Summary
Detta protokoll beskriver en optimerad hematopoetisk stam- och stamcellsodlingsprocedur (HSPC) för robust engraftment av genredigerade celler in vivo.
Abstract
CRISPR/Cas9 är ett mycket mångsidigt och effektivt genredigeringsverktyg som används i stor utsträckning för att korrigera olika genetiska mutationer. Genomförbarheten av genmanipulation av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) in vitro gör HSPC till en idealisk målcell för genterapi. HSPCs förlorar dock måttligt sin engraftment och multilineage återbefolkningspotential i ex vivo-kulturen . I den aktuella studien beskrivs ideala odlingsförhållanden som förbättrar HSPC-engraftment och genererar ett ökat antal genmodifierade celler in vivo. Den aktuella rapporten visar optimerade in vitro-odlingsförhållanden , inklusive typen av odlingsmedier, unikt småmolekylärt cocktailtillskott, cytokinkoncentration, cellodlingsplattor och odlingstäthet. Utöver detta tillhandahålls en optimerad HSPC-genredigeringsprocedur, tillsammans med valideringen av genredigeringshändelserna. För in vivo-validering visas den genredigerade HSPCs-infusionen och post-engraftment-analysen hos musmottagare. Resultaten visade att odlingssystemet ökade frekvensen av funktionella HSC in vitro, vilket resulterade i robust engraftment av genredigerade celler in vivo.
Introduction
Otillgängligheten för humant leukocytantigen (HLA) -matchade givare i allogena transplantationsmiljöer och den snabba utvecklingen av mycket mångsidiga och säkra gentekniska verktyg gör autolog hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) till en botande behandlingsstrategi för de ärftliga blodsjukdomarna 1,2. Autolog hematopoietisk stam- och stamcellsgenterapi (HSPC) involverar insamling av patienternas HSPC, genetisk manipulation, korrigering av sjukdomsframkallande mutationer och transplantation av genkorrigerade HSPC till patienten 3,4. Det framgångsrika resultatet av genterapin är dock beroende av kvaliteten på det transplanterbara genmodifierade transplantatet. Genmanipulationsstegen och ex vivo-odlingen av HSPC påverkar transplantatets kvalitet genom att minska frekvensen av långsiktiga hematopoetiska stamceller (LT-HSC), vilket kräver infusion av stora doser av genmanipulerade HSPCs 2,5,6.
Flera små molekyler, inklusive SR1 och UM171, används för närvarande för att expandera HSPCs i navelsträngsblod robust 7,8. För vuxna HSPC: er, på grund av det högre cellutbytet som erhålls vid mobilisering, krävs inte robust expansion. Att behålla stammen hos isolerade HSPCs i ex vivo-odling är dock avgörande för dess genterapitillämpningar. Därför utvecklas ett tillvägagångssätt som fokuserar på odlingsanrikning av hematopoetiska stamceller (HSC) med hjälp av en kombination av små molekyler: Resveratrol, UM729 och SR1 (RUS)7. De optimerade HSPC-odlingsförhållandena främjar anrikningen av HSC: er, vilket resulterar i ökad frekvens av genmodifierade HSC in vivo och minskar behovet av genmanipulation av stora doser av HSPC, vilket underlättar kostnadseffektiva genterapimetoder8.
Här beskrivs ett omfattande protokoll för HSPCs-odling, tillsammans med infusion och analys av genredigerade celler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo-experiment på immunbristmöss godkändes av och utfördes enligt riktlinjerna från Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, Indien. Granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF) -mobiliserade perifera blodprover samlades in från friska mänskliga givare med informerat samtycke efter att ha fått godkännande från Institutional Review Board (IRB).
1. Isolering av mononukleära celler i perifert blod (PBMNCs) och rening av CD34 + - celler
- Utför PBMNC-isolering enligt stegen nedan.
OBS: För in vitro HSPC-odling och genredigering är det idealiskt att börja med minst 1 x 106 HSPC / grupp. För analys av in vivo-engraftment är ett startcellantal på minst 5 x 10 6 HSPC/grupp idealiskt om en grupp innehåller åtta möss och varje mus infunderas med minst6 x 105 celler. För att erhålla ett tillräckligt antal PBMNC (~ 1 x 109) för proceduren rekommenderas att börja med 20 ml mobiliserat perifert blod (mPB).- Efter uppsamling av mPB, späd 20 ml mPB med steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i förhållandet 1:1.
OBS: Effektiviteten av G-CSF-mobilisering kan variera mellan individerna9, och därför varierar antalet HSPCs som erhålls från 20 ml mobiliserat blod mellan givare. - Tillsätt 10 ml densitetsgradientmedium (Lymphoprep, se materialtabell) till ett 50 ml rör och skikta det utspädda blodet genom rörets sidor i förhållandet 1:2.
OBS: Lutning av 50 ml röret i en vinkel på 20 ° medan du tillsätter det utspädda blodet förhindrar att det blandas med Lymphoprep, vilket leder till tydlig separation av blodkomponenter efter centrifugering. - Centrifugera vid 600 x g i 30 minuter vid rumstemperatur (RT) med en accelerationshastighet på 1 m/s² och en retardationshastighet på 1 m/s². Kassera det övre lagret (plasma) med en serologisk pipett och skörda buffybeläggningen som finns vid interfasen (PBMNCs) ovanför densitetsgradientens mellanskikt.
OBS: Aspirera buffy-pälsen med en serologisk pipett genom att försiktigt virvla den på rörets sidor. Undvik att samla en högre volym interfas medan du aspirerar buffybeläggningen för att förhindra granulocyt- och RBC-kontaminering. - Överför PBMNC till ett nytt 50 ml koniskt rör och späd cellsuspensionen med 1x PBS i förhållandet 1: 2.
