baculovirus-Transfektionsreagenz, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie es für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
      3. Die Mischung (Bacmid und Reagenz) wird auf die Zellen gegeben (Schritt 1.2.6.1) und 3 h lang bei 27 °C beschichtet.
      4. Entfernen Sie das Grace-Medium und ersetzen Sie es durch 2 ml ESF921-Zellkulturmedium. Die sechs Vertiefungsplatten bei 27 °C und das ESF921-Zellkulturmedium nach 5 Tagen nach der Transfektion auffangen.
      5. Zentrifugieren Sie bei 500 x g bei 4 °C für 10 min, um die Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in 2 ml Röhrchen. Dies ist der P0-Baculovirus-Bestand.
    7. P1-Virusbestand isolieren
      1. 30 ml sf9-Zellen in eine konische Flasche geben, bei 27 °C mit Schütteln bei 270 U/min kultivieren und überprüfen, ob die Zellen eine logarithmische Phase (1,0-1,5 x 106 Zellen/ml) erreichen.
      2. 2 ml P0-Virusbrühe in die Flasche geben und 4 Tage lang bei 270 °C bei 270 U/min schütteln.
      3. Die Zellen werden in ein 50-ml-Röhrchen überführt, bei 1.800 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zellen und Ablagerungen zu entfernen, und den Überstand in 50-ml-Röhrchen überführen. Dies ist der P1-Baculovirus-Bestand.
    8. Baculoviralen Bestand verstärken
      1. Wiederholen Sie Schritt 1.2.7 mit 50 ml sf9-Zellen in der Log-Phase (1,0-1,5 x 106 Zellen/ml) und 1 ml P1-Schaft.
      2. Lagern Sie den resultierenden P2-Baculovirus-Bestand bei 4 °C und schützen Sie ihn vor Licht.
        HINWEIS: Amplifizieren Sie das Baculovirus nicht unbegrenzt, da die schädlichen Mutanten mit jeder Passage produziert wurden.
  3. Expression des S1PRs-G-Proteinkomplexes
    1. Kultur von sf9-Insektenzellen , um eine Dichte von 2,5 x 106 Zellen / ml zu erreichen, Co-Infektion mit dem P2-Baculovirus, das für S1PRs, Gi1 und Gβ1γ2 kodiert, in einem Volumenverhältnis von 1: 2: 1 und Kultur erneut bei 27 ° C für 48 h.
    2. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 700 x g bei 4 °C für 15 min, frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei -80 °C für den Gebrauch.
  4. Proteinreinigung
    1. Das in Schritt 1.3 erhaltene Zellpellet wird bei Raumtemperatur aufgetaut und anschließend in Lysepuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2) resuspendiert, ergänzt mit 100 μg/ml Benzamidin, 100 μg/ml Leupeptin, 100 μg/ml Aprotinin, 25 mU/ml Apyrase und 10 μM Agonist. Rühren Sie die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 2 h ein, um die Bildung des S1PRs-G-Proteinkomplexes zu induzieren.
      HINWEIS: Apyrase ist eine ATP-Diphosphohydrolase. Es katalysiert die Entfernung des Gammaphosphats aus ATP und des Betaphosphats aus ADP.
    2. Die Lösung in die Röhrchen geben, bei 70.000 x g 10 min zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in Solubilisierungspuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl2, 0,5% (w/v) LMNG, 0,1% (w/v) CHS, 1% (w/v) Natriumcholat, 10% (v/v) Glycerin).
    3. Die Suspension in einen Glas-Dounce geben und das Pellet vollständig homogenisieren. 10 μM Agonist, 4 mg scFv16, 100 μg/ml Benzamidin, 100 μg/ml Leupeptin, 100 μg/ml Aprotinin und 25 mU/ml Apyrase in die Suspension geben und bei 4 °C 2 h rühren.
      HINWEIS: Die Schritte der Homogenisierung der Pellets sind entscheidend für die Herstellung des GPCR-G-Proteinkomplexes.
    4. Die Lösung in die Röhrchen geben und bei 100.000 x g 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
    5. Das Flaggenharz mit dem Waschpuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 10 μM Agonist, 0,0375% (w/v) LMNG, 0,0125% (w/v) GDN,0,01% (w/v) CHS) voräquilibrieren.
    6. Der Überstand wird in die Röhrchen überführt und mit dem Flaggenharz bei 4 °C für 2 h inkubiert.
    7. Laden Sie die obige Mischung auf die Glassäule und waschen Sie die Säule mit 50 ml Waschpuffer, ergänzt mit 100 μg/ml Benzamidin, 100 μg/ml Leupeptin und 100 μg/ml Aprotinin.
    8. Eluieren Sie die Säule mit 10 mL des Elutionspuffers, der 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 200 μg/ml Flag-Peptid, 10 μM Agonist, 0,0375% (w/v) LMNG, 0,0125% (w/v) GDN, 0,01% (w/v) CHS, 100 μg/ml Benzamidin, 100 μg/ml Leupeptin und 100 μg/ml Aprotinin enthält.
    9. Sammeln Sie den S1PRs-G-Proteinkomplex und konzentrieren Sie sich auf 1 ml mit einem 100 kDa Cut-off-Konzentrator bei 1.300 x g bei 4 °C. Durch einen 0,22-μM-Filter filtrieren und bei 13.000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Aggregate zu entfernen.
    10. Laden Sie den S1PRs-G-Proteinkomplex auf eine mit dem SEC-Puffer voräquilibrierte S1PRs-G-Proteinfiltrationssäule mit 20 mM HEPES-pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 μM Agonist, 100 μm TCEP, 0,00375 % (w/v) LMNG, 0,00125 % (w/v) GDN und 0,001 % (w/v) CHS bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min bei 4 °C.
    11. Sammeln Sie die Spitzenfraktionen und konzentrieren Sie sich mit einem 100-kDa-Cut-off-Konzentrator bei 1.300 x g bei 4 °C für Kryo-EM.

