Summary
Mus hjertetransplantasjonsmodeller representerer verdifulle forskningsverktøy for å studere transplantasjonsimmunologi. Den nåværende protokollen beskriver mus heterotopisk cervikal hjertetransplantasjon som innebærer plassering av mansjetter på mottakerens felles halspulsåren og donorens lungearterie trunk for å tillate laminær blodstrøm.
Abstract
Murine modeller av hjertetransplantasjon er ofte brukt til å studere iskemi-reperfusjon skade, medfødte og adaptive immunresponser etter transplantasjon, og virkningen av immunmodulerende behandlinger på graft avvisning. Heterotopisk cervikal hjertetransplantasjon hos mus ble først beskrevet i 1991 ved hjelp av suturerte anastomoser og deretter modifisert for å inkludere mansjettteknikker. Denne modifikasjonen tillot forbedrede suksessrater, og siden da har det vært flere rapporter som har foreslått ytterligere tekniske forbedringer. Imidlertid forblir oversettelse til mer utbredt bruk begrenset på grunn av den tekniske vanskeligheten forbundet med transplantatanastomoser, noe som krever presisjon for å oppnå tilstrekkelig lengde og kaliber av mansjettene for å unngå vaskulær anastomotisk vridning eller overdreven spenning, noe som kan føre til skade på transplantatet. Denne protokollen beskriver en modifisert teknikk for å utføre heterotopisk cervikal hjertetransplantasjon hos mus som innebærer mansjettplassering på mottakerens felles halspulsåren og donorens lungearterie i samsvar med retningen av blodstrømmen.
Introduction
Abbott og medarbeidere publiserte1 den første beskrivelsen av heterotopisk abdominal hjertetransplantasjon hos rotter i 1964. Disse kirurgiske teknikkene ble raffinert og forenklet av Ono og medarbeidere i 19692. Corry og medarbeidere beskrev først en metode for heterotopisk abdominal hjertetransplantasjon hos mus i 1973; I likhet med de tidligere rapporterte rottemodellene innebar dette innpoding i vertens abdomen med revaskularisering ved ende-til-side anastomoser av donorens lungearterie og stigende aorta til mottakerens nedre vena cava og abdominal aorta, henholdsvis3. Heterotopisk cervikal hjertetransplantasjon hos rotter ble beskrevet av Heron i 1971 ved hjelp av teflonmansjetter laget av 16 G (1,6 mm ytre diameter) intravenøse katetre4. Chen5 og Matsuura et al.6 rapporterte senere heterotopisk cervikal hjertetransplantasjon hos mus i 1991, hvis teknikker hovedsakelig var forskjellige i deres metode for re-anastomose. Chens tilnærming involverte suturerte anastomoser av donorens stigende aorta til halspulsåren til mottakeren og donorens lungearterie til mottakerens ytre jugularis vena5. På grunn av den avanserte tekniske ferdigheten som kreves for disse mikrokirurgiske suturerte anastomosene, var det nødvendig med en betydelig mengde tid og erfaring for å oppnå en høy suksessrate. Matsuura og medarbeidere beskrev en metode som benyttet en ikke-sutur mansjettteknikk, lik den som ble brukt av Heron, som involverte ende-til-ende anastomoser ved hjelp av ekstra-luminal plassering av mansjetter. Han laget teflonmansjetter fra henholdsvis 22 G (0,8 mm ytre diameter) og 24 G (0,67 mm ytre diameter) intravenøse katetre og plasserte dem over mottakerens ytre vena jugularis og arteria carotis communis, henholdsvis6. Disse mansjettene ble deretter plassert inne i donorens lungearterie og aorta og sikret ved å binde en suturligatur rundt forbindelsen. Denne tilnærmingen oversatt til en forbedret suksessrate. Viktigst, det resulterte i en forkortelse av tiden som kreves for å fullføre begge cervikale anastomoser, og dermed redusere den varme iskemiske tiden til transplantatet til mindre enn en tredjedel av det som bruker abdominal sutureringsmetode. Videre, siden mansjettene er plassert rundt fartøyets ytre overflate, er det ingen fremmedlegeme utsatt for fartøyets lumen, noe som i stor grad reduserer muligheten for trombose etter operasjon7. I mellomtiden gir bruk av mansjettteknikken støtte rundt karene på anastomosestedet uten å kreve suturering, noe som reduserer risikoen for blødning etter revaskularisering6.
