Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/64074
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, and Department of Neuroscience & Physiology, State University of New York (SUNY) Upstate Medical University

Summary

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

Abstract

באופן מסורתי, שלדי האקטין והמיקרוטובול נחקרו כישויות נפרדות, מוגבלים לאזורים או תהליכים תאיים ספציפיים, ומווסתים על ידי חבילות שונות של חלבונים קושרים ייחודיים לכל פולימר. מחקרים רבים מראים כיום כי הדינמיקה של שני הפולימרים הציטוסקטליים שלובים זה בזה, וכי הצלבה זו נדרשת עבור רוב ההתנהגויות התאית. מספר חלבונים המעורבים באינטראקציות אקטין-מיקרוטובול כבר זוהו (כלומר, טאו, MACF, GAS, פורמינים ועוד) והם מאופיינים היטב ביחס לאקטין או למיקרוטובולים בלבד. עם זאת, מחקרים מעטים יחסית הראו בדיקות של תיאום אקטין-מיקרוטובול עם גרסאות דינמיות של שני הפולימרים. זה עשוי לחסום מנגנוני קישור מתפתחים בין אקטין למיקרוטובולים. כאן, טכניקת שיקום מחדש של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) המבוססת על מיקרוסקופיה במבחנה מאפשרת הדמיה של דינמיקה של אקטין ומיקרוטובולים הן מהתגובה הביוכימית האחת. טכניקה זו משמרת את דינמיקת הפילמור של חוט אקטין או מיקרוטובולים בנפרד או בנוכחות הפולימר האחר. חלבון טאו הזמין באופן מסחרי משמש להדגמת האופן שבו התנהגויות של אקטין-מיקרוטובולים משתנות בנוכחות חלבון קלאסי של קישור צולב של שלד ציטוסקטלי. שיטה זו יכולה לספק תובנות פונקציונליות ומכניסטיות מהימנות לגבי האופן שבו חלבונים רגולטוריים בודדים מתאמים דינמיקה של אקטין-מיקרוטובולים ברזולוציה של חוטים בודדים או קומפלקסים מסדר גבוה יותר.

Introduction

מבחינה היסטורית, אקטין ומיקרוטובולים נתפסו כישויות נפרדות, שלכל אחת מהן קבוצה משלה של חלבונים רגולטוריים, התנהגויות דינמיקה ומיקומים תאיים נפרדים. ראיות רבות מראות כיום כי אקטין ופולימרים של מיקרוטובולים עוסקים במנגנוני crosstalk פונקציונליים החיוניים לביצוע תהליכים תאיים רבים, כולל נדידה, מיקום ציר מיטוטי, הובלה תוך-תאית ומורפולוגיהשל תאים 1,2,3,4. ההתנהגויות המתואמות המגוונות העומדות בבסיס דוגמאות אלה תלויות באיזון מורכב של גורמי צימוד, אותות ותכונות פיזיקליות. עם זאת, הפרטים המולקולריים העומדים בבסיס מנגנונים אלה עדיין אינם ידועים במידה רבה מכיוון שרוב המחקרים מתמקדים בפולימר ציטוסקטלי יחיד בכל פעם 1,2,5.

אקטין ומיקרוטובולים אינם מתקשרים ישירות 6,7,8. הדינמיקה המתואמת של אקטין ומיקרוטובולים הנראים בתאים מתווכת על ידי גורמים נוספים. חלבונים רבים שנחשבו לווסתים את ההצלבה של אקטין-מיקרוטובול זוהו ופעילותם מאופיינת היטב ביחס לפולימר ציטוסקטלי בלבד 1,2. ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שגישת פולימר יחיד זו הסתירה את הפונקציות הכפולות של חלק מהחלבונים/קומפלקסים המאפשרים אירועי צימוד אקטין-מיקרוטובול 7,8,9,10,11,12,13. ניסויים שבהם שני הפולימרים נוכחים הם נדירים ולעתים קרובות מגדירים מנגנונים עם פולימר דינמי יחיד וגרסה מיוצבת סטטית של 6,8,9,10,10,11,14,15,16,17,18 . לפיכך, יש צורך בשיטות כדי לחקור את התכונות המתפתחות של חלבונים מתאמי אקטין-מיקרוטובולים, שניתן להבין אותם במלואם רק במערכות ניסיוניות המשתמשות בשני הפולימרים הדינמיים.

השילוב של גישות לסימון חלבונים ישירים, תגי זיקה מקודדים גנטית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית כוללת של השתקפות פנימית (TIRF) יושם בהצלחה רבה במערכות שחזור ביומימטיות 19,20,21,22,23. תוכניות רבות מלמטה למעלה אינן מכילות את כל הגורמים המווסתים חלבונים בתאים. עם זאת, טכנולוגיית "ביוכימיה על כוסית" עידנה מנגנונים רבים של דינמיקת אקטין ומיקרוטובולים בקני מידה מרחביים וטמפורליים גבוהים, כולל הרכיבים הדרושים להרכבה או לפירוקשל פולימרים, ותנועת חלבונים מוטוריים 5,12,23,24,25,26,27 . כאן מתוארת גישה מינימלית של רכיב יחיד לחקר צימוד אקטין-מיקרוטובול במבחנה. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם חלבונים מטוהרים זמינים מסחרית או טהורים מאוד, חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי, תאי פרפוזיה, ומורחבים לסכימות מסובכות יותר המכילות תמציות תאים או מערכות סינתטיות. כאן, חלבון טאו הזמין באופן מסחרי משמש להדגמת האופן שבו הדינמיקה של השלד הציטו-שלדי משתנה בנוכחות חלבון צימוד אקטין-מיקרוטובול, אך ניתן להחליף אותו בגורמים מתאמים אחרים של אקטין-מיקרוטובול. היתרון העיקרי של מערכת זו על פני גישות אחרות הוא היכולת לנטר בו זמנית את הדינמיקה של פולימרים ציטוסקטליים מרובים בתגובה אחת. פרוטוקול זה גם מספק למשתמשים דוגמאות וכלים פשוטים לכימות שינויים בפולימרים של שלדיים. לפיכך, משתמשי הפרוטוקול יפיקו נתונים אמינים, כמותיים, בעלי רזולוציה של נימה אחת, כדי לתאר מנגנונים העומדים בבסיס האופן שבו חלבונים רגולטוריים מגוונים מתאמים את הדינמיקה של אקטין-מיקרוטובול.

Protocol

1. שטיפת הכיסויים

הערה: שטיפה (24 מ"מ x 60 מ"מ, #1.5) מכסה את הליפסים על פי Smith et al., 201328.

