Summary
हम समग्र चूहे के हिंदलिम्ब्स के लिए सर्जिकल तकनीक और डीसेल्यूलराइजेशन प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। डीसेलुलराइजेशन एक पूर्व विवो मशीन छिड़काव प्रणाली के माध्यम से कम सांद्रता सोडियम डोडेसिल सल्फेट का उपयोग करके आयोजित किया जाता है।
Abstract
गंभीर दर्दनाक चोटों और ऊतक हानि वाले रोगियों को जटिल शल्य चिकित्सा पुनर्निर्माण की आवश्यकता होती है। संवहनी समग्र एलोट्रांसप्लांटेशन (वीसीए) एक समग्र सबयूनिट के रूप में कई ऊतकों को स्थानांतरित करने के लिए एक विकसित पुनर्निर्माण एवेन्यू है। वीसीए की आशाजनक प्रकृति के बावजूद, दीर्घकालिक इम्यूनोसप्रेसिव आवश्यकताएं घातकता, अंत-अंग विषाक्तता और अवसरवादी संक्रमण के बढ़ते जोखिम के कारण एक महत्वपूर्ण सीमा हैं। इम्यूनोसप्रेशन की आवश्यकता को कम करने में एककोशिकीय मिश्रित मचानों की ऊतक इंजीनियरिंग एक संभावित विकल्प है। इसमें, एक चूहे हिंदलिम्ब की खरीद और सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) का उपयोग करके इसके बाद के डीसेलुलराइजेशन का वर्णन किया गया है। प्रस्तुत खरीद रणनीति आम ऊरु धमनी पर आधारित है। एक मशीन छिड़काव-आधारित बायोरिएक्टर सिस्टम का निर्माण किया गया था और हिंदलिम्ब के पूर्व विवो डीसेल्यूलराइजेशन के लिए उपयोग किया गया था। सफल छिड़काव डीसेल्यूलराइजेशन किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप हिंदलिम्ब की सफेद पारभासी जैसी उपस्थिति हुई। पूरे हिंदलिम्ब में एक बरकरार, अपरिवर्तनीय, संवहनी नेटवर्क देखा गया था। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने परमाणु सामग्री को हटाने और सभी ऊतक डिब्बों में ऊतक वास्तुकला के संरक्षण को दिखाया।
Introduction
वीसीए जटिल शल्य चिकित्सा पुनर्निर्माण की आवश्यकता वाले रोगियों के लिए एक उभरता हुआ विकल्प है। दर्दनाक चोटों या ट्यूमर के शोधन के परिणामस्वरूप वॉल्यूमेट्रिक ऊतक हानि होती है जिसे पुनर्निर्माण करना मुश्किल हो सकता है। वीसीए त्वचा, हड्डी, मांसपेशियों, नसों और वाहिकाओं जैसे कई ऊतकों का प्रत्यारोपण एक दातासे प्राप्तकर्ता को समग्र ग्राफ्ट के रूप में प्रदान करता है। इसकी आशाजनक प्रकृति के बावजूद, वीसीए दीर्घकालिक इम्यूनोसप्रेसिव रेजिमेन के कारण सीमित है। ऐसी दवाओं के आजीवन उपयोग से अवसरवादी संक्रमण, दुर्भावनाओं और अंत-अंग विषाक्तता 1,2,3 के लिए जोखिम बढ़ जाता है। इम्यूनोसप्रेशन की आवश्यकता को कम करने और / या समाप्त करने में मदद करने के लिए, वीसीए के लिए डीसेलुलराइजेशन दृष्टिकोण का उपयोग करके ऊतक-इंजीनियर मचान महान वादा दिखाते हैं।
ऊतक विकोशिकीयकरण सेलुलर और परमाणु सामग्री को हटाते हुए बाह्य मैट्रिक्स संरचना को बनाए रखने पर जोर देता है। इस विकोशिकीय पाड़ को रोगी-विशिष्ट कोशिकाओं के साथ फिर से आबाद किया जा सकताहै। हालांकि, समग्र ऊतकों के ईसीएम नेटवर्क को संरक्षित करना एक अतिरिक्त चुनौती है। यह एक मचान के भीतर अलग-अलग ऊतक घनत्व, आर्किटेक्चर और शारीरिक स्थानों के साथ कई ऊतक प्रकारों की उपस्थिति के कारण है। वर्तमान प्रोटोकॉल एक सर्जिकल तकनीक और एक चूहे हिंदलिम्ब के लिए एक डीसेल्युलराइजेशन विधि प्रदान करता है। यह समग्र ऊतकों के लिए इस ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक को लागू करने के लिए एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट मॉडल है। यह पुनर्कोशिकीयकरण के माध्यम से समग्र ऊतकों को पुनर्जीवित करने के बाद के प्रयासों को भी प्रेरित कर सकता है।
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Protocol