Tallrike revisjoner av denne teknikken har blitt foreslått. For å imøtekomme den korte lengden på musens felles halspulsåre (ca. 5 mm), utviklet Tomita et al.8 en modifikasjon av denne teknikken med en mindre arteriell mansjett (0,6 mm ytre diameter) mens man utelot å holde suturer og trekke arterien direkte gjennom mansjetten med fine tang i stedet. Wang og medarbeidere forenklet denne tilnærmingen ytterligere ved å plassere henholdsvis 22 G og 24 G mansjetter på donors høyre lungearterie og mottakers høyre arteria carotis communis, henholdsvis9. Ulike rapporter har beskrevet endringer i disse tilnærmingene, inkludert bruk av spesialiserte mansjetter, mikrokirurgiske klemmer, fartøydilatatorer og kardioplegi10,11,12. Spesielt involverer alle disse metodene retrograd blodsirkulasjon gjennom hjertet, med blod som strømmer fra mottakerens felles halspulsåren til donoraorta, koronararteriene, koronar sinus, deretter tømmes inn i høyre atrium og går ut fra lungearterien inn i mottakerens eksterne jugulære vene.
Sammenlignet med engraftment i magen, tilbyr cervikal hjertetransplantasjon flere fordeler. Som tidligere nevnt gir cervikal eksponering raskere revaskularisering og kortere varme iskemiske tider6. Den cervikale metoden er også mindre invasiv og er forbundet med kortere postoperative gjenopprettingstider, da den unngår laparotomi6. Det er viktig at ende-til-ende anastomoser med mansjetter kan utføres i stedet for ende-til-side anastomoser, noe som reduserer risikoen for komplikasjoner som anastomotisk blødning. Abdominal tilnærming gir også økt risiko for å utvikle trombotiske komplikasjoner i abdominal aorta eller dårligere vena cava, noe som fører til ryggmargsiskemi og lammelse av bakbenet. Den overfladiske cervikale plasseringen av transplantasjonen gir enkel tilgang til transplantatets levedyktighetsvurdering ved palpasjon, elektrokardiografi og invasiv eller ikke-invasiv avbildning. Selv om livmorhalstransplantatene gjenopptar spontan hjerteaktivitet etter reperfusjon, påvirker de ikke signifikant mottakerens systoliske og diastoliske parametere. Denne modellen gir verdifull innsikt for å studere cellulære responser etter transplantasjon, for eksempel iskemi-reperfusjonsskade og avstøtning av transplantat. Videre tilbyr denne modellen en ideell tilnærming for å tillate posttransplantasjonsavbildning, for eksempel intravital to-fotonmikroskopi eller positronemisjonstomografi (PET) avbildning. Til dette formål har vårt laboratorium tidligere rapportert metoder for å avbilde bevegelige vev og organer i musen, inkludert bankende murine hjerter og aortabuetransplantater etter heterotopisk cervikaltransplantasjon for å visualisere leukocytthandel under iskemi-reperfusjonsskade og i aterosklerotiske plakk, henholdsvis13,14,15 . I tillegg, på grunn av sin overfladiske plassering og enkle eksponering, er denne modellen egnet for hjertetransplantasjon16.
Denne rapporten beskriver en teknikk som muliggjør laminær blodstrøm med ekstern plassering av vaskulære mansjetter på karene som blodstrømmen stammer fra. Dette muliggjør en jevn overgang av blodstrømmen fra ett fartøy til det neste, og unngår eksponering av den distale karkanten i det vaskulære lumen. I tillegg benytter teknikken en større 20 G mansjett, i stedet for tidligere brukte 22 G mansjetter, for donorlungearterien for å sikre god retur av blodstrøm til mottakeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrehåndteringsprosedyrer ble utført i samsvar med NIH Care and Use of Laboratory Animals retningslinjer og godkjent av Animal Studies Committee ved Washington University School of Medicine. Hjerter fra C57BL/6 (B6) og BALB/c-mus (som veide 20-25 g) ble transplantert til kjønnsmatchede B6-mottakere (6-8 ukers alder). Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se Tabell over materialer). Syngeneiske transplantasjoner ble utført for å evaluere cellulære responser relatert til iskemi-reperfusjonsskade, og allogene transplantasjoner ble utført for å undersøke immunmekanismene involvert i grafttoleranse og avstøtning. B6 lysozym M-grønt fluorescerende protein (LysM-GFP) reporter mus17, opprinnelig hentet fra Klaus Ley fra La Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA, og senere oppdrettet i vårt anlegg, ble brukt som mottakere for utvalgte eksperimenter for å visualisere nøytrofil infiltrasjon i hjertetransplantater. Overlevelseskirurgi ble utført med aseptiske prosedyrer.