2. Elektronenmikroskopie zur Auflösung der S1PRs-Struktur

  1. Datensammlung
    1. Um die Kryo-EM-Gitter vorzubereiten, halten Sie 300-Mesh-Au R1.2/1.3-Gitter für 10 s und Glimmentladung für 60 s bei 15 mA mit einem Glimmentladungsreinigungssystem.
    2. Die Probenvitrifikation wird wie zuvor beschriebendurchgeführt 33,34. Stellen Sie in der Tauchgefrierkonsole die Temperatur auf 4 °C und die relative Luftfeuchtigkeit auf 100 % für die Arbeitsumgebung der Kammer ein. Verwenden Sie die Fleckkraft für 0, die Wartezeit von 0 s, die Abtupzeit von 2 oder 3 s und die Abflusszeit von 0 s. Es benötigt normalerweise nur 3 μL der Probe in Konzentrationen von 5-10 mg / ml für die einmalige Vitrifikation.
    3. Clippen und laden Sie Gitter in die automatische Rastermontage, laden Sie die automatische Gittermontage in Nanocab und laden Sie Nanocab mit dem Autoloader in das Mikroskop, wie zuvorbeschrieben 35. Probenqualität mit EPU2-Software34. In der Regel waren die Daten, die in den Bereichen mit geeigneter Eisdicke gesammelt wurden, besser.
    4. Sammeln Sie Kryo-EM-Daten, wie zuvor ausführlich beschrieben35. Für den S1P-Rezeptor ist der Defokus-Offset zwischen -1,0 μm und -1,8 μm mit der Expositionselektronendosis von 50-65 e-/Å2einzustellen. Für die S1PR1-Gi-Komplexe erfassen Sie den Filmstapel automatisch mithilfe der EPU2-Software im Zählmodus mit dem K2-Detektor bei einer Gesamtbelichtungszeit von 2 s, einer Aufnahmerate von fünf Rohbildern pro Sekunde und einer Gesamtdosis von 56 e-/Å2 , um 35 Bilder pro Stapel zu erzeugen.
      HINWEIS: Normalerweise werden mehr als 5.000 Filme benötigt, um die Rezeptorstruktur wieder aufzubauen.
  2. Verarbeiten Sie die Daten mit einer Kombination von RELION36 und cryoSPARC37 , um eine ideale Kryo-EM-Dichtekarte zu erhalten. Verwenden Sie RELION-3.1_gpu_ompi4, um die Daten anfänglich zu verarbeiten, was ähnliche Vorgänge wie zuvor beschrieben beinhaltet34.
    1. Geben Sie im Linux-Systemterminal das übergeordnete Verzeichnis des Datenspeicherverzeichnisses ein.
    2. Geben Sie im Terminal den Befehl relion ein, um die grafische Benutzeroberfläche (GUI) von RELION zu öffnen.
      HINWEIS: Wenn dies das erste Mal ist, dass eine RELION GUI in diesem Verzeichnis geöffnet wird, wird ein Eingabeaufforderungsfenster angezeigt. Klicken Sie auf Ja.
    3. Klicken Sie in der Funktionsleiste auf der rechten Seite der RELION GUI auf Importieren , um die Rohdaten in den RELION zu importieren.
      1. Wählen Sie in der Option Filme/Mikrofone die Option Ja für Rohfilme/Mikrobilder importieren?, geben Sie den Datenpfad in das Feld Roheingabedateien ein (Platzhalter werden empfohlen), und wählen Sie Ja für Sind diese Multiframefilme? aus. Geben Sie die Pixelgröße von Filmen in das Feld Pixelgröße (Angström), die Betriebsspannung des Mikroskops (in kV) im Feld Spannung (kV) und die sphärische Aberration des Mikroskops in das Feld Sphärische Aberration (mm) ein. Dies sind die Parameter, die zum Zeitpunkt der Datenerhebung aufgezeichnet wurden.
      2. Ändern Sie in der Option Wird ausgeführt den Namen der Warteschlange entsprechend dem Server, auf dem das Programm ausgeführt wird (andere Funktionen müssen diesen Parameter ebenfalls ändern). Belassen Sie die anderen Parameter auf den von LIONEN festgelegten Standardwerten. Wenn schließlich alle Parameter korrekt erkannt wurden, klicken Sie auf AUSFÜHREN!, um das Programm auszuführen.
    4. Verwenden Sie die Bewegungskorrekturfunktion für die Ausrichtung aller Bilder38.
      1. Klicken Sie in der I/O-Option auf Durchsuchen und wählen Sie die Ausgabe der Importfunktion movies.star als Eingabe der Eingabefilm-STAR-Datei. Geben Sie Dosis pro Bild in das Feld Dosis pro Bild (e/A2) ein, was der Gesamtdosis dividiert durch die Anzahl der Bilder entspricht. Wählen Sie Nein für Summe der Leistungsspektren speichern?.
      2. Geben Sie in der Option Bewegung 250 für B-Faktor, 5,5 für Anzahl der Patches X,Y und 2 für Gruppenframes ein (stellen Sie sicher, dass die Dosis der Gruppe >3) ist. Wenn die Daten während des Erfassungszeitraums nicht verstärkungsreferenziert wurden, wird ein Verstärkungsreferenzbild benötigt, das durch Erfassung eines leeren Rasterbereichs erhalten werden kann. Wählen Sie Nein für RELIONs eigene Implementierung verwenden? und geben Sie das Verzeichnis mit der ausführbaren Datei von MOTIONCOR2 39 in das ausführbare Feld MOTIONCOR2 ein.
