Summary
تمثل نماذج زراعة قلب الفئران أدوات بحثية قيمة لدراسة مناعة الزرع. يفصل البروتوكول الحالي زراعة قلب عنق الرحم غير المتجانسة للفأر والتي تتضمن وضع أصفاد على الشريان السباتي المشترك للمتلقي وجذع الشريان الرئوي للمتبرع للسماح بتدفق الدم الصفحي.
Abstract
كثيرا ما تستخدم نماذج الفئران لزراعة القلب لدراسة إصابة نقص التروية ، والاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية بعد الزرع ، وتأثير العلاجات المناعية على رفض الكسب غير المشروع. تم وصف زراعة قلب عنق الرحم غير المتجانس في الفئران لأول مرة في عام 1991 باستخدام مفاغرة مخيطة وتم تعديلها لاحقا لتشمل تقنيات الكفة. سمح هذا التعديل بتحسين معدلات النجاح ، ومنذ ذلك الحين ، كانت هناك تقارير متعددة اقترحت المزيد من التحسينات التقنية. ومع ذلك ، لا تزال الترجمة إلى استخدام أكثر انتشارا محدودة بسبب الصعوبة الفنية المرتبطة بمفاغرة الكسب غير المشروع ، والتي تتطلب الدقة لتحقيق الطول والعيار المناسبين للأصفاد لتجنب التواء مفاغرة الأوعية الدموية أو التوتر المفرط ، مما قد يؤدي إلى تلف الكسب غير المشروع. يصف البروتوكول الحالي تقنية معدلة لإجراء زرع قلب عنق الرحم غير المتجانس في الفئران والتي تنطوي على وضع الكفة على الشريان السباتي المشترك للمتلقي والشريان الرئوي للمتبرع بما يتماشى مع اتجاه تدفق الدم.
Introduction
نشر أبوت وآخرون1 أول وصف لزراعة قلب البطن غير المتجانس في الفئران في عام 1964. تم تنقيح هذه التقنيات الجراحية وتبسيطها بواسطة Ono et al. في عام 19692. وصف كوري وآخرون لأول مرة طريقة لزراعة قلب البطن غير المتجانس في الفئران في عام 1973. على غرار نماذج الفئران التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، تضمن ذلك النقش في بطن المضيف مع إعادة التوعي عن طريق مفاغرة من طرف إلى جانب للشريان الرئوي للمتبرع والشريان الأورطي الصاعد إلى الوريد الأجوف السفلي للمتلقي والشريان الأورطي البطني ، على التوالي3. تم وصف زرع قلب عنق الرحم غير المتجانس في الفئران بواسطة Heron في عام 1971 باستخدام أصفاد تفلون مصنوعة من 16 جم (1.6 مم قطر خارجي) قسطرة في الوريد4. أبلغ Chen5 و Matsuura et al.6 لاحقا عن زرع قلب عنق الرحم غير المتجانس في الفئران في عام 1991 ، والتي اختلفت تقنياتها في المقام الأول في طريقة إعادة المفاغرة. تضمن نهج تشن مفاغرة خياطة الشريان الأورطي الصاعد للمتبرع إلى الشريان السباتي للمتلقي والشريان الرئوي للمتبرع إلى الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي5. نظرا للمهارة التقنية المتقدمة المطلوبة لهذه المفاغرة الجراحية المجهرية ، كان هناك حاجة إلى قدر كبير من الوقت والخبرة لتحقيق معدل نجاح مرتفع. وصف ماتسورا وآخرون طريقة تستخدم تقنية الكفة غير المخيطة ، على غرار تلك المستخدمة من قبل هيرون ، والتي تضمنت مفاغرة من طرف إلى طرف باستخدام وضع الأصفاد خارج اللمعة. قام بتصميم أصفاد تفلون من القسطرة الوريدية 22 جم (القطر الخارجي 0.8 مم) و 24 جم (القطر الخارجي 0.67 مم) ووضعها فوق الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي والشريان السباتي المشترك ، على التوالي6. ثم تم وضع هذه الأصفاد داخل الشريان الرئوي والشريان الأورطي للمتبرع وتأمينها عن طريق ربط رباط خياطة حول الوصلة. ترجم هذا النهج إلى معدل نجاح محسن. الأهم من ذلك ، أنه أدى إلى تقصير الوقت اللازم لإكمال كل من مفاغرة عنق الرحم ، وبالتالي تقليل الوقت الإقفاري الدافئ للكسب غير المشروع إلى أقل من ثلث ذلك باستخدام طريقة خياطة البطن. علاوة على ذلك ، نظرا لوضع الأصفاد حول السطح الخارجي للسفينة ، لا يوجد جسم غريب يتعرض لتجويف الوعاء ، مما يقلل إلى حد كبير من احتمال تجلط الدم بعد الجراحة7. وفي الوقت نفسه ، يوفر استخدام تقنية الكفة الدعم حول الأوعية في موقع المفاغرة دون الحاجة إلى أي خياطة ، مما يقلل من خطر النزيف بعد إعادة التوعي6.