1. Prosedyre for givere
- Bedøv musene ved å injisere ketamin (80-100 mg / kg) og xylazin (8-10 mg / kg) (se materialtabell) intraperitonealt i donormusen. Bekreft kirurgisk anestesiplan med tå og haleklemme.
- Forbered det kirurgiske området ved å barbere håret fra brystet og magen ved hjelp av en elektrisk barberhøvel.
- Administrer 100 enheter heparin (se materialtabell) intravenøst i penisvenen (menn) eller ekstern jugularvenen (menn eller kvinner).
- Plasser musene i en liggende stilling med forben over hodet. Fest forbenene og bakbenene med kirurgisk tape og desinfiser huden med tre vekslende skrubber med 0,75% jod og 70% etanol.
- Utfør et snitt, median laparosternotomi, fra navle til sternal vinkel (3-4 cm), etterfulgt av en bilateral toraktomi langs hver kystmargin (2 cm bilateralt). Brett den fremre brystveggen over halsen for full eksponering av mediastinum.
- Excise thymus og utsette intrathoracic inferior vena cava.
- Transekt over bredden av abdominal aorta for exsanguination.
- Ved retrograd perfusjon injiseres 1,5 ml 4 °C saltvann i intratorakal inferior vena cava med kanylen plassert overlegen mot transplantatet, som tidligere beskrevet13.
- Ligate den overlegne vena cava ved hjelp av en 8-0 silke sutur og dele distalt.
- Gjenta retrograd perfusjon ved å injisere ytterligere 1,5 ml 4 °C saltvann via vena cava inferior.
- Ligate den dårligere vena cava ved hjelp av en 8-0 silke sutur og dele distalt.
- Disseker aortabuen og lungearteriestammen for transplantasjonshøsting og transekt begge distalt. Ligate lungevenene på den bakre overflaten av hjertet ved hjelp av en 6-0 silke sutur og dele distalt.
- Utfør klargjøring av transplantat ved å fjerne donorhjertet fra brysthulen. Plasser det utskårne hjertet i en plastbeholder fylt med 4 °C heparinisert saltvann i 1-2 minutter. Overfør transplantatet over på en steril plastflaske fylt med is for plassering av mansjett (figur 1A).
MERK: Hjertetransplantatet må forbli på kolben i ca. 5 minutter for å plassere donorens lungearteriemansjett. - Plasser et 1 mm langt 20 G angiokateter (se Materialtabell) mansjett over lungearterien for donormansjetten. Bruk fin tang, brett forsiktig kantene på arterien tilbake over mansjetten. Fest det brettede karet til mansjetten med et 10-0 nylonbånd, som beskrevet tidligere18 (Figur 1B, C).
- Oppbevar donorhjertet i heparinisert saltvann eller annen konserveringsløsning ved 4 °C.
MERK: Mens noen kanskje foretrekker spesifikke bevaringsløsninger (f.eks. University of Wisconsin-løsningen) for langvarig iskemisk bevaring, kan det være kostbart19. Saltvann kan være et egnet alternativ for korte perioder med iskemi (<1 t)20. Til syvende og sist avhenger valget av bevaringsløsning av det eksperimentelle designet21.
2. Mottakers prosedyre
- Injiser ketamin (80−100 mg/kg) og xylazin (8−10 mg/kg) intraperitonealt i mottakermusen for anestesi. Injiser buprenorfin med vedvarende frisetting (0,5-1,0 mg/kg) subkutant ved analgesi. Bekreft kirurgisk anestesiplan med tå og haleklemme.
- Forbered det kirurgiske området ved å barbere håret fra livmorhalsområdet ved hjelp av en elektrisk barberhøvel. Påfør steril, ikke-medisinert oftalmisk salve til øynene for å forhindre tørking av hornhinnen.
- Plasser dyret i en liggende stilling med forben ved siden av kroppen og hodet vendt litt til venstre. Fest forbenene og bakbenene med kirurgisk tape. Desinfiser huden med tre vekslende skrubber med 0,75% jod og 70% etanol.