      3. Wählen Sie in der Option Wird ausgeführt die entsprechende MPI- und Thread-Nummer entsprechend der Rechenleistung des Servers aus. hier wurden MPI = 8 und Gewinde = 3 verwendet.
    5. Verwenden Sie die CTF-Schätzfunktion zur Modulation des Kryo-EM-Bildes der vitrifizierten Probe40. Klicken Sie in der I/O-Option auf Durchsuchen und wählen Sie die Ausgabe von Motion cor namens corrected micrographs.star als Eingabe der Eingabefilme STAR-Datei. Wählen Sie in der Option Gctf stattdessen Ja für UseGctf aus.
    6. Verwenden Sie die Subset-Auswahlfunktion , um Schliffbilder mit dem Wert rlnCtfMaxResolutin >4 zu entfernen.
      1. Klicken Sie in der I/O-Option auf Durchsuchen auf der rechten Seite von ODER wählen Sie aus micrographs.star und wählen Sie die Ausgabe von CtfFind mit dem Namen micrographs_ctf.star als Eingabe. Wählen Sie in der Option Teilmenge die Option Ja für Basierend auf Metadatenwerten auswählen? aus, und geben Sie 4 als Maximaler Metadatenwert zum Entfernen fehlerhafter Daten ein.
    7. Manuelle Kommissionierung: Wählen Sie einige Bilder manuell für die vorläufige Auswahl und Klassifizierung aus.
      1. Klicken Sie in der I/O-Option auf Durchsuchen und wählen Sie micrographs_selected.star aus dem vorherigen Verzeichnis auswählen (Schritt 2.2.6) als Eingabe.
      2. Klicken Sie auf RUN! (ein Fenster erscheint). Klicken Sie auf Datei in der oberen linken Ecke des neuen Fensters und klicken Sie auf Auswahl umkehren , um die Auswahl aller Bilder aufzuheben. Aktivieren Sie das Auswahlfeld ganz links in der entsprechenden Zeile jedes Eintrags und klicken Sie auf Auswählen , um die Bilder zu überprüfen und ~500 gute Bilder auszuwählen. Klicken Sie auf Datei > Auswahl speichern, um die ausgewählten Bilder zu speichern und das Fenster zu schließen.
    8. Auto-Picking: Automatisierte Partikelpicking-Softwarepakete sind nützlich und leistungsstark41.
      1. Klicken Sie in der I/O-Option rechts neben Input microGraphs for autopick auf Browse (Durchsuchen) und wählen Sie micrographs_selected.star aus dem vorherigen ManualPick-Verzeichnis (Schritt 2.2.7) als Eingabe. Am Anfang wird der Laplacian-of-Gauß-Algorithmus verwendet, also wählen Sie Ja für ODER: Laplacian-of-Gauß verwenden.
      2. Setzen Sie in der Option Laplacian Min.diameter für LoG-Filter (A) auf 80 und Max.diameter für LoG-Filter (A) auf 130. Legen Sie in der Option Autopicking die Option Minimaler Partikelabstand (A) auf 65 fest, und wählen Sie Ja für GPU-Beschleunigung verwenden, wenn auf GPU zugegriffen werden kann.
    9. Extrahieren Sie Partikel für die nächsten Schritte.
      1. Klicken Sie in der I/O-Option auf Browse (Navigieren ) rechts neben der Mikrographie-STAR-Datei und wählen Sie die Datei micrographs_selected.star aus Schritt 2.2.6 aus. Klicken Sie rechts neben Eingabekoordinaten auf Durchsuchen und wählen Sie den cords_suffix_autopick.star aus Schritt 2.2.8 aus.
      2. Wählen Sie in der Option Extrahieren die Option Ja für Partikel neu skalieren aus, und legen Sie die Größe neu skaliert (Pixel) auf 128 fest, um spätere Schritte zu beschleunigen.
    10. 2D-Klassifizierung zur vorläufigen Klassifizierung von Partikeln
      1. Klicken Sie in der I/O-Option rechts neben Input images STAR-Datei auf Browse (Navigieren) rechts neben Input images STAR und wählen Sie die Datei particles.star aus Schritt 2.2.9 aus. Legen Sie in der Option Optimierung Anzahl der Klassen auf 100 und Maskendurchmesser (A) auf 140 fest.
      2. Legen Sie in der Option " Berechnen" die Option Anzahl der gepoolten Partikel auf 10 fest, geben Sie das Verzeichnis ein, das sich auf einem schnellen lokalen Laufwerk (z. B. einem SSD-Laufwerk) im Feld Partikel in Scratch-Verzeichnis kopieren befindet, und wählen Sie Ja für GPU-Beschleunigung verwenden? für eine schnellere Verarbeitungsgeschwindigkeit.
    11. Teilmengenauswahl zur Auswahl guter 2D-Ergebnisse als Vorlagen zur Auswahl von Partikeln
      1. Klicken Sie in der I/O-Option rechts neben Klassen aus model.star auswählen auf Durchsuchen und wählen Sie die Ausgabe von Schritt 2.2.10 mit dem Namen run_it025_model.star als Eingabe. Klicken Sie auf RUN!. Aktivieren Sie im Popup-Fenster Bilder sortieren und Sortierung umkehren? und klicken Sie auf Anzeige!.
      2. Wählen Sie gute repräsentative 2D-Ergebnisse als Referenz für Referenz der Auto-Picking-Funktion .
        HINWEIS: Die ausgewählten Ergebnisse sind rot eingerahmt. Die guten und schlechten 2D-Klassifizierungsergebnisse werden später angezeigt.