تم اقتراح العديد من التنقيحات لهذه التقنية. لاستيعاب الطول القصير للشريان السباتي المشترك للفأر (حوالي 5 مم) ، طور Tomita et al.8 تعديلا لهذه التقنية مع صفعة شريانية أصغر (قطر خارجي 0.6 مم) مع حذف عقد الغرز وسحب الشريان مباشرة من خلال الكفة باستخدام ملقط دقيق بدلا من ذلك. قام وانغ وآخرون بتبسيط هذا النهج عن طريق وضع أصفاد 22 G و 24 G على الشريان الرئوي الأيمن للمتبرع والشريان السباتي المشترك الأيمن للمتلقي ، على التوالي9. وصفت تقارير مختلفة تعديلات على هذه الأساليب ، بما في ذلك استخدام الأصفاد المتخصصة ، والمشابك المجهرية ، وموسعات الأوعية الدموية ، وشلل القلب10،11،12. والجدير بالذكر أن كل هذه الطرق تنطوي على الدورة الدموية الرجعية عبر القلب ، حيث يتدفق الدم من الشريان السباتي المشترك المتلقي إلى الشريان الأورطي المتبرع ، والشرايين التاجية ، والجيب التاجي ، ثم يفرغ في الأذين الأيمن ويخرج من الشريان الرئوي إلى الوريد الوداجي الخارجي المتلقي.
بالمقارنة مع النقش في البطن ، فإن زراعة قلب عنق الرحم توفر مزايا متعددة. كما ذكرنا سابقا ، يسمح التعرض لعنق الرحم بإعادة التوعي بشكل أسرع وأوقات نقص تروية دافئة أقصر6. طريقة عنق الرحم هي أيضا أقل توغلا وترتبط بأوقات تعافي أقصر بعد العملية الجراحية لأنها تتجنب بضع البطن6. الأهم من ذلك ، يمكن إجراء مفاغرة من طرف إلى طرف مع الأصفاد بدلا من مفاغرة من طرف إلى آخر ، مما يقلل من خطر حدوث مضاعفات مثل نزيف مفاغرة. يشكل نهج البطن أيضا خطرا متزايدا للإصابة بمضاعفات خثارية في الشريان الأورطي البطني أو الوريد الأجوف السفلي، مما يؤدي إلى إقفار الحبل الشوكي وشلل الأطراف الخلفية. يسمح موقع عنق الرحم السطحي لعملية الزرع بالوصول السهل إلى تقييم جدوى الكسب غير المشروع عن طريق الجس وتخطيط القلب الكهربائي والتصوير الغازي أو غير الجراحي. على الرغم من أن الطعوم العنقية تستأنف نشاط القلب التلقائي بعد إعادة التروية ، إلا أنها لا تؤثر بشكل كبير على المعلمات الانقباضية والانبساطية للمتلقي. يوفر هذا النموذج رؤية قيمة لدراسة الاستجابات الخلوية بعد الزرع ، مثل إصابة نقص التروية ورفض الكسب غير المشروع. علاوة على ذلك ، يقدم هذا النموذج نهجا مثاليا للسماح بالتصوير بعد الزرع ، مثل الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم أو التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET). تحقيقا لهذه الغاية ، أبلغ مختبرنا سابقا عن طرق لتصوير الأنسجة والأعضاء المتحركة في الفأر ، بما في ذلك ضربات قلوب الفئران وترقيع قوس الأبهر بعد زرع عنق الرحم غير المتجانس لتصور الاتجار بالكريات البيض أثناء إصابة نقص التروية وداخل لويحات تصلب الشرايين ، على التوالي13،14،15 . بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لموقعه السطحي وسهولة التعرض ، فإن هذا النموذج مناسب لإعادة زرع القلب16.