  1. ארגנו כיסויים במיכל דואר שקופיות מפלסטיק.
  2. טבילה מכסה כיסויים ברצף בתמיסות הבאות וסוניקאט במשך 30-60 דקות, שטיפה עם ddH2O 10 פעמים בין כל תמיסה: ddH2O עם טיפה אחת של סבון כלים; 0.1 מ' קוה. החנויות מכסות ב-100% אתנול למשך עד 6 חודשים.
    הערה: אין לגעת במשטחי זכוכית באצבעות לא אהובות. במקום זאת, השתמש במלקחיים.

2. ציפוי מנוקה (24 מ"מ x 60 מ"מ, #1.5) מכסה כיסויים עם mPEG- וביוטין-PEG-סילאן

הערה: פרוטוקול זה משתמש באופן ספציפי במערכת ביוטין-סטרפטווידין כדי למקם אקטין ומיקרוטובולים בתוך מישור ההדמיה של TIRF. ניתן להשתמש בציפויים ומערכות אחרות (למשל, נוגדנים, פולי-L-ליזין, מיוזין NEM וכו ').

  1. הפשרת אליקוטים של אבקות PEG-סילאן וביוטין-PEG-סילאן.
  2. ממיסים אבקות PEG ב-80% אתנול (pH 2.0) כדי ליצור תמיסות ציפוי של 10 מ"ג/מ"ל mPEG-סילאן ו-2-4 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן, ממש לפני השימוש.
    הערה: אבקות PEG נראות לעתים קרובות מומסות אך ייתכן שאינן ברמה המיקרוסקופית. החייאה נכונה אורכת כ-1-2 דקות עם צנרת קבועה. משתמשים מוזמנים לטפט 10 פעמים נוספות בעקבות הופעת פירוק אבקה.
    אזהרה: לבשו כפפות כדי להגן על העור מפני HCl מרוכז בעת ביצוע 80% אתנול (pH 2.0).
  3. הסר את הכיסוי הנקי (24 מ"מ x 60 מ"מ, #1.5) מאחסון אתנול באמצעות מלקחיים. מייבשים בגז חנקן ומאחסנים בצלחת פטרי נקייה.
  4. ציפוי מכסה תמיסת ציפוי של 100 μL: תערובת של 2 מ"ג/מ"ל mPEG-סילאן (MW 2,000) ו-0.04 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן (MW 3,400) ב-80% אתנול (pH 2.0).
    הערה: לציפוי דליל (מומלץ) יש להשתמש ב-2 מ"ג/מ"ל mPEG-silane וב-0.04 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן. לציפוי צפוף יש להשתמש ב-2 מ"ג/מ"ל mPEG-סילאן, 4 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן.
  5. הדגירה מכסה כיסויים בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות לפחות או עד לשימוש.
    הערה: כיסויים מצופים מתפרקים אם הם מאוחסנים בטמפרטורה של 70 °C (70 °F) למשך יותר משבועיים.

3. הרכבת תאי זרימה להדמיה

  1. חותכים 12 רצועות של סרט דו-צדדי בעל גב כפול לאורך של 24 מ"מ. הסר צד אחד של גיבוי הקלטת ותקן פיסות נייר דבק הסמוכות לששת החריצים הנמצאים בתא הדמיה נקי.
    הערה: קלטת חייבת להיות שטוחה להרכבה נכונה, אחרת תאי הדמיה ידלפו. הסר בזהירות את גיבוי הקלטת כדי למנוע בליטות. מומלץ להחליק תאים מודבקים על משטח נקי כדי להחליק מגעים של תאי קלטות.
  2. הסר את פיסת הגב השנייה של הקלטת כדי לחשוף את הצד הדביק של הקלטת לאורך כל חריץ תא. מניחים את סרט התא בצד על משטח נקי.
  3. ערבבו את תמיסות השרף וההקשחה 1:1 (או על פי הוראות היצרן) בסירת שקילה קטנה.
  4. השתמש בקצה P1000 כדי למקם טיפה של אפוקסי מעורב בין רצועות הקלטת בסוף כל חריץ של תא הדמיה (חץ אדום; איור 1A). מניחים סרט דביק/אפוקסי בצד על משטח נקי.
  5. הסר כיסוי מצופה מחממה של 70 °C. יש לשטוף משטחים מצופים ולא מצופים של כיסויים עם ddH2O שש פעמים, יבשים עם גז חנקן מסונן, ולאחר מכן מודבקים לתא ההדמיה עם ציפוי הכיסוי בצד לכיוון הסרט.
  6. השתמש בקצה פיפטה P200 או P1000 כדי להפעיל לחץ על ממשק הזכוכית-קלטת כדי להבטיח אטימה טובה בין הקלטת לבין הכיסוי.
    הערה: עם אטימה מתאימה, סרט הדבקה דו-צדדי הופך להיות שקוף. תאי הדמיה ללא מגעים מספיקים של תאי קלטות ידלפו.
  7. דגירה של תאים מורכבים בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות לפחות כדי לאפשר לאפוקסי לאטום באופן מלא בארות תאים לפני השימוש. תאי פרפוזיה פוקעים תוך 12-18 שעות מההרכבה.
    הערה: בהתאם למיקום הקלטת ולעובי של סרט הדבקה הדו-צדדי שבו נעשה שימוש, התא המורכב יהיה בעל נפח סופי של 20-50 μL.

4. התניה של תאי פרפוזיה

  1. השתמש במשאבת פרפוזיה (קצב מוגדר ל- 500 μL/min) כדי להחליף ברצף פתרונות התניה בתא פרפוזיה באופן הבא:
    1. זרימה של 50 μL של 1% BSA כדי להכין את תא ההדמיה. הסר את המאגר העודף ממאגר התאמת נעילת Luer.
    2. זרימה 50 μL של 0.005 מ"ג /מ"ל סטרפטווידין. דגירה למשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר. הסר חיץ עודף מהמאגר.
    3. זרימה של 50 μL של 1% BSA לחסימת קשירה לא ספציפית. דגירה למשך 10-30 שניות. הסר חיץ עודף מהמאגר.
    4. זרימה 50 μL של חיץ TIRF חם (37 °C) 1x (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM גלוקוז, 0.25% (v/v) מתילצלולוז (4,000 cp)).
      הערה: אין להסיר את המאגר העודף מהמאגר. זה מונע מהתא להתייבש, מה שעלול להכניס בועות אוויר למערכת.
    5. אופציונלי: זרימה של 50 μL של זרעי מיקרוטובולים מיוצבים של29 ו-50% ביוטינילציה המדוללים ב-1x buffer TIRF.
      הערה: הדילול הנכון חייב להיקבע באופן אמפירי ולהכיל השתנות מאצווה לאצווה. פרוטוקולים מתוך27,29 מומלצים כנקודות התחלה. דילול המניב 10-30 זרעים לכל שדה ראייה עובד היטב עם הגדרה זו.