      3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Ausgewählte Klassen speichern aus.
    12. Verwenden Sie die Vorlage für die zweite Runde der automatischen Kommissionierung. Klicken Sie in der I/O-Option rechts neben Input micrographs for autopick auf Browse (Durchsuchen) und wählen Sie micrographs_selected.star aus Schritt 2.2.6. Klicken Sie rechts neben 2D-Referenzen auf Durchsuchen, wählen Sie class_averages.star aus Schritt 2.2.11 und wählen Sie Nein für ODER: Laplacian-of-Gaussia n verwenden.
    13. Führen Sie die Partikelextraktion erneut mit coord_suffix_autopick.star aus Schritt 2.2.12 und micrographs_selected.star aus Schritt 2.2.6 durch.
    14. Führen Sie die 2D-Klassifizierung mit particles.star aus Schritt 2.2.13 erneut durch.
    15. Führen Sie die Teilmengenauswahl mit run_it025_optimiser.star aus Schritt 2.2.14 erneut durch.
      HINWEIS: Alle 2D-Bilder mit klaren Konturen und korrekten Formen müssen ausgewählt werden.
    16. Führen Sie die Partikelextraktion wie folgt durch. Klicken Sie in der I/O-Option auf Browse right from micrograph STAR file, wählen Sie die Datei micrographs_selected.star aus Schritt 2.2.6 und wählen Sie Ja für ODER raffinierte Partikel erneut extrahieren?. Klicken Sie rechts neben Raffinierte Partikel auf STAR-Datei navigieren und wählen Sie die Datei particles.star aus Schritt 2.2.15 aus.
    17. 3D-Ausgangsmodell und Generierung einer Referenzkarte: Klicken Sie in der I /O-Option rechts neben Input images STAR file auf Browse (Navigieren) rechts neben Input images STAR file und wählen Sie die Datei particles.star aus Schritt 2.2.16 aus. Legen Sie Anzahl der Klassen auf 1 und Maskendurchmesser (A) auf 140 in der Option Optimierung fest.
    18. 3D-Klassifizierung und Generierung einer vorläufigen 3D-Karte: Klicken Sie in der I/O-Option rechts neben Input images STAR-Datei auf Browse und wählen Sie die Datei particles.star aus Schritt 2.2.16. Klicken Sie rechts neben Referenzkarte auf Durchsuchen und wählen Sie die Datei initial_model.mrc aus Schritt 2.2.17 aus. Legen Sie Anzahl der Klassen auf 4-6 und Maskendurchmesser (A) auf 140 in der Option Optimierung fest.
    19. Maskengenerierung: Wählen Sie gute 3D-Karten aus Schritt 2.2.17 als Eingabe in der I/O-Option aus. Legen Sie den anfänglichen Binarisierungsschwellenwert auf 0,05 fest (passen Sie ihn basierend auf der Ausgabe an), Erweitern Sie die Binärzuordnung so viele Pixel auf 3 und fügen Sie die weiche Kante dieser vielen Pixel auf 8 in der Option " Maske" hinzu.
    20. Verwenden Sie cryoSPARC für die nächste Verarbeitung.
    21. Erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich und klicken Sie auf Job Builder für den ersten Auftrag.
    22. Um den Partikelstapel zu importieren, geben Sie den Partikelpfad (Schritt 2.2.16) in das Feld Partikelmetapfad und den Pfad des Films (Schritt 2.2.16) in das Feld Partikeldatenpfad ein.
      HINWEIS: Die Parameter Accelerating Voltage (kV), Spherical Aberration (mm) und Pixel Size (Angström) sind die gleichen wie zuvor. Der Wert für Amplitudenkontrast (Bruch) beträgt 0,1.
    23. Importieren Sie 3D-Volumes, indem Sie den Pfad des besten 3D-Volumes in Schritt 2.2.18 im Volume-Datenpfad eingeben und unter Typ des zu importierenden Volumes die Option Karte auswählen.
    24. Importmaske, indem Sie den Maskenpfad (Schritt 2.2.19) in den Datenpfad Volume eingeben und Maske für Typ des zu importierenden Volumes auswählen.
    25. Ungleichmäßige Verfeinerung: Nehmen Sie die Ausgaben der Schritte 2.2.22, 2.2.23 und 2.2.24 als Eingabe.
      HINWEIS: Diese Funktion ist sehr nützlich für Membranproteine.
      1. Ziehen Sie die Ausgabe von Schritt 2.2.22 (imported_particles) als Eingabe der Partikel (Partikel) der ungleichmäßigen Verfeinerung, die Ausgabe von Schritt 2.2.23 (imported_volume_1) als Eingabe des Volumens (Volumen) der ungleichmäßigen Verfeinerung und die Ausgabe von Schritt 2.2.24 (imported_mask_1) als Eingabe der Maske (Maske der ungleichmäßigen Verfeinerung).
        HINWEIS: Manchmal können bessere Ergebnisse ohne Maske erzielt werden.
      2. Klicken Sie auf Warteschlange , um die Verarbeitung zu starten.
    26. Führen Sie die Schritte 2.2.18-2.2.25 aus, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Durch die obige Verarbeitungsreihe kann eine S1PR-Gi 3D-Karte mit guter Auflösung erhalten werden.