يصف هذا التقرير تقنية تسمح بتدفق الدم الصفحي مع الوضع الخارجي للأصفاد الوعائية على الأوعية التي ينشأ منها تدفق الدم. هذا يسمح بالانتقال السلس لتدفق الدم من وعاء إلى آخر ، وتجنب تعرض حافة الوعاء البعيد في تجويف الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم هذه التقنية صفعة أكبر 20 جراما ، بدلا من أصفاد 22 جراما المستخدمة سابقا ، للشريان الرئوي للمتبرع لضمان عودة تدفق الدم إلى المتلقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات وفقا لإرشادات رعاية واستخدام المختبر الصادرة عن المعاهد الوطنية للصحة ووافقت عليها لجنة الدراسات الحيوانية في كلية الطب بجامعة واشنطن. تم زرع قلوب من الفئران C57BL / 6 (B6) و BALB / c (التي تزن 20-25 جم) في متلقي B6 المتطابقين بين الجنسين (6-8 أسابيع من العمر). تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد). تم إجراء عمليات زرع syngeneic لتقييم الاستجابات الخلوية المتعلقة بإصابة نقص التروية ، وتم إجراء عمليات زرع خيفي للتحقيق في الآليات المناعية المشاركة في تحمل الكسب غير المشروع والرفض. تم استخدام الفئران المراسلة B6 lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP)17 ، التي تم الحصول عليها في الأصل من Klaus Ley من معهد La Jolla للحساسية والمناعة ، La Jolla ، CA ، وتم تربيتها لاحقا في منشأتنا ، كمتلقين لتجارب مختارة لتصور تسلل العدلات إلى الطعوم القلبية. تم إجراء جراحة البقاء على قيد الحياة باستخدام إجراءات معقمة.
1. إجراءات المانحين
- تخدير الفئران عن طريق حقن الكيتامين (80-100 ملغم / كغم) والزيلازين (8-10 ملغم / كغم) (انظر جدول المواد) داخل الصفاق في الفأر المتبرع. تأكيد الطائرة الجراحية للتخدير مع قرصة إصبع القدم والذيل.
- تحضير المنطقة الجراحية عن طريق حلق الشعر من الصدر والبطن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
- تطبيق 100 وحدة من الهيبارين (انظر جدول المواد) عن طريق الوريد في الوريد القضيبي (الذكور) أو الوريد الوداجي الخارجي (الذكور أو الإناث).
- ضع الفئران في وضع ضعيف مع الأطراف الأمامية فوقها. تأمين الأطراف الأمامية والخلفية مع الشريط الجراحي وتطهير الجلد مع ثلاثة الدعك بالتناوب من 0.75 ٪ من اليود و 70 ٪ من الإيثانول.
- إجراء شق ، بضع البطن المتوسط ، من السرة إلى الزاوية القصية (3-4 سم) ، تليها بضع الصدر الثنائي على طول كل هامش ساحلي (2 سم ثنائيا). قم بطي جدار الصدر الأمامي فوق الرقبة للتعرض الكامل للمنصف.
- استئصال الغدة الصعترية وفضح الوريد الأجوف السفلي داخل الصدر.
- عبر عرض الشريان الأورطي البطني للاستنزاف.
- للتروية المرتجعة ، قم بحقن 1.5 مل من محلول ملحي 4 درجات مئوية في الوريد الأجوف السفلي داخل الصدر مع توجيه الإبرة بشكل أعلى نحو الكسب غير المشروع ، كما هو موضح سابقا13.
- ربط الوريد الأجوف العلوي باستخدام 8-0 خياطة الحرير وتقسيمها بعيدا.
- كرر التروية الرجعية عن طريق حقن 1.5 مل أخرى من محلول ملحي 4 درجات مئوية عبر الوريد الأجوف السفلي.
- ربط الوريد الأجوف السفلي باستخدام 8-0 خياطة الحرير وتقسيمها بعيدا.
- تشريح قوس الأبهر وجذع الشريان الرئوي لحصاد الكسب غير المشروع وعرضهما بعيدا. ربط الأوردة الرئوية على السطح الخلفي للقلب باستخدام خياطة الحرير 6-0 وتقسيمها بعيدا.
- قم بإعداد الكسب غير المشروع عن طريق إزالة قلب المتبرع من تجويف الصدر. ضع القلب المستأصل في وعاء بلاستيكي مملوء بمحلول ملحي بالهيبارين 4 درجات مئوية لمدة 1-2 دقيقة. انقل الكسب غير المشروع إلى قارورة بلاستيكية معقمة مملوءة بالثلج لوضع الكفة (الشكل 1 أ).
ملاحظة: يجب أن يبقى طعم القلب على القارورة لمدة 5 دقائق تقريبا لوضع صفعة الشريان الرئوي للمتبرع. - ضع قسطرة وعائية بطول 1 مم 20 جم (انظر جدول المواد) فوق الشريان الرئوي لصفعة المتبرع. باستخدام ملقط ناعم ، قم بطي حواف الشريان برفق فوق الكفة. قم بتأمين الوعاء المطوي في الكفة باستخدام ربطة عنق من النايلون 10-0 ، كما هو موضح سابقا18 (الشكل 1B ، C).
- قم بتخزين قلب المتبرع في محلول ملحي هيبارين أو محلول حفظ آخر عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: في حين أن البعض قد يفضل حلول حفظ محددة (على سبيل المثال ، حل جامعة ويسكونسن) للحفظ الإقفاري لفترات طويلة ، فقد يكون مكلفا19. قد يكون المحلول الملحي بديلا مناسبا لفترات قصيرة من نقص التروية (<1 ساعة)20. في النهاية ، يعتمد اختيار حل الحفظ على التصميم التجريبي21.
2. إجراء المستلم
- حقن الكيتامين (80-100 ملغم / كغم) وزيلازين (8-10 ملغم / كغم) داخل الصفاق في الفأر المتلقي للتخدير. حقن البوبرينورفين المستمر الإطلاق (0.5-1.0 ملغم / كغم) تحت الجلد لتسكين. تأكيد الطائرة الجراحية للتخدير مع قرصة إصبع القدم والذيل.
- تحضير المنطقة الجراحية عن طريق حلق الشعر من منطقة عنق الرحم باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. ضع مرهم عيون معقم وغير طبي على العينين لمنع جفاف القرنية.
- ضع الحيوان في وضع ضعيف مع الأطراف الأمامية المجاورة للجسم وتحول الرأس قليلا إلى اليسار. تأمين الأطراف الأمامية والخلفية بشريط جراحي. تطهير الجلد مع ثلاثة الدعك بالتناوب من 0.75 ٪ من اليود و 70 ٪ من الإيثانول.
- قم بعمل شق عنق الرحم في خط الوسط من الفك السفلي إلى القص.
- اعبر العضلة القصية الترقوية الخشائية اليمنى. استئصال الفص الأيمن من الغدة تحت الفك السفلي لخلق مساحة لزرع الكسب غير المشروع.
- اربط عقدة منزلقة فوق الوريد الوداجي الخارجي القريب باستخدام خياطة حريرية 6-0. ربط الوريد الوداجي الخارجي البعيد والفروع المجاورة باستخدام 8-0 خياطة الحرير. قم بعمل شق عرضي عبر الجدار الأمامي للوريد الوداجي الخارجي.
- ضع خياطة نايلون 10-0 عبر حافة الوريد الوداجي الخارجي القريب والأنسجة الكامنة لتأمين الوريد أثناء إدخال الكفة (الشكل 1 د).
- ربط الشريان السباتي المشترك الأيمن البعيد باستخدام 8-0 خياطة الحرير فقط أدنى من تشعب السباتي. اربط عقدة منزلقة فوق الشريان السباتي المشترك القريب باستخدام خياطة حريرية 6-0. اقطع الشريان بعيدا بين الغرز.
- على غرار الكفة المتبرعة، ضع صفعة قسطرة بطول 0.6 مم بطول 24 جم فوق الشريان السباتي المشترك الأيمن للمتلقي. باستخدام ملقط ناعم ، قم بطي حواف الشريان برفق فوق الكفة. قم بتأمين الوعاء المطوي في الكفة باستخدام ربطة عنق من النايلون 10-0.
- ضع قلب المتبرع أعلى من منطقة عنق الرحم اليمنى.
- قم بتقطير محلول ملحي بارد على طعم القلب كل بضع دقائق أثناء الزرع.
- ضع خياطة نايلون 10-0 من خلال حافة الشريان الأورطي المتبرع ومن خلال لدغة سطحية من الأنسجة الكامنة لتأمين الكسب غير المشروع في مكانه (الشكل 1E).
- اغسل الشريان الأورطي المتبرع ب 0.5 مل من محلول ملحي بالهيبارين بنسبة 0.9٪.
- أدخل صفعة الشريان السباتي المشتركة للمتلقي في الشريان الأورطي للمتبرع. تأمين مفاغرة مع 8-0 ربطة عنق حريرية (الشكل 1F). قم بإزالة خياطة مرساة الأبهر.
- قم بإزالة الهواء من الوريد الوداجي الخارجي عن طريق شطف الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي ب 0.5 مل من محلول ملحي بالهيبارين بنسبة 0.9٪.
