S1P utøver sine forskjellige fysiologiske effekter gjennom underfamilien S1P-reseptorer (S1PRs). Her beskrives en rørledning for å forklare strukturene og funksjonen til S1PRs.
Lysofosfolipider (LPL) er bioaktive lipider som inkluderer sfingosin 1-fosfat (S1P), lysofosfatidinsyre, etc. S1P, et metabolsk produkt av sfingolipider i cellemembranen, er en av de best karakteriserte LPL-ene som regulerer en rekke cellulære fysiologiske responser via signalveier mediert av sfingosin 1-fosfatreseptorer (S1PRs). Dette impliserte at signalsystemet S1P-S1PRs er et bemerkelsesverdig potensielt terapeutisk mål for lidelser, inkludert multippel sklerose (MS), autoimmune lidelser, kreft, betennelse og til og med COVID-19. S1PRs, en liten delmengde av klasse A G-proteinkoblet reseptor (GPCR) familie, består av fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 og S1PR5. Mangelen på detaljert strukturell informasjon hindrer imidlertid narkotikaoppdagelsen rettet mot S1PR. Her brukte vi kryo-elektronmikroskopimetoden for å løse strukturen til S1P-S1PRs-komplekset, og belyste mekanismen for aktivering, selektiv legemiddelgjenkjenning og G-proteinkobling ved å bruke cellebaserte funksjonelle analyser. Andre lysofosfolipidreseptorer (LPLR) og GPCR kan også studeres ved hjelp av denne strategien.
Sfingosin-1-fosfat (S1P), et metabolsk produkt av sfingolipider i cellemembranen, er et allestedsnærværende lysofosfatidisk signalmolekyl som involverer ulike biologiske aktiviteter, inkludert lymfocytthandel, vaskulær utvikling, endotelintegritet og hjertefrekvens 1,2,3. S1P utøver sine ulike fysiologiske effekter gjennom fem S1P-reseptorundertyper (S1PRs 1-5); S1PR finnes i en rekke vev og viser unike preferanser for nedstrøms G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært kombinert med Gi-proteinet, som senere hemmer cAMP-produksjonen; S1PR2 og S1PR3 er koblet sammen med Gi, Gq og G12/13, og S1PR4 og S1PR5 transduserer signal gjennom Gi og G12/136.
S1P-S1PR-signalering er et kritisk terapeutisk mål for flere sykdommer, inkludert autoimmune lidelser7, betennelse8, kreft9 og til og med COVID-1910. I 2010 ble fingolimod (FTY720) lisensiert som et førsteklasses legemiddel rettet mot S1PR for å behandle residiverende multippel sklerose (MS)11. Det er imidlertid i stand til å binde seg til alle S1PR unntatt S1PR2, mens ikke-spesifikk binding til S1PR3 resulterer i ødem i hjernebarken, vaskulær og bronkial innsnevring og lungeepitellekkasje12. Som en alternativ strategi for å øke terapeutisk selektivitet er det produsert subtypespesifikke ligander for reseptoren. Siponimod (BAF312) ble godkjent i 2019 for tilbakefall MS-behandling13; det retter seg effektivt mot S1PR1 og S1PR5, mens det ikke har noen affinitet for S1PR3, og viser færre bivirkninger i klinisk praksis14. I 2020 godkjente US Food and Drug Administration ozanimod for MS-terapi15. Det har blitt rapportert at ozanimod har en 25 ganger større selektivitet for S1PR1 enn for S1PR516. Spesielt i sammenheng med den nåværende COVID-19-pandemien har det blitt oppdaget at agonistmedisiner rettet mot S1PR kan brukes til å behandle COVID-19 ved å bruke immunmodulerende terapiteknikker17. Sammenlignet med fingolimod har ozanimod vist overlegenhet i å senke symptomene hos COVID-19-pasienter og gjennomgår nå kliniske studier10. Å forstå det strukturelle grunnlaget og funksjonen til S1PRs legger et betydelig grunnlag for å utvikle et stoff som selektivt retter seg mot S1PRs18.