5. הכנת מיקרוסקופ

הערה: תגובות ביוכימיות המכילות חוטי אקטין דינמיים ומיקרוטובולים מוצגות/מבוצעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת הפוכה (TIRF) המצויד בלייזרים במצב מוצק של 120-150 מ"וואט, מטרת TIRF טבילת שמן מתוקנת בטמפרטורה של 63x, ומצלמת EMCCD. חלבונים בדוגמה זו מוצגים באורכי הגל הבאים: 488 ננומטר (מיקרוטובולים) ו-647 ננומטר (אקטין).

  1. הגדר את מכשיר החימום לבמה/מטרה כדי לשמור על 35-37 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות לפני הדמיית התגובה הביוכימית הראשונה.
  2. הגדר את הפרמטרים של רכישת התמונה באופן הבא:
    1. הגדר את מרווח הרכישה לכל 5 שניות למשך 15-20 דקות.
    2. הגדר חשיפות לייזר של 488 ו- 647 ל- 50-100 אלפיות השנייה בהספק של 5%-10%. הגדר זווית TIRF מתאימה למיקרוסקופ.
      הערה: ללא קשר להתקנת מיקרוסקופ, הדרך הפשוטה ביותר להגדיר את עוצמת הלייזר, החשיפה וזווית ה-TIRF היא לבצע התאמות בתמונות של כל אחד מהפולימרים בלבד (ראו 5.2.2.1 ו-5.2.2.2.2, להלן). מומלץ מאוד למשתמשים להשתמש בהספק הלייזר הנמוך ביותר ובהגדרות החשיפה שעדיין מאפשרות זיהוי.
      1. התאם את תגובת הפילמור (איור 1C) כדי ליזום מכלול חוטי אקטין ולרכוש תמונות במהירות של 647 ננומטר. בצע התאמות מתאימות.
      2. התאימו את תגובת הפילמור בזלוף מותנה שני היטב כדי להתחיל מכלול מיקרוטובולים (איור 1C) והדמיינו ב-488 ננומטר. בצע התאמות מתאימות.

6. הכנת תערובות תגובה חלבונית

  1. הכן תמיסת מלאי של טובולין עם תווית פלואורסצנטית.
    1. קבע את הריכוז של טובולין ללא תווית תוצרת בית באמצעות ספקטרופוטומטריה ב- Abs280, כדלקמן:
      1. ספקטרופוטומטר ריק עם 1xBRB80 חסר GTP.
      2. חשב את ריכוז טובולין באמצעות מקדם ההכחדה שנקבע של 115,000 M-1 cm-1 והנוסחה הבאה:
        Equation 1
    2. 488-טובולין ל-10 מיקרומטר (1 מ"ג/מ"ל; 100 מ"ל; 100% תווית) עם תווית של 20 מיקרול' של 1x BRB80 חסר GTP.
    3. להפשיר 7.2 μL aliquot של 100 μM ללא תווית טובולין ממוחזר29 על קרח.
      הערה: טובולין ממוחזר הוא קריטי להרכבה מוצלחת של מיקרוטובולים במבחנה מכיוון שהוא מסיר דימרים חסרי יכולת פולימריזציה הנוצרים במלאי חלבון קפוא29,30.
    4. שלבו 3 μL של 10 μM 488-tubulin עם 7.2 μL aliquot של 100 μM ללא תווית tubulin, לא יותר מ 15 דקות לפני השימוש.
  2. הכן את תמיסת המלאי של אקטין המסומן באופן פלואורסצנטי.
    1. עבור חלבונים תוצרת בית, קבע את הריכוז ואת תווית האחוזים של אקטין באמצעות ספקטרופוטומטריה Abs290 ו- Abs650, כדלקמן:
      1. ספקטרופוטומטר ריק עם מאגר G.
      2. חשב את הריכוז של אקטין ללא תווית באמצעות מקדם ההכחדה שנקבע של 25,974 M-1 cm-1 והנוסחה הבאה:
        Equation 2
      3. חישוב ריכוז הליזין המסומן Alexa-647-actin באמצעות מקדם ההכחדה של אקטין ללא תווית, מקדם תיקון הפלואור של 0.03, והנוסחה הבאה:
        [Alexa-647 actin], μM = (Abs290 - Equation 3
      4. חשב את תווית האחוזים של Alexa-647-actin באמצעות ε שנקבע עבור Alexa-647 מתוך 239,000 M-1 cm-1, כדלקמן:
        % תווית של אלקסה-647-אקטין = (Abs290 - (Equation 4
    2. להפשיר 2 μL aliquot אחד של 3 μM 100% מסומן ביוטין-אקטין (מסומן על שאריות ליזין). דילול פי 10 על ידי הוספת 18 μL של G-buffer.
    3. שלבו 3 μL של אקטין ביוטינילי מדולל, נפחים מתאימים של אקטין ללא תווית ומסומן (לעיל) כך שהתערובת הסופית תהיה 12.5 μM סה"כ אקטין עם תווית פלואורסצנטית של 10%-30%.
      הערה: יותר מ-30% אחוז מונומרים של אקטין פלואורסצנטי (סופי) יכולים לפגוע ברזולוציית ההדמיה מכיוון שקשה להבחין בחוטים מהרקע.
  3. הכינו תערובות תגובות (איור 1C).
    1. הכן את תערובת השלד של ציטוסקלטון (Tube A) על ידי שילוב של 2 μL של ציר תערובת אקטין של 12.5 μM (6.2.3) עם תערובת ציר טובולין (6.1.4), לא יותר מ -15 דקות לפני ההדמיה. יש לאחסן על קרח עד לשימוש.
    2. הכינו את תערובת תגובת החלבון (Tube B) על ידי שילוב של כל המרכיבים והחלבונים הניסיוניים האחרים, כולל: 2x בופר TIRF, אנטי אקונומיקה, נוקלאוטידים, מאגרים וחלבונים נלווים. דוגמה לכך מוצגת באיור 1C.
      הערה: הדילול הסופי גורם למאגר TIRF של 1x המכיל ATP, GTP ועוצמה יונית בטווח הפיזיולוגי המשוער.
  4. דגירה צינור A וצינור B בנפרד ב 37 °C (84 °F) עבור 30-60 שניות. כדי ליזום תגובה, ערבבו והוסיפו את התוכן של Tube B לצינור A (להלן).