- إجراء مفاغرة الشريان الرئوي عن طريق إدخال صفعة الشريان الرئوي للمتبرع في الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي وتأمينها ب 8-0 ربطة عنق حريرية (الشكل 1G). قم بإزالة خياطة مرساة الوريد الوداجي الخارجي وعبر الجدار الخلفي المتبقي من الوريد الوداجي الخارجي لتحرير الكسب غير المشروع من الأنسجة الكامنة. تأكد من توجيه الكسب غير المشروع بشكل صحيح دون التواء أو التواء مفاغرة.
- حرر العقد المنزلقة على الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي متبوعا بالشريان السباتي المشترك لبدء إعادة تروية الكسب غير المشروع للقلب (الشكل 1H).
- أغلق شق جلد عنق الرحم باستخدام خياطة نايلون متقطعة 6-0.
3. رعاية ما بعد الجراحة
- ضع المتلقي في غرفة إنعاش دافئة مباشرة بعد الجراحة وراقبها عن كثب حتى يتعافى تماما من التخدير (حوالي 1 ساعة).
- استمر في مراقبة الحيوان عن كثب (كل 6-8 ساعات) لمدة 72 ساعة على الأقل بعد الجراحة بحثا عن علامات السلوك غير الطبيعي ، مثل الخمول أو الاهتزاز أو التنفس السريع أو فقدان الشهية.
- للسيطرة على الألم ، حقن كاربروفين (5 ملغ / كغ) تحت الجلد كل 8-12 ساعة للتسكين ، بالإضافة إلى البوبرينورفين تحت الجلد (0.05 ملغ / كغ) كل 8-12 ساعة لمدة 24-48 ساعة بدءا من نهاية الجراحة.
4. التصوير داخل الفوتون ثنائي المفعول للاتجار الكريات البيض في الكسب غير المشروع القلب
- حقن الكيتامين (80-100 ملغ/كغ) والزيلازين (8-10 ملغ/كغ) داخل الصفاق في الفأر المتلقي B6 LysM-GFP17 2 ساعة بعد إعادة ضخ الكسب غير المشروع للتخدير.
- إجراء التنبيب الرغامي باستخدام قسطرة وعائية 20 G ، كما هو موضح سابقا18.
- قم بتوصيل قسطرة الأوعية الدموية بأنبوب من جهاز التنفس الصناعي الميكانيكي للفأر وقم بالتهوية بهواء الغرفة بمعدل 120 نفسا / دقيقة وحجم المد والجزر 0.5 مل18.
- حقن 12 ميكرولتر من 655 نانومتر من النقاط الكمومية غير المستهدفة (انظر جدول المواد) ، معلقة في 50 ميكرولتر من PBS عن طريق الوريد ، كما هو موضح سابقا13.
- أعد فتح شق الرقبة لكشف طعم القلب. ضع الماوس في غرفة التثبيت.
- قم بتأمين جزء من الجدار الحر للبطين الأيسر باستخدام حلقة رقيقة من لاصق الأنسجة (انظر جدول المواد) ، يتم تطبيقه على غطاء زجاجي متصل بلوحة الغرفة العلوية.
- ضع الغرفة تحت هدف مجهر الفوتونين للحصول على الصور ومقاطع الفيديو ، كما هو موضح سابقا13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام نموذج زراعة القلب غير المتجانس لعنق الرحم لإجراء أكثر من 1000 عملية زرع في مختبرنا ، بمعدل بقاء يبلغ حوالي 97٪. معدل النجاح أعلى قليلا من التقارير السابقة باستخدام تقنيات زرع القلب غير المتجانسة عنق الرحم الأخرى في الفئران 10،11،20. يمكن أن يعزى ذلك إلى الكفة الأكبر 20 جم الموضوعة على الشريان الرئوي للمتبرع لضمان عودة تدفق الدم إلى المتلقي (الشكل 1B ، C). بالإضافة إلى ذلك ، فإن محاذاة تدفق الدم مع وضع الكفة في التقنية الحالية تقلل من خطر تجلط الدم واضطراب مفاغرة (الشكل 1،2). في حين أن التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) أو الموجات فوق الصوتية يمكن أن يقيم اضطراب نضح الكسب غير المشروع22,23 ، إلا أننا لم نستخدم هذه التقنيات بعد في التجارب. الموت أثناء العملية باستخدام هذه التقنية نادر الحدوث بالنسبة للجراحين المجهريين ذوي الخبرة. غالبا ما يكون معدل الوفيات بعد العملية الجراحية بسبب مضاعفات النزيف. كان متوسط وقت تشغيل المتلقي 36.5 ± 3.5 دقيقة ، بمتوسط وقت نقص تروية بارد يبلغ 20 دقيقة. بالنسبة لدراسات البقاء على قيد الحياة ، تم تقييم الطعوم القلبية يوميا عن طريق التصور المباشر والجس الرقمي لنبضات القلب. عادة ما يتم التضحية بالفئران لتقييم الكسب غير المشروع بعد حوالي 7-14 يوما من الجراحة. التصوير ثنائي الفوتون داخل الجسم هو إجراء نهائي يتم إجراؤه عادة في وقت مبكر بعد الزرع لتقييم الاتجار بالكريات البيض (الشكل 3).