टोरंटो जनरल हॉस्पिटल रिसर्च इंस्टीट्यूट से प्राप्त कैडवेरिक नर लुईस चूहों (300-430 ग्राम) का उपयोग सभी प्रयोगों के लिए किया गया था। सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए, बाँझ उपकरणों और आपूर्ति का उपयोग सड़न रोकनेवाली तकनीक को बनाए रखने के लिए किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। टोरंटो जनरल हॉस्पिटल रिसर्च इंस्टीट्यूट, यूनिवर्सिटी हेल्थ नेटवर्क (टोरंटो, ओएन, कनाडा) में पशु देखभाल समिति के दिशानिर्देशों के अनुपालन में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया था। कुल चार हिंदलिम्ब्स को डीसेल्यूलराइज्ड किया गया था।
1. प्रीसर्जिकल तैयारी
- 5% हेपरिनाइज्ड खारा का 50 एमएल तैयार करें। एक 50 एमएल खारा बैग से, 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 2.5 एमएल खारा घोल निकालें और फेंक दें। 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, खारा बैग में 2.5 एमएल हेपरिन जोड़ें। खारा बैग को उसकी सामग्री को मिलाने के लिए उलटा करें।
- नीले पैड के नीचे लापरवाह स्थिति में एक कैडवेरिक चूहे को रखें। इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके हिंदलिम्ब और कमर क्षेत्र को शेव करें और बालों को हटा दें।
- चूहे को सर्जिकल स्टेशन पर लाएं और हिंदलिम्ब और कमर क्षेत्र में धुंध का उपयोग करके पोविडोन आयोडीन स्क्रब समाधान लागू करें। इसके बाद, धुंध का उपयोग करके स्क्रब समाधान को मिटाने के लिए 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल लागू करें।
- चरण 1.2 से नीले पैड को छोड़ दें और नए, बाँझ दस्ताने में बदलें।
2. चूहे हिंदलिम्ब की खरीद
- # 10 सर्जिकल ब्लेड और # 3 ब्लेड रनर का उपयोग करके त्वचा का चीरा लगाएं, जो एक पार्श्व से एक औसत दिशा में जाता है (चित्रा 1 ए)। चिकनी चीरा सुनिश्चित करने के लिए आसपास की त्वचा को पकड़ने के लिए एडसन फोर्स का उपयोग करें।
- जब अंतर्निहित वसा उजागर हो जाती है, तो वसा के माध्यम से सावधानीपूर्वक विच्छेदन करने के लिए कुंद विच्छेदन का उपयोग करें। बेहतर एपिगैस्ट्रिक वाहिकाओं का पता लगाएं।
- समीपस्थ रूप से विच्छेदन करने और अंतर्निहित ऊरु तंत्रिका, धमनी और नस को इंगुइनल लिगामेंट स्तर पर उजागर करने के लिए माइक्रोसिसर का उपयोग करें।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ऊरु वाहिकाओं की पहचान करें और धमनी नेटवर्क के विभाजन बिंदुओं से पर्याप्त लंबाई प्राप्त करने के लिए ठीक बल का उपयोग करके धमनी और नस को समीपस्थ रूप से विच्छेदित करें (चित्रा 1 बी)।
- 6-0 सीवन का उपयोग करके ऊरु धमनी और नस को अलग-अलग लाइगेट करें।
- लिगेटेड ऊरु वाहिकाओं को बाधित किए बिना हिंदलिम्ब के शेष भाग के चारों ओर परिधीय विच्छेदन का संचालन करें।
- हड्डी कटर का उपयोग करके ऊरु हड्डी को मध्य लंबाई में सही करें।
- हिंदलिम्ब को पूरी तरह से अलग करने के लिए, माइक्रोसिसर का उपयोग करके लिगेटर्स के नीचे लिगेटेड फेमोरल वाहिकाओं को सही करें।
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत 24 जी एंजियोकैथेटर का उपयोग करके ऊरु धमनी को कैनुलाट करें। कैनुला को सावधानी से डालने के लिए बारीक बल का उपयोग करें। हेपरिनाइज्ड खारा के साथ फ्लश जब तक ऊरु नस से स्पष्ट बहिर्वाह नहीं देखा जाता है।
- कैनुला के चारों ओर एक सीवन बांधकर कैनुला को सुरक्षित करें और कैनुला के चारों ओर एक और सीवन को दूर से बांधें। सुनिश्चित करें कि विभाजन बिंदुओं को अवरुद्ध करने से रोकने के लिए कैनुला को समीपस्थ रूप से रखा गया है।