7. דימוי אקטין ודינמיקה של מיקרוטובולים

  1. מצב זלוף היטב (איור 1B; שלב 4, לעיל).
  2. הפעילו את הרכבת האקטין והמיקרוטובולים בו-זמנית על-ידי הוספת התוכן של Tube B (תערובת תגובה) לצינור A (תערובת שלד ציטוסקלטון) (איור 1C).
  3. זרימה של 50 μL של תגובה המכילה 1x BUFFER TIRF בתוספת טובולין חופשי 15 μM, 1 mM GTP, ו 0.5 μM אקטין מונומרים ונפחים מתאימים של בקרות מאגר.
  4. הקלט סרט בהילוך מהיר באמצעות תוכנת מיקרוסקופ כדי לרכוש כל 5 שניות למשך 15-20 דקות.
    הערה: התחלת הדינמיקה של אקטין ומיקרוטובול מתרחשת תוך 2-5 דקות (איור 2). עיכובים ארוכים יותר מצביעים על בעיות בבקרת טמפרטורה או בבעיות הקשורות לריכוז של חלבונים בתמהיל התגובות.
  5. התנו באר פרפוזיה חדשה (שלב 4) והחליפו את נפח המאגר בחלבונים רגולטוריים בעלי עניין (כלומר, טאו) ובקרות מאגר (איור 1C). רכוש כמתואר בשלב 7 (לעיל) כדי להעריך חלבונים רגולטוריים עבור פונקציות אקטין-מיקרוטובול מתפתחות.

8. לעבד ולנתח תמונות באמצעות תוכנת FIJI31

  1. פתח סרטי TIRF שמורים והצג כקומפוזיט.
  2. נתחו את הדינמיקה של המיקרו-טובולים (איור 3A), באופן הבא:
    1. צור הקרנת Z מרבית מבוססת זמן מתפריט ערימות התמונות.
    2. סנכרן את חלון הקרנת Z עם סרט TIRF המקורי מתפריט כלי ניתוח>> סינכרון Windows .
    3. צייר קו באמצעות כלי הקו הישר לאורך מיקרוטובול מעניין בתמונה המוקרנת בזמן המוקרן.
      1. פתח את מנהל אזור העניין (ROI) מתפריט הניתוח (ניתוח> כלים> מנהל ההחזר על ההשקעה).
      2. שמור מיקומי מיקרוטובולים בודדים על ידי לחיצה על "t". חזור על הפעולה עבור כל המיקרוטובולים המעניינים.
    4. להתוות קיומוגרפים של שורות נבחרות באמצעות "/" או להריץ את המאקרו מרובה קימו שיוצר וידאו וקימוגרף עבור כל מיקרוטובול במנהל ההחזר על ההשקעה31.
      1. הוסף סרגלי קנה מידה של אורך (μm) וזמן (min) לקימוגרפים מתפריט סרגלי קנה מידה של כלי ניתוח>> .
    5. מדדו את מהירויות הגדילה של המיקרוטובולים ממדרונות קימוגרף (איור 3A, 1-2; שיפוע הקווים השחורים).
    6. ספירת אירועי מיקרוטובולים דינמיים (קטסטרופה או צמיחה מחדש) מהקימוגרף שנוצר או באמצעות פקודות מאקרו של ניתוח זמין 5,8,18,25. קווים מנוקדים אדומים באיור 3A, 1-2 מייצגים אירועי קטסטרופה/פירוק מהיר.
  3. נתחו את הדינמיקה של אקטין (איור 3B), באופן הבא:
    1. מדידת נוקלאציה של אקטין, כדלקמן:
      1. ספירת מספר חוטי האקטין הנמצאים בשדה הראייה 100 שניות לאחר תחילת התגובה והבעתם על ידי האזור (חוטים לכל μm2).
      2. רשום ושמור נתונים במנהל ההחזר על ההשקעה, כמו בשלב 8.2.3.1, לעיל.
    2. מדוד את שיעורי התארכות האקטין (איור 3B), באופן הבא:
      1. ציירו קו לאורך חוט אקטין בעל עניין באמצעות הכלי מקו מקוטע.
      2. הוסף שורה למנהל החזר ההשקעה כמו בשלב 8.2.3.1, לעיל.
      3. חזור על הפעולה לאחר השורה (הוספת כל מדידה למנהל ההחזר על ההשקעה) עבור ארבעה מסגרות סרט לפחות.
        הערה: מומלץ למדוד שבע עד שמונה מסגרות רצופות, אולם תנאים מסוימים מאטים את הפילמור של אקטין מתחת לגבול הניתן לזיהוי שניתן לפתור על ידי הגדרות אובייקטיביות/מיקרוסקופיות. במקרה כזה, ניתן לבצע מדידות במרווחי זמן קבועים על פני מסגרות לא רציפות (למשל, כל חמש מסגרות).
      4. תרשים ערכי אורך שנמדדו לאורך הזמן שחלף. השיפוע של הקו שנוצר הוא קצב התארכות האקטין במיקרונים/שניות.
      5. העבר את השיעורים המחושבים הסופיים כתת-יחידות s-1 μM-1 באמצעות מקדם תיקון של 370 תת-יחידות כדי להסביר את מספר המונומרים של אקטין במיקרון של נימה32.
  4. בצע ניתוח מתאם עבור אזורים של שיוך אקטין-מיקרוטובול מקבילי (איור 3C), כדלקמן:
    1. צייר קו לאורך מיקרוטובול בעל עניין בנקודת זמן מסוימת (כלומר, 300 שניות לאחר התחלת התגובה), באמצעות כלי הקו הישר.
      1. הוסף שורה למנהל החזר ההשקעה כמו בשלב 8.2.3.1, לעיל.
    2. התווה את עוצמת הפלואורסצנציה לאורך הקו בכל ערוץ.
      1. בחר כל ערוץ עם מחוון התמונה והתווה את העוצמות לאורך הקו באמצעות "פקודה k".
      2. שמור או ייצא ערכים על-ידי לחיצה על הלחצן "רשימה" בחלון הפלט.
    3. צימוד אקטין-מיקרוטובול אקספרסי של אירועים כיחס (אקטין חופף למיקרוטובולים) מאירועים בודדים או כספירה של אירועים בשדה ראייה נתון בנקודת זמן עקבית (איור 3C).
    4. חלופה: השתמש בתוכנה כדי לקבוע את אחוז החפיפה של שני הערוצים 5,12.