3. S1PRs-Gi-vermittelter cAMP-Hemmungsassay

HINWEIS: Das S1PRs-Gi-vermittelte cAMP-Hemmungsexperiment wurde in mehrere Teile unterteilt, und die folgenden experimentellen Verfahren sind detailliert. Das Versuchsprinzip und der allgemeine Versuchsablauf sind in Form eines Flussdiagramms in Abbildung 1 dargestellt.

  1. Plasmidbau
    1. Subklonen Sie die cDNAs des Wildtyps S1PR1, S1PR3 und S1PR5 in den Vektor pcDNA3.1+ mit einer HA-Signalsequenz, gefolgt von einem Flag-Tag am N-Terminus (Table of Materials).
      HINWEIS: Mutationen für alle Rezeptoren wurden mit dem Mutagenese-Kit (Table of Materials) erzeugt.
  2. Herstellung des Plasmids
    1. Die rekombinanten pcDNA3.1+-Vektoren oder das Sensorplasmid (Table of Materials) werden zu 50 μL DH5α-kompetentem Escherichia coli (E. coli) gegeben, die in einem 1,5-ml-Röhrchen bei -80 °C separat gelagert werden, und 30 min auf Eis inkubieren. Die Zellen 90 s lang bei 42 °C hitzeschocken, sofort auf das Eis überführen und 2 min kühlen.
      HINWEIS: Das Sensorplasmid, das vom Gi-Inhibition cAMP Assay Kit (Table of Materials) bereitgestellt wird, exprimiert ein modifiziertes Luciferase-Gen, das mit einer cAMP-Bindungsdomäne fusioniert ist, und erhöht die Lumineszenzaktivität, wenn cAMP gebunden ist.
    2. Schütteln Sie das Röhrchen bei 37 °C für 1 h nach Zugabe mit 300 μL Lysogeny Bouillon (LB) Medium. 100 μL Zellen in die LB-Agarplatte geben und bei 37 °C unter Dunkelhaltung 48 h inkubieren. Die weiße Kolonie wird in 5 ml LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin geimpft und 16 h lang bei 37 °C kultiviert.
    3. Isolierung der DNA mit dem Plasmid-Miniprep-Kit (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers; das Plasmid lag in einer Konzentration von über 350 ng/μL mit einem Wert von A260/A280 zwischen 1,7 und 1,9.
  3. Zellkultur
    1. Die CHO-K1-Zellen in einer 10 cm großen Petrischale beschichten, in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2 kultivieren und ernten, wenn die Monoschicht bei 80%-90% Konfluenz ist.
    2. Das Wachstumsmedium der CHO-K1-Zellen absaugen, 4 ml 0,05% Trypsin-EDTA, vorgewärmt bei 37 °C, vorsichtig auf die Petrischale geben und 15 s inkubieren. Fügen Sie dann 4 ml Wachstumsmedium hinzu, bestehend aus F12-Medium + 10% FBS.
    3. Lösen Sie die Zellen von der Petrischalenoberfläche, indem Sie sanft wiegen und auf die Seite der Petrischale klopfen. Füllen Sie ein konisches Röhrchen mit Zellsuspension. Rühren und pipetten Sie langsam, um Zellklumpen vorsichtig zu entfernen.
    4. Zentrifugieren Sie Zellen bei 250 x g für 5 min bei Raumtemperatur, aspirieren Sie den Überstand und reanimieren Sie sie mit 3 mL PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt.
    5. Bestimmen Sie die Zellzahl mit dem Hämazytometer und zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    6. Saugen Sie PBS-Zellen mit 3 ml Wachstumsmedium bestehend aus F12-Medium und 10% FBS ab und resuspendieren Sie sie.
    7. Fügen Sie 2 ml des Wachstumsmediums, bestehend aus F12-Medium und 10% FBS, in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte hinzu und säen Sie 150 μL Zellsuspension in jede Vertiefung, um die Zellen bei der Dichte von 1,5 x 105 Zellen / ml zu halten. Die Sechs-Well-Platte in einem 37 °C Gewebekultur-Inkubator mit 5%CO2 für ca. 24 h inkubieren.
  4. Transiente Transfektion
    1. 2 μg DNA (Schritt 3.2.3) werden in 200 μl Transfektionsreagenzienpuffer (Materialtabelle) verdünnt. Mischen Sie durch Wirbeln für 10 s und kurz drehen vor Gebrauch.
      HINWEIS: Hier enthalten die 2 μg DNA 0,5 μg Rezeptorvektor (S1PR1, S1PR3 oder S1PR5) und 1,5 μg des Sensorplasmids.
    2. Fügen Sie 4 μL des Transfektionsreagenz (Table of Materials) hinzu, wirbeln Sie für 10 s und drehen Sie kurz vor Gebrauch. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Lassen Sie langsam 200 μL Transfektionsmischung in jede Vertiefung (die CHO-K1-Zellen enthält) fallen, um sie gleichmäßig zu verteilen. Schütteln Sie die Sechs-Well-Platte vorsichtig, um eine gründliche Mischung zu gewährleisten.
    4. Ersetzen Sie das Transfektionsmedium nach 4-6 h durch das Zellwachstumsmedium, das aus F12-Medium + 10% FBS besteht, und bringen Sie die Sechs-Well-Platte in den Inkubator zurück.
    5. Erntezellen 24-48 h nach der Transfektion.
      1. Die CHO-K1-Zellen auf der Vertiefung mit 500 μL 0,05% Trypsin-EDTA (vorgewärmt bei 37 °C) für 15 s aufschließen und 1 ml Wachstumsmedium bestehend aus F12-Medium + 10% FBS hinzufügen. Lösen Sie die Zellen von der Brunnenoberfläche, indem Sie die Seite des Brunnens schaukeln und vorsichtig klopfen.
      2. Die Zellsuspension in ein konisches Röhrchen überführen und bei 250 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand ab und ernten Sie die transfizierten Zellen.
        HINWEIS: Überprüfen Sie vor der Bestimmung des Fluoreszenzsignals die Zelloberflächenexpression von Rezeptoren durch ELISA wie zuvor beschrieben26.
  5. Gleichgewicht mit D-Luciferin-Kaliumsalz (Table of Materials)
    1. Die entnommenen Zellen (24-48 h nach der Transfektion) werden sofort mit 3 ml Assay-Puffer suspendiert (d. h. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10 mM HEPES pH 7,4), mit einer zusätzlichen 3% v/v Verdünnung des D-Luciferin-Kaliumsalzes.
    2. Fügen Sie 90 μL Zellsuspension pro Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette hinzu und mischen Sie vorsichtig.
    3. 40 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Bestimmung des Fluoreszenzsignals
    1. Bereiten Sie im Voraus 10 mM Stammlösungen von Siponimod gelöst in DMSO vor und führen Sie vor der Ligandenstimulation eine serielle Verdünnung unter Verwendung eines HBSS-Puffers durch, der 25 μM Forskolin enthält.
      HINWEIS: Mit Ausnahme der Kontrollgruppe ohne Liganden haben die übrigen einen Konzentrationsgradientenbereich von 10-11-10-5 mol/L.
    2. Mit 10 μL (pro Well) Agonistenlösung in verschiedenen Konzentrationen für 30 min stimulieren.
    3. Zählen Sie die Lumineszenzsignale auf einem Mikrotiterplattenleser unter Verwendung der zugehörigen Softwareparameter (Table of Materials) wie folgt. Wählen Sie Lumineszenz für Erkennungsmethode, Endpunkt für Lesetyp und Lumineszenzfaser für Optiktyp aus. Stellen Sie die optische Verstärkung auf 255 ein.
      ANMERKUNG: Jede Messung wurde in mindestens drei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausfertigung wiederholt.
    4. Ermitteln Sie die Werte des Fluoreszenzsignals, importieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm und verarbeiten Sie die Daten mit der nichtlinearen Regression (Kurvenanpassung) Dosis-Wirkungs-Funktion.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Experiments. Eine detaillierte Schrittanleitung für den Aufbau und die Ausführung von Experimenten. Kurz gesagt, der Rezeptor und die modifizierte Luciferase wurden vorübergehend in CHO-K1-Zellen exprimiert, indem der Rezeptor und das Sensorplasmid mit Transfektionsreagenz in die Zellen transfiziert wurden. Die Zellen wurden in HBSS-Lösung mit D-Luciferin-Kaliumsalz, dem Luciferase-Substrat, suspendiert und nach 24 h in eine 96-Well-Platte ausgesät. Um eine Permeation in die Zellen zu ermöglichen, muss D-Luciferin mit den Zellen vorausgeglichen werden. Das oxidative Enzym Luciferase wandelt Luciferin in Oxyluciferin um und emittiert Licht. Die modifizierte Luciferase hingegen erzeugt Licht über eine chemische Reaktion nur, wenn sie an cAMP gebunden ist, und die Intensität des Lichts hat eine positive Assoziation mit dem cAMP-Spiegel in Zellen. Die cAMP-Spiegel wurden mit GPCR reguliert, das durch einen Agonisten aktiviert wurde. Gi-gekoppelte Rezeptoren reduzierten die cAMP-Spiegel, was die Zugabe von Forskolin erforderlich machte, um die Adenylylzyklase im Gi-Hemmungs-cAMP-Experiment zu aktivieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Representative Results