- Lag et midtlinje cervical snitt fra nedre mandibel til brystbenet.
- Transekt høyre sternocleidomastoid muskel. Excise høyre lobe av submandibulær kjertel for å skape plass til graftimplantasjon.
- Bind en slipknot over den proksimale ytre jugulære venen ved hjelp av en 6-0 silkesutur. Ligate den distale ytre jugulære venen og tilstøtende grener ved hjelp av en 8-0 silke sutur. Lag et tverrgående snitt over den fremre veggen av den ytre jugulære venen.
- Plasser en 10-0 nylonsutur gjennom kanten av den proksimale ytre jugulære venen og det underliggende vevet for å sikre venen under mansjettinnsetting (figur 1D).
- Prosedere den distale høyre arteria carotis communis ved hjelp av en 8-0 silke sutur bare dårligere enn carotis bifurcation. Bind en slipknot over den proksimale vanlige halspulsåren ved hjelp av en 6-0 silkesutur. Transektere arterien distalt mellom suturene.
- I likhet med donormansjetten, plasser en 0,6 mm lang 24 G angiokatetermansjett over mottakerens høyre arteria carotis communis. Bruk fin tang, brett forsiktig kantene på arterien tilbake over mansjetten. Fest det brettede karet til mansjetten med et 10-0 nylonbånd.
- Plasser donorhjertet bedre enn høyre livmorhalsområde.
- Drypp kaldt saltvann på hjertetransplantatet hvert par minutter under implantasjonen.
- Plasser en 10-0 nylonsutur gjennom kanten av donoraorta og gjennom et overfladisk bitt av det underliggende vevet for å sikre transplantatet på plass (figur 1E).
- Skyll donoraorta med 0,5 ml 0,9% heparinisert saltvann.
- Sett mottakerens felles halspulsåren mansjett inn i donor aorta. Sikre anastomosen med 8-0 silkebånd (figur 1F). Fjern aortaanker suturen.
- Avluft den ytre vena jugularis ved å skylle mottakerens ytre vena jugularis med 0,5 ml 0,9 % heparinisert saltvann.
- Utfør anastomose i lungearterien ved å stikke donor pulmonal arterie mansjetten inn i mottakerens ytre vena jugularis og sikre med en 8-0 silkebånd (figur 1G). Fjern den eksterne jugulære veneankersuturen og transekt den gjenværende bakre veggen av den ytre jugulære venen for å frigjøre transplantatet fra det underliggende vevet. Sørg for at transplantatet er riktig orientert uten kinking eller vridning av anastomosene.
- Slipp slipknutene på mottakerens ytre vena jugularis etterfulgt av arteria carotis communis for å initiere reperfusjon av hjertetransplantat (figur 1H).
- Lukk livmorhalshudinnsnittet ved hjelp av en avbrutt 6-0 nylon sutur.
3. Postoperativ omsorg
- Plasser mottakeren i et varmt gjenopprettingskammer umiddelbart etter operasjonen og overvåk nøye til den er fullstendig gjenopprettet fra anestesi (ca. 1 time).
- Fortsett å overvåke dyret nøye (hver 6-8 timer) i minst 72 timer etter operasjonen for tegn på unormal oppførsel, som sløvhet, risting, rask pust eller anoreksi.
- For smertekontroll, injiser karprofen (5 mg / kg) subkutant hver 8-12 timer for analgesi, i tillegg til subkutan buprenorfin (0,05 mg / kg) hver 8-12 timer i 24-48 timer fra slutten av operasjonen.
4. Intravital to-foton avbildning av leukocytthandel i hjertetransplantatet
- Injiser ketamin (80-100 mg/kg) og xylazin (8-10 mg/kg) intraperitonealt inn i en B6 LysM-GFP mottakermus17 2 timer etter transplantatreperfusjon for anestesi.
- Utfør orotrakeal intubasjon ved hjelp av et 20 G angiokateter, som tidligere beskrevet18.
- Koble angiokateteret til slangen fra en mekanisk museventilator og ventiler med romluft med en hastighet på 120 pust/min og et tidevannsvolum på 0,5 ml18.
- Injiser 12 μL av 655 nm ikke-målrettede kvanteprikker (se tabell over materialer), suspendert i 50 μL PBS intravenøst, som beskrevet tidligere13.