OBS: Späd cellsuspensionen med 1x PBS i förhållandet 1: 4 om ett överskott av interfas samlades upp medan du aspirerade buffybeläggningen. - Centrifugera cellsuspensionen vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur med en accelerationshastighet på 9 m/s² och en retardationshastighet på 7 m/s² och kassera supernatanten med en serologisk pipett. Tillsätt 30 ml iskall RBC-lysbuffert (se tabell 7) till pelleten och inkubera i is i 10 minuter. Blanda genom att invertera röret var 2: e minut.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur med en accelerationshastighet på 9 m/s² och en retardationshastighet på 7 m/s², och kassera supernatanten. Upprepa steg 1.1.5.-1.1.6. tills pelletsrödheten försvinner. Återsuspendera pelleten med basala medier (IMDM, se Materialförteckning) och utför en cellräkning med trypanblå i en Neubauer-kammare10.
OBS: De isolerade PBMNC: erna kan omedelbart användas för att rena CD34 + HSPCs. Alternativt kan PBMNC: erna kryokonserveras och återupplivas när det behövs för CD34 + -anrikning. För kryokonservering, centrifugera 5 x 108 celler vid 200 x g i 5 minuter och tillsätt 4 ml kryomedia innehållande IMDM: FBS: DMSO (se materialtabell) i förhållandet 7:2:1. - Överför injektionsflaskorna till en 1 °C kryokylare och förvara dem vid −80 °C i upp till 12 timmar. Överför och förvara kryovialerna i en behållare med flytande kväve för långvarig lagring.
- Efter uppsamling av mPB, späd 20 ml mPB med steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i förhållandet 1:1.
- Återuppliva de kryokonserverade PBMNC: erna.
- Halvtina kryovialerna i ett 37 °C vattenbad genom att försiktigt virvla i <1 min. Överför cellsuspensionen av kryovialen till ett 50 ml rör innehållande IMDM i förhållandet 1:10.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur med en accelerationshastighet på 9 m/s² och en retardationshastighet på 7 m/s², och kassera supernatanten med en serologisk pipett.
- Rena CD34 + -cellerna från PBMNCs enligt stegen nedan.
- Förbered reningsbufferten med steril 1x PBS innehållande 2% filtrerat fostervin serum (FBS). Återsuspendera PBMNC-cellpelleten i bufferten enligt tabell 1.
OBS: Bufferten måste vara Ca++ och Mg++ fri. - Överför cellsuspensionen innehållande 1 x 10 8-5 x 108 celler av färska eller kryokonserverade PBMNC till 5 ml polystyren rundbottenrör (se materialtabell).
OBS: Tillsätt DNase (se materialförteckning) i en slutlig koncentration av 100 μg/ml till cellsuspensionen för att förhindra cellklumpning. Vi använde ett kommersiellt tillgängligt kit för CD34-rening som innehåller human CD34 Positive Selection Cocktail och Dextran Rapid Spheres (se Materialförteckning). - Lägg till kommersiellt tillgänglig human CD34-cocktail med positivt urval (se materialtabell) i koncentrationen av 100 μl/ml celler och återsuspendera försiktigt.
- Inkubera vid RT i 30 minuter och återsuspendera försiktigt cellsuspensionen var 5:e minut. Tillsätt 50 μl/ml kommersiellt tillgängliga Dextran Rapid Spheres (se materialförteckning) och återsuspendera försiktigt.
OBS: Vortex dextransfärerna med hög hastighet i 5 s för att säkerställa att partiklarna verkar jämnt dispergerade och lägg sedan till dem i cellerna. - Inkubera vid RT i 15 minuter och återsuspendera försiktigt cellsuspensionen var 5:e minut. Gör cellsuspensionen till en total volym på 2,5 ml med reningsbuffert och återsuspendera den försiktigt.
- Placera röret i en kommersiellt tillgänglig immunomagnetisk kolonnfri magnet (se materialtabell) och inkubera i 5 minuter vid RT. Efter inkubation, invertera magneten och kassera supernatanten i en kontinuerlig rörelse.
OBS: Dextran Rapid Spheres-märkta CD34 + -celler förblir lockade till sidorna av röret av magnetfältet. Röret måste hållas i inverterat läge i 2-3 s. Undvik att darra eller blotta dropparna som hänger kvar från rörets mynning. - Ta bort röret från magneten och tillsätt 2,5 ml reningsbuffert. Upprepa steg 1.3.6-1.3.7 fem gånger.
OBS: Under tillsatsen av reningsbuffert, placera röret i en spetsig vinkel och lägg till buffert genom att virvla röret, eftersom cellerna kan fästa vid ytväggarna medan de inverterar magneten. - Efter att ha slutfört fem tvättar, ta bort röret från magneten, tillsätt 4 ml 1x steril PBS och återsuspendera cellsuspensionen. Överför cellsuspensionen till 15 ml centrifugröret och gör det upp till 10 ml med 1x PBS. Utför en cellräkning med trypanblå i en Neubauer-kammare10.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid RT (acceleration ~9 m/s², retardation ~7 m/s²) och kassera supernatanten med pipett. För att odla HSPC: erna, återsuspendera cellerna i HSPC-odlingsmedier, som nämns i steg 2.1.
OBS: Överskotten av renade HSPCs kryokonserverades i ett kommersiellt tillgängligt kryokonserveringsmedium (se materialtabell) med en densitet av 9 x 106 celler / ml efter odling av HSPC: erna i 12 timmar i HSPC-odlingsmedier.