Mange teknikker brukes til å undersøke strukturell informasjon om biomacromolecules, inkludert røntgenkrystallografi, kjernemagnetisk resonans (NMR) og elektronmikroskopi (EM). Fra mars 2022 er det mer enn 180 000 strukturer deponert på Protein Databank (PDB), og de fleste av dem er løst ved røntgenkrystallografi. Men med den første nær-atomiske oppløsningsstrukturen til TPRV1 (3.4 Å-oppløsning) rapportert av Yifan Cheng og David Julius i 201319, har kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) blitt en vanlig teknikk for proteinstrukturer, og det totale antallet EM PDB-strukturer var mer enn 10.000. De kritiske gjennombruddsområdene er utviklingen av nye kameraer for bildebehandling kjent som direkte elektrondeteksjonskameraer og nye bildebehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolusjonert strukturbiologi og strukturbasert legemiddeloppdagelse det siste tiåret20. Ettersom forståelse av hvordan makromolekylære komplekser oppfyller sine kompliserte roller i den levende cellen er et sentralt tema i biologiske, har cryo-EM potensial til å avsløre konformasjoner av dynamiske molekylære komplekser, spesielt for transmembranproteiner21. G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) er den største superfamilien av transmembranproteiner og målene for mer enn 30% av dagens markedsførte legemidler22. Utviklingen av cryo-EM har bidratt til et utbrudd av høyoppløselige strukturer av GPCR-G-proteinkomplekser, noe som muliggjør strukturell bestemmelse for “ugjennomtrengelige” mål som fortsatt ikke er tilgjengelige for røntgenkrystallografisk analyse i legemiddeldesign23. Derfor gir cryo-EM-applikasjonen en sjanse til å bestemme den tredimensjonale strukturen til GPCR under nær-innfødte forhold ved nær atomoppløsning24. Fremskritt i cryo-EM gjør det mulig å visualisere mekanistiske underlag av GPCR-stimulering eller inhibering, og ytterligere nytte i å avdekke de nye bindingsstedene for GPCR-målrettet narkotikaopprettelse25.
Ved å stole på de enorme fremskrittene med kryo-EM-teknologi, har vi identifisert strukturer av forpinte S1PR1-, S1PR3- og S1PR5-Gi-signalkomplekser nylig26,27. Hos mennesker finnes S1PR i forskjellige vev og utviser unike preferanser for nedstrøms G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært kombinert med Gi protein, som senere hemmer 3′,5′-syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) produksjon. S1PR3 og S1PR5 er også i stand til å koble til Gi 6,28. Siden Gi-koblet reseptoraktivering reduserer produksjonen av cAMP29, ble en Gi-hemming cAMP-analyse introdusert for å måle cAMP-hemmingseffekter for å fange funksjonelle endringer26,27. Ved å bruke en mutert versjon av Photinus pyralis luciferase hvor en cAMP-bindende proteindel er satt inn, tilbyr denne cAMP-analysen en enkel og pålitelig metode for å overvåke GPCR-aktivitet gjennom endringer i intracellulær cAMP-konsentrasjon30. Det er en sensitiv og ikke-radioaktiv funksjonell analyse og kan brukes til å overvåke sanntids nedstrøms signalering av et bredt spekter av GPCR for narkotikaoppdagelsesformål31.
Her gis et sammendrag av de kritiske metodene for å løse aktiverings- og legemiddelgjenkjenningsmodusene til S1PR, primært inkludert kryo-EM-manipulasjoner og en Gi-hemming cAMP-analyse. Denne artikkelen tar sikte på å gi omfattende eksperimentell veiledning for videre utforskning av strukturer og funksjoner i GPCRs.
Denne protokollen beskriver en primær rørledning for å bestemme strukturene til S1PR ved kryo-EM og måle aktiveringsstyrken til S1PR ved Gi-mediert cAMP-hemmingsanalyse. Noen trinn er avgjørende for eksperimentets suksess.
For å rense S1PRs-Gi-komplekset, bør kvaliteten på viruset og helsen til sf9-celler være mer oppmerksom på. Uttrykket av reseptoren reduseres dramatisk i dårlige sf9-celler . Helsen til sf9-celler ble vurdert ved å måle diameteren. Den…
The authors have nothing to disclose.
