Summary

Un pipeline pour étudier les structures et les voies de signalisation des récepteurs de la sphingosine 1-phosphate

Published: June 08, 2022
doi:

Summary

S1P exerce ses divers effets physiologiques à travers la sous-famille des récepteurs S1P (S1PR). Ici, un pipeline est décrit pour expliquer les structures et la fonction des S1PR.

Abstract

Les lysophospholipides (LPL) sont des lipides bioactifs qui comprennent la sphingosine 1-phosphate (S1P), l’acide lysophosphatidique, etc. S1P, un produit métabolique des sphingolipides dans la membrane cellulaire, est l’un des LPL les mieux caractérisés qui régule une variété de réponses physiologiques cellulaires via des voies de signalisation médiées par les récepteurs de la sphingosine 1-phosphate (S1PR). Cela implique que le système de signalisation S1P-S1PRs est une cible thérapeutique potentielle remarquable pour des troubles, notamment la sclérose en plaques (SEP), les maladies auto-immunes, le cancer, l’inflammation et même la COVID-19. Les S1PR, un petit sous-ensemble de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de classe A, sont composés de cinq sous-types: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 et S1PR5. Le manque d’informations structurelles détaillées, cependant, entrave la découverte de médicaments ciblant les RP S1. Ici, nous avons appliqué la méthode de cryo-microscopie électronique pour résoudre la structure du complexe S1P-S1PRs et élucidé le mécanisme d’activation, la reconnaissance sélective des médicaments et le couplage des protéines G en utilisant des tests fonctionnels cellulaires. D’autres récepteurs des lysophospholipides (LPLR) et RCPG peuvent également être étudiés en utilisant cette stratégie.

Introduction

La sphingosine-1-phosphate (S1P), un produit métabolique des sphingolipides dans la membrane cellulaire, est une molécule de signalisation lysophosphatique omniprésente qui implique diverses activités biologiques, y compris le trafic de lymphocytes, le développement vasculaire, l’intégrité endothéliale et la fréquence cardiaque 1,2,3. Le S1P exerce ses divers effets physiologiques par l’intermédiaire de cinq sous-types de récepteurs S1P (S1PRs 1-5); Les S1PR se trouvent dans une variété de tissus et présentent des préférences uniques pour les protéines G en aval 4,5. S1PR1 est principalement couplé à la protéine Gi, qui inhibe par la suite la production d’AMPc; S1PR2 et S1PR3 sont couplés avec Gi, Gq et G12/13, et S1PR4 et S1PR5 transduisent le signal via Gi et G12/136.

La signalisation S1P-S1PR est une cible thérapeutique essentielle pour de multiples maladies, notamment les maladies auto-immunes7, l’inflammation8, le cancer9 et même la COVID-1910. En 2010, le fingolimod (FTY720) a été homologué en tant que médicament de première classe ciblant les RP S1 pour traiter la sclérose en plaques (SEP)11. Cependant, il est capable de se lier à tous les S1PR sauf S1PR2, tandis que la liaison non spécifique à S1PR3 entraîne un œdème du cortex cérébral, une constriction vasculaire et bronchique et une fuite épithélialepulmonaire 12. Comme stratégie alternative pour augmenter la sélectivité thérapeutique, des ligands spécifiques au sous-type pour le récepteur ont été produits. Le siponimod (BAF312) a été approuvé en 2019 pour le traitement de la SEP en rechute13; il cible efficacement S1PR1 et S1PR5, alors qu’il n’a aucune affinité pour S1PR3, présentant moins d’effets secondaires dans la pratique clinique14. En 2020, la Food and Drug Administration des États-Unis a autorisé l’ozanimod pour le traitement de la SEP15. Il a été rapporté que l’ozanimod détient une sélectivité 25 fois plus grande pour S1PR1 que pour S1PR516. Notamment, dans le contexte de la pandémie actuelle de COVID-19, il a été découvert que des médicaments agonistes ciblant les RP S1 peuvent être utilisés pour traiter la COVID-19 en utilisant des techniques de thérapie immunomodulatrice17. En comparaison avec le fingolimod, l’ozanimod a montré sa supériorité dans la réduction des symptômes chez les patients atteints de COVID-19 et fait actuellement l’objet d’essais cliniques10. Comprendre la base structurelle et la fonction des RP S1 jette des bases importantes pour le développement d’un médicament qui cible sélectivement les PRS11 18.