- Åpne nakkesnittet igjen for å eksponere hjertetransplantatet. Plasser musen i et stabiliseringskammer.
- Fest en del av den frie veggen i venstre ventrikel ved hjelp av en tynn ring av vevslim (se Materialtabell), påført et glassdeksel festet til den øvre kammerplaten.
- Plasser kammeret under to-foton mikroskop målet å skaffe bilder og videoer, som beskrevet tidligere13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne mus cervical heterotopiske hjertetransplantasjonsmodellen har blitt brukt til å utføre over 1000 transplantasjoner i vårt laboratorium, med en overlevelsesrate på ca. 97%. Suksessraten er litt høyere enn tidligere rapporter ved bruk av andre cervical heterotopic hjertetransplantasjonsteknikker hos mus10,11,20. Dette kan potensielt tilskrives den større 20 G-mansjetten plassert på donorlungearterien for å sikre god retur av blodstrøm til mottakeren (figur 1B, C). I tillegg minimerer justeringen av blodstrømmen med mansjettplassering i den nåværende teknikken risikoen for trombose og anastomotisk turbulens (figur 1,2). Mens magnetisk resonansavbildning (MR) eller ultralyd kan vurdere turbulensen av transplantatperfusjon22,23, har vi ennå ikke brukt disse teknikkene i forsøkene. Intraoperativ død ved hjelp av denne teknikken er sjelden for erfarne mikrokirurger. Postoperativ dødelighet skyldes oftest blødningskomplikasjoner. Gjennomsnittlig mottakeroperasjonstid var 36,5 ± 3,5 min, med en gjennomsnittlig kald iskemitid på 20 min. For overlevelsesstudier ble hjertetransplantater vurdert daglig ved direkte visualisering og digital palpasjon av hjerterytmen. Mus blir vanligvis ofret for transplantatevaluering rundt 7-14 dager postoperativt. Intravital to-fotonavbildning er en terminal prosedyre som vanligvis utføres tidlig etter transplantasjon for å evaluere leukocytthandel (figur 3).
De fleste syngeneiske transplantasjoner opprettholdt sterke hjerteslag til ofre, opptil 6 måneder etter transplantasjon. Ved grov inspeksjon fremsto de fleste syngeneiske transplantater som normale, og histologisk undersøkelse viste ingen holdepunkter for avvisning. Alle ikke-immunsupprimerte allogene transplantasjoner (BALB/c til B6) utviklet redusert hjerterytme innen 1-2 uker etter transplantasjon. Utskårne allogene transplantater fra slike mus var grovt utvidet, og histologisk undersøkelse viste diffus infiltrasjon av lymfocytter og områder med myokardnekrose.
Figur 1: Tilberedning av hjertetransplantat for transplantasjon . (A) Hjertet er skåret ut fra donormusen. (B,C) Stammen i lungearterien er eksponert og trukket gjennom en 20 G mansjett, brettet tilbake og sikret med en 10-0 nylonsutur. (D) En 10-0 nylonsutur plasseres gjennom kanten av mottakerens ytre jugulære vene og festes til underliggende vev. (E) En 10-0 nylon sutur er plassert gjennom kanten av donor aorta og festet til underliggende vev ved siden av mottakeren halspulsåren. (F) Mottakerens felles halspulsåremansjett settes inn i donoraorta og festes med 8-0 silke sutur. (G) Donorlungearteriemansjetten settes inn i mottakerens ytre vena jugularis og festes med 8-0 silke sutur. (H) Proksimal slipknot på mottakerens ytre vena jugularis frigjøres, etterfulgt av frigjøring av halspulsåreslipp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Intraoperativt syn på hjertetransplantat. En 1 mm 20 G mansjett trekkes over donors lungearterie og festes med 10-0 nylonslips. En 0,6 mm 24 G mansjett trekkes over mottakerens høyre arteria carotis communis og festes med 10-0 nylonslips. Ankersuturer (10-0 nylon) plasseres i veggen av donoraorta og mottakerens høyre ytre jugulære vene og festes til underliggende vev for å hindre bevegelse under mansjettinnsetting. (AO = aorta, PA = lungearterien, CCA = arteria carotis communis, EJV = vena jugularis ekstern). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Intravital to-foton avbildning av leukocyttdynamikk i hjertetransplantatet. Intravital to-foton avbildning av bankende hjerte transplantert fra B6 mus til B6 LysM-GFP mottaker demonstrerer handel med mottaker nøytrofiler inn i hjertetransplantatvevet mellom 2-3 timer postoperativt. (Grønn = nøytrofiler, rød = kar merket med kvanteprikker). Skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komplikasjon | Mulige årsaker | Løsninger |