- खरीदे गए हिंदलिम्ब्स को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में डीसेल्युलराइजेशन तक डुबोएं।
चित्र 1: चूहे हिंदलिम्ब की खरीद। (ए) पार्श्व से औसत दर्जे तक इनगुइनल लिगामेंट स्तर पर त्वचा चीरा का अंकन। (बी) ऊरु नस और ऊरु धमनी का दृश्य, जिसे डॉटेड लाइन द्वारा इंगित इनगुइनल लिगामेंट की ओर समीपस्थ रूप से विच्छेदित किया गया है। संक्षिप्तरूप: एल = पार्श्व; एम = औसत दर्जे का; एफवी = ऊरु नस; एफए = ऊरु धमनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
3. समाधान तैयार करना
- 6 लीटर ग्लास फ्लास्क में, 5 लीटर अल्ट्राप्योर डिस्टिल्ड पानी में 12.5 ग्राम एसडीएस पाउडर को भंग करके 0.25% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) का 5 लीटर डिटर्जेंट जलाशय तैयार करें। इसे सील करने के लिए फ्लास्क के उद्घाटन को पैराफिल्म के साथ कवर करें।
- एक 1 लीटर ग्लास जार में, 1 लीटर अल्ट्राप्योर डिस्टिल्ड पानी में 2.5 ग्राम एसडीएस को घोलकर अलग से 0.25% एसडीएस घोल का 1 लीटर तैयार करें। सभी एसडीएस भंग होने तक एक चुंबकीय हलचल पर घोल को मिलाने के लिए एक हलचल पट्टी जोड़ें।
- 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (एए) समाधान के साथ 1 लीटर 1x PBS धोने का समाधान तैयार करें। 1 लीटर फ्लास्क में, 990 एमएल 1x PBS समाधान और 10 mL AA जोड़ें।
- अलग से, 500 एमएल ग्लास जार में, 1x PBS + 1% AA समाधान को 495 mL 1x PBS समाधान और 5 mL AA का उपयोग करके फिर से तैयार करें।
- 1% पेरासिटिक एसिड (पीएए)/4% इथेनॉल (ईटीओएच) समाधान के 200 एमएल तैयार करें। इस घोल को एक फ्यूम हुड के तहत तैयार करें।
4. बायोरिएक्टर और छिड़काव सर्किट निर्माण
नोट: सूचीबद्ध चरणों में बायोरिएक्टर और छिड़काव सर्किट के विन्यास के लिए चित्रा 2 देखें।
- 500 एमएल चैंबर (प्लास्टिक कंटेनर) में, चित्रा 2 में लेबल किए गए स्थानों पर तीन छेद (1/4 इंच) ड्रिल करें: पोर्ट ए इनलेट लाइन है, पोर्ट बी फिर से भरने वाली लाइन है, और पोर्ट सी आउटलेट लाइन है। अतिरिक्त प्लास्टिक को हटा दें और छोड़ दें। 70% इथेनॉल के साथ कक्ष को स्प्रे और पोंछें।
- तीन 5 सेमी लंबी सिलिकॉन ट्यूबों को काटें और कक्ष के प्रत्येक बंदरगाह में एक आधा डालें। पोर्ट ए के उद्घाटन पर एक पुरुष लुएर कनेक्टर को कक्ष के अंदर की ओर और एक महिला लुएर कनेक्टर को कक्ष के बाहर ट्यूब के दूसरे छोर पर कनेक्ट करें।
- पोर्ट बी और पोर्ट सी पर एक महिला लुएर कनेक्टर को कक्ष से बाहर निकलने वाली ट्यूबों के सिरों पर कनेक्ट करें।
- प्लास्टिक कंटेनर के लिए एक एयर-टाइट ढक्कन में, ढक्कन की सतह पर एक छेद ड्रिल करें।
- एक 3 सेमी सिलिकॉन ट्यूब काटें और इसे ढक्कन के छेद में डालें। सुनिश्चित करें कि ट्यूब का लगभग 2 सेमी ढक्कन से बाहर स्थित है, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।
- ट्यूबिंग के साथ कक्ष और ढक्कन दोनों को निष्फल करें।
- कैंची का उपयोग करके दो 30 सेमी सिलिकॉन ट्यूबों को काटें। प्रत्येक ट्यूब के एक छोर पर कनेक्टर में 1/16 इंच को 1/8 से कनेक्ट करें।
- अलग से, कैंची का उपयोग करके दो 12 सेमी सिलिकॉन ट्यूबों को काटें। दोनों ट्यूबों के एक छोर पर कनेक्टर में 1/16 इंच को 1/8 से कनेक्ट करें। एक ट्यूब के दूसरे छोर पर एक पुरुष लुएर कनेक्टर और दूसरी ट्यूब से एक महिला लुएर कनेक्टर कनेक्टर कनेक्टर को कनेक्ट करें।
- चरण 4.7 और चरण 4.8 से सभी टयूबिंग सामग्री को निष्फल करें। नसबंदी में दो 3-स्टॉप पंप टयूबिंग (1.85 मिमी) शामिल करें।