حافظت معظم عمليات الزرع الجيني على دقات قلب قوية حتى التضحية ، حتى 6 أشهر بعد الزرع. عند الفحص الإجمالي ، بدت معظم الطعوم التوليفية طبيعية ولم يكشف الفحص النسيجي عن أي دليل على الرفض. جميع عمليات زرع الخيفي غير المثبطة للمناعة (BALB / c إلى B6) طورت نبضات قلب متناقصة في غضون 1-2 أسابيع بعد التطعيم. تم توسيع الطعوم الخيفية المستأصلة من هذه الفئران بشكل كبير ، وأظهر الفحص النسيجي تسلل منتشر للخلايا الليمفاوية ومناطق نخر عضلة القلب.
الشكل 1: تحضير طعم القلب للزراعة. أ: يتم استئصال القلب من الفأر المتبرع. (ب، ج) يتم كشف جذع الشريان الرئوي وسحبه من خلال صفعة 20 جم ، مطوية للخلف ، ومثبتة بخياطة نايلون 10-0. (د) توضع خياطة نايلون 10-0 عبر حافة الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي وتثبت على الأنسجة الكامنة. (ه) توضع خياطة نايلون 10-0 عبر حافة الشريان الأورطي للمتبرع وتثبت في النسيج الكامن المجاور للشريان السباتي المتلقي. (F) يتم إدخال صفعة الشريان السباتي المشتركة للمتلقي في الشريان الأورطي للمتبرع وتثبيتها ب 8-0 خياطة الحرير. (ز) يتم إدخال صفعة الشريان الرئوي للمتبرع في الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي وتثبيتها ب 8-0 خياطة الحرير. (H) يتم تحرير العقدة المنزلقة القريبة على الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي ، تليها إطلاق عقدة الشريان السباتي المشترك. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: منظر أثناء العملية للطعم القلبي. يتم سحب سوار 1 مم 20 جم فوق الشريان الرئوي للمتبرع وتثبيته بربطة نايلون 10-0. يتم سحب صفعة 0.6 مم 24 جم فوق الشريان السباتي المشترك الأيمن للمستلم وتثبيتها بربطة عنق من النايلون 10-0. يتم وضع خيوط مرساة (10-0 نايلون) في جدار الشريان الأورطي للمتبرع والوريد الوداجي الخارجي الأيمن للمتلقي ويتم تثبيتها في الأنسجة الكامنة لمنع الحركة أثناء إدخال الكفة. (AO = الشريان الأورطي ، PA = الشريان الرئوي ، CCA = الشريان السباتي المشترك ، EJV = الوريد الوداجي الخارجي). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: التصوير داخل الفوتونين لديناميكيات الكريات البيض في طعم القلب. يوضح التصوير ثنائي الفوتون داخل الجسم للقلب النابض المزروع من الفأر B6 إلى متلقي B6 LysM-GFP تهريب العدلات المتلقية إلى أنسجة الكسب غير المشروع للقلب بين 2-3 ساعات بعد الجراحة. (الأخضر = العدلات ، الأحمر = الأوعية الموسومة بالنقاط الكمومية). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| تعقيد | الأسباب المحتملة | محاليل |
| وفاة المستلم | انخفاض حرارة الجسم | وسادة التدفئة |
| تجفاف | 0.9٪ محلول ملحي بعد العملية الجراحية | |
| ضعف التروية الكسب غير المشروع | التواء الشريان السباتي | إعادة مفاغرة ، أو |
| خثرة أو الصمات الهوائية | مفاغرة شريانية مفتوحة وتتدفق بمحلول ملحي هيباريني | |
| انسداد وريدي | خثرة أو الصمات الهوائية | إعادة مفاغرة ، أو |
| فتح مفاغرة وريدية وتدفق مع محلول ملحي هيبارين | ||
| نزيف ما بعد الجراحة | نزيف فروع الوريد الوداجي | فروع الوريد الوداجي Ligate |
| ضغط مسحة القطن | ||
| أساور فضفاضة | شد الأساور | |
| ضعف ضربات القلب | الكسب غير المشروع القلبي البارد | بالتنقيط محلول ملحي دافئ على سطح القلب |
| التواء الكسب غير المشروع | موقف الكسب غير المشروع | تأكد من توجيه الكسب غير المشروع بشكل صحيح قبل إغلاق الجلد |