| Mottakers død | Hypotermi | Varmepute |
| Dehydrering | 0,9 % saltvann i.p. postoperativt | |
| Dårlig transplantatperfusjon | Torsjon av halspulsåren | Re-anastomose, eller |
| Trombus eller luftemboli | Åpne arteriell anastomose og skyll med heparinisert saltvann | |
| Venøs obstruksjon | Trombus eller luftemboli | Re-anastomose, eller |
| Åpen venøs anastomose og flush med heparinisert saltvann | ||
| Postoperativ blødning | Blødende jugulære venegrener | Ligate jugular vene grener |
| Bomullspinne kompresjon | ||
| Løse mansjetter | Stram mansjetter | |
| Svak hjerterytme | Kaldt hjertetransplantat | Drypp varmt saltvann på overflaten av hjertet |
| Pode vridning | Feil podeposisjon | Sørg for at transplantatet er riktig orientert før huden lukkes |
| Uberegnelig aktivitet (f.eks. løping i sirkler) | Cerebral iskemi | Ligate felles halspulsåren dårligere enn carotis bifurcation |
Tabell 1: Feilsøking for komplikasjoner. Vanlige komplikasjoner med løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av denne teknikken kan mus heterotopisk cervikal hjertetransplantasjon utføres på mindre enn 40 minutter av en erfaren mikrokirurg og på omtrent 60 minutter av en mikrokirurg på inngangsnivå. Mens cervikal hjertetransplantasjon har blitt studert i mange dyremodeller, forblir en musemodell gullstandarden på grunn av flere veldefinerte genetiske stammer, genetiske endringsevner og tilgjengeligheten av mange reagenser, inkludert monoklonale antistoffer24. Teknikken beskrevet her gir en unik mulighet for overvåking etter transplantasjon, for eksempel elektrokardiografi eller intravital avbildning, inkludert to-fotonmikroskopi (figur 3) eller seriell ikke-invasiv PET-avbildning13,14,15,25. Denne metoden gir en overfladisk plassering for hjertetransplantatet som er lettere å stabilisere for intravital avbildning, og unngår dermed kompleksiteten som er forbundet med buktransplantasjonsmetoden på grunn av den dypere plasseringen av transplantatet og de omkringliggende bukorganene. Videre er denne teknikken spesielt nyttig i sammenheng med retransplantasjon. Retransplantasjonsmodeller representerer kraftige verktøy for å identifisere bosatte celler i transplanterte hjertetransplantater som formidler alloimmune responser. Mens vi tidligere har brukt denne teknikken i en musehjertetransplantasjonsmodell for å vurdere kortsiktige resultater, kan denne tilnærmingen utvides i fremtidige eksperimenter for å utforske langsiktige utfall16. Til dette formål har de nåværende undersøkelsene hittil benyttet en kort periode med kald iskemi (ca. 20 min). Fremtidige studier kan undersøke effekten av langvarig kald eller varm iskemi på kort- og langsiktige utfall for å etterligne klinisk transplantasjon nærmere.
Flere kritiske trinn i denne teknikken må vurderes. Tidligere metoder innebærer mansjettinnsetting på den mindre ytre jugulære venen i den store lumen i donorlungearterien 6,8. Plasseringen av den større mansjetten på donorlungearterien for å etablere riktig orientering med blodstrømmen gjør det litt vanskeligere å sette mansjetten inn i den mindre ytre jugulære venen. Feste kanten av venen til det underliggende vevet og bare delvis innsnevring av venens fremre vegg letter mansjettinnsettingen. I tillegg kan mansjettplassering på mottakerens felles halspulsåre være ganske utfordrende på grunn av fartøyets lille kaliber. Som sådan har tidligere teknikker rapportert bruken av mindre mansjetter (f.eks. 26 G) for denne anastomosen12. Imidlertid bruker den nåværende tilnærmingen en større 24 G mansjett for å sikre tilstrekkelig transplantatperfusjon, som vi tror kan gi noen overlevelsesfordeler. Å velge større mottakermus kan hjelpe nybegynnere mikrokirurger. Ankersuturer fjernes etter reperfusjon, og transplantatet er ikke festet i riktig retning som andre har beskrevet3. Det er derfor viktig å kontrollere at transplantatet er riktig plassert og orientert før cervikal hudlukking for å hindre vridning eller vridning (tab 1). Eksisjon av høyre submandibulær kjertel utføres for å gi tilstrekkelig plass til hjertetransplantatet, og dermed unngå transplantatkompresjon etter hudlukking.
Modellen beskrevet her gir flere fordeler. Ved å plassere mansjettene på donor lungearterien stammen og mottakerens felles halspulsåren, justerer mansjetten orientering med retningen av blodstrømmen. Dette reduserer sannsynligheten for turbulent strømning og trombusdannelse. For det andre benyttes en større 20 G lungearteriemansjett for å sikre god retur av blodstrømmen til mottakeren. For det tredje plasseres en større 24 G mansjett på halspulsåren for å sikre tilstrekkelig perfusjon av transplantatet. Til slutt brukes 10-0 nylonankersuturer for å feste transplantatet til underliggende vev og lette mansjettinnsetting. Disse modifikasjonene bidrar til å overvinne de tekniske utfordringene i prosedyren, forhindre anastomotisk turbulens og redusere postoperative komplikasjoner som trombusdannelse.
En viktig begrensning av alle musehjertetransplantasjonsmodeller er at fysiologisk blodstrøm ikke gjenopprettes gjennom hjertets kamre. I stedet er disse modellene avhengige av sirkulasjon gjennom koronarbeinene. Konsekvensene av dette retrograde strømningsmønsteret på transplantatets cellulære skade og immunresponser er ikke klart avgrenset; Det er imidlertid mulig at mekaniske skjærkrefter som følge av denne ikke-fysiologiske sirkulasjonen påvirker immunresponsene. En kirurgisk modell for hjertetransplantasjon hos mus som gjenoppretter fysiologisk blodstrøm, er ennå ikke utviklet og vil kreve betydelige tekniske fremskritt. Det observeres at en liten andel mus (<3%) opplever forbigående uberegnelig oppførsel (f.eks. Kjører i sirkler) etter prosedyren. Denne oppførselen varer i omtrent 1-2 timer før oppløsning. Gitt at denne oppførselen ikke observeres etter andre prosedyrer ved bruk av samme bedøvelsesregime, kan det være relatert til forbigående cerebral iskemi på grunn av blodstrømsendringer etter cervikal hjertetransplantasjon. Full gjenoppretting har skjedd hos alle mus uten at det er observert kroniske underskudd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
DK støttes av National Institutes of Health tilskudd 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, Veterans Administration Merit Review grant 1I01BX002730, og The Foundation for Barnes-Jewish Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
| Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
| Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
| Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
| Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
References
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. The Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Section A Pathology. 79 (4), 366-372 (1971).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52 (6), 1099-1101 (1991).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
- Yu, Y., et al. Cuff anastomosis of both renal artery and vein to minimize thrombosis: a novel method of kidney transplantation in mice. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 56-60 (2022).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64 (11), 1598-1601 (1997).
- Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. 25 (1), 76-79 (2005).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).
- Ratschiller, T., et al. Heterotopic cervical heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
- Mao, X., Xian, P., You, H., Huang, G., Li, J. A modified cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (180), e63504 (2022).
- Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2499-2508 (2012).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (5), 1030-1036 (2018).
- Li, W., et al. Lung transplant acceptance is facilitated by early events in the graft and is associated with lymphoid neogenesis. Mucosal Immunology. 5 (5), 544-554 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513 (2019).
- Ma, Y., et al. Optimization of the cuff technique for murine heart transplantation. Journal of Visualized Experiments. (160), e61103 (2020).
- Latchana, N., Peck, J. R., Whitson, B., Black, S. M. Preservation solutions for cardiac and pulmonary donor grafts: a review of the current literature. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1143-1149 (2014).
- Hartley, C. J., et al. Doppler velocity measurements from large and small arteries of mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), 269-278 (2011).
- Bovenkamp, P. R., et al. Velocity mapping of the aortic flow at 9.4 T in healthy mice and mice with induced heart failure using time-resolved three-dimensional phase-contrast MRI (4D PC MRI). MAGMA. 28 (4), 315-327 (2015).
- Wang, H. Small animal models of xenotransplantation. Methods in Molecular Biology. 885, 125-153 (2012).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