Vor dem Einfrieren der Probe des S1PRs-Gi-Komplexes muss die gereinigte Probe durch Größenausschlusschromatographie (SEC) getrennt und mit Gelfiltrationschromatographie analysiert werden. Abbildung 2 zeigt den S1PR3-Gi-Komplex als Beispiel. Der Spitzenanteil des homogenen GPCR-G-Proteinkomplexes lag üblicherweise bei ~10,5 ml der Größenausschlusschromatographie (Abbildung 2A). Die SDS-Seitenanalyse des S1PR3-Gi-Komplexes (Abbildung 2B) zeigt vier Banden, die den theoretischen Banden von S1PR3, Gαi, Gβ und scFv16 entsprechen, und deutet somit darauf hin, dass der Komplex erfolgreich gereinigt wurde. Die Rezeptorbande wurde oft aufgrund unterschiedlicher Modifikationsgrade (Glykosylierung oder Palmitoylierung) diffundiert, und die Bande von Gγ wurde nicht gefunden.

Figure 2
Abbildung 2: Analyse der Proteinreinigungsergebnisse (A) Gelfiltrationschromatogramm, das den dem Protein entsprechenden Spitzenanteil zeigt. (B) SDS-seitiges Gelelektrophoresemuster. Diese Zahl wurde der Referenznummer27 entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die komplexen Fraktionen des S1PR3-Gi-Komplexes wurden gesammelt und für die Elektronenmikroskopie konzentriert. Die Verfahren und repräsentativen Ergebnisse der Gittervitrifikation und des Probenscreenings wurden zuvor diskutiert34. Ein Flussdiagramm (Abbildung 3) wird dargestellt, um eine hochauflösende Struktur des S1PRs-G-Proteinkomplexes mit zwei verschiedenen Verarbeitungsplattformen zu erhalten: RELION-3 und cryoSPARC v3.