| نشاط غير منتظم (مثل الجري في دوائر) | نقص التروية الدماغية | ربط الشريان السباتي المشترك أدنى من التشعب السباتي |
الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمضاعفات. المضاعفات الشائعة مع الحلول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام هذه التقنية ، يمكن إجراء زراعة قلب عنق الرحم غير المتجانسة للفأر في أقل من 40 دقيقة بواسطة جراح دقيق متمرس وفي حوالي 60 دقيقة بواسطة جراح مجهري مبتدئ. بينما تمت دراسة زرع قلب عنق الرحم في العديد من النماذج الحيوانية ، يظل نموذج الفأر هو المعيار الذهبي بسبب السلالات الجينية المتعددة المحددة جيدا ، وقدرات التغيير الجيني ، وتوافر العديد من الكواشف ، بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة24. توفر التقنية الموصوفة هنا فرصة فريدة لمراقبة ما بعد الزرع ، مثل تخطيط القلب الكهربائي أو التصوير داخل الجسم ، بما في ذلك الفحص المجهري ثنائي الفوتون (الشكل 3) أو التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني التسلسلي غير الجراحي13،14،15،25. توفر هذه الطريقة موقعا سطحيا لطعم القلب يسهل تثبيته للتصوير داخل الجسم ، وبالتالي تجنب التعقيد المتأصل في طريقة زرع البطن بسبب الموقع الأعمق للطعم وأعضاء البطن المحيطة. علاوة على ذلك ، هذه التقنية مفيدة بشكل خاص في سياق إعادة الزرع. تمثل نماذج إعادة الزرع أدوات قوية لتحديد الخلايا المقيمة في الطعوم القلبية المزروعة التي تتوسط في الاستجابات المناعية الخيفية. بينما استخدمنا هذه التقنية سابقا في نموذج إعادة زرع قلب الفأر لتقييم النتائج قصيرة المدى ، يمكن توسيع هذا النهج في التجارب المستقبلية لاستكشاف النتائج طويلة المدى16. تحقيقا لهذه الغاية ، استخدمت التحقيقات الحالية حتى الآن فترة قصيرة من نقص التروية الباردة (حوالي 20 دقيقة). يمكن للدراسات المستقبلية التحقيق في تأثير نقص التروية البارد أو الدافئ لفترات طويلة على النتائج قصيرة وطويلة الأجل لتقليد الزرع السريري بشكل أوثق.
يجب النظر في العديد من الخطوات الحاسمة لهذه التقنية. تتضمن الطرق السابقة إدخال الكفة على الوريد الوداجي الخارجي الأصغر في التجويف الكبير للشريان الرئويالمتبرع 6,8. إن وضع الكفة الأكبر على الشريان الرئوي للمتبرع لتحديد الاتجاه الصحيح مع تدفق الدم يجعل إدخال الكفة في الوريد الوداجي الخارجي الأصغر أكثر صعوبة. إن تثبيت حافة الوريد بالأنسجة الكامنة وشق الجدار الأمامي للوريد جزئيا فقط يسهل إدخال الكفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون وضع الكفة على الشريان السباتي المشترك للمتلقي أمرا صعبا للغاية بسبب العيار الصغير للسفينة. على هذا النحو ، أبلغت التقنيات السابقة عن استخدام أصفاد أصغر (على سبيل المثال ، 26 جم) لهذا المفاغرة12. ومع ذلك ، فإن النهج الحالي يستخدم صفعة أكبر 24 جراما لضمان التروية الكافية للكسب غير المشروع ، والتي نعتقد أنها قد تقدم بعض فوائد البقاء على قيد الحياة. قد يساعد اختيار الفئران المتلقية الأكبر حجما الجراحين المجهريين المبتدئين. تتم إزالة خيوط المرساة بعد إعادة التروية ، ولا يتم إصلاح الكسب غير المشروع في الاتجاه المناسب كما وصف آخرون3. وبالتالي ، من المهم التحقق من وضع الكسب غير المشروع وتوجيهه بشكل صحيح قبل إغلاق جلد عنق الرحم لمنع الالتواء أو الالتواء (الجدول 1). يتم إجراء استئصال الغدة تحت الفك السفلي الأيمن لتوفير مساحة كافية لترقيع القلب ، وبالتالي تجنب ضغط الكسب غير المشروع بعد إغلاق الجلد.