- डीसेलुलराइजेशन सेटअप के लिए तीन 3-तरफा स्टॉपकॉक, एक सिरिंज फिल्टर, दो 1 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट और एक 10 एमएल सिरिंज तैयार करें। 1 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट से फिल्टर निकालें।
चित्रा 2: बायोरिएक्टर और छिड़काव सर्किट निर्माण की तैयारी। छिड़काव सर्किट के उपकरण दिखाए गए हैं जिनमें (ए) पेरिस्टाल्टिक पंप और (बी) इनलेट और आउटलेट लाइनों दोनों के लिए संबंधित कैसेट शामिल हैं। (C, D) 12 सेमी और 30 सेमी की सिलिकॉन ट्यूबिंग भी संबंधित कनेक्टर के साथ दिखाए गए हैं। (ई) पेरिस्टालिक पंप (1.85 मिमी) के लिए ट्यूबिंग। (एफ) प्रवाह, (जी) पोर्ट को फिर से भरने और (एच) बहिर्वाह के लिए लेबल किए गए पोर्ट के साथ बायोरिएक्टर चैंबर। (I) बायोरिएक्टर ढक्कन वेंटिलेशन पोर्ट के साथ दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
5. चूहे के पिछले अंगों का विकोशिकीयकरण
- इनलेट, आउटलेट और रिप्लानिंग लाइनों पर तीन एकल-उपयोग वाले 3-वे स्टॉपकॉक पर निष्फल कक्ष और स्क्रू रखें। सुनिश्चित करें कि रिसाव को रोकने के लिए पुनःपूर्ति बंदरगाह के लिए स्टॉपकॉक को इसके शेष दो बंदरगाहों पर कवर किया गया है।
- चरण 4.8 में बनाए गए ट्यूबों को इनलेट और आउटलेट लाइनों पर स्टॉपकॉक से संलग्न करें।
- ऊपर दिए गए चरण में ट्यूबों से पेरिस्टालिक टयूबिंग कनेक्ट करें। पेरिस्टालिक ट्यूबिंग पर कैसेट को सुरक्षित करें और इसे पेरिस्टालिक पंप पर रखें। अभी तक ट्यूबिंग के साथ कैसेट को सुरक्षित न करें।
- ऊपर दिए गए चरण से आउटलेट लाइन के पेरिस्टालिक टयूबिंग के अंत तक चरण 4.7 से एक ट्यूब कनेक्ट करें। दूसरे छोर पर एक 1 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट कनेक्ट करें। अपशिष्ट जलाशय फ्लास्क में सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ जुड़े अंत को निलंबित करें।
- इनलेट लाइन के लिए चरण 4.7 दोहराएँ। डिटर्जेंट जलाशय में सीरोलॉजिकल पिपेट से जुड़ी ट्यूब के अंत को निलंबित करें। पैराफिल्म के साथ डिटर्जेंट जलाशय फ्लास्क के उद्घाटन को तुरंत सील करें। डीसेल्युलराइजेशन सर्किट के अवलोकन के लिए चित्रा 3 ए, बी देखें।
- आधे स्तर पर बायोरिएक्टर कक्ष में 1 एल ग्लास जार (चरण 3.2) से 0.25% एसडीएस जोड़ें।
- एडसन फोर्सप्स का उपयोग करके खरीदे गए हिंदलिम्ब को लें और इसे बायोरिएक्टर चैंबर में सावधानी से निलंबित करें।
- हिंदलिम्ब के कैनुलेटेड हिस्से को इनलेट लाइन तक निर्देशित करने के लिए एडसन फोर्स के दो जोड़े का उपयोग करें। कैनुला को एक जोड़ी फोर्सप्स के साथ पकड़ते समय, इनलेट लाइन को कैनुला में मोड़ने और सुरक्षित करने के लिए फोर्स की दूसरी जोड़ी का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि कैनुला को डिकैनुलेशन को रोकने के लिए खींचा या मोड़ा नहीं गया है।
- एक बार सुरक्षित होने के बाद, आवश्यकतानुसार अंग को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए 1 एल ग्लास जार से 0.25% एसडीएस जोड़ें। सुनिश्चित करें कि आउटलेट पोर्ट भी बायोरिएक्टर जलाशय में डूबा हुआ है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि लगातार बहिर्वाह बनाए रखा गया है (चित्रा 3 सी)।
- चरण 4.4 और चरण 4.5 का उल्लेख करते हुए, बायोरिएक्टर चैंबर के ढक्कन पर वेंटिलेशन पोर्ट पर एक एकल-उपयोग सिरिंज फ़िल्टर संलग्न करें।
- बायोरिएक्टर पर ढक्कन को सुरक्षित करें और सुनिश्चित करें कि कक्ष सभी तरफ से सील हो (चित्रा 3 बी)।
- ट्यूबिंग से हवा को हटाने और छिड़काव सर्किट को प्राइम करने के लिए, इनलेट लाइन पर 3-वे स्टॉपकॉक का उपयोग करके डिटर्जेंट जलाशय से डिटर्जेंट खींचने के लिए एक नए, एकल-उपयोग 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करें।