Representative Results

עם התנאים שתוארו לעיל (איור 1), פולימרים של אקטין ומיקרוטובול אמורים להיות גלויים (ודינמיים) תוך 2 דקות מרכישת התמונה (איור 2). כמו בכל פרוטוקול מבוסס ביוכימיה, ייתכן שתידרש אופטימיזציה עבור חלבונים רגולטוריים שונים או קבוצות של חלבון. מסיבות אלה, זווית TIRF וחשיפות התמונה מוגדרות תחילה עם תגובות המכילות כל פולימר בנפרד. זה מאשר כי חלבונים מאוחסנים הם פונקציונליים ומספיק חלבון מסומן נמצא לזיהוי. אמנם לא תמיד הכרחי (ולא מבוצע כאן), אך ניתן להשתמש לאחר עיבוד של סרטים (כלומר, חיסור רקע, ממוצע או טרנספורמציות פורייה) כדי לשפר את ניגודיות התמונה (במיוחד של מיקרוטובולים)5,25,33. ההדמיה הישירה של חוטי אקטין יחידים ומיקרוטובולים הניתנים על ידי מבחן זה תומכת בקביעה כמותית של מספר מדדים דינמיים עבור רכיב ציטוסקלטון לבדו או יחדיו, כולל פרמטרי פילמור (כלומר, קצב נוקלאציה או התארכות), פרמטרים של פירוק (כלומר, שיעורי התכווצות או אירועי קטסטרופה), ופחם/חפיפה של פולימרים (איור 3 ). יתר על כן, אמצעים אלה יכולים לשמש כנקודת מוצא לפענוח הקשירה או ההשפעה של ליגנדות רגולטוריות כמו טאו (איור 3). מדידות רבות של חוטי אקטין בודדים או מיקרוטובולים יכולות להיעשות מסרט TIRF אחד. עם זאת, בשל וריאציות בציפוי כיסוי, צנרת וגורמים אחרים, מדידות מהימנות צריכות לכלול גם תגובות/סרטים משוכפלים טכניים מרובים.

היבטים רבים של דינמיקת המיקרוטובולים יכולים להיקבע מקיומוגרפים לדוגמה, כולל קצב התארכות המיקרוטובולים, כמו גם תדירות אירועי הקטסטרופה וההצלה (איור 3A). השימוש בקימוגרפים למדידת דינמיקת אקטין במערכת זו אינו פשוט כל כך מכיוון שחוטים של אקטין מפותלים יותר ממיקרוטובולים. כתוצאה מכך, הפרמטרים של דינמיקת חוט אקטין נמדדים ביד, וזה גוזל זמן ועבודה אינטנסיבית. ספירות נוקלאציה נמדדות כמספר חוטי האקטין הקיימים בנקודת זמן עקבית עבור כל התנאים. ספירות אלה משתנות מאוד על פני שדות הדמיה של TIRF, אך ניתן להשתמש בהן עם שכפולים רבים או כדי להשלים תצפיות ממבחני פילמור אחרים. ספירת גרעין עשויה לשמש גם למיקרו-טובולים אם תנאי הניסוי חסרים זרעי מיקרוטובולים מיוצבים. קצבי התארכות נימה של אקטין נמדדים כאורך החוט לאורך זמן מארבעה פריימים קולנועיים לפחות. ערכי קצב מועברים לכל אקטין מיקרומולרי עם מקדם תיקון של 370 תת-יחידות כדי להסביר את מספר המונומרים של אקטין במיקרון של נימה (איור 3B)32. מדידות להגדרת ההתנהגויות המתואמות בין אקטין למיקרוטובולים מוגדרות פחות טוב. עם זאת, אנליזות מתאמיות יושמו כדי למדוד את צירוף המקרים של שני הפולימרים, כולל סריקות קו (איור 3C) או תוכנת חפיפה 5,11,34.

זמינות נתונים:
כל מערכי הנתונים הקשורים לעבודה זו הופקדו בזנודו והם זמינים עם בקשה סבירה בכתובת: 10.5281/zenodo.6368327.