- Förbered reningsbufferten med steril 1x PBS innehållande 2% filtrerat fostervin serum (FBS). Återsuspendera PBMNC-cellpelleten i bufferten enligt tabell 1.
- Återuppliva de kryokonserverade HSPC: erna.
- Tina kryovialerna i <1 min i ett 37 °C vattenbad genom att försiktigt virvla. Överför cellsuspensionen i kryovialen till ett 50 ml rör.
- Tillsätt 1% BSA resuspended i 1x PBS droppe för droppe med konstant omrörning och gör det upp till 20 ml. Centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur med en accelerationshastighet på 9 m/s² och en retardationshastighet på 7 m/s² och kassera supernatanten med en serologisk pipett.
- Upprepa steg 1.4.2. 1x. Återsuspendera cellerna i HSPC-odlingsmedier och odling enligt beskrivningen i steg 2.1.
2. In vitro-odling av renade HSPC
- Förbered odlingsmediet med SFEM-II med SCF (240 ng/ml), FLT3 (240 ng/ml), TPO (80 ng/ml), IL6 (40 ng/ml) och 1x antibiotika-antimykotiska (se materialförteckning).
OBS: Nyberedda kulturmedier rekommenderas starkt. Mediet kan dock förvaras vid 4 °C i upp till 24 timmar efter beredning. - Återsuspendera CD34+ -pelleten med odlingsmediet, tillsätt 3 μl RUS-cocktail/ml media (Resveratrol, 10 μM; UM729, 500 nM; StemReginin-1, 750 nM; se Materialförteckning) och odla cellerna vid 37 °C med 5 %CO2.
UM171 (10 nm) kan användas för att ersätta UM729 (500 nM) eftersom båda har liknande effekter på HSPC-stammighetsunderhåll7. Injektionsflaskorna kan inte frysas mer än två gånger. - Frö initialt de renade cellerna med en sammanflöde av 5 x 105 / ml i kommersiellt tillgängliga delta-ytbehandlade 6-brunnsplattor (se materialtabell) för att avlägsna de vidhäftande cellerna.
- Åter cellerna i suspensionen vid ett sammanflöde av 2 x 105 celler/ml i en ny 6-brunnsplatta efter 6 timmars rening.
- Karakterisera HSPCs stamhet med hjälp av flödescytometri före genredigering.
- För analys av flödescytometri, ta 1 x 105 celler i 100 μL 1x PBS och tillsätt 3 μL (75 ng) CD34 PE, 4 μL (100 ng) CD133 FITC och 4 μL (100 ng) CD90 APC (se Materialförteckning).
- Inkubera röret vid RT i 20 minuter i mörkret. Tvätta cellerna med 2 ml 1x PBS 2x och centrifugera vid 200 x g i 5 min vid RT. Kassera supernatanten med en pipett, återsuspendera cellpelleten med 150 μL 1x PBS och förvärva den i flödescytometri.
OBS: Om andelen CD34+ -celler är <90%, öka antalet tvättar upp till sex gånger i steg 1.3.7. Frö de renade HSPC: erna i odlingsmedier och samla efter 6 timmar endast cellerna i suspensionen. De flesta CD34-cellerna fäster vid odlingsplattan.
3. Genredigering av HSPCs
- Utför guide RNA-rekonstituering.
OBS: Syntetiskt sgRNA med fosforotioatmodifieringar riktade mot CCR5-locus erhölls från kommersiella källor (se materialförteckning).- För beredning, ställ in termoblandaren på 37 °C och förvärm 1x TE-bufferten (se materialtabellen) vid 37 °C i 10 minuter. Centrifugera den syntetiska kemiskt modifierade injektionsflaskan med sgRNA vid 11 000 x g i 1 min vid 4 °C.
- Till sgRNA-injektionsflaskan innehållande 1,5 nM frystorkat sgRNA, tillsätt 15 μL 1x TE-buffert, vilket ger en slutlig koncentration på 100 pM/μL. Återsuspendera försiktigt upp till 5x och virvla spetsen runt hörnen.
- Inkubera i termoblandaren vid 37 °C i 30–40 s med minimal skakning. Efter en kort snurrning, samla 15 μl sgRNA och förvara som 1 μl alikvoter (100 pM/μL) vid −80 °C för framtida användning i upp till 1 år.
OBS: Undvik upprepad frysning-upptining. Högst en frys-tina cykel av alikvoterat gRNA rekommenderas.
- Utför nukleofektion enligt stegen nedan.
- På dag 3 av odlingen, räkna cellerna med Neubauers förbättrade cellräkningskammare10.
- För RNP-beredning (för nukleofektering av 2 x 10 5 celler), ta 1 μL sgRNA riktat mot CCR5-genen (100 pM) i ett0,5 ml rör och tillsätt 2,65 μL Cas9 (50 pM) genom att försiktigt virvla runt flaskans botten. Inkubera vid RT i 10 min.
OBS: gRNA-sekvens: (CCR5) TGACATCAATTATACATCGG. - För buffertberedning, tillsätt 16,4 μl P3 primärcellslösning och 3,6 μl tillskott, försedd med det kommersiella nukleofektionssatsen (se materialtabellen) och inkubera vid RT i 10 minuter. Bered odlingsmediet (steg 2.1) och förinkubera det vid 37 °C i odlingsplattan före nukleofektion.
- Pellet 2 x 10 5 celler genom centrifugering vid 200 x g i5 min vid RT och kassera försiktigt supernatanten med en pipett utan att störa pelleten. Återsuspendera pelleten med 20 μl av den buffert som beretts i steg 3.2.3. och försiktigt återuppta det.