De nombreuses techniques sont utilisées pour étudier l’information structurelle des biomacromolécules, y compris la cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la microscopie électronique (EM). En mars 2022, plus de 180 000 structures ont été déposées sur la banque de données sur les protéines (PDB), et la plupart d’entre elles ont été résolues par cristallographie aux rayons X. Cependant, avec la première structure de résolution quasi atomique de TPRV1 (résolution de 3,4 Å) rapportée par Yifan Cheng et David Julius en 2013 19, la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est devenue une technique courante pour les structures protéiques, et le nombre total de structures EM PDB était supérieur à10 000. Les domaines de percée critiques sont le développement de nouvelles caméras pour l’imagerie connues sous le nom de caméras de détection directe d’électrons et de nouveaux algorithmes de traitement d’image. Cryo-EM a révolutionné la biologie des structures et la découverte de médicaments basés sur la structure au cours de la dernière décennie20. Comme comprendre comment les complexes macromoléculaires remplissent leurs rôles complexes dans la cellule vivante est un thème central en sciences biologiques, la cryo-EM a le potentiel de révéler des conformations de complexes moléculaires dynamiques, en particulier pour les protéines transmembranaires21. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande superfamille de protéines transmembranaires et les cibles de plus de 30 % des produits pharmaceutiques actuellement commercialisés22. Le développement de la cryo-EM a contribué à une explosion de structures à haute résolution de complexes protéiques GPCR-G, permettant la détermination structurelle de cibles « réfractaires » qui ne sont toujours pas accessibles à l’analyse cristallographique aux rayons X dans la conception de médicaments23. Par conséquent, l’application cryo-EM offre une chance de déterminer la structure tridimensionnelle des RCPG dans des conditions quasi natives à une résolution atomique proche de24. Les progrès de la cryo-EM permettent de visualiser les fondements mécanistes de la stimulation ou de l’inhibition des RCPG, et d’autres avantages dans la découverte de nouveaux sites de liaison pour la création de médicaments ciblant les RCPG25.

En nous appuyant sur les énormes progrès de la technologie cryo-EM, nous avons identifié des structures de complexes de signalisation agonisés S1PR1-, S1PR3- et S1PR5-Gi récemment26,27. Chez l’homme, les S1PR se trouvent dans divers tissus et présentent des préférences uniques pour les protéines G en aval 4,5. S1PR1 est principalement couplé à la protéine Gi, qui inhibe par la suite la production d’adénosine monophosphate 3′,5′-cyclique (AMPc). S1PR3 et S1PR5 sont également capables de se coupler avec Gi 6,28. Étant donné que l’activation des récepteurs gicouplés diminue la production d’AMPc29, un test d’inhibition de l’AMPc de Gi a été introduit pour mesurer les effets d’inhibition de l’AMPc pour capturer les altérations fonctionnelles26,27. Utilisant une version mutante de Photinus pyralis luciferase dans laquelle une fraction protéique de liaison à l’AMPc a été insérée, ce test d’AMPc offre une méthode simple et fiable pour surveiller l’activité des RCPG par des changements dans la concentration intracellulaire d’AMPc30. Il s’agit d’un essai fonctionnel sensible et non radioactif qui peut être appliqué pour surveiller la signalisation en aval en temps réel d’un large éventail de RCPG à des fins de découverte de médicaments31.

Ici, un résumé est fourni des méthodes critiques pour résoudre les modes d’activation et de reconnaissance des médicaments des S1PR, y compris principalement des manipulations cryo-EM et un test d’AMPc d’inhibition de Gi. Cet article vise à fournir des conseils expérimentaux complets pour d’autres explorations des structures et des fonctions des RCPG.

Protocol

1. Purification du complexe protéique S1PRs-G Pour purifier le complexe protéique humain S1PRs-G, cloner les ADNc de S1PR1 dépourvus de résidus C-terminaux 338-382, le type sauvage S1PR3, S1PR5 tronqué avec 345-398 à l’extrémité C, et le Gi1 de type sauvage dans le vecteur pFastBac1 et les ADNc des Gβ1 et Gγ2 de type sauvage dans le vecteur pFastBacdual (Table of Materials).REMARQUE: Toutes les constructions pour les S1PR contiennent également la séquence de s…

Representative Results

Avant de congeler l’échantillon du complexe S1PRs-Gi, l’échantillon purifié doit être séparé par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et analysé par chromatographie par filtration sur gel. La figure 2 montre le complexe S1PR3-Gi à titre d’exemple. La fraction maximale du complexe homogène de protéines GPCR-G était habituellement située à ~10,5 mL de la chromatographie d’exclusion de taille (Figure 2A). L’analyse SDS du complexe S1…

Discussion

Ce protocole décrit un pipeline primaire pour déterminer les structures des S1PR par cryo-EM et mesurer le pouvoir d’activation des S1PR par test d’inhibition de l’AMPc médié par Gi. Certaines étapes sont cruciales pour le succès de l’expérience.

Pour purifier le complexe S1PRs-Gi, il convient d’accorder plus d’attention à la qualité du virus et à la santé des cellules sf9 . L’expression du récepteur est considérablement réduite dans les cellules sf9</e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les données du complexe S1PRs-Gi ont été récoltées au West China Cryo-EM Center de l’Université du Sichuan et au Cryo-EM Center de la Southern University of Science and Technology (SUSTech) et traitées au Duyu High-Performance Computing Center de l’Université du Sichuan. Ce travail a été soutenu par la Natural Science Foundation of China (32100965 à L.C., 32100988 à W.Y., 31972916 à Z.S.) et le Fonds de recherche postdoctorale à temps plein de l’Université du Sichuan (2021SCU12003 à L.C.)

Materials

0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
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catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

References

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O’Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3′,5′-monophosphate and guanosine cyclic 3′,5′-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

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Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

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