Figure 1
איור 1. סכמות ניסיוניות: הרכבת תא זרימה לרכישת תמונה. (א) מכלול תא הדמיה. מלמעלה למטה: תאי ההדמיה של IBIDI מודבקים לאורך בארות פרפוזיה (מסומנים בחץ); השכבה השנייה (הלבנה) של גיבוי סרט הדבקה (שנשארה בתמונה המוצגת למשתמשים בעלי אוריינטציה טובה יותר) מוסרת ואפוקסי מוחל בקצה תא ההזלפה (חץ). הערה: כדי לכוון את המשתמשים ביתר קלות היכן למקם את האפוקסי, הגב הלבן הושאר בתמונה זו. הכיסוי המנוקה והמצופה מחובר לתא ההדמיה כאשר צד הציפוי פונה אל פנים באר הזלוף. (B) תרשים זרימה הממחיש את השלבים להתאמת תאי הדמיה עבור קשרים ביוטין-סטרפטווידין. (C) דוגמאות לתגובות המשמשות לרכישת סרטי TIRF של מיקרוטובולים דינמיים וחוטים אקטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2. רצפי תמונה של חוטי אקטין גדלים ומיקרוטובולים בהיעדר או נוכחות של טאו. מונטאז' תמונה בהילוך מהיר ממבחני TIRF המכיל 0.5 μM אקטין (10% Alexa-647-actin ו-0.09% ביוטין-אקטין מסומן) ו-15 μM ללא טובולין (4% HiLyte-488 מסומן) בהיעדר (A) או נוכחות (B) של 250 ננומטר טאו. הזמן שחלף מתחילת התגובה (ערבוב צינור A וצינור B) מוצג. סרגלי קנה מידה, 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3. מדידות לדוגמה של מיקרוטובולים ודינמיקת חוט אקטין. (A) הקרנת זמן ממוצעת של תעלת טובולין ממחישה ביעילות את אורכי המיקרוטובולים הכוללים עבור סריקות הקו המשמשות ליצירת תרשימי קימוגרף. קווים מנוקדים שחורים מתאימים לשני הקימוגרפים לדוגמה של מיקרוטובולים דינמיים המוצגים מימין. גדילה (קווים שחורים מוצקים) ופאזות פירוק (קווים ורודים מנוקדים; שניים מסומנים בחצים ורודים) של מיקרוטובולים מוצגים על כל קיומוגרף. סרגל קנה מידה של זמן, 3 דקות. סרגל קנה מידה אורך, 10 מיקרומטר. התגובה מכילה 0.5 μM אקטין (10% 647-תווית) ו-15 μM ללא טובולין (4% תווית 488-HiLyte). רק ערוץ טובולין מוצג. (B) שני מונטאז'ים לדוגמה של תמונות בהילוך מהיר המתארים חוטים חד-אקטיןים המפולימרים באופן פעיל. שיעורי התארכות מחושבים כשיפוע של חלקות באורך חוטי אקטין לאורך זמן לכל אקטין מיקרומולרי אקטין. לפיכך, יש להחיל מקדם תיקון של שניים על תגובות אקטין של 0.5 μM לצורך השוואה לשיעורים הנקבעים בדרך כלל בריכוז אקטין של 1 μM. דוגמאות מחמישה חוטים מוצגות מימין. מוטות קנה מידה, 10 מיקרומטר. התגובה מכילה 0.5 μM אקטין (10% 647-תווית) ו-15 μM ללא טובולין (4% תווית 488-HiLyte). רק ערוץ האקטין מוצג. (C) תמונות TIRF של מיקרוטובולים דינמיים (MT) (ירוק) וחוטים אקטין (סגול) פולימריזציה בהיעדר (שמאל) או נוכחות של 250 ננומטר טאו (באמצע). קווים וחצים מנוקדים כחולים מסמנים היכן צויר קו עבור החלקות של סריקת הקו המתאימות לכל תנאי (מתחת לכל תמונה). ניתן להבקיע חפיפה בין מיקרוטובולים לאזורי אקטין (המוצגים כשחורים) בנקודת זמן מוגדרת לכל אזור (מימין). מוטות קנה מידה, 25 מיקרומטר. התגובות מכילות אקטין 0.5 μM (10% 647-label) ו-15 μM ללא טובולין (4% תווית 488-HiLyte) עם או בלי 250 ננומטר טאו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כוללת של השתקפות פנימית (TIRF) כדי לדמיין חלבונים מטוהרים היה גישה פורה ומשכנעת לנתח מנגנונים ייחודיים של ויסות ציטוסקטלי 5,23,24,25,26,27,35. בהשוואה למבחנים ביוכימיים מסורתיים, תגובות TIRF דורשות נפחים קטנים מאוד (50-100 μL), ומדידות כמותיות של דינמיקה ציטוסקטלית יכולות להילקח מבדיקה בודדת. רוב המחקרים על דינמיקה של שלד ציטוסקטלי מתמקדים במערכת פולימרית בודדת (כלומר, חוטי אקטין או מיקרוטובולים), ולכן מדידות מפורטות של ההצלבה או ההתנהגויות המתפתחות בין חוטי אקטין למיקרוטובולים הנראים בדרך כלל בתאים נותרו חמקמקות וקשות לשחזור במבחנה. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרוסקופיה TIRF בעלת נימה אחת המאפשרת הדמיה ישירה של אקטין דינמי ופולימרים מיקרוטובולים באותה תגובה ביוכימית. לפיכך, שיטה זו חורגת מעבר למבחנים מסורתיים המסכמים את ההתנהגות הדינמית של חוטי אקטין או מיקרוטובולים בלבד. טכניקה זו בוצעה גם עם טאו כדוגמה לאופן שבו מספר תכונות דינמיות משתנות בנוכחות גורם צימוד ציטוסקטון. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם חלבונים נוספים הידועים או החשודים כמתאמים אקטין או דינמיקה של מיקרוטובולים, כולל (אך לא רק) MACF, GAS, פורמינים ועוד. לבסוף, ניתן להשתמש בניתוחים לדוגמה כמדריך לכימות נתונים שנרכשו באמצעות פרוטוקול זה.

"לראות זה להאמין" היא סיבה משכנעת לבצע בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה. עם זאת, נדרשת זהירות בביצוע ובפענוח של ניסויי מיקרוסקופיה של TIRF. אחד האתגרים הגדולים של מבחני הרכבה משותפת של ציטוסקטליים הוא שתנאי הדמיה נפוצים רבים אינם תואמים כל פולימר. למיקרוטובולים ולאקטין יש בדרך כלל דרישות שונות של מאגר, טמפרטורה, מלח, נוקלאוטיד וריכוז לפולימריזציה. אקטין, טובולין, חלבונים רגולטוריים בעלי עניין, והמאגרים המשמשים בפרוטוקול זה רגישים למחזורי הקפאה-הפשרה. לכן, טיפול זהיר בחלבונים ובמאגרים נחוץ כדי לבצע בהצלחה פרוטוקול זה. כדי להפיג רבים מהחששות הללו, מומלץ מאוד להשתמש בטובולין ממוחזר טרי (קפוא למשך <6 שבועות), ולפנות מראש אקטינים קפואים/מוחזרים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה. שיקולים אלה חלים גם על שלל החלבונים הרגולטוריים שיש להעריך בהליך זה, אשר עשויים להיות רגישים למחזורי הפשרה בהקפאה או לריכוז מלחי החיץ 5,11,36.

למרבה הצער, לא קיים מאגר אחד שמתאים לכולם ללא פשרות ניסיוניות. כדי להתאים נפח גדול יותר לחלבונים בעלי ריכוז נמוך יותר, ATP ו-GTP עשויים להיכלל בתמיסת המאגר 2x TIRF (איור 1C). עם זאת, מכיוון שהנוקלאוטידים האלה רגישים מאוד למחזורי הפשרה בהקפאה, זה לא מומלץ. תרכובות טיהור החמצן המשמשות כאן (כלומר, קטלאז וגלוקוז-אוקסידאז) נחוצות כדי להמחיש חלבונים לפרקי זמן ארוכים (דקות עד שעות), אך ידוע שהן מגבילות פילמור מיקרוטובולים בריכוזים גבוהים5. בהקשר לשיקולי מאגר אלה, מגבלה של פרוטוקול זה היא שחלק מהחלבונים הרגולטוריים הקשורים למיקרוטובולים קנוניים עשויים לדרוש פחות או יותר מלח כדי לשחזר פונקציות שנמצאות בתאים או במבחנים באמצעות מיקרוטובולים בלבד (ללא אקטין). שינוי האופי או הריכוז של המלח כדי לתת מענה לחששות אלה ישפיע ככל הנראה על שיעורי פילמור נימה של אקטין ו/או פרמטרים של דינמיקה של מיקרוטובולים. מדידות של פרמטרים תיאוריים מרובים (מינימלי, נוקלאציה, קצב התארכות ויציבות) (איור 3) נדרשות כדי לאשר את הצלחת הפרוטוקול או לתעד במפורש את ההשפעות של מאגרים ספציפיים או חלבונים רגולטוריים. לדוגמה, יותר מדי פולימריזציה של חוטי אקטין יכולה לטשטש אירועי צימוד אקטין-מיקרוטובול תוך שניות. כתוצאה מכך, כוונון עדין של תנאי הניסוי על ידי הפחתת הריכוז הכולל של אקטין או הכללת חלבונים נוספים לדיכוי גרעין אקטין (כלומר, פרופילין) יאריך את התקופה הכוללת שבה ניתן לראות בבירור פעילויות אקטין-מיקרוטובול מתואמות. פקדים המתייחסים לתנאים מוקדמים אלה, ושכפולים טכניים (מעבר לשדות תצוגה מרובים), הם קריטיים עבור משתמשים כדי ליצור תוצאות מהימנות וניתנות לשחזור.