- Blanda försiktigt cellsuspensionen med det beredda RNP-komplexet (steg 3.2.2.) utan luftbubblor. Överför suspensionen till den kommersiella nukleofektionsremsan (se materialförteckningen) och välj pulskoden DZ100 för att elektropolera cellerna med hjälp av 4D-nukleofektorn (se materialtabell).
OBS: Cellsuspensionens slutliga volym, inklusive buffert- och RNP-komponenterna, får inte överstiga mer än 27 μl/elektroporering. - För experimentell kontroll, pellet 2 x 10 5 oredigerade HSPC genom centrifugering vid 200 x g i5 min vid RT och återsuspendera pelleten med 20 μl av bufferten beredd i steg 3.2.3. utan RNP-komplex.
- Tillsätt 100 μl förinkuberade odlingsmedier (steg 3.2.3) till de elektroporerade cellerna och lämna cellerna ostörda i 10 minuter i nukleofektionsremsan vid RT. Efter 10 minuters inkubation överför du innehållet till odlingsplattan enligt de experimentella kraven.
OBS: Detta protokoll kan tillämpas på icke-homologa ändfogning (NHEJ) -medierad riktad störning av alla genomiska locus med hjälp av målspecifikt gRNA. Samma protokoll kan tillämpas för att införa stora deletioner genom att inkludera dubbelt gRNA i steg 3.2.2. 11. Efter 10 minuters RNP-inkubation kan samma protokoll dessutom användas för homologistyrd reparation (HDR)-baserad genredigering när den förses med en donatormall12. Protokollet har validerats av den riktade störningen av AAVS1, pseudo β-globin, β-globin och CCR5-locus 7,8.
4. Validering av genredigeringshändelser i HSPCs
- Utför DNA-extraktion.
- Efter 72 timmar efter nukleofektion, utför en cellräkning med trypanblå i en Neubauer-kammare. Samla in 1 x 105 genredigerade HSPC för DNA-extraktion.
- Centrifugera cellerna vid 11 000 x g i 5 minuter vid RT och kassera supernatanten med pipett. Återsuspendera pelleten med 1 ml 1x PBS och upprepa centrifugeringen och kassera supernatanten. Tillsätt 20 μl snabb extraktlösning (se materialtabell) till pelleten för 1 x 105 celler och återsuspendera pelleten.
- Inkubera blandningen i en termocykler vid 68 °C i 30 minuter. Efter en kort snurrning, inkubera blandningen i en termocykler vid 98 °C i 10 minuter. Mät koncentrationen av DNA i rålysatet med hjälp av en spektrofotometer13.
- Utför förstärkningen av det genredigerade locuset med PCR.
- Använd Primer3 (se Materialtabell) och designa de locusspecifika primersna som spänner över DSB-platsen (double-stringed break) med ampliconstorlekar mellan 400-700 bp (tabell 2).
OBS: Primer3 är ett webbaserat verktyg med öppen källkod för design av PCR-primers. - Bered reaktionsblandningen enligt tabell 3 och kör termocykeln med de cykelförhållanden som anges i tabell 4. För att bekräfta förstärkningen av önskat lokus, blanda 5 μL PCR-produkt med 6x laddningsfärgämne och ladda på 2% agarosgelelektrofores tillverkad med TAE-buffert.
OBS: TAE-buffertkomponenterna finns i tabell 7. - Kör i 30-40 min vid 100 V och detektera amplikonen med hjälp av ett gelavbildningssystem (se Materialförteckning). Enligt PCR-reningstillverkarens protokoll (se materialförteckning), rengör den förstärkta PCR-produkten.
- Mät koncentrationen av den renade PCR-produkten med hjälp av en nanodroppspektrofotometer (se materialförteckning).
- Använd Primer3 (se Materialtabell) och designa de locusspecifika primersna som spänner över DSB-platsen (double-stringed break) med ampliconstorlekar mellan 400-700 bp (tabell 2).
- Utför Sanger-sekvensering och borttagning av fri färgterminator enligt stegen nedan.
- Bered reaktionsblandningen enligt tabell 5. Kör termocykeln med de cykelförhållanden som nämns i tabell 6.
- Tillsätt 10 μL HighPrep DTR-reagens (se materialtabell) och 40 μl 85 % etanol till 10 μl PCR-prov i ett 1,5 ml rör och blanda det genom kraftig pipettering ca 8x-10x.
- Inkubera blandningen vid RT i 5 minuter och placera 1,5 ml röret på magnetseparationsstället i 5 minuter. Ta bort supernatanten med en pipett och tillsätt 100 μl 85% etanol.
- Kasta supernatanten och upprepa steg 4.3.3. 1x. Ta ut 1,5 ml rören från magnetstället och inkubera dem vid 37 °C i 10 minuter i en termomixer för att torka etanolen.
- Återsuspendera kraftigt pärlorna med 40 μl nukleasfritt vatten och inkubera vid RT i 5 minuter. Placera röret på det magnetiska separationsstället i 5 minuter och utför Sanger-sekvensering efter publicerade rapporter14,15.
- Utför en indelfrekvensbedömning med ICE-analys16.
- Använd Synthego (se Materialförteckning) för ICE-analysen.
- Ladda upp ab1-filer med redigerade och oredigerade prover och gRNA-sekvenser och klicka på analysera för att få frekvensen av Indels.
5. Transplantation av genredigerade HSPCs
- Förutsätt den kommersiellt tillgängliga NOD scid gammamusen (NSG)17 och NOD. CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 möss (se materialförteckning) för benmärgstransplantation.
- För förkonditionering av NSG-möss, välj 6-8 veckor gamla honmöss och separera dem i kontroll- och redigerade grupper genom blindad randomisering.