- एक बार खींचने के बाद, आउटलेट लाइन पर 3-वे स्टॉपकॉक में डालने के लिए उसी तरल पदार्थ का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि इनलेट और आउटलेट लाइनों दोनों पर ट्यूबिंग में डिटर्जेंट मौजूद है।
- नीचे दबाएं और कैसेट को ट्यूबिंग के साथ पेरिस्टालिक पंप में सुरक्षित करें। पावर बटन का उपयोग करके पेरिस्टालिक पंप चालू करें।
- पेरिस्टाल्टिक पंप स्क्रीन पर, पहले चैनल के लिए छिड़काव दर सेट करने के लिए तीर कुंजी का उपयोग करके दूसरे टैब पर आगे बढ़ें। डिलीवरी के मोड के रूप में इनपुट प्रवाह दर और छिड़काव दर को 1 एमएल / मिनट पर सेट करें। सुनिश्चित करें कि उपकरण सेट-अप के अनुसार प्रवाह की दिशा सही है। दूसरे चैनल के लिए दोहराएँ।
- पेरिस्टालिक पंप को यह सुनिश्चित करने के लिए कैलिब्रेट करें कि इनलेट लाइन के माध्यम से वितरित तरल पदार्थ की मात्रा और / या आउटलेट लाइन से लिया गया दोनों के बीच एक सुसंगत दर पर बह रहा है। सुनिश्चित करें कि टयूबिंग आईडी 1.85 मिमी पर सेट है।
- कीपैड पर पावर बटन दबाकर इनलेट और आउटलेट लाइनों दोनों के लिए 1 एमएल / मिनट पर मशीन छिड़काव के माध्यम से डीसेल्युलराइजेशन शुरू करें। मॉनिटर करें और सुनिश्चित करें कि प्रवाह इनलेट और आउटलेट लाइनों दोनों पर सुसंगत और चल रहा है।
- डीसेल्यूलराइजेशन जारी रखें और दैनिक निगरानी करें। आवश्यकतानुसार, पुनःपूर्ति बंदरगाह के माध्यम से बायोरिएक्टर जलाशय को फिर से भरने के लिए 0.25% एसडीएस (चरण 3.2) के 1 एल का उपयोग करें। ऊतक की एक सफेद, पारभासी उपस्थिति की तलाश करें, जो दिन 5 तक दिखाई देगा, जो चूहे के पिछले अंगों के विकोशिकीयकरण का संकेत देता है।
चित्रा 3: चूहे के हिंदलिम्ब के छिड़काव डीसेल्युलराइजेशन बायोरिएक्टर सर्किट का अवलोकन। नीले तीर डिटर्जेंट और अपशिष्ट प्रवाह की दिशा को इंगित करते हैं। (बी) चूहे के हिंदलिम्ब युक्त बायोरिएक्टर के साथ डीसेल्युलराइजेशन सर्किट का अवलोकन। एसडीएस जलाशय (बाएं फ्लास्क) पेरिस्टालिक पंप में और बायोरिएक्टर के इनलेट टयूबिंग में जाता है। बहिर्वाह पेरिस्टालिक पंप के माध्यम से अपशिष्ट जलाशय (दाएं फ्लास्क) से जुड़ा हुआ है। (सी) (आई) बायोरिएक्टर जिसमें कैनुलाटेड फेमोरल धमनी से जुड़े इनलेट टयूबिंग के साथ चूहे हिंदलिम्ब होता है। (II) डिटर्जेंट को भरने के लिए कोने में स्थित बंदरगाह को फिर से भरना। (iii) निलंबन जलाशय में बहिर्वाह टयूबिंग निलंबित। संक्षिप्त नाम: एसडीएस = सोडियम डोडेसिल सल्फेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
6. पोस्ट-डीसेलुलराइजेशन धुलाई और नसबंदी
- डीसेल्युलराइजेशन की पुष्टि के बाद, डिटर्जेंट जलाशय को 1x PBS + 1% AA जलाशय से बदलें। पैराफिल्म के साथ फ्लास्क के उद्घाटन को सील करें। 1 mL / min पर 1x PBS + 1% AA छिड़काव शुरू करें और 2 दिनों तक जारी रखें।
- 1x PBS + 1% AA जलाशय को 0.1% PAA/4% EtOH जलाशय के 200 mL के साथ प्रतिस्थापित करें और 2 घंटे के लिए 1 mL/min पर छिड़काव शुरू करें।
- बाँझ एडसन फोर्सप्स के दो जोड़े का उपयोग करके इनलेट लाइन से हिंदलिम्ब को डिस्कनेक्ट करें, जिसमें एक जोड़ी इनलेट लाइन को मोड़ने के लिए बल की एक जोड़ी होती है और दूसरी कैनुला को पकड़ती है। सुनिश्चित करें कि कैनुला को डिकैनुलेशन को रोकने के लिए खींचा नहीं गया है।
- अंग को 500 एमएल ग्लास जार में स्टोर करें जिसमें 1x PBS + 1% AA होता है, जो आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर होता है।
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Representative Results
खरीद प्रोटोकॉल बाद के छिड़काव चरणों के लिए आम ऊरु धमनियों को अलग करने और कैनुला करने में सफल रहा। चित्रा 1 ए, बी में प्रतिनिधि विच्छेदन छवियां द्विभाजन बिंदुओं से पर्याप्त दूरी के साथ ऊरु वाहिकाओं के चीरा स्थान और जोखिम को दिखाती हैं। चित्रा 2 बायोरिएक्टर और छिड़काव सर्किट तैयार करने के लिए आवश्यक उपकरण दिखाता है। डीसेलुलराइजेशन का समापन बिंदु ऊतक की एक सफेद, पारभासी जैसी उपस्थिति को देखकर निर्धारित किया गया था। एक्स विवो मशीन छिड़काव प्रणाली चूहे के हिंदलिम्ब के छिड़काव डीसेल्युलराइजेशन में सफल रही। एक एकल-पास, क्लोज्ड-सिस्टम सर्किट बनाए रखा गया था (चित्रा 3)। देशी हिंदलिम्ब की सकल आकृति विज्ञान 0.25% एसडीएस छिड़काव के 5 दिनों के बाद एक सफेद, पीला रूप में बदल गया (चित्रा 4)।
ऊरु वाहिकाओं, त्वचा, तंत्रिका, हड्डी और मांसपेशियों में हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) से सना होने पर सेलुलर सामग्री को हटाने का अवलोकन किया गया था, जहां कोई नाभिक नहीं पाया गया था। प्रत्येक ऊतक संरचना की संरचनाओं का विश्लेषण देशी ऊतक के सापेक्ष किया गया था। विकोशिकीय ऊरु धमनी और नस दोनों ने नीले दाग वाले नाभिक की कमी को देखते हुए सभी परतों और आसपास के संयोजी ऊतक में परमाणु सामग्री का नुकसान दिखाया, अन्यथा देशी वाहिकाओं में मौजूद है (चित्रा 5 ए, बी और चित्रा 5 डी, ई)। ऊरु नस और धमनियों दोनों के ट्यूनिका इंटिमा, मीडिया और एडवेंटिटिया को डीसेलुलर वाहिकाओं (चित्रा 5 डी, ई) में बनाए रखा गया था। ऊरु तंत्रिका ने ऊतक संरचना का संरक्षण दिखाया, जिसमें एंडोन्यूरियम (चित्रा 5 सी और चित्रा 5 एफ) शामिल हैं। हड्डी ने अपनी समग्र ऊतक संरचना को डीसेलुलराइजेशन के बाद बनाए रखा, जिसमें हड्डी से और आसपास के एंडोस्टेम और पेरीओस्टेम परतों से ओस्टियोसाइट्स के दाग वाले नाभिक का अवलोकन योग्य नुकसान हुआ (चित्रा 5 जी और चित्रा 5 जे)। त्वचा ने एपिडर्मिस और डर्मिस से कोशिकाओं का नुकसान दिखाया। डर्मिस ने देशी त्वचा ऊतक (चित्रा 5 एच और चित्रा 5 के) के समान कोलेजन फाइबर को बरकरार रखा। अंत में, कंकाल की मांसपेशियों के अनुप्रस्थ दृश्य ने नाभिक के नुकसान को दिखाया जो अन्यथा एंडोमिसियम की परिधि में स्थित था। मायोफिबर सामग्री को डीसेलुलराइजेशन के बाद संबंधित फैसिकल्स (चित्रा 5 आई और चित्रा 5 एल) के भीतर बनाए रखा गया। पिकोग्रीन का उपयोग करके डीएनए परिमाणीकरण भी किया गया था, जहां ऊरु वाहिकाओं, तंत्रिका, त्वचा, मांसपेशियों और हड्डी में डीएनए सामग्री काफी कम हो गई थी (चित्रा 6)।
चित्र 4: देशी और विकोशिकीय चूहे के हिंदलिम्ब्स की सकल आकृति विज्ञान। (ए) खरीद के बाद 24 जी एंजियोकैथेटर के साथ देशी हिंदलिम्ब की ऊरु धमनी को शामिल किया जाता है। (बी) 0.25% एसडीएस के साथ डीसेलुलराइजेशन के 5 दिनों के बाद हिंदलिम्ब की सफेद, पारभासी उपस्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन का उपयोग करके चूहे के हिंदलिम्ब ऊतकों का हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन। एच एंड ई-सना हुआ देशी (शीर्ष पैनल) और डीसेल्यूलराइज्ड (निचला पैनल) (ए, डी) ऊरु नस और (बी, ई) धमनी, (सी, एफ) तंत्रिका, (जी, जे) हड्डी, (एच, के) त्वचा, और (आई, एल) मांसपेशी। सभी डीसेल्यूलराइज्ड नमूनों में दिखाई देने वाले नाभिक और सेलुलर सामग्री का नुकसान। स्केल बार = 200 μm (वाहिकाओं, तंत्रिका, हड्डी) और 300 μm (त्वचा, मांसपेशी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: देशी और डीसेल्यूलराइज्ड चूहे हिंदलिम्ब ऊतकों का डीएनए परिमाणीकरण। डीएनए सामग्री देशी और डीसेल्यूलराइज्ड वाहिकाओं, तंत्रिका, मांसपेशियों, त्वचा और हड्डी में कम हो जाती है, जो एनजी / मिलीग्राम सूखे वजन में व्यक्त की जाती है। ऊतकों को सुखाया गया और 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पपैन में पचाया गया। कई अप्रकाशित टी-परीक्षण किए गए थे। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया है। **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. संक्षिप्तरूप: एन = देशी; डी = डीसेल्यूलराइज्ड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
वीसीए 5 में प्रायोगिक मॉडल के रूप में चूहे के हिंदलिम्बउपयोगी हैं। एककोशिकीय मचानों की ऊतक इंजीनियरिंग वीसीए से जुड़े दीर्घकालिक इम्यूनोसप्रेशन रेजिमेन की कमियों को संबोधित करने में पहला कदम है। मिश्रित ग्राफ्ट का उपयोग कई ऊतकों की उपस्थिति को देखते हुए एक अतिरिक्त चुनौती है, जिनमें से प्रत्येक में अद्वितीय कार्यात्मक, इम्युनोजेनिक और संरचनात्मक गुण होते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल एककोशिकीय समग्र चूहे के हिंदलिम्ब्स प्राप्त करने के लिए एक सफल विधि दिखाता है। इन मचानों को और अधिक पुनर्कोशिकीय किया जा सकता है और वीसीए के लिए एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट मॉडल का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है।
सफल खरीद और डीसेल्यूलराइजेशन सुनिश्चित करने के लिए, सर्जिकल और डीसेल्यूलराइजेशन चरणों में विभिन्न महत्वपूर्ण कदम हैं। पूरे देशी वाहिका में डिटर्जेंट और बाँझ समाधान के प्रणालीगत वितरण को सुनिश्चित करने के लिए, महत्वपूर्ण चरणों में एपिगैस्ट्रिक वाहिकाओं का बंधाव शामिल है, साथ ही ऊरु वाहिकाओं के बंधाव से पहले धमनीशिरापरक नेटवर्क के विभाजन बिंदुओं से पर्याप्त दूरी प्राप्त करना शामिल है। वर्णित नसबंदी प्रक्रिया पुनर्कोशिकीयकरण प्रयोगों के लिए बायोबर्डन को कम करने में मदद करती है जहां सेल लगाव, अस्तित्व और विकासके लिए एक बाँझ वातावरण की आवश्यकता होती है।
हम एक छिड़काव बायोरिएक्टर सिस्टम भी प्रस्तुत करते हैं जिसे डीसेल्युलराइजेशन को लागू करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। महत्वपूर्ण घटकों में एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके निरंतर छिड़काव की क्षमता और कैनुलेटेड धमनी के माध्यम से डिटर्जेंट और बाँझ के एकल-पास छिड़काव की अनुमति शामिल है। फिजियोलॉजिकल स्थितियों के समान पेरिस्टालिक पंप को एक पल्सटाइल प्रवाह पर भी सेट किया गया था। अंत में, बाहरी वातावरण में हिंदलिम्ब को उजागर किए बिना बायोरिएक्टर में निलंबन जलाशय को फिर से भरने के लिए एक भरने वाले बंदरगाह को शामिल किया गया था। इसलिए, यह बायोरिएक्टर सिस्टम फायदेमंद है क्योंकि यह एक बंद-सिस्टम, सिंगल-पास फैशन में एक चूहे के हिंदलिम्ब एक्स विवो को डीसेल्युलर और स्टरलाइज़ कर सकता है। सर्किट के घटक ऑटोक्लेवेबल हैं और प्रत्येक डीसेलुलराइजेशन चक्र से पहले निष्फल किए जा सकते हैं। हिंदलिम्ब में मांसपेशियों के घनत्व और अपेक्षाकृत बड़ी उपस्थिति को देखते हुए, मांसपेशियों तक पहुंचने और विकोशिकीय बनाने में मदद करने के लिए इस पूर्व विवो सर्किट के डिजाइन में डिटर्जेंट छिड़काव और पनडुब्बी विधियों दोनों को शामिल किया गया था।
यद्यपि बायोरिएक्टर चैंबर और डीसेल्यूलराइजेशन सर्किट को सावधानीपूर्वक डिजाइन किया गया था और चूहे के हिंदलिम्ब के अनुरूप बनाया गया था, लेकिन इसमें एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डिजाइन है जिसे अन्य ऊतकों के लिए इस प्रोटोकॉल को अपनाते समय संशोधित किया जा सकता है। अतिरिक्त संशोधनों में छिड़काव सर्किट में एक बुलबुला जाल शामिल हो सकता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि हवा के बुलबुले 7,8 के कारण प्रवाह दर बाधित न हो। इसके अलावा, हमने डीसेलुलराइजेशन की अवधि के दौरान छिड़काव दबाव की निगरानी के लिए दबाव निगरानी प्रणाली को शामिल नहीं किया। इंट्राल्यूमिनल सेलुलर मलबे के कारण छिड़काव दबाव में उतार-चढ़ाव संभव है। हाल ही में, कोहेन एट अल ने 1-2 एमएल / मिनट की समान लक्ष्य प्रवाह दर का उपयोग करके, चूहे के हिंदलिम्ब में संवहनी चिमेरिज्म उत्पन्न करने के दृष्टिकोण में एसडीएस छिड़काव के दौरान छिड़काव दबाव में अस्थायी उतार-चढ़ाव की सूचना दी। संभावित क्लोग्स9 के उपचार के बाद छिड़काव दबाव को स्थिर किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए भविष्य के छिड़काव प्रणाली डिजाइन संशोधनों के लिए, एक दबाव मॉनिटर का समावेश किसी भी इंट्राल्यूमिनल रोड़ा के बारे में जानकारीपूर्ण हो सकता है और वाहिका को नुकसान को रोकने में मदद करने के लिए उपचार की आवश्यकता का संकेत दे सकता है।
इस मॉडल में, डीसेलुलराइजेशन के दौरान और बाद में बहिर्वाह देखा गया था। मचानों की व्यवहार्यता और कार्यक्षमता सुनिश्चित करने के लिए, एक समग्र ग्राफ्ट10 में विभिन्न ऊतकों को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के वितरण के लिए संवहनी पैटेंसी की आवश्यकता होती है। इस डीसेल्यूलराइजेशन प्रोटोकॉल की क्षमता को आगे के पुनर्कोशिकीयकरण अध्ययनों में विस्तारित किया जा रहा है, बहिर्वाह का अवलोकन महत्वपूर्ण है ताकि पुनर्कोशिकीयकरण के दौरान विकोशिकीय संवहनी पेड़ को फिर से आबाद और पुन: कार्यात्मक बनाया जा सके। संवहनी इमेजिंग का उपयोग संवहनी पैटेंसी की पुष्टि करने के लिए पोस्ट-डीसेल्युलराइजेशन का उपयोग किया जा सकता है।
आज तक, चूहे के हिंदलिम्ब के डीसेल्यूलराइजेशन पर कुछ अध्ययन किए गए हैं, जिसमें प्रत्येक ऊतक डिब्बे 9,11 में सफलता पर सीमित परिणाम हैं। वर्तमान अध्ययन में प्रतिनिधि परिणाम हिंदलिम्ब में मौजूद सभी ऊतक डिब्बों में डीसेल्युलराइजेशन के प्रभाव को दिखाते हैं। सर्जिकल विधि बड़ी मात्रा में मांसपेशियों और त्वचा को भी बनाए रखती है जिसे क्रमिक रूप से बायोप्सी किया जा सकता है और आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल कम एसडीएस एकाग्रता को नियोजित करके कम विषाक्त डीसेल्युलराइजेशन दृष्टिकोण का सुझाव देता है जो आमतौर पर समग्र और पृथकऊतकों के लिए डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है। प्रस्तावित पूर्व विवो बायोरिएक्टर सिस्टम को अन्य ऊतकों और मॉडलों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।
अंत में, प्रस्तावित प्रोटोकॉल एक पूर्व विवो मशीन छिड़काव प्रणाली का उपयोग करके चूहे के हिंदलिम्ब्स के लिए एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य शल्य चिकित्सा तकनीक और डीसेल्युलराइजेशन विधि प्रदान करता है। भविष्य के अनुप्रयोगों में ऊतक-विशिष्ट कोशिकाओं के साथ इस मचान को फिर से बनाना और हड्डी, मांसपेशियों और तंत्रिका जैसे ऊतकों में कार्यात्मक क्षमता को पुनर्जीवित करने के लिए रास्ते की जांच करना शामिल है। भविष्य के अध्ययन बाह्य मैट्रिक्स, देशी वाहिका के प्रतिधारण और जैव रासायनिक गुणों को भी चिह्नित कर सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
चित्र 3A BioRender.com में बनाया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
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