מחקרים מבוססי תאים מספקים הזדמנות מוגבלת לבחון יחסי חלבון-חלבון ישירים או את פעולתם של קומפלקסים רגולטוריים. לעומת זאת, חלק מהמנגנונים שנלקחו ממבחני מבחנה לא תמיד משקפים את ההתנהגויות המדויקות של חלבונים הנראים בתאים. ניתן לטפל בדילמה ביוכימאית קלאסית זו ביישומים עתידיים של טכניקה זו עם שינויים ספציפיים. לדוגמה, הוספת חלבוני צימוד פונקציונליים בעלי תווית פלואורסצנטית מרחיבה את השיטה הזו ממחקרים בעלי נימה בודדת למחקרים של מולקולה אחת. ניתן לשנות עוד יותר את הבדיקות כדי להשתמש בתמציות תאים שעשויות להוסיף את גורמי המפתח הלא ידועים "החסרים" הנדרשים כדי לשחזר תופעות דמויות תאים. לדוגמה, לבדיקות מבוססות TIRF המשתמשות בתמציות שמרים או קסנופוס יש טבעות אקטומיוזין מתכווצות37, צירים מיטוטיים 26,38, רכיבים של מכלול אקטין או מיקרוטובול39,40, ואפילו דינמיקה בסנטרוזום ובקינטוכורים 36,41,42,43 . יתר על כן, מערכות כאלה עשויות לסלול את הדרך למערכות תאים מלאכותיות שיש להן ליפידים או גורמי איתות המציגים 44,45,46.