Figure 3
Abbildung 3: Datenverarbeitungs-Workflow der pFTY720-gebundenen S1PR3-Gi-scFv16-Komplexe. Das Kryo-EM-Datenverarbeitungs-Flussdiagramm des pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16-Komplexes wird gezeigt. Repräsentative Kryo-EM-Mikroskopaufnahmen Auto-Picking, 2D-Klassifizierungsmittelwerte, 3D-Rekonstruktionen und ungleichmäßige Verfeinerung des pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16-Komplexes sind in der Abbildung dargestellt. Diese Zahl wurde gegenüber Referenznummer27 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zuerst wurden Filme in RELION-3 importiert, und anschließend wurden Bewegungskorrektur und CTF-Schätzung durchgeführt, um gemittelte Mikroaufnahmen zu erzeugen. Durch die Kommissionierung von Partikeln und die iterative 2D-Klassifizierung wurden bessere Partikel für die Weiterverarbeitung gewonnen. Es ist wichtig, Partikel mit genau definierten 2D-Klassen auszuwählen, die die sekundären Strukturinformationen des S1PR3-Gi-Komplexes eindeutig darstellen (Abbildung 4A), da Partikel von schlechter Qualität nachfolgende Verarbeitungsstufen behindern können (Abbildung 4B), was zu einer Rekonstruktion mit geringerer Auflösung führt. Unter Verwendung der 3D-Klassifizierung wurden die Partikel weiter klassifiziert, um Rauschpartikel auszuschließen, verschiedene mögliche Konformationen zu unterscheiden und mehrere 3D-Rekonstruktionen zu erhalten. Schließlich wurde eine komplexe EM-Karte von S1PR3-Gi (Abbildung 5A) mit guter Auflösung über Fourier-Shell-Korrelation (FSC) (Abbildung 5B) durch ungleichmäßige Verfeinerung erzeugt.

Figure 4
Abbildung 4: Auswahl von 2D-Klassen. (A,B) Ergebnisse der 2D-Klassifizierung. (A) Wählen Sie Mittelwerte der 2D-Klasse aus, die genau definierte Klassen für die weitere Verarbeitung enthalten, und (B) lehnen Sie Teilpartikel oder Partikel mit geringer Auflösung und geringem Rauschen ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Hochauflösende Struktur der pFTY720-gebundenen S1PR3-Gi-scFv16-Komplexe. (A) Die hochauflösende Struktur des pFTY720-gebundenen S1PR3-Komplexes zeigt eine wohldefinierte Kryo-EM-Dichte, die S1PR3- und Gi-Proteinstrukturelemente darstellt. (B) Goldstandard-Fourierschalenkorrelationskurve (FSC) für pFTY720-gebundenen S1PR3-Gi-Komplex. Diese Zahl wurde der Referenznummer27 entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Durch die Auflösung der Strukturen des S1PRs-G-Proteinkomplexes mit Kryo-EM haben wir den Mechanismus der Aktivierung, selektiven Wirkstofferkennung und G-Protein-Kopplung durch funktionelle Assays in der Zelle aufgeklärt. Der Gi-Inhibition cAMP-Assay misst die Veränderungen der cAMP-Konzentration in Zellen (Abbildung 1) und wurde häufig verwendet, um die Aktivierungspotenz von Rezeptoren in Verbindung mit Gs oder Gi zu validieren.

Das Konzentrationsverhältnis von Rezeptor- zu Sensorplasmid im Experimentsystem ist entscheidend für die experimentelle Lebensfähigkeit. Um also eine effektive und präzise Funktionsanalyse durchzuführen, muss ein Plasmidkonzentrationsverhältnis mit einem maximalen Emax-Wert gewählt werden. In diesem Experiment wurden drei Konzentrationsverhältnisse (1:1, 1:3 und 1:9) von Rezeptor-Sensor-Plasmid untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass ein maximaler E-Maximalwert erreicht wurde, wenn das Konzentrationsverhältnis von Rezeptor- zu Sensorplasmid 1:3 betrug (Abbildung 6).

Figure 6
Abbildung 6: Die Wirkung unterschiedlicher Konzentrationsverhältnisse von S1PR3 auf Sensorplasmid auf die Fensterperiode wurde in der CHO-K1-Zelllinie untersucht. Die Daten werden als Mittel ± REM von drei unabhängigen Experimenten präsentiert, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Neben dem Konzentrationsverhältnis des Rezeptors zum Sensorplasmid waren auch die in diesem Experiment eingesetzten Zelllinien wichtig. Es gab keinen wesentlichen Unterschied zwischen HEK293- und CHO-K1-Zelllinien für die meisten Rezeptoren. CHO-K1-Zelllinien hingegen hatten eine realistischere Gesamtkurve als HEK293-Zellen für S1PR3 (Abbildung 7). Daher wurden CHO-K1-Zellen für den funktionellen experimentellen Nachweis von S1PR3 ausgewählt.

Figure 7
Abbildung 7: Der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationsverhältnisse von S1PR3 auf Sensorplasmid auf die Fensterperiode wurde in der HEK293-Zelllinie untersucht. Die Daten werden als Mittel ± REM von drei unabhängigen Experimenten präsentiert, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine primäre Pipeline zur Bestimmung der Strukturen von S1PRs durch Kryo-EM und zur Messung der Aktivierungspotenz von S1PRs durch Gi-vermittelten cAMP-Inhibitionsassay. Einige Schritte sind entscheidend für den Erfolg des Experiments.

Um den S1PRs-Gi-Komplex zu reinigen, sollte der Qualität des Virus und der Gesundheit der sf9-Zellen mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden. Die Expression des Rezeptors ist in armen sf9-Zellen dramatisch reduziert. Die Gesundheit der sf9-Zellen wurde durch Messung ihres Durchmessers beurteilt. Die gesunde sf9-Zelle hat einen Durchmesser von etwa 15 μm. Die Ausbeute des S1PRs-Gi-Komplexes wird durch das Volumenverhältnis der Rezeptor-, Gi- und Gβγ-Viren beeinflusst, das durch den Aufbau des S1PRs-G-Proteinkomplexes in vitro42 überwunden werden kann. Darüber hinaus sind GPCR-G-Proteinkomplexe nicht immer stabil, und so wurde die NanoBiT-Strategie entwickelt und häufig zur Stabilisierung des Komplexes43 angewendet.