- Placera NSG-mössen i pajburarna och bestråla vid 3,5 Gy med hjälp av en kommersiellt tillgänglig bestrålning (se materialtabell) 6-8 timmar före HSPC-transplantation.
OBS: Det rekommenderas att väga mössen före bestrålning, och möss som väger >20 g kommer att utsättas för bestrålning. - För förkonditionering av 6-8 veckor gamla manliga och kvinnliga NBSGW-möss, injicera busulfan (se materialförteckning) genom intraperitoneal (IP) injektion i en dos av 12,5 mg/kg kroppsvikt 48 timmar före HSPC-transplantation.
OBS: Busulfan-konditionering ökar engraftmentet av humana HSPC i musbenmärgen och minskar behovet av att införa stora doser av genredigerade HSPCs19. Det ideala intervallet av busulfan dos för konditionering är mellan 10 mg/kg till 15 mg/kg kroppsvikt. Ökade doser av busulfan kommer att resultera i allvarliga dödlighet problem.
- Förbered cellsuspensionen för benmärgstransplantation.
- Efter 10 minuters inkubation av de genredigerade HSPC:erna i nukleofektionsremsan (se steg 3.2.7), överför cellsuspensionen till 10 ml 1x PBS. Räkna cellerna med Neubauers förbättrade cellräkningskammare10.
- För infusion av en mus, pellet 6 x 10 5 celler i ett 1,5 ml rör genom centrifugering vid 200 x g i5 min vid RT och kassera försiktigt supernatanten med en pipett utan att störa pelleten. Återsuspendera cellpelleten med 100 μL 1x PBS.
- Infusera HSPC: erna genom svansveninjektion enligt stegen nedan.
- Placera den förkonditionerade NSG- eller NBSGW-musen i mushållaren (se Materialförteckning).
- Håll mussvansen och tryck försiktigt på kontakten för att hålla fast musen. Torka försiktigt av mussvansen med 70% etanol. Aspirera 100 μL av cellsuspensionen i en 31 G insulinspruta.
OBS: Undvik strikt bubblor i infusionsprodukten genom att försiktigt knacka på sprutan eller försiktigt flytta kolven. - Rikta ljuset från den infraröda lampan på svansen i 30-40 s och täck musens kroppsområde med veck av silkespapper. För försiktigt in nålens fasade del i vänster eller höger stjärtfena i en vinkel på 20°.
- Lyft svansen med vänster pekfinger för att hålla den i den plana axeln med sprutan. Tryck på kolven för att införa cellsuspensionen i venen. Applicera försiktigt tryck nära det genomborrade området med silkespapper och dra ut nålen.
- Efter 30 s applicering av försiktigt tryck, ta bort musen från fasthållningsanordningen och överför den till buret.
6. Bedömning av potentialen för korttidsingraftment
- Efter 4 veckors human HSPC-transplantation, bedöma den kortvariga engraftmentet genom att samla blod via orbital venös sinus i ett hepariniserat rör med hjälp av en Pasteur-pipett.
- Bedöva djuret med ketamin (90-120 mg/kg) och xylazin (8-12 mg/kg) formulering via intraperitoneal (IP) injektion före provtagning.
OBS: Tryck försiktigt på bakbenen på den bedövade musen för att bekräfta förlusten av känsla. - Efter bedövning, placera djuret i ventral recumbency och försiktigt skrubba musen för att öppna ögat, vilket gör att ögats jordklot kan sticka ut något.
- För försiktigt in Pasteur-pipetten i ögats mediala canthus under nictatingmembranet i en vinkel på 30°-45°. Efter att ha placerat Pasteur-pipetten i rätt läge, applicera lätt tryck på röret och börja rotera röret försiktigt.
OBS: Blod kommer in i röret genom kapillärverkan så snart retro-orbital plexus punkteras.
- Bedöva djuret med ketamin (90-120 mg/kg) och xylazin (8-12 mg/kg) formulering via intraperitoneal (IP) injektion före provtagning.
- Efter att ha samlat 50-80 μl perifert blod, dra försiktigt ut pipetten från ögats mediala canthus.
- För att upphöra med blödningen runt ögatets bana, stäng ögonlocken och applicera försiktigt tryck med en bit gasbindning.
- Färga cellerna med respektive antikroppar (tabell 8) och inkubera cellerna i mörker i 25-30 min vid RT.
- För RBC-lys, till cellsuspensionen, tillsätt 3 ml 1x RBC-lysbuffert (tabell 7) och inkubera i 10 minuter i is.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid rt och kassera supernatanten med pipett. Upprepa steg 6.4. tills pelletens rodnad försvinner.
- Tillsätt 2 ml 1x PBS och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid RT för att avlägsna cellskräpet i samband med RBC-lys.
- Tillsätt 150 μl 1x PBS till pelleten och fortsätt sedan med immunofenotypning för flödescytometri för att utvärdera procentandelen engraferade humana celler7.
7. Bedömning av långsiktig engraftmentpotential
- Avliva mössen.
- Offra de transplanterade mössen vid vecka 16 för engraftmentanalys genom att införa 100% CO 2 kvävning20 inuti mössburen i1-2 min.
- Bekräfta eutanasi genom att fastställa hjärt- och andningsstopp och frånvaron av muskelrörelser med mild klämning av bakbenen. Om båda villkoren är uppfyllda, ta bort mössen från buret.
- För att utvärdera mänsklig cellchimerism, samla cellerna från benmärgen.
- Isolera celler från benmärgen enligt stegen nedan.
- Efter avlivning, gör ett vertikalt snitt 1 cm över urinröret och förläng till 1 cm under membranet. Skär horisontellt i hörnen av det snittade området för att öppna bukregionen i stor utsträckning.
- Dissekera lårbenet och skenbenet och ta bort de mjuka vävnaderna som är fästa vid lårbenet och skenbenet med sax. Skrubba försiktigt med silkespapper och gör ett litet hål med en diameter som inte överstiger 0,2 cm längst ner på ett 0,5 ml mikrocentrifugrör med en skalpell.
- Ta bort de proximala ändarna av benen med en skalpell och placera benen med den skurna sidan vänd mot hålet i 0,5 ml mikrocentrifugeringsröret. Placera 0,5 ml röret med benen i 1,5 ml röret som innehåller 100 μl steril 1x PBS.
- Stäng locket, snurra rören i 3 minuter vid 1000 x g under sterila förhållanden vid RT och kassera 0,5 ml rör som innehåller ben med en tom märghålighet. Tillsätt 1 ml 1x PBS till 1,5 ml reaktionsröret som innehåller benmärg och återsuspendera försiktigt cellerna ungefär inte mindre än 10x med en 1 ml pipett.
- Överför 1 ml av cellsuspensionen till ett 15 ml rör innehållande 9 ml RBC-lysbuffert. Inkubera cellerna i is i 7 min med mild inversion av rören var 2: e minut.
- Efter 7 min, centrifugera vid 200 x g i 5 min vid RT med en acceleration på 9 m/s² och en deacceleration på 7 m/s². Upprepa steg 7.2.5. tills en klar blekvit pellet observeras.
- Återsuspendera cellerna med 10 ml steril 1x DPBS och filtrera benmärgscellsuspensionen med en 40 μm cellsil på ett 15 ml rör. Skölj cellsilen med 2 ml 1x PBS 2x för att undvika förlust av celler.
- Centrifugera i 5 minuter vid 200 x g, RT, och kassera supernatanten med en pipett. Återsuspendera cellerna med 10 ml IMDM med DNase-I vid en arbetskoncentration på 100 μg/ml.
- Ta 1 x 106 mononukleära celler i ett FACS-rör för engraftmentanalys med flödescytometri. För att bedöma genredigeringsfrekvensen i engraferade mononukleära benmärgsceller, pellet 1 x 106 mononukleära celler vid 11 000 x g i 5 minuter vid RT och kassera supernatanten med hjälp av en pipett.
8. Immunfenotypning
- Inkubera benmärgscellerna med 1,5 μl av ett renat rekombinant humant Fc-protein (se materialtabell) i 15 minuter vid 4 °C innan det färgas med antikroppar.
OBS: Det humana Fc-proteinet som används här är formulerat för att blockera icke-specifik antikroppsfärgning orsakad av receptorer för IgG; Därmed ökar det specificiteten av antikroppsmärkning 7,21,22. Innan antikroppsfärgning av målcellerna, utför antikroppstitrering. Det rekommenderas starkt att inkludera FMO-kontroller och isotypkontroller när du arbetar med flerfärgad flödescytometrisk analys. - För att bestämma procentandelen human cellingraftment med flödescytometer, ta 1 x 106 mononukleära celler i ett FACS-rör och fläcka cellerna som nämns i tabell 8.
- Inkubera cellerna i mörker i 25–30 min vid RT. Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid RT och kassera supernatanten med pipett.
- Förvärva cellerna med en flödescytometer, grinda cellpopulationen (P1) med hjälp av framåt (FSC) och sidospridningar (SSC) av mononukleära celler och justera spänningen enligt cellpopulationen. Förvärva 50 000 cellhändelser i P1-populationen.
- För att analysera humana leukocytpopulationer i musbenmärg, grinda de humana CD45 + -cellerna och mus-CD45.1 från P1-cellpopulationen med hjälp av en programvara för analys av flödescytometridata (se materialtabell).
- Beräkna engraftmentet av mänskliga celler med hjälp av följande formel8:
% av engraftment = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
OBS: Tröskeln för human engraftment ansågs vara 0,1% positiv för CD45. - Vidare analysera andelen hCD34 + -celler från humana CD45 + -celler för att utvärdera de långsiktiga återbefolkningscellerna. För att bedöma flerlinjerekonstitueringen av de engraferade mänskliga cellerna, fläcka 100 μl cellsuspension enligt tabell 9.
OBS: Antikropparna måste titreras före experiment. - Med hjälp av flödescytometriprogramvaran grindar du hCD45 från P1-cellpopulationen och, från hCD45, kvantifierar procentandelen hCD19, hCD3 och hCD13 (lymfoida och myeloida delmängder).
9. Bedömning av genredigeringsfrekvens i engraferade mononukleära benmärgsceller
- Till benmärgens mononukleära cellpellet, tillsätt 50 μl snabb extraktlösning (se materialtabell) för 5 x 105 celler och återsuspendera pelleten.
- Inkubera blandningen i en termocykler vid 68 °C i 30 minuter. Efter en kort snurrning, inkubera blandningen i en termocykler vid 98 °C i 10 minuter.