Disclosures

אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אני אסיר תודה למארק רידילה (תיקון ביוטכנולוגיה) ובריאן הארר (SUNY Upstate) על הערות מועילות על פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (GM133485).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% BSA (w/v) Fisher Scientific BP1600-100 For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter.
1× BRB80 Homemade 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO G2133-50KU Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use
100 µM tubulin Cytoskeleton Inc, Denver, CO T240 Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
100 mM ATP Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO A-081 Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.
100 mM GTP Fisher Scientific AC226250010 Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.
120-150 mW solid-state lasers Leica Microsystems 11889151; 11889148
2 mg/mL catalase Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO C40-100 Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use
2× TIRF buffer Homemade 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.
24 × 60 mm, #1.5 coverglass Fisher Scientific, Waltham, MA 22-266882 Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)
37 oC heatblock
37 oC water bath
5 mg/mL Streptavidin (600x stock) Avantor, Philadelphia, PA RLS000-01 Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use
5 min Epoxy resin and hardener Loctite, Rocky Hill, CT 1365736 Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds Cytoskeleton Inc; Homemade T333P (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).
70 oC incubator
Actin mix stock Homemade; this protocol A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).
Appropriate buffer controls Homemade Combination of buffers from all proteins being assessed
Biotin-PEG-silane (MW 3,400) Laysan Bio Inc biotin-PEG-SIL-3400 Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Biotinylated actin Cytoskeleton Inc; Homemade AB07 Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.  Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.
Dishsoap Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.
Dry ice
FIJI Software www.https://imagej.net/software/fiji/downloads Schneider et al. (2012)31.
Fluorescently labeled actin Cytoskeleton Inc; Homemade AR05 Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use.
Fluorescently labeled tubulin Cytoskeleton Inc TL488M, TLA590M, TL670M Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
G-buffer Homemade 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Buffer Homemade 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
Ice
Ice bucket
Imaging chambers IBIDI, Fitchburg, WI 80666 Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings
iXon Life 897 EMCCD camera Andor, Belfast, Northern Ireland 8114137
LASX Premium microscope software Leica Microsystems 11640611
Methylcellulose (4,000 cp) Sigma Aldrich Inc M0512
Microscope base equipped with TIRF module Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11889146
mPEG-silane (MW 2,000) Laysan Bio Inc, Arab, AL mPEG-SIL-2000 Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Objective heater and heated stage insert OKO labs, Pozzioli, Italy 8113569 Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.
Perfusion pump Harvard Apparatus, Holliston, MA 704504 A syringe and tubing can be substituted.
Petri Dish, 100 x 15 mm Genesee Scientific, San Diego, CA 32-107
Plastic slide mailer container Fisher Scientific HS15986
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick Grace Biolabs, Bend, OR 620001 Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.
Small styrofoam container Abcam, Cambridge, UK Reused from shipping
Small weigh boat Fisher Scientific 02-202-100
Spectrophotometer
Tau Cytoskeleton Inc TA01 Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20).
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective Leica Microsystems 11506319
Tubulin stock Homemade; this protocol A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.
Unlabeled actin (dark) Cytoskeleton Inc; Homemade AKL99 Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pimm, M. L., Henty-Ridilla, J. L. New twists in actin-microtubule interactions. Molecular Biology of the Cell. 32 (3), 211-217 (2021).
  2. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  3. Etienne-Manneville, S. Actin and microtubules in cell motility: which one is in control. Traffic. 5 (7), 470-477 (2004).
  4. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nature Cell Biology. 5 (7), 599-609 (2003).
  5. Prezel, E., et al. TIRF assays for real-time observation of microtubules and actin coassembly: Deciphering tau effects on microtubule/actin interplay. Methods in Cell Biology. 141, 199-214 (2017).
  6. Griffith, L. M., Pollard, T. D. The interaction of actin filaments with microtubules and microtubule-associated proteins. The Journal of Biological Chemistry. 257 (15), 9143-9151 (1982).
  7. Henty-Ridilla, J. L., Rankova, A., Eskin, J. A., Kenny, K., Goode, B. L. Accelerated actin filament polymerization from microtubule plus ends. Science. 352 (6288), 1004 (2016).
  8. Elie, A., et al. Tau co-organizes dynamic microtubule and actin networks. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
  9. Preciado López, M., et al. Actin-microtubule coordination at growing microtubule ends. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
  10. Oberhofer, A., et al. Molecular underpinnings of cytoskeletal cross-talk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 3944-3952 (2020).
  11. Nakos, K., et al. Septins mediate a microtubule-actin crosstalk that enables actin growth on microtubules. bioRxiv. , (2022).
  12. Kučera, O., Gaillard, J., Guérin, C., Théry, M., Blanchoin, L. Actin-microtubule dynamic composite forms responsive active matter with memory. bioRxiv. , (2022).
  13. Kundu, T., Dutta, P., Nagar, D., Maiti, S., Ghose, A. Coupling of dynamic microtubules to F-actin by Fmn2 regulates chemotaxis of neuronal growth cones. Journal of Cell Science. 134 (13), 252916 (2021).
  14. Roth-Johnson, E. A., Vizcarra, C. L., Bois, J. S., Quinlan, M. E. Interaction between microtubules and the Drosophila formin Cappuccino and its effect on actin assembly. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4395-4404 (2014).
  15. Gaillard, J., et al. Differential interactions of the formins INF2, mDia1, and mDia2 with microtubules. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4575-4587 (2011).
  16. Bartolini, F., et al. The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity. The Journal of Cell Biology. 181 (3), 523-536 (2008).
  17. Sider, J. R., et al. Direct observation of microtubule-F-actin interaction in cell free lysates. Journal of Cell Science. 112 (12), 1947-1956 (1999).
  18. Alkemade, C., et al. Cross-linkers at growing microtubule ends generate forces that drive actin transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (11), 2112799119 (2022).
  19. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  20. Amann, K. J., Pollard, T. D. Direct real-time observation of actin filament branching mediated by Arp2/3 complex using total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15009-15013 (2001).
  21. Al-Bassam, J. Reconstituting dynamic microtubule polymerization regulation by TOG domain proteins. Methods in Enzymology. 540, 131-148 (2014).
  22. Smith, B. A., Gelles, J., Goode, B. L. Single-molecule studies of actin assembly and disassembly factors. Methods in Enzymology. 540, 95-117 (2014).
  23. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
  24. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), (2019).
  25. Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments. (150), e59520 (2019).
  26. King, M. R., Petry, S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation. Nature Communications. 11 (1), 270 (2020).
  27. Ramirez-Rios, S., et al. A TIRF microscopy assay to decode how tau regulates EB's tracking at microtubule ends. Methods in Cell Biology. 141, 179-197 (2017).
  28. Smith, B. A., et al. Three-color single molecule imaging shows WASP detachment from Arp2/3 complex triggers actin filament branch formation. eLife. 2, 01008 (2013).
  29. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  30. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
  33. Kapoor, V., Hirst, W. G., Hentschel, C., Preibisch, S., Reber, S. MTrack: Automated detection, tracking, and analysis of dynamic microtubules. Scientific Reports. 9 (1), 3794 (2019).
  34. Willige, D., et al. Cytolinker Gas2L1 regulates axon morphology through microtubule-modulated actin stabilization. EMBO reports. 20 (11), (2019).
  35. Hirst, W. G., Kiefer, C., Abdosamadi, M. K., Schäffer, E., Reber, S. In vitro reconstitution and imaging of microtubule dynamics by fluorescence and label-free microscopy. STAR Protocols. 1 (3), 100177 (2020).
  36. Farina, F., et al. The centrosome is an actin-organizing centre. Nature Cell Biology. 18 (1), 65-75 (2016).
  37. Mishra, M., et al. In vitro contraction of cytokinetic ring depends on myosin II but not on actin dynamics. Nature Cell Biology. 15 (7), 853-859 (2013).
  38. Groen, A. C., Ngyuen, P. A., Field, C. M., Ishihara, K., Mitchison, T. J. Glycogen-supplemented mitotic cytosol for analyzing Xenopus egg microtubule organization. Methods in Enzymology. 540, 417-433 (2014).
  39. Pollard, L. W., Garabedian, M. V., Alioto, S. L., Shekhar, S., Goode, B. L. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Molecular Biology of the Cell. 31 (5), 335-347 (2020).
  40. Bergman, Z. J., Wong, J., Drubin, D. G., Barnes, G. Microtubule dynamics regulation reconstituted in budding yeast lysates. Journal of Cell Science. 132 (4), 219386 (2018).
  41. Inoue, D., et al. Actin filaments regulate microtubule growth at the centrosome. The EMBO Journal. 38 (11), (2019).
  42. Colin, A., Singaravelu, P., Théry, M., Blanchoin, L., Gueroui, Z. Actin-network architecture regulates microtubule dynamics. Current Biology. 28 (16), 2647-2656 (2018).
  43. Torvi, J. R., et al. Reconstitution of kinetochore and microtubule dynamics reveals a role for a kinesin-8 in establishing end-on attachments. bioRxiv. , (2022).
  44. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  45. Abu Shah, E., Keren, K. Symmetry breaking in reconstituted actin cortices. eLife. 3, 01433 (2014).
  46. Vendel, K. J. A., Alkemade, C., Andrea, N., Koenderink, G. H., Dogterom, M. In vitro reconstitution of dynamic co-organization of microtubules and actin filaments in emulsion droplets. Cytoskeleton Dynamics. 2101, 53-75 (2020).
  47. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  48. Liu, X., Pimm, M. L., Haarer, B., Brawner, A. T., Henty-Ridilla, J. L. Biochemical characterization of actin assembly mechanisms with ALS-associated profilin variants. European Journal of Cell Biology. 101 (2), 151212 (2022).
  49. Pimm, M. L., Liu, X., Tuli, F., Lojko, A., Henty-Ridilla, J. L. Visualizing functional human profilin in cells and in vitro applications. bioRxiv. , (2021).

Tags

ביוכימיה גיליון 185 מיקרוסקופיית TIRF אקטין מיקרוטובולים דינמיקה של שלד ציטוסקטלי מבחני פני שטח במבחנה טאו
הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול <em>במבחנה</em> על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Henty-Ridilla, J. L. Visualizing… More

Henty-Ridilla, J. L. Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e64074, doi:10.3791/64074 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter