Summary
We beschrijven de chirurgische techniek en het decellularisatieproces voor samengestelde rattenachterpoten. Decellularisatie wordt uitgevoerd met behulp van natriumdodecylsulfaat met een lage concentratie via een ex vivo machineperfusiesysteem.
Abstract
Patiënten met ernstige traumatische verwondingen en weefselverlies vereisen een complexe chirurgische reconstructie. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is een evoluerende reconstructieve weg voor het overbrengen van meerdere weefsels als een samengestelde subeenheid. Ondanks het veelbelovende karakter van VCA, zijn de immunosuppressieve vereisten op lange termijn een significante beperking vanwege het verhoogde risico op maligniteiten, eindorgaantoxiciteit en opportunistische infecties. Tissue engineering van acellulaire composietsteigers is een potentieel alternatief om de behoefte aan immunosuppressie te verminderen. Hierin wordt de verkrijging van een rat hindlimb en de daaropvolgende decellularisatie met behulp van natriumdodecylsulfaat (SDS) beschreven. De gepresenteerde inkoopstrategie is gebaseerd op de gemeenschappelijke dijbeenslagader. Een machinaal perfusie-gebaseerd bioreactorsysteem werd gebouwd en gebruikt voor ex vivo decellularisatie van de achterste. Succesvolle perfusie decellularisatie werd uitgevoerd, resulterend in een wit doorschijnend-achtig uiterlijk van de achterste. Een intact, doorlaatbaar, vasculair netwerk in de hele achtervel werd waargenomen. Histologische analyses toonden de verwijdering van nucleaire inhoud en het behoud van weefselarchitectuur in alle weefselcompartimenten.
Introduction
VCA is een opkomende optie voor patiënten die een complexe chirurgische reconstructie nodig hebben. Traumatische verwondingen of tumorresecties resulteren in volumetrisch weefselverlies dat moeilijk te reconstrueren kan zijn. VCA biedt de transplantatie van meerdere weefsels zoals de huid, bot, spier, zenuwen en bloedvaten als een samengesteld transplantaat van een donor naar een ontvanger1. Ondanks het veelbelovende karakter is VCA beperkt vanwege langdurige immunosuppressieve regimes. Levenslang gebruik van dergelijke geneesmiddelen resulteert in een verhoogd risico op opportunistische infecties, maligniteiten en eindorgaantoxiciteit 1,2,3. Om de behoefte aan immunosuppressie te verminderen en / of te elimineren, zijn weefsel-gemanipuleerde steigers met behulp van decellularisatiebenaderingen voor VCA veelbelovend.
Weefseldecellularisatie houdt in dat de extracellulaire matrixstructuur behouden blijft terwijl de cellulaire en nucleaire inhoud wordt verwijderd. Deze gedecellulariseerde steiger kan opnieuw worden bevolkt met patiëntspecifieke cellen4. Het behoud van het ECM-netwerk van samengestelde weefsels is echter een extra uitdaging. Dit komt door de aanwezigheid van meerdere weefseltypen met verschillende weefseldichtheden, architecturen en anatomische locaties binnen een steiger. Het huidige protocol biedt een chirurgische techniek en een decellularisatiemethode voor een rat hindlimb. Dit is een proof-of-concept model voor het toepassen van deze tissue engineering techniek op composiet weefsels. Dit kan ook leiden tot latere inspanningen om samengestelde weefsels te regenereren door middel van recellularisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cadaverische mannelijke Lewisratten (300-430 g) verkregen van het Toronto General Hospital Research Institute werden gebruikt voor alle experimenten. Voor alle chirurgische ingrepen werden steriele instrumenten en benodigdheden gebruikt om de aseptische techniek te behouden (zie de Tabel van Materialen). Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Animal Care Committee van het Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Canada). In totaal werden vier achterpoten gedecellulariseerd.
1. Prechirurgische bereiding
- Bereid 50 ml 5% gehepariniseerde zoutoplossing. Haal uit een zoutzak van 50 ml 2,5 ml zoutoplossing met een spuit van 5 ml en gooi deze weg. Voeg met een spuit van 5 ml 2,5 ml heparine toe aan de zoutzak. Keer de zoutzak om om de inhoud ervan te mengen.