- Mät koncentrationen av DNA i rålysatet med hjälp av en spektrofotometer. Följ steg 4.2.-4.4. för att validera genredigeringsfrekvensen med hjälp av ICE-analys 8,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie identifierar idealiska HSPC-odlingsförhållanden som underlättar retentionen av CD34 + CD133 + CD90 + HSC i ex vivo-kultur. För att demonstrera odlingsanrikningen av HSC tillsammans med den förbättrade genereringen av genmodifierade HSC: er tillhandahålls de optimerade procedurerna för PBMNC-isolering, CD34 + cellrening, odling, genredigering, transplantation, karakterisering av engraftment och genmodifierade celler in vivo (Figur 1). Efter rening utfördes flödescytometriutvärdering för att kontrollera HSPC-markörerna och HSPC odlades i 72 timmar. Efter 72 timmars kultur kärnbehandlades HSPC: erna med Cas9 RNP och odlades i ytterligare 2 dagar. De optimerade odlingsförhållandena som innehöll RUS-cocktailen visade ökad livskraft och högre frekvens av CD34 + CD133 + CD90 + HSC och ökad genredigeringsfrekvens (figur 2). För att ytterligare visa att de optimerade odlingsförhållandena ökar frekvensen av genmodifierade celler in vivo, genredigerades dag 3 HSPC: er riktade mot CCR5-locus och infunderades i sub-dödligt bestrålade NSG-möss. Engraftmentet av humana celler i musbenmärg (BM) analyserades 16 veckor efter infusion (figur 3A). Flödescytometrianalys av humana CD45+ (hCD45)-celler i NSG-möss visade ökad engraftment under odlingsförhållandena (figur 3B,C). Analys av genredigeringsfrekvensen i musens BM-celler visade ökad engraftment av genredigerade HSPC i RUS-kompletterade odlingsförhållanden (figur 3D).
Figur 1: Sammanfattning av denna studie. Grafisk sammanfattning av proceduren som är involverad i isolering av PBMNC, magnetisk anrikning av CD34 + -celler från PBMNC, odling, karakterisering av humana hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC), genredigering och transplantation representeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: RUS-cocktailen berikar frekvensen av HSC: er. mPB-HSPCs odlades i stamcellsodlingsmediet innehållande cytokiner med vehikel (DMSO) och RUS-cocktail i 3 dagar och genredigerades med 25 pM Cas9-RNP. De genredigerade cellerna analyserades av FACS för markörerna för HSPCs 48 h efter nukleofection. (A) Flödesdiagram representerar de levande cellerna (7AAD-) och CD34+ CD90+-populationen. (B) Procentandelen och frekvensen av indelmönster som analyserats 72 timmar efter redigering i den DMSO- och RUS-behandlade gruppen. (C) Det absoluta antalet CD34 + CD90 + -celler analyserade 48 timmar efter redigering (n = 2) (givare = 1). (D) Det absoluta antalet totala kärnceller (TNC) analyserade 48 timmar efterredigering (n = 2) (givare = 1). Felstaplar representerar medelvärdet ± SEM, *p ≤ 0,05 (oparat t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Optimerade odlingsförhållanden ökar frekvensen av genmodifierade celler in vivo. (A) Schematisk representation av experimentet. (B) Representativt FACS-diagram som visar hCD45+-cellerna i musens BM. Insatsen avser mänskliga celler (vänster) och musceller (höger). HSPCs odlades i 3 dagar, genredigerades med sgRNA på dag 3 och transplanterades omedelbart efter elektroporation. C) Integrering av mänskliga celler i BM hos mus 16 veckor efter infusion (n = 4). (D) Den humana genmodifierade cellen (hCD45+ genredigerade celler) chimerism i mus BM vid 16 veckor efter infusion (n = 4) (givare = 1). Varje punkt representerar en enskild mus och datapunkterna kommer från ett enskilt experiment. Felstaplar representerar medelvärdet ± SEM, *p≤ 0,05 (oparat t-test). Figuren är anpassad med tillstånd från Christopher et al.7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antal celler | Reningsbuffert (ml) |
| < 1 x 107 celler | 0.1 |
| 1 x 107 - 1 x 108 celler | 0.5 |
| 1 - 5 x 108 celler | 1 |
Tabell 1: Reningsbuffertens volym för att förbereda cellsuspensionen för CD34+ cellrening.
| Primer namn | Sekvens |
| CCR5 framåt | CAGAGCCAAGCTCTCCATC |
| CCR5 omvänd | AGAGACGCAAACACAGCCA |
| CCR5-sekvensering Framåtprimer | AATGTAGACATCTATGTAGG |
Tabell 2: Primersekvens för förstärkning av CCR5-locus.
| Komponenter | 50 μl reaktion |
| Buffert (5x) | 10 μl |
| Primer framåt (10 μM) | 1 μL |
| Omvänd primer (10 μM) | 1 μL |
| dNTP | 4 μl |
| Polymeras | 1 μL |
| Genomiskt DNA | 200 ng |
| Nukleasfritt vatten | upp till 50 μl |
Tabell 3: Reaktionsblandningen för förstärkning av CCR5-locus med PCR.
| Trappsteg | Varaktighet | Temperatur | Antal cykler |
| Inledande denaturering | 1 minuter | 95 °C | 1 |
| Denaturering | 10 sekunder | 98 °C | 35 |
| Glödgning | 15 sekunder | 56 °C | |
| Förlängning | 30 sekunder | 68 °C | |
| Slutlig förlängning | 1 minuter | 72 °C | 1 |
| Hålla | ∞ | 15 °C |
Tabell 4: Termocyklernas villkor för förstärkning av CCR5-locus.
| Komponenter | 10 μl reaktion |
| Buffert (5x) | 2 μl |
| primer (2 μM) | 1,6 μL |
| RR-blandning | 0,75 μL |
| PCR-rengöringsprodukt | 80 ng |
| Nukleasfritt vatten | upp till 10 μl |
Tabell 5: Reaktionsblandningen för Sanger-sekvensering av PCR.
| Trappsteg | Varaktighet | Temperatur | Antal cykler |
| Denaturering | 15 sekunder | 96 °C | 27 |
| Glödgning | 20 sekunder | 55 °C | |
| Förlängning | 4 minuter | 60 °C | |
| Hålla | ∞ | 15 °C |
Tabell 6: Termocykler för Sanger-sekvensering PCR.