Die Qualität der Probe ist die Grundlage für alles im Kryo-EM-Experiment. Ein Aggregations- oder Dissoziationsphänomen wurde häufig beim Probenscreening beobachtet. Einige Ansätze können bei der Stabilisierung von GPCR-G-Proteinkomplexen hilfreich sein. Die C-Terminus-Rückstände von S1PRs können im S1PRs-Gi-Komplexprojekt26 eine Probenaggregation verursachen. Der Signalweg-Assay muss verwendet werden, um ein akzeptables C-terminales Ende für S1PRs26,27 auszuwählen. Die Konzentration des LMNG ist der zweitwichtigste Faktor; Zu hohe Waschmittelkonzentrationen können den GPCR-G-Proteinkomplex stabilisieren, aber auch seine Auflösung verringern, während niedrige Konzentrationen das Gegenteil bewirken können. Der entscheidende Aspekt bei der Stabilisierung des Komplexes ist eine optimale Reinigungsmittelkonzentration, die so niedrig wie möglich ist. Außerdem kann die Konzentration der Probe gelegentlich die Menge der gesammelten Daten beeinflussen. Bei der Vitrifizierung einer Probe machen wir häufig einen Farbverlauf. In der Datenverarbeitung ist die Wahl der Algorithmen in der Partikelselektion und 2D- oder 3D-Klassifizierung wichtig für die Lösung der S1PRs-G-Proteinkomplexe, insbesondere für die Modellierung der Liganden und ECLs; Die Dichte von ECLs wurde kontinuierlich in der S1PR1-Struktur gefunden, die in der von Shian Liu et al.42 beschriebenen Literatur aufgelöst wurde, und diskontinuierlich in S1PR5-Strukturen26. Obwohl es keine universelle Lösung für dieses Problem für alle GPCR-Komplexe gibt, sollte jede Strategie zur Verbesserung der EM-Dichtekarte ausprobiert werden. Die entscheidenden Schritte zur Vitrifikation, Datenerhebung und Bildverarbeitung wurden zuvor34,44 beschrieben.

Ein Assay ist erforderlich, um die Aktivierungs- oder Hemmungspotenz von S1PR-Liganden zu bewerten, nachdem die Strukturen von S1PRs durch Kryo-EM bestimmt wurden. Es können zahlreiche Ansätze verwendet werden. Der Gi-Inhibition cAMP-Assay bewertet die Wirksamkeit der Rezeptoraktivierung, indem er regelmäßig Veränderungen der cAMP-Spiegel in Zellen überwacht, die durch Agonisten verursacht werden. a) Zellkultur, b) Transfektion, c) das Molverhältnis von Plasmidrezeptor (oder Mutationen) und Sensorplasmid und d) die Wahl des Zelltyps sind entscheidend für ein erfolgreiches Experiment. Die Gesundheit der Zellen kann die Transfektionseffizienz und die Rezeptor- oder Sensorexpression beeinflussen, was einen signifikanten Einfluss auf das Signal-Rausch-Verhältnis des Experiments haben kann. Zellen sind im Allgemeinen nach 20 Generationen gesund, obwohl dies nicht immer der Fall ist. Es ist wichtig, den Zustand der Zellen immer im Auge zu behalten. Die Trypsin-Verdauungsphase während der Zellpassage muss streng verwaltet werden, da der Zustand der Zelle im Laufe der Zeit einen signifikanten Einfluss hat. Transfektionsreagenzien beeinflussen die Rezeptorexpression in mehreren Zelltypen, und eine geeignete Zellmarke muss ausgewählt werden. Das Molverhältnis von Plasmidrezeptor zu Sensorplasmid im Gi-Inhibition cAMP-Assay muss optimiert werden. Wir wählen oft eine Reihe von Molverhältnissen zwischen Rezeptor- und Sensorplasmid und identifizieren die höchste Variation der Fluoreszenzintensität, um die Datengenauigkeit für Gi-Inhibition cAMP-Assays mit Rezeptormutanten zu gewährleisten.

Einige andere Assays werden verwendet, um zelluläre cAMP-Spiegel in einer Vielzahl von Probentypen zu überwachen, wie z. B. ELISA-Assay45 und NanoBiT46. Der cAMP ELISA-Assay wird verwendet, um die Menge des mit dem spezifischen Antikörper gebundenen cAMP zu messen. Der cAMP-spezifische Antikörper wird auf einer Mikrotiterplatte verankert und der Peroxidase-cAMP-Tracer konkurriert mit cAMP um die Bindung an den Antikörper. Die Menge des an die Platte gebundenen Peroxidase-cAMP-Tracers wird unter Verwendung fluorometrischer Tests gemessen, die umgekehrt proportional zur Menge an cAMP sind. Im Jahr 2007 entwickelten Jiang et al. eine Methode zur quantitativen und schnellen Überwachung der cAMP-Spiegel in vivo unter Verwendung der Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer-Technologie (BRET) (cAMP-Sensor mit YFP-Epac-RLuc)46. Der NanoBiT-basierte cAMP-Assay verwendet den cAMP-Sensor LgBiT-Epac-SmBiT, der YFP und Rluc durch LgBiT bzw. SmBiT ersetzt und zur Messung der Dissoziation des G-Protein-Heterotrimers oder der Kopplung zwischen dem Rezeptor und dem G-Protein-Heterotrimer verwendet wird.

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Disclosures

Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Daten des S1PRs-Gi-Komplexes wurden im West China Cryo-EM Center der Sichuan University und im Cryo-EM Center an der Southern University of Science and Technology (SUSTech) gesammelt und im Duyu High-Performance Computing Center der Sichuan University verarbeitet. Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China (32100965 an L.C., 32100988 an W.Y., 31972916 an Z.S.) und dem Vollzeit-Postdoctoral Research Fund der Universität Sichuan (2021SCU12003 bis L.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
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Biochemie Ausgabe 184
Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren
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Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

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