Dataene fra S1PRs-Gi-komplekset ble høstet ved West China Cryo-EM Center i Sichuan University og Cryo-EM Center ved Southern University of Science and Technology (SUSTech) og behandlet ved Duyu High-Performance Computing Center i Sichuan University. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China (32100965 til L.C., 32100988 til W.Y., 31972916 til Z.S.) og heltids postdoktorforskningsfondet ved Sichuan University (2021SCU12003 til L.C.)
0.05% trypsin-EDTA | GIBCO | Cat# 25300054 | |
0.22 µM filter | Thermo Fisher Scientific | Cat# 42213-PS | |
100 kDa cut-off concentrator | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88533 | |
6-well plate | Corning | Cat# 43016 | |
96-well plate | Corning | Cat# 3917 | |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | Cat# 9087-70-1 | |
Apyrase | NEB | Cat# M0398S | |
Baculovirus transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10362100 | For the preparation of P0 baculovirus |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | Cat# B6506 | |
CHO-K1 | ATCC | N/A | |
CHS | Sigma-Aldrich | Cat# C6512 | |
CryoSPARC | Punjani, A., et al.,2017 | https://cryosparc.com/ | |
DH5α competent E.coli | Thermo Fisher Scientific | Cat# EC0112 | |
D-Luciferin-Potassium Salt | Sigma- Aldrich | Cat# 50227 | |
DMSO | Sigma- Aldrich | Cat# D2438 | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | Cat# S311-500 | |
ESF921 cell culture medium | Expression Systems | Cat# 96-001 | |
Excel | microsoft | N/A | |
F12 medium | Invitrogen | Cat# 11765 | |
FBS | Cell Box | Cat# SAG-01U-02 | |
Flag resin | Sigma- Aldrich | Cat# A4596 | |
Forskolin | APExBIO | Cat# B1421 | |
Gctf | Zhang, 2016 | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | |
GDN | Anatrace | Cat# GDN101 | |
Gel filtration column | GE healthcare | Cat# 28990944 | |
Gen5 3.11 | BIO-TEK | N/A | |
Gentamicin | Solarbio | Cat# L1312 | |
GloSensor cAMP assay kit | Promega | Cat# E1291 | Gi-inhibition cAMP assay kit |
GloSensor plasmid | Promega | Cat# E2301 | Sensor plasmid |
Grace’s medium | GIBCO | Cat# 11595030 | |
GraphPad Prism 8 | Graphpad | N/A | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88284 | |
HEPES | Sigma- Aldrich | Cat# H4034 | |
jetPRIME Reagent | Polyplus Transfection | Cat# 114-15 | transfection reagent |
Janamycin | Solarbio | Cat# K1030 | |
LB medium | Invitrogen | Cat# 12780052 | |
Leupeptin | Sigma-Aldrich | Cat# L2884 | |
LMNG | Anatrace | Cat# NG310 | |
MotionCor2 | (Zheng et al., 2017) | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | |
NanoCab | Thermo Fisher Scientific | Cat# 1121822 | |
PBS | Invitrogen | Cat# 14190-144 | |
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs | GenScript | N/A | |
pFastBac1-Gαi | GenScript | N/A | |
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 | GenScript | N/A | |
pFastBacdual-Gβ1γ2 | GenScript | N/A | |
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | Cat# K210003 | For the preparation of plasmids and P0 baculovirus |
Q5 site-Directed Mutagenesis kit | NEB | Cat# E0554S | For the preparation of plasmids |
Quantifoil | Quantifoil | Cat# 251448 | |
RELION-3.1 | (Zivanov et al., 2018) | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion | |
S1PRs cDNA | addgene | N/A | |
scFv16 | Invitrogen | Cat# 703976 | |
Sf9 | Expression Systems | N/A | |
Siponimod | Selleck | Cat# S7179 | |
sodium cholate | Sigma-Aldrich | Cat# C1254 | |
Synergy H1 microplate reader | BIO-TEK | N/A | |
Synthetic T4L DNA (sequence) | N/A | N/A | Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac |
TCEP | Thermo Fisher Scientific | Cat# 77720 | |
Tetracycline | Solarbio | Cat# T8180 | |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A |