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Biology

केनोरहाब्डिस एलिगेंस में दीर्घायु और जीन ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए लिपिड पूरकता

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64092
Automatic Translation
*1,2, 2,3,4, 2,4,5, *2
1Graduate Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 3Integrative Program of Molecular and Biochemical Sciences, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल केनोरहाब्डिस एलिगेंस के लिए तरल और ऑन-प्लेट संस्कृतियों में लिपिड पूरक विधियों का वर्णन करता है, जो थोक या कुछ कीड़े और कृमि ऊतकों से अनुदैर्ध्य अध्ययन और जीन ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के साथ युग्मित है।

Abstract

उम्र बढ़ने एक जटिल प्रक्रिया है जो पर्यावरण और आनुवंशिक योगदान दोनों के परिणामस्वरूप प्रगतिशील शारीरिक परिवर्तनों की विशेषता है। लिपिड कोशिका झिल्ली के संरचनात्मक घटकों के गठन, ऊर्जा भंडारण और सिग्नलिंग अणुओं के रूप में महत्वपूर्ण हैं। लिपिड चयापचय और सिग्नलिंग का विनियमन अलग-अलग दीर्घायु मार्गों को सक्रिय करने के लिए आवश्यक है। राउंडवर्म केनोरहाब्डिस एलिगेंस एक उत्कृष्ट और शक्तिशाली जीव है जो दीर्घायु विनियमन में लिपिड चयापचय और सिग्नलिंग के योगदान को विच्छेदित करता है। कई शोध अध्ययनों ने वर्णन किया है कि विशिष्ट लिपिड अणुओं के आहार पूरक सी एलिगेंस जीवनकाल का विस्तार कैसे कर सकते हैं; हालांकि, पूरक स्थितियों में मामूली अंतर विभिन्न प्रयोगशालाओं में वैज्ञानिकों के बीच प्रजनन क्षमता के मुद्दों का कारण बन सकता है। एलिगेंस के लिए दो विस्तृत पूरक विधियों को लिपिड पूरकता का उपयोग करने की सूचना दी गई है या तो प्लेटों पर बीजित बैक्टीरिया या तरल संस्कृति में जीवाणु निलंबन के साथ। यहां आजीवन लिपिड पूरकता और क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण के साथ जीवनकाल परख करने के लिए विवरण भी दिए गए हैं, जो कुछ कीड़े से प्राप्त पूरे कीड़े लाइसेट या विच्छेदित ऊतकों का उपयोग करते हैं। लिपिड पूरकता पर अनुदैर्ध्य अध्ययन और ट्रांसक्रिप्शनल जांच के संयोजन का उपयोग करते हुए, फीडिंग परख यह विच्छेदन करने के लिए भरोसेमंद दृष्टिकोण प्रदान करते हैं कि लिपिड दीर्घायु और स्वस्थ उम्र बढ़ने को कैसे प्रभावित करते हैं। इस पद्धति को विभिन्न पोषण संबंधी स्क्रीनिंग दृष्टिकोणों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है ताकि या तो विच्छेदित ऊतकों या कुछ जानवरों की एक छोटी संख्या का उपयोग करके प्रतिलिपियों के उप-समूह में परिवर्तन का आकलन किया जा सके।

Introduction

लिपिड
लिपिड कार्बनिक सॉल्वैंट्स में घुलनशील छोटे हाइड्रोफोबिक या एम्फीपैथिक अणु होते हैं लेकिन पानी में अघुलनशीलहोते हैं 1,2. अलग-अलग लिपिड अणु अपनी श्रृंखलाओं, स्थान, डबल बॉन्ड की संख्या और ग्लिसरॉल या फॉस्फेट सहित बाध्य संरचनाओं में निहित कार्बन की संख्या के आधार पर एक दूसरे से अंतर करते हैं। लिपिड जीव कार्यों को विनियमित करने के लिए अलग-अलग कोशिकाओं के भीतर और बाहर महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जिसमें झिल्ली बाइलेयर का गठन करना, ऊर्जा भंडारण प्रदान करना और सिग्नलिंगअणुओं के रूप में कार्य करना शामिल है।

सबसे पहले, लिपिड जैविक झिल्ली के संरचनात्मक घटक हैं, जिनमें प्लाज्मा झिल्ली और इंट्रासेल्युलर उपकोशिकीय झिल्ली शामिल हैं जो आंतरिक डिब्बों को बाह्य वातावरण से विभाजित करते हैं। दूसरा, लिपिड कशेरुक और अकशेरुकी जानवरों में ऊर्जा भंडारण का प्रमुख रूप है। ट्राइसिलेग्लिसरॉल सहित तटस्थ लिपिड, वसा ऊतक सहित विभिन्न ऊतकों में एक विस्तारित अवधि के लिए संग्रहीत होते हैं। निमेटोड केनोरहाबिटिस एलिगेंस में, आंत प्रमुख चयापचय वसा भंडारण अंग है; इसका कार्य न केवल पाचन और पोषक तत्वों के अवशोषण में शामिल है, बल्कि विषहरण की प्रक्रिया में भी है, जो स्तनधारी हेपेटोसाइट्स की गतिविधि जैसा दिखता है। अन्य वसा भंडारण ऊतकों में जर्मलाइन शामिल है, जिसमें लिपिड अंडाणुओं के विकास के लिए आवश्यक हैं, और हाइपोडर्मिस, जो त्वचा जैसी एपिडर्मल कोशिकाओं से बना है 3,5. तीसरा, हाल के वर्षों में, अधिक सबूतों ने सुझाव दिया है कि लिपिड विभिन्न प्रकार के रिसेप्टर्स पर सीधे कार्य करके इंट्रा- और बाह्य सिग्नलिंग में शामिल शक्तिशाली सिग्नलिंग अणु हैं, जिनमें जी प्रोटीन-युग्मित और परमाणु रिसेप्टर्स शामिल हैं, या अप्रत्यक्ष रूप से झिल्ली तरलता मॉड्यूलेशन या पोस्ट-ट्रांसलेशनलसंशोधनों के माध्यम से 6,7,8,9 . आगे के अध्ययन दीर्घायु और स्वास्थ्य को बढ़ावा देने में लिपिड सिग्नलिंग के अंतर्निहित आणविक तंत्र को स्पष्ट करना जारी रखेंगे।

मॉडल जीव विशिष्ट जैविक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं जो मनुष्यों में अध्ययन करने के लिए बहुत जटिल हैं। उदाहरण के लिए, राउंडवर्म सी एलिगेंस मानव पोषण और रोग10 के लिए प्रासंगिक जैविक प्रक्रियाओं को विच्छेदित करने के लिए आनुवंशिक विश्लेषण करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। मानव शरीर विज्ञान, जटिल ऊतकों, व्यवहार पैटर्न और प्रचुर मात्रा में आनुवंशिक हेरफेर उपकरणों के लिए प्रासंगिक अत्यधिक संरक्षित आणविक मार्ग सी एलिगेंस को एक उल्लेखनीयमॉडल जीव बनाते हैं। उदाहरण के लिए, सी एलिगेंस फेनोटाइप-विशिष्ट जीन की पहचान करने के लिए आनुवंशिक स्क्रीन को अग्रेषित करने में उत्कृष्ट है, साथ ही आरएनए हस्तक्षेप12 के माध्यम से जीनोम-वाइड रिवर्स जेनेटिक स्क्रीन में भी।

प्रयोगशालाओं में, नेमाटोड को एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया के लॉन के साथ बीजित आगर पेट्री प्लेटों पर उगाया जाता है, जो प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट और संतृप्त और असंतृप्त फैटी एसिड जैसे मैक्रोन्यूट्रिएंट्स को ऊर्जा और बिल्डिंग ब्लॉक के स्रोतों के रूप में प्रदान करता है, और सूक्ष्म पोषक तत्व जैसे सह-कारक और विटामिन13। स्तनधारियों के समान, नेमाटोड पामिटिक एसिड और स्टीयरिक एसिड (संतृप्त 16-कार्बन और 18-कार्बन अणु, क्रमशः) दोनों से फैटी एसिड अणुओं को संश्लेषित करते हैं जो क्रमिक रूप से विघटित होते हैं और विभिन्न प्रकार के मोनो-असंतृप्त फैटी एसिड (एमयूएफए) और पॉली-असंतृप्त फैटी एसिड (पीयूएफए) 14,15,16,17,18 तक बढ़ते हैं। एलिगेंस फैटी एसिड जैवसंश्लेषण, डिसैचुरेशन और बढ़ाव में शामिल सभी आवश्यक फैटी एसिड और कोर एंजाइमों के नए संश्लेषण में सक्षम है, जो लंबी श्रृंखला पीयूएफए19 के संश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। अन्य पशु प्रजातियों से अलग, सी एलिगेंस 18-कार्बन और 20-कार्बन -6 फैटी एसिड को अपने स्वयं के 3 डेसाटुरेज एंजाइमों के साथ -3 फैटी एसिड में परिवर्तित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, कीड़े में एक ए12 डेसैचुरेज होता है जो ओलिक एसिड (ओए, 18: 1) 20,21 से लिनोलिक एसिड (एलए) के गठन को उत्प्रेरित करता है। अधिकांश जानवरों या पौधों में 12 और 3 -3 डेसैचुरेस दोनों की कमी होती है और इस प्रकार वे अपने पीयूएफए प्राप्त करने के लिए 1 -6 और 3 के आहार सेवन पर भरोसा करते हैं, जबकि सी एलिगेंस को आहार फैटी एसिड22 की आवश्यकता नहीं होती है। कार्यात्मक डेसैचुरेज एंजाइमों की कमी वाले पृथक उत्परिवर्ती का उपयोग प्रजनन, विकास, दीर्घायु और न्यूरोट्रांसमिशन सहित अलग-अलग जैविक प्रक्रियाओं में विशिष्ट फैटी एसिड के कार्यों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। विशिष्ट जैविक मार्गों पर व्यक्तिगत फैटी एसिड के प्रभाव को आनुवंशिक दृष्टिकोण और आहारपूरकता 16,17,23 दोनों का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है। आज तक, लिपिड अनुसंधान ने न्यूरोलॉजिकल और विकासात्मक स्थितियों में लिपिड संश्लेषण, गिरावट, भंडारण और टूटने में शामिल जीन को चिह्नित करने पर ध्यान केंद्रितकिया है। हालांकि, दीर्घायु विनियमन में लिपिड की भूमिका अभी प्रकट होने लगी है।

दीर्घायु विनियमन में लिपिड सिग्नलिंग
लिपिड अलग-अलग ऊतकों और सेल प्रकारों में सेलुलर सिग्नलिंग कैस्केड को सक्रिय करके दीर्घायु विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हाल के अध्ययनों ने लिपिड-बाइंडिंग प्रोटीन या झिल्ली रिसेप्टर्स25 की मान्यता के माध्यम से प्रतिलेखन और सेल-सेल संचार को संशोधित करने में लिपिड की सक्रिय भूमिकाओं पर प्रकाश डाला है। इसके अतिरिक्त, आहार लिपिड पूरकता यह विच्छेदन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करती है कि लिपिड चयापचय सी एलिगेंस में जीवनकाल को कैसे प्रभावित करता है। प्रतिलेखनकारक26,27 को सक्रिय करके दीर्घायु को बढ़ावा देने के लिए अलग-अलग एमयूएफए और पीयूएफए दिखाए गए हैं।

इंसुलिन / आईजीएफ -1 सिग्नलिंग और जर्मलाइन अग्रदूत कोशिकाओं के पृथक्करण सहित दीर्घायु मॉडल, एमयूएफए जैवसंश्लेषण मार्ग से जुड़े हैं, और एमयूएफए पूरकता, जिसमें ओलिक एसिड, पामिटोलिक एसिड और सीआईएस-वैकेनिक शामिल हैं, सी एलिगेंस जीवनकाल26 का विस्तार करने के लिए पर्याप्त है। यद्यपि एमयूएफए प्रशासन द्वारा प्रदान किए गए दीर्घायु प्रभाव को आगे की जांच की आवश्यकता होती है, अंतर्निहित तंत्र को एसकेएन -1 / एनआरएफ 2 प्रतिलेखन कारक द्वारा मध्यस्थ होने की संभावना है, जो ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया और दीर्घायु विनियमन28,29 का एक प्रमुख उत्प्रेरक है। एमयूएफए के बीच, एन-एसिलेथेनॉलमाइन (एनएई) नामक फैटी एसाइल इथेनॉलएमाइड्स का एक विशेष वर्ग सूजन, एलर्जी, सीखने, स्मृति और ऊर्जा चयापचय सहित अलग-अलग तंत्रों में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाता है। विशेष रूप से, लिपिड अणु जिसे ओलेयलेथेनॉलमाइड (ओईए) के रूप में जाना जाता है, को परमाणु हार्मोन रिसेप्टर्स एनएचआर -49 और एनएचआर -80 7 को सक्रिय करने के लिए नाभिक में लिपिड-बाइंडिंग प्रोटीन 8 (एलबीपी -8) के स्थानांतरण को बढ़ावा देकर दीर्घायु के सकारात्मक नियामक के रूप में पहचाना गयाहै। ओईए एनालॉग केडीएस -5104 का पूरक जीवनकाल का विस्तार करने के लिए पर्याप्त है, और ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रियाओं और माइटोकॉन्ड्रियल β-ऑक्सीकरण 7,8 में शामिल जीनकी अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है।

इसी समय, पीयूएफए की भूमिका को दीर्घायु विनियमन से भी जोड़ा गया है। पीयूएफए -3 फैटी एसिड α-लिनोलेनिक एसिड (एएलए) का प्रशासन एनएचआर -49 / पीपीएआर, एसकेएन -1 / एनआरएफ प्रतिलेखन कारकों को सक्रिय करके और माइटोकॉन्ड्रियल β-ऑक्सीकरण31 को प्रेरित करके दीर्घायु को बढ़ावा देता है। दिलचस्प बात यह है कि एएलए के पेरोक्सीडेटेड उत्पाद, जिन्हें ऑक्सीलिपिन के रूप में जाना जाता है, एसकेएन -1 / एनआरएफ को सक्रिय करते हैं, यह सुझाव देते हुए कि पीयूएफए और उनके ऑक्सीडेटिव डेरिवेटिव दोनों दीर्घायु लाभ प्रदान करसकते हैं। ए -6 फैटी एसिड एराकिडोनिक एसिड (एए) और डिहोमो-γ-लिनोलेनिक एसिड (डीजीएलए) के पूरक ऑटोफैगी सक्रियण के माध्यम से जीवनकाल बढ़ाते हैं, प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण को बढ़ावा देते हैं और इसके परिणामस्वरूप बर्बाद और विषाक्त प्रोटीन समुच्चय27,32 का क्षरण होता है। हाल ही में, लिपिड-बाइंडिंग प्रोटीन 3 (एलबीपी -3) और डीजीएलए द्वारा मध्यस्थ एक सेल-गैर-स्वायत्त सिग्नलिंग विनियमन को न्यूरॉन्स को परिधीय संकेत भेजकर दीर्घायु को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है, जो प्रणालीगत स्तर33 पर अंतर-ऊतक संचार में लिपिड अणुओं की लंबी दूरी की भूमिका का सुझाव देता है। वर्तमान अध्ययन तरल संस्कृति में प्लेटों या जीवाणु निलंबन पर बीजित बैक्टीरिया के साथ लिपिड पूरक करने के लिए प्रत्येक चरण की रिपोर्ट करता है। इन पद्धतियों का उपयोग जीवनकाल और ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण का आकलन करने के लिए किया जाता है, जो पूरे शरीर की सामग्री या कुछ कीड़े से प्राप्त विच्छेदित ऊतकों को नियोजित करता है। निम्नलिखित तकनीकों को विभिन्न प्रकार के पोषण संबंधी अध्ययनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और यह विच्छेदन करने के लिए एक वैध उपकरण प्रदान करता है कि लिपिड चयापचय दीर्घायु और स्वस्थ उम्र बढ़ने को कैसे प्रभावित करता है।

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Protocol

चित्रा 1 विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स का उपयोग करके लिपिड फीडिंग के एक योजनाबद्ध को दर्शाता है।

1. लिपिड-वातानुकूलित बैक्टीरिया की तैयारी

  1. 999 एमएल विआयनीकृत पानी में 5.85 ग्राम एनएसीएल, 1.0 ग्राम के के2एचपीओ4, और 6.0 ग्राम केएच2पीओ4 ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करके बैक्टीरियल तनुकरण आहार प्रतिबंध (बीडीआर) बेस समाधान तैयार करें। पीएच को 0.5 M KOH के साथ 6.0 में समायोजित करें, और फिर 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    नोट: बीडीआर समाधान को लंबी अवधि के भंडारण के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. बीडीआर बेस समाधान के प्रत्येक 10 एमएल में 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल (200-प्रूफ इथेनॉल में घुलित) के 10 μL जोड़कर बीडीआर माध्यम तैयार करें।
  3. ओपी 50 बैक्टीरिया ( सामग्री की तालिका देखें) को -80 डिग्री सेल्सियस स्टॉक से एलबी-एगर प्लेटों तक खींचें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद, ओपी 50 प्लेट को स्थिर भोजन परिणामों के लिए 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. ओपी 50 एलबी-एगर प्लेट से एलबी माध्यम में ओपी 50 बैक्टीरिया को टीका लगाएं और रात भर (16 घंटे) 37 डिग्री सेल्सियस शेकर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: आवश्यक एलबी मध्यम वॉल्यूम प्रयोगात्मक सेटिंग्स पर निर्भर करता है। 6 सेमी प्लेटों में से प्रत्येक पर बीजित 5x केंद्रित बैक्टीरिया के 200 μL और 10 सेमी प्लेटों में से प्रत्येक के लिए 5x केंद्रित बैक्टीरिया के 1 एमएल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है और तरल भोजन की स्थिति की प्रत्येक प्रतिकृति। इस प्रकार, प्रत्येक लिपिड-फीडिंग कल्चर के लिए क्रमशः 1 एमएल और 5 एमएल प्रारंभिक एलबी टीकाकरण तैयार किया जाना चाहिए।
  5. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बैक्टीरिया एकत्र करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
  6. बीडीआर बेस के 20 एमएल में बैक्टीरियल पेलेट को निलंबित करें, और 10 मिनट के लिए 4,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    नोट: बैक्टीरियल पेलेट में एलबी के बचे हुए अवशेषों को धोने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है।
  7. 20x BDR बैक्टीरिया स्टॉक बनाने के लिए BDR माध्यम में प्रत्येक जीवाणु गोली को निलंबित करें। उपयोग से पहले बीडीआर माध्यम के साथ 20x BDR बैक्टीरिया स्टॉक को 5x तक पतला करें।
    नोट: बैक्टीरिया के लिए 20x एकाग्रता तक पहुंचने के लिए मूल एलबी वॉल्यूम के बीडीआर माध्यम की 1/20 मात्रा का उपयोग करें। 20x बैक्टीरिया स्टॉक को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. एक नए आटोक्लेव ग्लास शीशी में विलायक के रूप में इथेनॉल या डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) का उपयोग करके एक लिपिड स्टॉक समाधान तैयार करें, और ऑक्सीकरण को रोकने के लिए ग्लास शीशी को आर्गन या नाइट्रोजन से भरें।
    नोट: स्टॉक समाधान एकाग्रता आमतौर पर 250 mM और 1 mM के बीच होती है।
  9. फीडिंग स्थितियों में वांछित अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए लिपिड स्टॉक समाधान को बीडीआर बैक्टीरिया समाधान की वांछित मात्रा में स्थानांतरित करें। 20 सेकंड के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: लिपिड और परीक्षण स्थितियों के आधार पर, भोजन में लिपिड की अंतिम एकाग्रता आमतौर पर 1 μM से 1 mM होती है। नए लिपिड के साथ काम करते समय 0.1 μM से 1 mM तक विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करने के लिए पहले एक पायलट प्रयोग चलाने की सिफारिश की जाती है। लिपिड स्टॉक समाधान को प्लेट पर बीज देने या तरल कृमि संस्कृतियों में डालने से पहले बीडीआर बैक्टीरिया के साथ मिलाएं। कीड़े को खिलाने से पहले लिपिड-वातानुकूलित बैक्टीरिया को 1 घंटे से अधिक समय तक तैयार न करें।
  10. वाहन नियंत्रण के रूप में काम करने के लिए बीडीआर बैक्टीरिया के साथ फ़िल्टर किए गए इथेनॉल या डीएमएसओ (लिपिड फीडिंग समूह के लिए उपयोग किए जाने वाले आधार पर) की समान मात्रा मिलाएं।

2. लिपिड पूरकता के लिए सिंक्रनाइज़ सी एलिगेंस की तैयारी

  1. (निर्दिष्ट अंतिम सांद्रता का उपयोग करके) 22 mM KH 2 PO4,22mM Na2HPO4, 85 mM NaCl, और 2 mM MgSO4 को मिलाकर M9 बफर तैयार करें (सामग्री की तालिका देखें)। बफ़र को निष्फल करने के लिए ऑटोक्लेव करें।
  2. 60% घर ब्लीच (v/v, सामग्री की तालिका देखें) और 1.6 M NaOH की अंतिम एकाग्रता के साथ एक ताजा ब्लीच समाधान तैयार करें।
  3. एम 9 बफर के 10 एमएल का उपयोग करके 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ग्रेविड वयस्कों को इकट्ठा करें।
    नोट: सिंक्रनाइज़ेशन के लिए आवश्यक कीड़े और प्लेटों की संख्या प्रयोगात्मक सेटिंग्स (यानी, शर्तों और प्रतिकृतियों और खिलाने के तरीकों की संख्या) पर निर्भर करती है। आदर्श रूप से, वयस्क कीड़े की प्रत्येक पूर्ण 6 सेमी प्लेट सिंक्रनाइज़ेशन के बाद कम से कम 600 एल 1 कीड़े पैदा करने में सक्षम होनी चाहिए।
  4. कीड़े को 30 सेकंड के लिए 1,450 x g पर घुमाएं। सतह पर तैरने वाला निकालें और 10 एमएल एम 9 बफर के साथ कीड़े को एक बार और कुल्ला करें।
  5. कीड़े को 30 सेकंड के लिए 1,450 x g पर घुमाएं। शंक्वाकार ट्यूब में 4 एमएल एलिकोट छोड़ते हुए, सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। 2 मिलीलीटर ब्लीच घोल जोड़ें और 1 मिनट के लिए जोर से हिलाएं।
  6. कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 1,450 x g पर कीड़े को घुमाएं।
  7. सतह पर तैरने वाला निकालें और 4 एमएल एम 9 बफर और 2 एमएल ब्लीच समाधान जोड़ें। ट्यूब को तब तक हिलाएं जब तक कि कीड़े के शरीर घुल न जाएं।
  8. कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए अंडे को 1,450 x g पर घुमाएं।
  9. सतह पर तैरने वाला निकालें और अंडे को 10 एमएल एम 9 बफर के साथ धो लें।
  10. चरण 2.8 और 2.9 3x दोहराएँ।
  11. एम 9 बफर के 6 एमएल के साथ भ्रूण को निलंबित करें। भ्रूण को 2 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर घुमाने वाले पर रॉक करें ताकि उन्हें हैच और सिंक्रनाइज़ किया जा सके।
  12. एल 1 लार्वा को ओपी 50 बीज वाली प्लेटों में स्थानांतरित करें। सिंक्रनाइज़ किए गए एल 4 कीड़े इकट्ठा करने के लिए 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, दिन -1 वयस्कों के लिए 72 घंटे और दिन -2 वयस्कों के लिए 96 घंटे।
    नोट: ओपी 50 प्लेटों को प्रत्येक 10 सेमी नेमाटोड विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेट34 में 20x OP50 बैक्टीरिया के 1 एमएल जोड़कर तैयार किया जाता है। यदि एल 4 चरण में कीड़े की कटाई का लक्ष्य रखा जाता है, तो ओपी 50 प्लेटों में से प्रत्येक में 30,000 एल 1 कीड़े बोए जा सकते हैं, और वर्तमान प्रयोगात्मक सेटिंग्स में दिन -1 वयस्कों की कटाई का लक्ष्य रखते हुए ओपी 50 प्लेटों में से प्रत्येक में 20,000 एल 1 कीड़े लगाए जा सकते हैं। यह विभिन्न प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए अलग-अलग हो सकता है, इसलिए कृमि संख्याओं का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है जिन्हें यह सुनिश्चित करने के लिए बीज दिया जा सकता है कि कीड़े के पास कटाई से पहले पर्याप्त भोजन बचा है।
  13. 10 एमएल एम 9 बफर का उपयोग करके 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एल 4, दिन -1 वयस्क, या दिन -2 वयस्क कीड़े एकत्र करें। प्लेटों से बचे हुए कीड़े को धोने के लिए एम 9 बफर के एक और 5 एमएल का उपयोग करें।
  14. कीड़े को 30 सेकंड के लिए 1,450 x g पर घुमाएं और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। कीड़े की गोली को 10 एमएल बीडीआर माध्यम के साथ धोएं, सेंट्रीफ्यूज को 30 सेकंड के लिए 1,450 x g पर धोएं, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  15. तरल भोजन विधि में कीड़े के लिए, बीडीआर माध्यम को कीड़े में स्थानांतरित करें ताकि 3,000 कीड़े / एमएल की कृमि एकाग्रता प्राप्त हो सके। ऑन-प्लेट फीडिंग विधियों में कीड़े के लिए, प्लेट पर सुखाने के समय को कम करने के लिए कीड़े में जोड़े गए बीडीआर माध्यम की मात्रा को कम करें।

3. सी एलिगेंस के लिए लिपिड पूरक

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए तरल संस्कृति में लिपिड पूरकता करें।
    नोट: यह विधि लिपिड के साथ पूरक थोक कीड़े का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त है।
    1. 12-वेल प्लेट में प्रत्येक कुओं में लिपिड या वाहन नियंत्रण की वांछित मात्रा स्थानांतरित करें। जैविक प्रतिकृति के रूप में प्रत्येक भोजन की स्थिति के लिए तीन से चार कुएं तैयार करें।
    2. चरण 2.15 से कृमि निलंबन को 1: 1 अनुपात में 5x BDR बैक्टीरिया के साथ मिलाएं ताकि बैक्टीरिया के लिए 1,500 कीड़े / एमएल और 2.5x की अंतिम एकाग्रता प्राप्त हो सके।
    3. बीडीआर माध्यम में कृमि-बैक्टीरिया मिश्रण के 2 एमएल को 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें।
    4. पन्नी के साथ 12-वेल प्लेट को लपेटें और वांछित इनक्यूबेशन लंबाई के लिए 100 आरपीएम पर 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हिलाएं।
      नोट: विभिन्न भोजन स्थितियों का परीक्षण करने के लिए, लिपिड को अलग-अलग लंबाई के लिए कीड़े के साथ इनक्यूबेट करें, जैसे कि 6 घंटे, 12 घंटे और 24 घंटे के लिए। इसके अलावा, विभिन्न कृमि चरणों को इष्टतम परिणामों के लिए परीक्षण किया जा सकता है, जिसमें एल 4 या दिन -1 वयस्क चरण से लिपिड फीडिंग शामिल है।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए 10 सेमी एनजीएम एगर प्लेटों पर लिपिड पूरकता करें।
    नोट: यह विधि लिपिड के साथ पूरक थोक कीड़े का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त है।
    1. चरण 1.9 से लिपिड-वातानुकूलित बैक्टीरिया का बीज 1 एमएल 10 सेमी प्लेटों में से प्रत्येक के केंद्र पर। जब बड़ी संख्या में प्लेटें तैयार की जाती हैं, तो भंवर सीडिंग के बीच कई बार अंतिम कार्यशील समाधान होता है। बायोसेफ्टी हुड का उपयोग करके प्लेटों को अंधेरे में सुखाएं।
    2. चरण 2.15 से 10 सेमी प्लेटों में से प्रत्येक में 3,000 कीड़े स्थानांतरित करें। प्लेटों को जैव सुरक्षा हुड में सुखाएं जब तक कि कीड़े तैरने के बजाय लिपिड-पूरक प्लेटों पर रेंग न सकें।
    3. वांछित समय के लिए 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लिपिड-वातानुकूलित प्लेटों पर कीड़े को इनक्यूबेट करें। पॉली-असंतृप्त लिपिड का उपयोग करते समय प्रकाश से रक्षा करें।
      नोट: विभिन्न भोजन स्थितियों का परीक्षण करने के लिए, लिपिड को विभिन्न लंबाई के लिए कीड़े के साथ इनक्यूबेट करें, जैसे कि 6 घंटे, 12 घंटे और 24 घंटे। इसके अलावा, विभिन्न कृमि चरणों को इष्टतम परिणामों के लिए परीक्षण किया जा सकता है, जिसमें एल 4 या दिन -1 वयस्क चरण में लिपिड फीडिंग शामिल है।
  3. ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए 6 सेमी एनजीएम एगर प्लेटों पर लिपिड पूरकता करें।
    नोट: यह विधि लिपिड के साथ पूरक कुछ कीड़े में ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त है।
    1. चरण 1.9 से 6 सेमी प्लेट के केंद्र में लिपिड-वातानुकूलित बैक्टीरिया का बीज 300 μL। जब बड़ी संख्या में प्लेटें तैयार की जाती हैं, तो भंवर सीडिंग के बीच कई बार अंतिम कार्यशील समाधान होता है। बायोसेफ्टी हुड का उपयोग करके प्लेटों को अंधेरे में सुखाएं।
    2. चरण 2.15 से 6 सेमी प्लेटों में से प्रत्येक में 300 कीड़े तक स्थानांतरित करें। प्लेटों को जैव सुरक्षा हुड में सुखाएं जब तक कि कीड़े तैरने के बजाय लिपिड-पूरक प्लेटों पर रेंग न सकें।
    3. वांछित समय के लिए 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लिपिड-वातानुकूलित प्लेटों पर कीड़े को इनक्यूबेट करें। पॉली-असंतृप्त लिपिड का उपयोग करते समय प्रकाश से रक्षा करें।
      नोट: विभिन्न भोजन स्थितियों का परीक्षण करने के लिए, अलग-अलग समय बिंदुओं पर कीड़े के साथ लिपिड को इनक्यूबेट करें, जैसे कि 6 घंटे, 12 घंटे और 24 घंटे। इसके अलावा, विभिन्न कृमि चरणों को इष्टतम परिणामों के लिए परीक्षण किया जा सकता है, जिसमें एल 4 या दिन -1 वयस्क चरण में लिपिड फीडिंग शामिल है।
  4. अनुदैर्ध्य जीवनकाल परख के लिए 6 सेमी एनजीएम एगर प्लेटों पर लिपिड पूरकता करें।
    1. 6 सेमी एनजीएम प्लेटों में से प्रत्येक के केंद्र में लिपिड-वातानुकूलित बैक्टीरिया (1x लिपिड एकाग्रता और 5x केंद्रित बैक्टीरिया के साथ) के बीज 200 μL। प्रत्येक भोजन की स्थिति के लिए तीन प्लेटें तैयार करें।
      नोट: प्लेटों को उपयोग के दिन ताजा तैयार किया जाना चाहिए (आदर्श रूप से उपयोग से ठीक पहले)।
    2. प्लेटों को जैव सुरक्षा हुड में सुखाएं। पॉली-असंतृप्त लिपिड का उपयोग करते समय हुड और कमरे में रोशनी बंद रखें।
    3. प्रत्येक प्लेट के लिए 30-40 सिंक्रनाइज़ किए गए एल 4 कीड़े चुनें। कीड़े के साथ प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। यदि पॉली-असंतृप्त लिपिड के साथ भोजन किया जाता है, तो प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक प्रकाश-संरक्षित बॉक्स में रखें।
      नोट: कीड़े को लेने के लिए गोंद के रूप में सामान्य 6 सेमी पैसेज प्लेट (बिना वातानुकूलित ओपी 50) से ओपी 50 का उपयोग करना संभव है, लेकिन परख प्लेट में बिना शर्त ओपी 50 की थोक मात्रा नहीं छोड़ना महत्वपूर्ण है।
    4. वांछित भोजन की स्थिति के आधार पर कीड़े को रोजाना या हर दूसरे दिन नई, ताजा लिपिड-वातानुकूलित प्लेटों में स्थानांतरित करें। उत्तरजीविता को उसी तरह से स्कोर किया जाता है जैसे पहले वर्णित4।

4. ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए आरएनए निष्कर्षण

  1. पूरे कीड़े की एक बड़ी संख्या से आरएनए निष्कर्षण करें।
    1. तरल संस्कृति में कीड़े को चरण 3.1 से 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। एम 9 बफर का उपयोग करके चरण 3.2 से 10 सेमी प्लेटों से कीड़े धोएं और एम 9 बफर में कीड़े को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    2. संक्षेप में कीड़े को 10 सेकंड के लिए टेबलटॉप मिनी सेंट्रीफ्यूज ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ सेंट्रीफ्यूज करें और जल्दी से सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
    3. बचे हुए कीड़ों को तरल फीडिंग कुओं से स्थानांतरित करें या प्लेट फीडिंग से उसी ट्यूब में धोएं और नीचे घूमें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    4. वर्म छर्रों को 1 एमएल बर्फ-ठंडे एम 9 के साथ धोएं, एक मिनी सेंट्रीफ्यूज के साथ 10 सेकंड के लिए संक्षिप्त रूप से घुमाएं, और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। सतह पर तैरने वाले की पारदर्शिता के आधार पर 1x या 2x दोहराएं।
    5. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को 2 मिनट के लिए बर्फ पर सेट करें और 200 μL पिपेट के साथ जितना संभव हो उतना सुपरनैटेंट निकालें, जिससे पैक किए गए कीड़े की गोली 15 μL से अधिक न हो।
    6. फिनोल और गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट (सामग्री की तालिका) युक्त आरएनए निष्कर्षण समाधान के 15 μL को प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और कीड़े को मोटर ग्राइंडर के साथ लगभग 30 सेकंड तक पीसें जब तक कि कोई बरकरार कीड़े दिखाई न दें।
      चेतावनी: आरएनए निष्कर्षण समाधान विषाक्त और ज्वलनशील है, और इस अभिकर्मक के साथ एक खुले कंटेनर को शामिल करने वाले किसी भी कदम को रासायनिक हुड में संचालित किया जाना चाहिए।
    7. मोटर ग्राइंडर टिप से किसी भी कीड़े की सामग्री को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में धोते समय आरएनए निष्कर्षण समाधान के 285 μL को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। भंवर को अच्छी तरह से मिश्रण करना।
      नोट: यह एक विराम बिंदु है। नमूने कुछ महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए निष्कर्षण समाधान में संग्रहीत किए जा सकते हैं। जब -80 डिग्री सेल्सियस से बाहर निकाला जाता है, तो नमूने को कमरे के तापमान पर पिघलने दें।
    8. प्रत्येक नमूने और भंवर में क्लोरोफॉर्म के 60 μL को सख्ती से स्थानांतरित करें। नमूने को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बसने दें।
      चेतावनी: क्लोरोफॉर्म विषाक्त है और इसे रासायनिक हुड में संभाला जाना चाहिए।
    9. सेंट्रीफ्यूज 21,000 x g पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सावधानीपूर्वक शीर्ष पर जलीय परत के 140 μL को 200 μL पिपेट का उपयोग करके एक नई और RNase-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, हर बार 70 μL के साथ 2x स्थानांतरित करें।
      नोट: इस कदम से आगे, नमूने के साथ सीधे संपर्क रखने वाले सभी पिपेट टिप्स और कंटेनरों को RNase-मुक्त होने की आवश्यकता है। सभी उपकरणों और कार्य स्थान को मिटाने के लिए आरएनएस परिशोधन समाधान का उपयोग करने का भी सुझाव दिया जाता है।
    10. नमूना ट्यूब में आइसोप्रोपेनोल के 140 μL स्थानांतरित करें। भंवर जोर से और नमूने को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बसने दें। सेंट्रीफ्यूज 21,000 x g पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, और ध्यान से सभी सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    11. आरएनए गोली के साथ नमूना ट्यूब में 0.5 एमएल बर्फ-ठंडा 80% इथेनॉल (वी / वी) स्थानांतरित करें। भंवर तब तक सख्ती से जब तक आरएनए गोली ट्यूब के निचले हिस्से को छोड़ नहीं देती है और इथेनॉल समाधान में चारों ओर तैरती है। सेंट्रीफ्यूज 21,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    12. ट्यूब की दीवार का पालन करने वाले किसी भी विलायक को स्पिन करने के लिए मिनी सेंट्रीफ्यूज में नमूना ट्यूबों को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर पिपेट के साथ जितना संभव हो उतना इथेनॉल समाधान निकालें।
    13. आरएनए गोली को सुखाने के लिए ट्यूब कैप को खुला छोड़ दें। यदि पेलेट को इथेनॉल समाधान के साथ अच्छी तरह से धोया गया था, तो सुखाने के चरण में 10 मिनट से कम समय लगना चाहिए।
      नोट: यह एक विराम बिंदु है। सूखे आरएनए गोली को 1 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    14. सूखी आरएनए गोली को न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 40 μL के साथ घोलें और निर्माता निर्देशों के अनुसार डीएनए-हटाने वाली किट के साथ प्रक्रिया करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: पहले न्यूक्लियस मुक्त पानी में आरएनए को भंग करने की सिफारिश की जाती है। यदि आरएनए ट्यूब में स्थानांतरित होने से पहले 10x DNase बफर के साथ 40 μL पानी मिलाया जाता है, तो आरएनए गोली पूरी तरह से भंग नहीं होगी। आरएनए गोली को पानी में घोलते समय आरएनए नमूनों को बर्फ पर रखने की आवश्यकता होती है। फ्रीज-पिघलना चक्र आरएनए गुणवत्ता को कम करता है; इसलिए, DNase उपचार के उसी दिन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण पर आगे बढ़ें।
  2. पूरे कीड़े की एक छोटी संख्या से आरएनए निष्कर्षण।
    1. कीड़े से बैक्टीरिया को हटाने के लिए अपने जीवाणु लॉन से 15-20 कीड़े को एक ताजा गैर-बीजित एनजीएम प्लेट में चुनें।
    2. क्यूआरटी-पीसीआर 2-स्टेप किट के निर्माता के अनुसार ( सामग्री की तालिका देखें), पीसीआर ट्यूबों में 19.8 μL लाइसिस समाधान के साथ DNase के 0.2 μL को मिलाकर प्रत्येक नमूने के लिए अंतिम लाइसिस समाधान का 20 μL तैयार करें। लाइसिस घोल को 5x ऊपर और नीचे करके मिलाएं।
    3. गैर-बीजित एनजीएम प्लेट से 15-20 कीड़े को पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें बैक्टीरिया की न्यूनतम संख्या के साथ अंतिम लाइसिस समाधान का 20 μL होता है। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए लाइसिस प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    4. प्रोब-सोनिकेट ( सामग्री की तालिका देखें) निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके 30% आयाम वाले कीड़े: 5 सेकंड के लिए सोनिकेशन, 5 सेकंड के लिए विराम, और 20 सेकंड के कुल सोनिकेशन समय के साथ 4x दोहराएं। सोनिकेशन के दौरान नमूनों को बर्फ-ठंडे पानी के स्नान में रखें।
    5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि नो-आरटी नकारात्मक नियंत्रण संबंधित स्तर पर डीएनए संदूषण दिखाता है तो इनक्यूबेशन से पहले अधिक डीनेस जोड़ें।
    6. लाइसिस प्रतिक्रिया में स्टॉप समाधान के 2 μL स्थानांतरित करें और धीरे से टैप करके मिलाएं। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर बर्फ पर सेट करें।
      नोट: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण पर आगे बढ़ने से पहले नमूने को बर्फ पर 2 घंटे तक छोड़ा जा सकता है।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कृमि ऊतकों से आरएनए निष्कर्षण करें।
    1. अपने जीवाणु लॉन से लगभग 20 कीड़े चुनें और उन्हें बैक्टीरिया को हटाने के लिए एक ताजा गैर-बीज वाले एनजीएम प्लेट पर रखें।
    2. 20 कीड़े (जितना संभव हो उतने कम बैक्टीरिया के साथ) को एक घड़ी ग्लास में ले जाएं जिसमें 500 μL M9 समाधान होता है जिसमें 4 μM levamisole होता है ( सामग्री की तालिका देखें)। स्थिरीकरण सेकंड के भीतर होगा।
    3. जब कीड़े स्थिर हो जाते हैं, तो 25 ग्राम सुई का उपयोग करके जर्मलाइन या आंत को विच्छेदित करें जिसे 1 एमएल सिरिंज से जोड़ा जा सकता है।
      1. विच्छेदन दायरे के तहत, आंत और जर्मलाइन के प्राकृतिक एक्सट्रूज़न की अनुमति देने के लिए दूसरे ग्रसनी बल्ब की स्थिति में कटौती करें। दो ऊतकों को उनकी आकृति विज्ञान और विभिन्न विपरीत के आधार पर आसानी से पहचाना जा सकता है। ऊतकों को धीरे से अलग करने के लिए चिमटी या सुइयों का उपयोग करें, उन्हें नुकसान पहुंचाने से बचें।
        नोट: 5-10 मिनट के भीतर विच्छेदन करने की सिफारिश की जाती है। यदि कट एक अच्छा ऊतक एक्सट्रूज़न पैदा नहीं करता है, तो अगले कीड़े में जाने और 10 मिनट के भीतर जितना संभव हो उतना विच्छेदन करने का सुझाव दिया जाता है। इस प्रक्रिया को पर्यावरण से ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों से बचने के लिए एक छोटी समय सीमा की आवश्यकता होती है।
    4. क्यूआरटी-पीसीआर 2-स्टेप किट निर्माता के अनुसार, पीसीआर ट्यूबों में डीनेस आई के 0.2 μL से 19.8 μL लाइसिस समाधान को मिलाकर प्रत्येक नमूने के लिए अंतिम लाइसिस समाधान का 20 μL तैयार करें। लाइसिस घोल को 5x ऊपर और नीचे करके मिलाएं।
    5. विच्छेदित ऊतकों को पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक ऑटोक्लेव ग्लास पिपेट का उपयोग करें। पीसीआर ट्यूबों को बर्फ पर 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करें ताकि नीचे सामग्री का जमाव हो सके। सुपरनैटेंट को हटा दें, पीसीआर ट्यूब में अंतिम लाइसिस समाधान के 20 μL जोड़ें, और टैप करके मिलाएं।
    6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए लाइसिस प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। फिर, लाइसिस प्रतिक्रिया में स्टॉप समाधान के 2 μL स्थानांतरित करें और टैप करके मिश्रण करें। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण पर आगे बढ़ने से पहले नमूने को बर्फ पर 2 घंटे तक छोड़ा जा सकता है।

5. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और क्यूआरटी-पीसीआर

  1. थोक कीड़े से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और क्यूआरटी-पीसीआर करें।
    1. आरएनए एकाग्रता को मापें और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए कुल आरएनए का 5 μg तैयार करें।
    2. प्रत्येक नमूने से आरएनए की समान मात्रा को मिलाकर और अंतिम आरएनए एकाग्रता को 0.556 ग्राम / एल (5 μg / 9 μL) में समायोजित करके एक पूल आरएनए नमूना तैयार करें। क्यूआरटी-पीसीआर मानक वक्र और आरटी-नकारात्मक नियंत्रण के लिए पूल किए गए आरएनए नमूने का उपयोग करें।
    3. निर्माता निर्देशों के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। व्यक्तिगत आरएनए नमूनों के साथ निम्न गुणवत्ता नियंत्रण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाएं चलाएं।
      1. टेम्पलेट के रूप में पूल किए गए आरएनए नमूने के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें (क्यूआरटी-पीसीआर मानक वक्र के लिए)।
      2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (आरटी-नकारात्मक नियंत्रण; संभावित जीनोम डीएनए संदूषण के लिए गुणवत्ता नियंत्रण) के बिना, टेम्पलेट के रूप में पूल किए गए आरएनए नमूने के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें।
      3. टेम्पलेट के रूप में न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें (आरटी-नकारात्मक नियंत्रण; अभिकर्मकों में संभावित आरएनए संदूषण के लिए गुणवत्ता नियंत्रण)।
        नोट: यह एक विराम बिंदु है। नमूने रात भर थर्मोसाइक्लर में छोड़ दिए जा सकते हैं या कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
    4. क्यूआरटी-पीसीआर मानक वक्रों के लिए न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ पूल किए गए आरएनए नमूनों से उत्पन्न सीडीएनए को चार बार, 20 बार, 100 बार और 500 बार पतला करें।
    5. क्यूआरटी-पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने के लिए प्रत्येक आरएनए नमूने से उत्पन्न सीडीएनए को 20-100 बार पतला करें।
      नोट: कमजोर पड़ने का अनुपात रुचि के जीन की प्रचुरता पर निर्भर करता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उच्च-व्यक्त जीन, जैसे हाउसकीपिंग जीन या ईजीएल -3 और ईजीएल -21 के लिए, 100 एक्स कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है। कम व्यक्त जीन के लिए, जैसे कि एलबीपी -8, 20 एक्स कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है।
    6. निर्माता निर्देशों के अनुसार क्यूआरटी-पीसीआर अभिकर्मकों के साथ क्यूआरटी-पीसीआर निष्पादित करें: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के साथ 40 बार और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के साथ दोहराएं, इसके बाद डिफ़ॉल्ट पिघलने वक्र कार्यक्रम, और अनिश्चित समय के लिए 8 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. कुछ कीड़े या कृमि ऊतकों से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और क्यूआरटी-पीसीआर करें।
    1. चरण 4.2.6 या चरण 4.3.6 से कृमि लाइसेट युक्त प्रत्येक ट्यूब में क्यूपीसीआर 2-चरण किट ( सामग्री की तालिका देखें) से आरटी बफर के 25 μL और 20x RT एंजाइम मिश्रण के 2.5 μL को स्थानांतरित करें।
      नोट: कुछ कीड़े से क्यूआरटी-पीसीआर के लिए आरटी-नकारात्मक नियंत्रण महत्वपूर्ण है। प्रत्येक प्रयोग में आरटी बफर के साथ कृमि लाइसेट (चरण 4.2.6 से) का एक नमूना शामिल करने की आवश्यकता होती है, लेकिन नमूनों में डीएनए संदूषण की जांच करने के लिए आरटी एंजाइम के बिना। यदि डीएनए संदूषण एक मुद्दा है, तो कीड़े के लाइस होने के बाद नमूने में अधिक डीनेस या अधिक डीनेस जोड़ने पर विचार करें। वैकल्पिक रूप से, कोई सामान्य आरटी प्रतिक्रिया में लाइसेट के आधे हिस्से का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के लिए आरटी-नकारात्मक नियंत्रण कर सकता है और दूसरा आधा रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस के बिना आरटी प्रतिक्रिया में कर सकता है।
    2. धीरे से टैप करके मिलाएं। 10 सेकंड के लिए मिनी सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके नीचे स्पिन करें।
    3. निर्माता के निर्देशों के बाद थर्मोसाइक्लर मशीन में नमूने लोड करें: 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, और अनिश्चित काल के लिए 8 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: यह एक विराम बिंदु है। नमूने रात भर थर्मोसाइक्लर में छोड़ दिए जा सकते हैं या कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
    4. सभी अभिकर्मकों और नमूनों को बर्फ पर रखें और क्यूआरटी-पीसीआर अभिकर्मकों को प्रकाश से बचाएं।
    5. एक 96-वेल क्यूपीसीआर प्लेट तैयार करें, और प्रत्येक अच्छी तरह से 6 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी, 10 μL qRT-PCR अभिकर्मक, 5 μM प्राइमर मिश्रण (आगे और पीछे) का 2 μL और cDNA के 2 μL मिलाएं। एक सुरक्षात्मक ऑप्टिकल फिल्म के साथ 96-वेल क्यूपीसीआर प्लेट सतह को कवर करें और सील करने के लिए दबाएं।
    6. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए थर्मल साइकलर पर क्यूआरटी-पीसीआर प्रोग्राम चलाएं: 2 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 3 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के साथ 40 बार दोहराएं, इसके बाद अनिश्चित समय के लिए 8 डिग्री सेल्सियस।

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Representative Results

लिपिड पूरकता पर कुछ पूरे कीड़े का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का सत्यापन
यह जांचने के लिए कि क्या कुछ पूरे कीड़े से सीडीएनए में आरएनए निकालने और रेट्रोट्रांसक्राइब करने का प्रोटोकॉल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और थोक कीड़े के डेटा के साथ तुलनीय है, आंत में लाइसोसोमल एसिड लाइपेस लिपे -4 को अतिरंजित करने वाले लंबे समय तक रहने वाले कृमि तनावको 7,8,33,35 नियोजित किया गया था। पिछले अध्ययनों में रिपोर्ट किए गए न्यूरोपैप्टाइड प्रोसेसिंग जीन ईजीएल -3 और ईजीएल -21 के ट्रांसक्रिप्शनल प्रेरणको मान्य किया गया था (चित्रा 2 ए, बी)। यह प्रेरण इंगित करता है कि कुछ जानवरों से आरएनए निष्कर्षण विधि थोक कृमि संस्कृतियों से मानक सीडीएनए संश्लेषण तकनीकों का एक वैध विकल्प है।

लिपिड पूरकता पर विच्छेदित कृमि ऊतकों का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शनल मूल्यांकन का सत्यापन
एलिगेंस में, 20-कार्बन पीयूएफए का संश्लेषण डेसाट्यूरेज़ एफएटी -316,17 की गतिविधि पर निर्भर है। पिछले अध्ययनों ने बताया है कि वसा -3 उत्परिवर्ती में 20-कार्बन पीयूएफए की कमी होती है, जिसमें डीजीएलए16 भी शामिल है। इससे पहले, यह पता चला था कि लिपल -4 जी कीड़े में ए 6-डेसाटुरेज एफएटी -3 का नुकसान न्यूरोपैप्टाइड प्रोसेसिंग जीन ईजीएल -3 और ईजीएल -21 33 के ट्रांसक्रिप्शनल प्रेरण को दबा देता है। इसके अलावा, डीजीएलए पूरकता इस तरह के प्रेरणको बचाती है। जीन एन्कोडिंग ईजीएल -21 न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है, जबकि ईजीएल -3 न्यूरॉन्स और आंतों36,37 दोनों में पाया जाता है। आगे यह जांचने के लिए कि क्या डीजीएलए पूरक आंत या न्यूरॉन्स में ईजीएल -3 और ईजीएल -21 के प्रेरण को पुनर्स्थापित करता है, आंत को विच्छेदित किया गया था और इस प्रोटोकॉल के चरण 4.3 और 5.2 में वर्णित क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण का उपयोग करके उनके ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों का मूल्यांकन किया गया था। डीजीएलए को दिन -1 वयस्कता में 12 घंटे के लिए स्रोत भोजन में पूरक किया गया था। आंत में ईजीएल -3 या ईजीएल -21 का कोई ट्रांसक्रिप्शनल प्रेरण नहीं पाया गया (चित्रा 2 सी), जो पिछलेनिष्कर्षों 36,38 के अनुरूप है।

लिपिड पूरकता पर जीवनकाल परख का सत्यापन
20-कार्बन पीयूएफए और वसा -3 को निष्क्रिय करने वाले दीर्घायु तंत्र के बीच संबंध का पहले पता लगाया गया था, विशेष रूप से लिपल -4 जी कीड़े33 की आंत में। यह पाया गया कि वसा -3 वध लिपल -433 द्वारा प्रदान किए गए जीवनकाल विस्तार को पूरी तरह से दबा देता है। यह आकलन करने के लिए कि क्या डीजीएलए लिपल -4 द्वारा मध्यस्थ दीर्घायु को बहाल करता है, डीजीएलए को वयस्कता के दिन -1 में स्रोत भोजन में हर दूसरे दिन ताजा पूरक किया गया था। यह पाया गया कि वसा -3 वध पर, डीजीएलए पूरकता जीवनकाल विस्तार (चित्रा 2 डी) 33 को बचाती है, जो जीवनकाल परख के साथ युग्मित एक सफल लिपिड पूरक प्रक्रिया का संकेत देती है।

Figure 1
चित्र 1: विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स का उपयोग करके लिपिड फीडिंग का योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: कीड़े, कुछ कीड़े और विच्छेदित ऊतकों की एक बड़ी आबादी का उपयोग करके न्यूरोपैप्टाइड प्रोसेसिंग जीन के ट्रांसक्रिप्शनल मूल्यांकन का सत्यापन। (A) कीड़े की एक बड़ी आबादी से निकाला गया आरएनएलिपल -4 टीजी जानवरों में न्यूरोपेप्टाइड प्रसंस्करण जीन के ईजीएल -3 और ईजीएल -21 प्रतिलेख स्तरों के प्रेरण को दर्शाता है। त्रुटि पट्टियाँ दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट द्वारा ±1 SEM. **** p < 0.0001 का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी) कुछ कीड़े से आरएनए निष्कर्षण लिपल -4 टीजी कीड़े में न्यूरोपैप्टाइड प्रसंस्करण जीन के ईजीएल -3 और ईजीएल -21 प्रतिलेख स्तरों के प्रेरण की पुष्टि करता है। त्रुटि पट्टियाँ दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट द्वारा ±1 SEM. **** p < 0.0001 का प्रतिनिधित्व करती हैं। (सी) न्यूरोनल न्यूरोपैप्टाइड प्रोसेसिंग जीन ईजीएल -3 और ईजीएल -21 विच्छेदित आंतों में प्रेरित नहीं होते हैं। त्रुटि पट्टियाँ ±1 SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण। (डी) विभिन्न सांद्रता पर डीजीएलए पूरकता, जिसमें 10 μm, 100 μm और 1 mM शामिल हैं, वसा -3 आरएनएआई पर लिपल -4Tg दीर्घायु प्रभाव को बचाता है। लॉग-रैंक टेस्ट द्वारा पी < 0.001। यह आंकड़ा सविनी एट अल.33 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

स्वस्थ उम्र बढ़ने पर कुछ लिपिड प्रजातियों के प्रत्यक्ष प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए उम्र बढ़ने के अनुसंधान में लिपिड पूरकता को नियोजित किया गया है 6,7,23,26,27,31। हालांकि, लिपिड पूरक प्रक्रिया चुनौतीपूर्ण हो सकती है, और प्रयोगों के बीच कोई भी असंगति गैर-प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम पैदा कर सकती है। यहां, तकनीकी अशुद्धता के कारण होने वाले संभावित नुकसान से बचने के लिए नए वैज्ञानिकों का मार्गदर्शन करने के लिए पहला विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रलेखित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों पर निम्नलिखित पैराग्राफ में विस्तार से चर्चा की जाएगी। लिपिड पूरकता के बाद केवल कुछ कीड़े और विशिष्ट कृमि ऊतकों से आरएनए अलगाव शुरू करके लिपिड अनुसंधान टूलबॉक्स का भी विस्तार किया जाता है। प्रतिलेख स्तरों की जांच करने के लिए पद्धति पर विचार करते समय, कुछ कीड़े या विच्छेदित ऊतकों के साथ क्यूआरटी-पीसीआर कुछ प्रतिलिपियों का विश्लेषण करने या कुछ ऊतक-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों की जांच करने के लिए उत्कृष्ट है। इसके अलावा, इन पद्धतियों का उपयोग करके कृमि प्रवर्धन के चरण को दूर किया जा सकता है जिसमें लगभग 5-6 अतिरिक्त दिन लग सकते हैं। इसी समय, थोक आरएनए निष्कर्षण के बाद लिपिड फीडिंग अधिक लागत प्रभावी और एक वैध विकल्प है जब लक्ष्य जीन के एक बड़े सेट का विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है।

लिपिड फीडिंग प्रभावों की प्रजनन क्षमता के लिए कई कदम महत्वपूर्ण हो सकते हैं। पहला पहलू जीवाणु स्थितियों से संबंधित है। यह सुझाव दिया जाता है कि ताजा जीवाणु प्लेटों का उपयोग करें जो टीकाकरण के लिए 7 दिनों से अधिक पुराने नहीं हैं। 1 सप्ताह के भीतर बीडीआर माध्यम में तैयार बैक्टीरिया का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। लिपिड के साथ मिश्रित बैक्टीरिया का तुरंत उपयोग किया जाना चाहिए। बैक्टीरिया के साथ लिपिड को 4 डिग्री सेल्सियस पर भी संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि बैक्टीरिया लिपिड को चयापचय करेगा। बीडीआर बेस में धोने के चरण और बीडीआर माध्यम में पुन: निलंबन बैक्टीरिया की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि बैक्टीरिया एलबी में उगाए गए थे, और सीधे कीड़े को खिलाया जाता है जो हमेशा लिपिड की खुराक के गहन प्रभाव को समाप्त करता है। दूसरा कारक कृमि स्थितियों से जुड़ा हुआ है। अंडे की तैयारी के लिए ब्लीचिंग चरण से पहले एलिगेंस को कम से कम तीन पीढ़ियों तक भूखा नहीं होना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे स्वस्थ और स्थिर चयापचय अवस्था में हैं। लिपिड पूरकता से पहले एगर प्लेटों पर सी एलिगेंस को कल्चर करना भी महत्वपूर्ण है; इसमें सिंक्रनाइज़ेशन चरण से पहले और बाद में शामिल हैं।

कीड़े जो लंबे समय तक तरल संस्कृतियों के अनुकूल होते हैं, आंशिक रूप से भूखे होते हैं; भुखमरी प्रो-दीर्घायु जीन के लिए आधार रेखा को बढ़ाती है, जिससे लिपिड पूरकता का कमजोर प्रभाव होता है। यदि चयापचय बहाव और गिरफ्तार एल 1 लार्वा का उपयोग करके परिवर्तन चिंता का विषय हैं, तो एक वैध विकल्प सीधे अंडे को प्लेट करना होगा। जब जीवनकाल या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए केवल कुछ कीड़े की आवश्यकता होती है, तो अंडे को सीधे लिपिड-वातानुकूलित प्लेटों पर प्लेट करना और बाद के प्रयोगों के लिए एल 4 चरण में हाथ से चुनकर उन्हें फिर से सिंक्रनाइज़ करना संभव है। हालांकि, अगर हाथ से चुनने वाले एल 4 लागू नहीं होने पर बड़ी मात्रा में कीड़े की आवश्यकता होती है, तो सीधे अंडे चढ़ाना आदर्श नहीं है। गुरुत्वाकर्षण वयस्कों से विरंजन के बाद अंडे सेने वाले अंडे अलग-अलग समय बिंदुओं पर हो सकते हैं और आबादी को सिंक्रनाइज़ नहीं कर सकते हैं, जो ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण में हस्तक्षेप करेगा। तीसरा महत्वपूर्ण हिस्सा लिपिड भंडारण स्थितियों से जुड़ा हुआ है; पीयूएफए को पूरक करते समय, अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता होती है क्योंकि ये अणु प्रकाश के प्रति संवेदनशील होते हैं और हवा में ऑक्सीकरण के लिए प्रवण होते हैं।

कृमि चरणों, पूरक लंबाई और सांद्रता सहित कई लिपिड-फीडिंग स्थितियों को नए लिपिड अणुओं का परीक्षण करते समय आगे की जांच की आवश्यकता होती है। एल 4, दिन -1 वयस्क, और दिन -2 वयस्क कीड़े आमतौर पर विभिन्न कृमि चरणों में परीक्षण के लिए प्रारंभिक बिंदु होते हैं। विशेष रूप से, एल 4 कीड़े को खिलाते समय, यदि नेमाटोड मोलिंग चरण के आसपास इनक्यूबेशन समय समाप्त होता है, तो एक बड़ी भिन्नता की उम्मीद है, जो परिणामों के महत्व और प्रजनन क्षमता को बहुत प्रभावित करती है। दिन -1 या दिन -2 वयस्क कीड़े का उपयोग करने के लिए एक अतिरिक्त चुनौती संतानों से संबंधित है जो जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण को जटिल कर सकती है। इस उदाहरण में, कुछ पूरे कीड़े से आरएनए निष्कर्षण थोक आबादी की तुलना में अधिक विश्वसनीय है। विभिन्न लिपिड अणुओं में शारीरिक प्रभाव पैदा करने के लिए अलग-अलग एकाग्रता सीमाएं होती हैं; इस प्रकार, 1 μM से 1 mM तक सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण करने का सुझाव दिया जाता है।

फीडिंग विधि चुनते समय विचार करने के लिए कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, जब लिपिड को कीड़े द्वारा अवशोषित या निगला नहीं जा सकता है, तो सी एलिगेंस में उनके जैविक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए पूरक विधि का उपयोग करना चुनौतीपूर्ण है। वर्तमान तकनीकों के साथ, मास स्पेक्ट्रोमेट्री या एसआरएस 13सी- या 2 एच-लेबल लिपिडयौगिकों 39 के साथ मिलकर कृमि शरीर में लिपिड अपटेक का परीक्षण करने के लिए वैध उपकरण हैं। दूसरा, इन फीडिंग विधियों को उच्च-थ्रूपुट जांच तकनीकों के लिए अनुकूलित नहीं किया जाता है। थोक कीड़े के साथ लिपिड पूरकता के लिए, तरल फीडिंग विधि से नमूना तैयारी ऑन-प्लेट फीडिंग की तुलना में तेज है, क्योंकि तरल संस्कृतियों को फीडिंग प्लेटों से धोने के बजाय सीधे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि निकाला गया आरएनए फसल की स्थिति में है, यह सुझाव दिया जाता है कि बर्फ पर कीड़े को स्थापित करने से लेकर उन्हें आरएनए निष्कर्षण समाधान में पीसने के बिंदु के बीच 15-20 मिनट से अधिक समय न गुजरने दें। हर 15 मिनट में कम स्थितियों को संसाधित करने की सिफारिश की जाती है जब अधिक संख्या में नमूनों को संसाधित करने की आवश्यकता होती है। कुछ जानवरों से पूरे कीड़े आरएनए निष्कर्षण के लिए, हाथ से चुनने वाला कदम दर-सीमित कदम है, जबकि ऊतकों को विच्छेदित करने के लिए, गैर-शारीरिक वातावरण के दीर्घकालिक जोखिम से बचने के लिए समय-कुशल तरीके से कार्य करना महत्वपूर्ण है। थोक आरएनए निष्कर्षण के समान, कीड़े चुनना या 10 मिनट के भीतर ऊतक के नमूने विच्छेदित करना बेहतर है।

सीमाओं के बावजूद, इन पूरक विधियों का उपयोग लिपिड अनुसंधान से परे किसी भी पोषण और औषधीय प्रभावों की पहचान में सहायता के लिए किया जा सकता है। यहां बताई गई प्रक्रियाएं न केवल उम्र बढ़ने के शोध तक सीमित हैं, बल्कि ऑर्गेनेल फिटनेस और सेल चयापचय होमियोस्टैसिस का आकलन करने के लिए वैकल्पिक फेनोटाइप हैं। थोक आबादी के साथ पूरक विधि को ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण के लिए आरएनए-सेक, मेटाबोलिक और प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री, या विशिष्ट प्रोटीन मार्करों के विश्लेषण के लिए पश्चिमी धब्बा के साथ जोड़ा जा सकता है, जबकि कुछ कीड़े के साथ लिपिड पूरक को इमेजिंग और व्यवहार विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम रखरखाव समर्थन के लिए पी स्वाय को धन्यवाद देते हैं। इस कार्य को एनआईएच अनुदान R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), मार्च ऑफ डाइम्स फाउंडेशन (MCW), वेल्च फाउंडेशन (MCW), HHMI अन्वेषक (M.C.W.), और NIH T32 ES027801 प्री-डॉक्टरेट छात्र फेलो (M.S.) द्वारा समर्थित किया गया था। कुछ उपभेदों को सीजीसी द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (पी 40 ओडी010440) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Pestle Genesee Scientific 93-165P15 For worm grinding with Trizol
Agarose Sigma A9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix GenDEPOT R5600 For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR ThermoFisher A28567 For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge Benchmark Scientific C1248 For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip Branson Ultrasonic Corporation 100-132-888R
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cholesterol Sigma C8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifuge Eppendorf 22620444R For RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler pro Eppendorf 950030010 For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate Neta Scientific 665180 12-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm Neta Scientific 664161 For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm Neta Scientific 628161 For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free water ThermoFisher AM9937
Isoproanol Sigma PX1835-2
Levamisole hydrochloride VWR SPCML1054
lipl-4Tg MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22) MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
Luria Broth Base ThermoFisher 12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma M2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode ThermoFisher 4483354 96-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied BioSystem 4311971 For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System Sigma Z00Q0V0WW Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2 Caenorhabditis Genetics Center N/A C. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher N/A For measuring RNA concentration
OP50 Caenorhabditis Genetics Center N/A Bacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) Sigma P5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma P0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kit ThermoFisher 4402953 For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher 4367659 For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach  KIK International LLC. 59647210143 6% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA Watch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination Solution ThermoFisher AM9780
Sodium cloride (NaCl) Sigma S7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma SX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) Sigma S9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge Thermo 7500-4337 For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge Thermo 7500-7200 For worm egg preparation
TRIzol Reagent TheroFisher 15596018 RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kit ThermoFisher AM1907 For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59 Denville Scientific INV S7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor VWR 47747-370 For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 VWR N/A For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm picker WormStuff 59-AWP

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जीव विज्ञान अंक 190
<em>केनोरहाब्डिस एलिगेंस</em> में दीर्घायु और जीन ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए लिपिड पूरकता
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Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., Zhou, Y. Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (190), e64092, doi:10.3791/64092 (2022).

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