| Buffert | Sammansättning |
| 10x RBC-lysbuffert - 100 ml (pH - 7.3) | 8,26 g NH4Cl, 1,19 g NaHCO3, 200 μL EDTA (0,5 M, pH8) |
| 50x TAE-buffert (pH - 8,3) | Lös upp 50 mM EDTA-natriumsalt, 2 M Tris, 1 M isättika i 1 liter vatten |
Tabell 7: Buffertsammansättningar
| Antikroppar | Volym |
| Anti-mänsklig CD45 APC | 3 μl |
| Anti-mus CD45.1 PerCP-Cy5 | 4,5 μL |
| Anti-mus CD34 PE | 3 μl |
Tabell 8: Antikroppar som används för att bedöma human cellingraftment.
| Antikroppar | Volym |
| Anti-mänsklig CD45 APC | 3 μl |
| Anti-mus CD19 PerCP | 15 μl |
| Anti-mus CD13 PE | 15 μl |
| Anti-mus CD3 PE-Cy7 | 2 μl |
Tabell 9: Antikroppar som används för att bedöma andelen celler med flera linjer som härrör från ingraferade HSPC:er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det framgångsrika resultatet av HSPC-genterapi är huvudsakligen beroende av kvaliteten och kvantiteten av engraferbara HSC i transplantatet. De funktionella egenskaperna hos HSC påverkas emellertid starkt under den förberedande fasen av genterapiprodukter, inklusive genom in vitro-odling och toxicitet associerad med genmanipulationsförfarandet. För att övervinna dessa begränsningar har vi identifierat idealiska HSPCs-odlingsförhållanden som behåller stammen hos CD34 + CD133 + CD90 + HSC i ex vivo-kultur. Många forskargrupper har använt SR1 eller UM171 eller andra molekyler som fristående molekyler för att expandera navelsträngsblod (UCB) HSPCs in vitro23,24. I en tidigare studie användes en kombination av både SR1 och UM17125. De små molekylerna och cytokinerna i odlingsmediet optimerades specifikt för mobiliserade vuxna HSPC och deras tillämpning i autolog genterapi. Screeningexperimentet visade att kombinera tre små molekyler Resveratrol, UM729 och SR1, är viktigt för att generera ett stort antal CD34 + CD90 + celler och hämma spridningen av differentierade och engagerade stamceller. UM729 i RUS-cocktailen kan ersättas med UM171. Den kommersiella upphandlingen av UM171 är dock mindre genomförbar. Cytokinkoncentrationerna antas från det protokoll som användes i kliniska studier26 för att minska variationerna under uppskalningsprocessen. Cytokincocktailen innehåller IL6 istället för IL3 för att minimera stamfaderproliferation och HSC-utmattning in vitro27. Beredning av färska alikvoter av odlingsmediet (basala medier + RUS + cytokincocktails) rekommenderas för att minska experimentell variation och erhålla hög reproducerbarhet. Protokollet är tillämpligt för både NHEJ- och HDR-medierad genredigering. I synnerhet är HSPC-kultur på 48-72 h före elektroporering och 24 timmar efter elektroporering avgörande för HDR-genredigering. De optimerade odlingsförhållandena bör gynna HDR-genredigering genom att bevara stamcellerna. Det observerades också att odlingsförhållandena hjälper lentiviral transduktion i långsiktiga HSC. Detta tyder på att om virala partiklar som AAV6 eller IDLV används som HDR-givare, förväntas HDR-redigeringseffektiviteten förbättras, eftersom de optimerade odlingsförhållandena främjar givarleverans till HSC.
För att bedöma genredigeringsresultat, inklusive NHEJ och HDR, föreslås NGS-analys, sond- eller ddPCR-analys eller Sanger-sekvensering 7,8,28, följt av dekonvolution med hjälp av onlineverktyg (ICE / ICE Knock-In)16, på grund av dess robusta kvantitativa natur. Alternativt kan en T7-endonukleasanalys utföras på redigerade DNA-prover, och de fragmenterade DNA-banden kan kvantifieras med hjälp av ImageJ. T7-endonukleasanalysmetoden är dock mindre exakt än dekonvolutionsanalys och riktar sig till nästa generations sekvensering.
Transplantationsprotokollet optimeras också genom att konditionera NBSGW-mössen med busulfan, vilket möjliggör låga celldoser för att bedöma HSPC-engraftment och återpopulation. Sammantaget måste detta förfarande minska de doser av HSPC som krävs för genmanipulation och öka tillgängligheten till HSPC-genterapi i utvecklingsländerna.
I den aktuella studien demonstrerades protokollen för PBMNC-isolering, CD34 + HSPC-rening, genredigering och validering och bedömning av de engraferade genredigerade HSPC: erna i musbenmärg. Det har också bevisats att den optimerade HSPC-kulturen berikar CD34 + CD133 + CD90 + HSPC och ökar chimerismen hos genredigerade celler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma personalen på flödescytometrianläggningen och djuranläggningen i CSCR. A. C. finansieras av ett ICMR-SRF-stipendium, K. V. K. finansieras av ett DST-INSPIRE-stipendium och P. B. finansieras av ett CSIR-JRF-stipendium. Detta arbete finansierades av Institutionen för bioteknik, Indiens regering (bidrag nr BT/PR26901/MED/31/377/2017 och BT/PR31616/MED/31/408/2019)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | - | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | - | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | - |
References
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
- Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
- Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
- Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
- Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
- Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
- Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
- Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
- Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
- Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
- Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
- Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
- Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
- Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
- Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