يقدم النموذج الموضح هنا العديد من المزايا. من خلال وضع الأصفاد على جذع الشريان الرئوي للمتبرع والشريان السباتي المشترك للمتلقي، يتماشى اتجاه الكفة مع اتجاه تدفق الدم. هذا يقلل من احتمال التدفق المضطرب وتشكيل الجلطة. ثانيا ، يتم استخدام صفعة شريان رئوي أكبر 20 جم لضمان عودة تدفق الدم إلى المتلقي. ثالثا ، يتم وضع صفعة أكبر 24 جم على الشريان السباتي المشترك لضمان التروية الكافية للطعم. أخيرا ، يتم استخدام 10-0 خيوط تثبيت نايلون لتثبيت الكسب غير المشروع في الأنسجة الكامنة وتسهيل إدخال الكفة. تساعد هذه التعديلات في التغلب على التحديات التقنية للإجراء ، ومنع الاضطرابات المفاغرة ، وتقليل مضاعفات ما بعد الجراحة مثل تكوين الجلطة.
أحد القيود المهمة لجميع نماذج زراعة قلب الفئران هو أن تدفق الدم الفسيولوجي لا يتم استعادته عبر غرف القلب. بدلا من ذلك ، تعتمد هذه النماذج على الدورة الدموية عبر الأوعية التاجية. لم يتم تحديد عواقب نمط التدفق الرجعي هذا على الإصابة الخلوية للطعم والاستجابات المناعية بوضوح. ومع ذلك ، فمن الممكن أن تؤثر قوى القص الميكانيكية الناتجة عن هذا الدوران غير الفسيولوجي على الاستجابات المناعية. لم يتم بعد تطوير نموذج جراحي لزراعة القلب في الفئران يعيد تدفق الدم الفسيولوجي وسيتطلب تقدما تقنيا كبيرا. لوحظ أن نسبة صغيرة من الفئران (<3٪) تعاني من سلوك غير منتظم عابر (على سبيل المثال ، الجري في دوائر) بعد الإجراء. يستمر هذا السلوك لمدة 1-2 ساعة تقريبا قبل الحل. بالنظر إلى أن هذا السلوك لا يلاحظ بعد إجراءات أخرى باستخدام نفس نظام التخدير ، فقد يكون مرتبطا بنقص التروية الدماغية العابرة بسبب تغيرات تدفق الدم بعد زرع قلب عنق الرحم. حدث الشفاء التام في جميع الفئران دون ملاحظة أي عجز مزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يتم دعم DK من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة 1P01AI116501 و R01HL094601 و R01HL151078 ومنحة مراجعة استحقاق إدارة المحاربين القدامى 1I01BX002730 ومؤسسة مستشفى بارنز اليهودي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
| Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
| Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
| Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
| Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
References
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. The Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Section A Pathology. 79 (4), 366-372 (1971).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52 (6), 1099-1101 (1991).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
- Yu, Y., et al. Cuff anastomosis of both renal artery and vein to minimize thrombosis: a novel method of kidney transplantation in mice. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 56-60 (2022).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64 (11), 1598-1601 (1997).
- Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. 25 (1), 76-79 (2005).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).
- Ratschiller, T., et al. Heterotopic cervical heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
- Mao, X., Xian, P., You, H., Huang, G., Li, J. A modified cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (180), e63504 (2022).
- Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2499-2508 (2012).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (5), 1030-1036 (2018).
- Li, W., et al. Lung transplant acceptance is facilitated by early events in the graft and is associated with lymphoid neogenesis. Mucosal Immunology. 5 (5), 544-554 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513 (2019).
- Ma, Y., et al. Optimization of the cuff technique for murine heart transplantation. Journal of Visualized Experiments. (160), e61103 (2020).
- Latchana, N., Peck, J. R., Whitson, B., Black, S. M. Preservation solutions for cardiac and pulmonary donor grafts: a review of the current literature. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1143-1149 (2014).
- Hartley, C. J., et al. Doppler velocity measurements from large and small arteries of mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), 269-278 (2011).
- Bovenkamp, P. R., et al. Velocity mapping of the aortic flow at 9.4 T in healthy mice and mice with induced heart failure using time-resolved three-dimensional phase-contrast MRI (4D PC MRI). MAGMA. 28 (4), 315-327 (2015).
- Wang, H. Small animal models of xenotransplantation. Methods in Molecular Biology. 885, 125-153 (2012).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