- Plaats een cadaverische rat in rugligging onder een blauwe pad. Scheer de achterwand en liesstreek om de hoek met een elektrisch scheerapparaat en verwijder het haar.
- Breng de rat naar het operatiestation en breng Povidone jodium scrub oplossing aan met behulp van een gaasje op de achter- en liesstreek. Breng vervolgens 70% isopropylalcohol aan om de scruboplossing met gaas af te vegen.
- Gooi de blauwe pad uit stap 1.2 weg en verander in nieuwe, steriele handschoenen.
2. Verkrijging van rat hindlimb
- Maak een huidincisie met behulp van een # 10 chirurgisch mes en een # 3 blade runner langs het niveau van het inguinale ligament, van een laterale naar een mediale richting (figuur 1A). Gebruik adson tang om de omliggende huid vast te houden om een gladde incisie te garanderen.
- Wanneer het onderliggende vet wordt blootgesteld, gebruik dan stompe dissectie om zorgvuldig door het vet te ontleden. Lokaliseer de superieure epigastrische vaten.
- Gebruik microscissors om proximaal te ontleden en de onderliggende femorale zenuw, slagader en ader bloot te leggen op het niveau van het inguinale ligament.
- Identificeer onder een dissectiemicroscoop de femorale vaten en ontleed de slagader en ader proximaal met behulp van een fijne tang om voldoende lengte te verkrijgen van de bifurcatiepunten van het arteriële netwerk (figuur 1B).
- Ligaat de dijbeenslagader en ader afzonderlijk met behulp van 6-0 hechtingen.
- Voer circumferentiële dissectie uit rond de rest van de achterste zonder de ligamb te verstoren.
- Transect het femorale bot halverwege de lengte met behulp van een botsnijder.
- Om de achterste stroming volledig te isoleren, transect de geligeerde femorale vaten onder de ligaturen met behulp van microscissors.
- Kan de dijbeenslagader met behulp van een 24 G angiocatheter onder de dissectiemicroscoop. Gebruik een fijne tang om de canule voorzichtig in te brengen. Spoel met gehepariniseerde zoutoplossing totdat een duidelijke uitstroom uit de femorale ader wordt waargenomen.
- Bevestig de canule door één hechting rond het gecannuleerde vat en een andere hechting distaal rond de canule zelf te binden. Zorg ervoor dat de canule proximaal wordt geplaatst om te voorkomen dat de bifurcatiepunten worden geblokkeerd.
- Dompel de verkregen achterpoten onder in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot decellularisatie.
Figuur 1: Inkoop van rattenachtervel. (A) Markering van de huidincisie op het niveau van het inguinale ligament van lateraal tot mediaal. (B) Zicht op de femorale ader en de dijbeenslagader, die proximaal zijn ontleed in de richting van het liesband, aangegeven door de stippellijn. Afkortingen: L = lateraal; M = mediaal; FV = femorale ader; FA = dijbeenslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Bereiding van oplossingen
- Bereid in een glazen kolf van 6 L een reinigingsmiddelreservoir van 5 L van 0,25% natriumdodecylsulfaat (SDS) door 12,5 g SDS-poeder op te lossen in 5 L ultrapuur gedestilleerd water. Bedek de opening van de kolf met parafilm om deze af te dichten.
- Bereid in een glazen pot van 1 L 1 L 0,25% SDS-oplossing afzonderlijk door 2,5 g SDS op te lossen in 1 L ultrapuur gedestilleerd water. Voeg een roerstaaf toe om de oplossing op een magneetroerder te mengen totdat alle SDS is opgelost.
- Bereid 1 l 1x PBS-wasoplossing met 1% antibioticum-antimycotische (AA) oplossing. Voeg in een kolf van 1 L 990 ml 1x PBS-oplossing en 10 ml AA toe.
- Bereid afzonderlijk, in een glazen pot van 500 ml, 1x PBS + 1% AA-oplossing opnieuw met 495 ml 1x PBS-oplossing en 5 ml AA.
- Bereid 200 ml 1% perazijnzuur (PAA)/4% ethanol (EtOH) oplossing. Bereid deze oplossing onder een zuurkast.
4. Bioreactor en perfusiecircuit constructie
OPMERKING: Raadpleeg figuur 2 voor de configuratie van de bioreactor en het perfusiecircuit in de vermelde stappen.
- Boor in een kamer van 500 ml (plastic container) drie gaten (1/4 inch) op de gelabelde locaties in figuur 2: poort A is de inlaatlijn, poort B is de vullijn en poort C is de uitlaatlijn. Verwijder en gooi overtollig plastic weg. Spuit en veeg de kamer af met 70% ethanol.
- Snijd drie 5 cm lange siliconen buisjes en steek er een half in elke poort van de kamer. Sluit een mannelijke Luer-connector aan op de opening van poort A aan de binnenkant van de kamer en een vrouwelijke Luer-connector aan het andere uiteinde van de buis buiten de kamer.
- Sluit een vrouwelijke Luer-connector aan op poort B en poort C aan de uiteinden van de buizen die uit de kamer zijn gericht.
- Boor in een luchtdicht deksel voor de plastic container één gat op het oppervlak van het deksel.
- Snijd een siliconen buis van 3 cm en steek deze in het gat van het deksel. Zorg ervoor dat ongeveer 2 cm van de buis zich uit het deksel bevindt, zoals weergegeven in figuur 2.
- Steriliseer zowel de kamer als het deksel met de slang.
- Knip twee siliconen buisjes van 30 cm met een schaar. Sluit een 1/16 in aan op een 1/8 in connector aan één uiteinde van elke buis.
- Knip afzonderlijk twee siliconenbuizen van 12 cm met een schaar. Sluit een 1/16 in aan op een 1/8 in connector aan het ene uiteinde van beide buizen. Sluit een mannelijke Luer-connector aan het andere uiteinde van de ene buis en een vrouwelijke Luer-connector aan op de andere buis.
- Steriliseer al het slangmateriaal uit stap 4.7 en stap 4.8. Neem twee 3-stop pompslangen (1,85 mm) op in de sterilisatie.
- Bereid drie 3-weg stopkranen, een spuitfilter, twee serologische pipetten van 1 ml en een spuit van 10 ml voor de decellularisatie-opstelling. Verwijder het filter uit de serologische pipetten van 1 ml.
Figuur 2: Voorbereiding van de bouw van bioreactoren en perfusiecircuits. Afgebeelde apparatuur van het perfusiecircuit, met inbegrip van (A) peristaltische pomp en (B) overeenkomstige cassettes voor zowel inlaat- als uitlaatleidingen. (C, D) Siliconen slangen van 12 cm en 30 cm worden ook weergegeven met respectievelijke connectoren. (E) Buizen voor peristaltische pomp (1,85 mm). Bioreactorkamer met gelabelde poorten voor (F) instroom, (G) vulpoort en (H) uitstroom. (I) Bioreactordeksel weergegeven met ventilatiepoort. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Decellularisatie van rattenachterpoten
- Plaats de gesteriliseerde kamer en schroef op drie 3-weg stopkranen voor eenmalig gebruik bij de inlaat-, uitlaat- en bijvulleidingen. Zorg ervoor dat de stopkraan voor de vulpoort is afgedekt op de resterende twee poorten om lekkage te voorkomen.
- Bevestig de in stap 4.8 gemaakte buizen aan de stopkranen bij de inlaat- en uitlaatleidingen.
- Sluit peristaltische buizen aan op de buizen in de bovenstaande stap. Bevestig de cassette op de peristaltische slang en plaats deze op de peristaltische pomp. Zet de cassettes nog niet vast met slangen.
- Sluit één buis van stap 4.7 aan op het einde van de peristaltische buis van de uitlaatlijn vanaf de bovenstaande stap. Sluit een serologische pipet van 1 ml aan het andere uiteinde aan. Hang het uiteinde bevestigd met een serologische pipet in de kolf van het afvalreservoir.
- Herhaal stap 4.7 voor de inlaatlijn. Hang het uiteinde van de buis dat aan de serologische pipet is bevestigd in het reinigingsmiddelreservoir. Sluit de opening van de kolf van het reinigingsreservoir onmiddellijk af met parafilm. Zie figuur 3A,B voor een overzicht van het decellularisatiecircuit.
- Voeg 0,25% SDS uit de glazen pot van 1 L (stap 3.2) halverwege toe aan de bioreactorkamer.
- Neem de verkregen achterklep met behulp van een Adson-tang en hang deze voorzichtig in de bioreactorkamer.
- Gebruik twee paar Adson-tangen om het gecannuleerde deel van de achterste naar de inlaatlijn te leiden. Terwijl u de canule met één tang vasthoudt, gebruikt u de andere tang om de inlaatlijn aan de canule te draaien en vast te zetten. Zorg ervoor dat de canule niet wordt getrokken of gedraaid om decannulatie te voorkomen.
- Eenmaal vastgezet, voegt u meer 0,25% SDS toe uit de glazen pot van 1 L om de ledemaat volledig onder te dompelen, indien nodig. Zorg ervoor dat de uitlaatpoort ook ondergedompeld is in het bioreactorreservoir om ervoor te zorgen dat een consistente uitstroom wordt gehandhaafd (figuur 3C).
- Bevestig een spuitfilter voor eenmalig gebruik op de ventilatiepoort op het deksel van de bioreactorkamer, verwijzend naar stap 4.4 en stap 4.5.
- Bevestig het deksel van de bioreactor en zorg ervoor dat de kamer van alle kanten is afgesloten (figuur 3B).
- Om lucht uit de slang te verwijderen en het perfusiecircuit te primen, gebruikt u een nieuwe spuit voor eenmalig gebruik van 10 ml om reinigingsmiddel uit het reinigingsmiddelreservoir te halen met behulp van de 3-weg stopkraan bij de inlaatlijn.
- Eenmaal getekend, gebruik dezelfde vloeistof om in de 3-weg stopkraan aan de uitlaatlijn te steken. Zorg ervoor dat er wasmiddel aanwezig is in de slang bij zowel de inlaat- als de uitlaatleidingen.
- Druk de cassettes met de slang in de peristaltische pomp en bevestig deze vast. Schakel de peristaltische pomp in met de aan/uit-knop.
- Ga op het peristaltische pompscherm naar het tweede tabblad met behulp van de pijltoets om de perfusiesnelheid voor het eerste kanaal in te stellen. Invoerdebiet als de wijze van afgifte en stel de perfusiesnelheid in op 1 ml/min. Zorg ervoor dat de stroomrichting correct is volgens de opstelling van het apparaat. Herhaal dit voor het tweede kanaal.
- Kalibreer de peristaltische pomp om ervoor te zorgen dat de hoeveelheid vloeistof die door de inlaatleiding wordt afgegeven en/of uit de uitlaatleiding wordt gehaald, met een consistente snelheid tussen de twee stroomt. Zorg ervoor dat de buis-ID is ingesteld op 1,85 mm.
- Begin met decellularisatie via machineperfusie op 1 ml /min voor zowel de inlaat- als de uitlaatlijnen door op de aan / uit-knop op het toetsenbord te drukken. Controleer en zorg ervoor dat de stroom consistent en continu is bij zowel de inlaat- als de uitlaatleidingen.
- Ga door met decellularisatie en controleer dagelijks. Gebruik de 1 L van 0,25% SDS (stap 3.2) om het bioreactorreservoir indien nodig aan te vullen via de vulpoort. Zoek naar een wit, doorschijnend uiterlijk van het weefsel, dat op dag 5 zal verschijnen, wat wijst op decellularisatie van de achterpoten van de rat.
Figuur 3: Overzicht van het perfusie decellularisatie bioreactor circuit van rat hindlimb. (A) Schematische weergave van bioreactor perfusie circuit. Blauwe pijlen geven de richting van de wasmiddel- en afvalstroom aan. (B) Overzicht van het decellularisatiecircuit met bioreactor met rattenachterhoek. Het SDS-reservoir (linkerkolf) leidt naar de peristaltische pomp en naar de inlaatbuis van de bioreactor. De uitstroom wordt via de peristaltische pomp verbonden met het afvalreservoir (rechterkolf). (C) (I) Bioreactor met rattenachterwand met inlaatbuizen verbonden met de gecannuleerde dijbeenslagader. (II) In de hoek gelegen aanvullingspoort voor het perfuseren van reinigingsmiddel. (III) Uitstroombuizen opgehangen in het suspensiereservoir. Afkorting: SDS = sodium dodecyl sulfate. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Wassen en steriliseren na decellularisatie
- Na de bevestiging van decellularisatie, vervangt u het reinigingsmiddelreservoir door het 1x PBS + 1% AA-reservoir. Sluit de opening van de kolf af met parafilm. Begin 1x PBS + 1% AA-perfusie bij 1 ml / min en ga 2 dagen door.
- Vervang het 1x PBS + 1% AA reservoir door 200 ml 0,1% PAA/4% EtOH reservoir en begin met perfusie bij 1 ml/min gedurende 2 uur.
- Koppel de achterklep los van de inlaatlijn met behulp van twee paar steriele Adson-tangen, waarbij één paar tangen de inlaatlijn draaien en de andere de canule vasthoudt. Zorg ervoor dat de canule niet wordt getrokken om decannulatie te voorkomen.
- Bewaar de ledemaat in een glazen pot van 500 ml met 1x PBS + 1% AA bij 4 °C tot verder gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het inkoopprotocol was succesvol in het isoleren en cannuleren van de gemeenschappelijke femorale slagaders voor volgende perfusiestappen. De representatieve dissectiebeelden in figuur 1A,B tonen de incisielocatie en belichting van de femorale vaten met voldoende afstand tot de bifurcatiepunten. Figuur 2 toont de apparatuur die nodig is voor de voorbereiding van de bioreactor en het perfusiecircuit. Het eindpunt van decellularisatie werd bepaald door een wit, doorschijnend uiterlijk van het weefsel te observeren. Het ex vivo machineperfusiesysteem was succesvol in de perfusie-decellularisatie van de ratachterhoek. Er werd een single-pass, gesloten systeemcircuit onderhouden (figuur 3). De grove morfologie van de inheemse achtervel veranderde in een wit, bleek uiterlijk na 5 dagen van 0,25% SDS-perfusie (figuur 4).
De verwijdering van cellulaire inhoud werd waargenomen wanneer gekleurd met hematoxyline en eosine (H &E) in de femorale vaten, huid, zenuw, bot en spieren waar geen kernen werden gevonden. De structuren van elke weefselstructuur werden geanalyseerd ten opzichte van inheems weefsel. Zowel gedecelluliseerde femorale slagader als ader vertoonden verlies van nucleaire inhoud over alle lagen en het omliggende bindweefsel, gezien het ontbreken van blauwgekleurde kernen, die anders aanwezig zijn in de inheemse bloedvaten (figuur 5A, B en figuur 5D, E). De tunica intima, media en adventitia van zowel de femorale ader als de slagaders werden gehandhaafd in de gedecellulariseerde vaten (figuur 5D, E). De femorale zenuw vertoonde behoud van de weefselstructuur, inclusief het endoneurium (figuur 5C en figuur 5F). Het bot behield zijn algehele weefselstructuur na decellularisatie, met een waarneembaar verlies van gekleurde kernen van osteocyten uit het bot en uit omliggende endosteum- en periosteumlagen (figuur 5G en figuur 5J). De huid vertoonde een verlies van cellen uit de opperhuid en dermis. De dermis vertoonde vastgehouden collageenvezels, vergelijkbaar met inheems huidweefsel (figuur 5H en figuur 5K). Ten slotte toonde het transversale beeld van de skeletspieren verlies van kernen die zich anders in de periferie van het endomysium bevonden. Het myofibergehalte bleef na de decellularisatie binnen de respectieve fascikels (figuur 5I en figuur 5L). DNA-kwantificering met picogreen werd ook uitgevoerd, waarbij het DNA-gehalte significant werd verlaagd over de femorale vaten, zenuwen, huid, spieren en botten (figuur 6).
Figuur 4: Bruto morfologie van inheemse en gedecelluliseerde rattenachterpoten. (A) Femorale slagader van inheemse achtervel gecannuleerd met een 24 G angiocatheter na verkrijging. (B) Wit, doorschijnend uiterlijk van de achterste na 5 dagen decellularisatie met 0,25% SDS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Histologische kleuring van achterpootweefsels van ratten met behulp van hematoxyline en eosine. H &e-gekleurde inheemse (bovenste paneel) en gedecellulariseerde (onderste paneel) (A, D) femorale ader en (B, E) slagader, (C, F) zenuw, (G, J) bot, (H, K) huid, en (I, L) spier. Verlies van kernen en cellulaire inhoud zichtbaar in alle gedecellulariseerde monsters. Schaalbalken = 200 μm (vaten, zenuw, bot) en 300 μm (huid, spier). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: DNA-kwantificering van inheemse en gedecellulariseerde achterste weefsels van ratten. Het DNA-gehalte wordt verlaagd over inheemse en gedecellulariseerde bloedvaten, zenuwen, spieren, huid en botten, uitgedrukt in ng / mg droog gewicht. Weefsels werden 's nachts gedroogd en verteerd in papaïne bij 65 °C. DNA werd fluorescerend gedetecteerd met PicoGreen. Er werden meerdere ongepaarde t-tests uitgevoerd. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SD. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Afkortingen: N = native; D = gedecellulariseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rattenachterpoten zijn nuttig als experimentele modellen in VCA5. Tissue engineering van acellulaire steigers is de eerste stap in het aanpakken van de tekortkomingen van langdurige immunosuppressieregimes geassocieerd met VCA. Het gebruik van composiettransplantaten vormt een extra uitdaging gezien de aanwezigheid van meerdere weefsels, elk met unieke functionele, immunogene en structurele eigenschappen. Het huidige protocol toont een succesvolle methode voor het verkrijgen van acellulaire composiet rat hindlimbs. Deze steigers kunnen verder worden gerecelluliseerd en vormen een proof-of-concept model voor VCA.
Om een succesvolle inkoop en decellularisatie te garanderen, zijn er verschillende kritieke stappen in de chirurgische en decellularisatiefasen. Om de systemische verdeling van het wasmiddel en de sterilante oplossing over de inheemse vasculatuur te garanderen, omvatten de kritieke stappen ligatie van de epigastrische vaten, evenals het verkrijgen van voldoende afstand tot de bifurcatiepunten van het arterioveneuze netwerk voorafgaand aan de ligatie van de femorale vaten. De beschreven sterilisatieprocedure helpt de bioburden te verminderen voor recellularisatie-experimenten waarbij een steriele omgeving nodig is voor celaanhechting, overleving en groei6.
We presenteren ook een perfusiebioreactorsysteem dat is ontworpen om decellularisatie te implementeren. Kritieke componenten omvatten het vermogen van continue perfusie met behulp van een peristaltische pomp en het mogelijk maken van single-pass perfusie van het wasmiddel en sterilismiddel door de gecannuleerde slagader. De peristaltische pomp werd ook ingesteld op een pulsatiele stroom, vergelijkbaar met fysiologische omstandigheden. Ten slotte werd een vulpoort toegevoegd voor het aanvullen van het ophangingsreservoir in de bioreactor zonder de achterklep bloot te stellen aan de externe omgeving. Dit bioreactorsysteem is daarom voordelig omdat het een rat hindlimb ex vivo kan decellulariseren en steriliseren op een gesloten systeem, single-pass manier. De componenten van het circuit zijn autoclaveerbaar en kunnen voorafgaand aan elke decellularisatiecyclus worden gesteriliseerd. Gezien de dichtheid en relatief grote aanwezigheid van spieren in de achterste, werden zowel detergentperfusie- als onderdompelingsmethoden opgenomen in het ontwerp van dit ex vivo circuit om toegang te krijgen tot de spier en deze te decellulariseren.
Hoewel de bioreactorkamer en het decellularisatiecircuit zorgvuldig zijn ontworpen en afgestemd op de achterklep van de rat, heeft het een reproduceerbaar ontwerp dat kan worden gewijzigd bij het aanpassen van dit protocol voor andere weefsels. Aanvullende wijzigingen kunnen het opnemen van een bellenvanger in het perfusiecircuit omvatten om ervoor te zorgen dat het debiet niet wordt verstoord door luchtbellen 7,8. Verder hebben we geen drukbewakingssysteem ingebouwd om de perfusiedruk gedurende de hele duur van de decellularisatie te controleren. Het is mogelijk dat de perfusiedruk fluctueert als gevolg van intraluminaal cellulair puin. Onlangs rapporteerden Cohen et al. tijdelijke fluctuaties in perfusiedruk tijdens SDS-perfusie in een benadering om vasculair chimerisme in de achtervel van de rat te genereren, met behulp van een vergelijkbare doelstroomsnelheid van 1-2 ml / min. De perfusiedruk werd gestabiliseerd na behandeling voor mogelijke klompen9. Voor toekomstige wijzigingen in het ontwerp van het perfusiesysteem voor het huidige protocol kan de integratie van een drukmonitor informatief zijn over eventuele intraluminale occlusies en de noodzaak van behandeling aangeven om schade aan de vasculatuur te helpen voorkomen.
In dit model werd de uitstroom waargenomen tijdens en na decellularisatie. Om de levensvatbaarheid en functionaliteit van de steigers te garanderen, is vasculaire doorgankelijkheid vereist voor de levering van zuurstof en voedingsstoffen aan verschillende weefsels in een samengesteld transplantaat10. Met het potentieel van dit decellularisatieprotocol dat wordt uitgebreid naar verdere recellularisatiestudies, is de observatie van de uitstroom van cruciaal belang, zodat de gedecellulariseerde vasculaire boom opnieuw kan worden bevolkt en geherfunctionaliseerd tijdens recellularisatie. Vasculaire beeldvorming kan na decellularisatie worden gebruikt om vasculaire doorgankelijkheid te bevestigen.
Tot op heden zijn er weinig studies uitgevoerd naar decellularisatie van de achtervel van de rat, met beperkte resultaten over het succes in elk van de weefselcompartimenten 9,11. De representatieve resultaten in deze studie tonen de impact van decellularisatie over alle weefselcompartimenten die aanwezig zijn in de achterklep. De chirurgische methode onderhoudt ook grote hoeveelheden spieren en huid die serieel kunnen worden gebiopteerd en gebruikt voor verdere analyses. Bovendien suggereert dit protocol een minder toxische decellularisatiebenadering door een lagere SDS-concentratie te gebruiken dan gewoonlijk wordt gebruikt in decellularisatieprotocollen voor samengestelde en geïsoleerde weefsels12. Het voorgestelde ex vivo bioreactorsysteem kan ook worden aangepast voor andere weefsels en modellen.
Kortom, het voorgestelde protocol biedt een betrouwbare en reproduceerbare chirurgische techniek en decellularisatiemethode voor rattenachterpoten met behulp van een ex vivo machineperfusiesysteem. Toekomstige toepassingen omvatten het herbevolken van deze steiger met weefselspecifieke cellen en het onderzoeken van mogelijkheden voor het regenereren van functionele capaciteit in weefsels zoals bot, spieren en zenuwen. Toekomstige studies kunnen ook de extracellulaire matrix, het behoud van de inheemse vasculatuur en biochemische eigenschappen karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Figuur 3A is gemaakt in BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
References
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
