Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lipidensuppletie voor een lange levensduur en gentranscriptionele analyse bij Caenorhabditis elegans

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64092
Automatic Translation
*1,2, 2,3,4, 2,4,5, *2
1Graduate Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 3Integrative Program of Molecular and Biochemical Sciences, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Het huidige protocol beschrijft lipidensuppletiemethoden in vloeibare en on-plate culturen voor Caenorhabditis elegans, in combinatie met longitudinale studies en gentranscriptionele analyse van bulk of een paar wormen en wormweefsels.

Abstract

Veroudering is een complex proces dat wordt gekenmerkt door progressieve fysiologische veranderingen als gevolg van zowel omgevings- als genetische bijdragen. Lipiden zijn cruciaal bij het vormen van structurele componenten van celmembranen, het opslaan van energie en als signaalmoleculen. Regulatie van lipidemetabolisme en signalering is essentieel om verschillende levensduurroutes te activeren. De spoelworm Caenorhabditis elegans is een uitstekend en krachtig organisme om de bijdrage van lipidemetabolisme en signalering in levensduurregulatie te ontleden. Meerdere onderzoeken hebben beschreven hoe dieetsuppletie van specifieke lipidemoleculen de levensduur van C. elegans kan verlengen; kleine verschillen in de suppletievoorwaarden kunnen echter reproduceerbaarheidsproblemen veroorzaken bij wetenschappers in verschillende laboratoria. Hier worden twee gedetailleerde suppletiemethoden voor C. elegans gerapporteerd met behulp van lipidensuppletie met bacteriën die op platen zijn gezaaid of bacteriële suspensie in vloeibare cultuur. Hierin worden ook de details gegeven om levensduurtests uit te voeren met levenslange lipidensuppletie en qRT-PCR-analyse met behulp van een hele wormlysaat of ontleedde weefsels afgeleid van een paar wormen. Met behulp van een combinatie van longitudinale studies en transcriptionele onderzoeken naar lipidensuppletie, bieden de voedingstests betrouwbare benaderingen om te ontleden hoe lipiden de levensduur en gezonde veroudering beïnvloeden. Deze methodologie kan ook worden aangepast voor verschillende benaderingen voor voedingsscreening om veranderingen in een subset van transcripten te beoordelen met behulp van een klein aantal ontleedde weefsels of een paar dieren.

Introduction

Lipiden
Lipiden zijn kleine hydrofobe of amfipathische moleculen die oplosbaar zijn in organische oplosmiddelen, maar onoplosbaar in water 1,2. Verschillende lipidemoleculen onderscheiden zich van elkaar op basis van het aantal koolstofatomen in hun ketens, locatie, aantal dubbele bindingen en gebonden structuren, waaronder glycerol of fosfaten. Lipiden spelen een cruciale rol in en tussen verschillende cellen om organismale functies te reguleren, waaronder het vormen van membraanbilagen, het bieden van energieopslag en het fungeren als signaalmoleculen 3,4.

Ten eerste zijn lipiden structurele componenten van biologische membranen, waaronder het plasmamembraan en intracellulaire subcellulaire membranen die de interne compartimenten scheiden van de extracellulaire omgeving. Ten tweede zijn lipiden de belangrijkste vorm van energieopslag bij gewervelde en ongewervelde dieren. Neutrale lipiden, waaronder triacylglycerolen, worden gedurende een langere periode opgeslagen in verschillende weefsels, waaronder in vetweefsel. In de nematode Caenorhabditis elegans is de darm het belangrijkste metabole vetopslagorgaan; de functie ervan is niet alleen betrokken bij de spijsvertering en absorptie van voedingsstoffen, maar ook bij het proces van ontgifting, dat lijkt op de activiteit van hepatocyten van zoogdieren. Andere vetopslagweefsels omvatten de kiembaan, waarin lipiden essentieel zijn voor het ontwikkelen van eicellen, en de hypodermis, die bestaat uit huidachtige epidermale cellen 3,5. Ten derde is er de laatste jaren meer bewijs dat lipiden krachtige signaalmoleculen zijn die betrokken zijn bij intra- en extracellulaire signalering door direct in te werken op een verscheidenheid aan receptoren, waaronder G-eiwitgekoppelde en nucleaire receptoren, of indirect via membraanfluïditeitsmodulatie of posttranslationele modificaties 6,7,8,9 . Verdere studies zullen doorgaan met het ophelderen van de onderliggende moleculaire mechanismen van lipidesignalering bij het bevorderen van een lang leven en de gezondheid.

Modelorganismen zijn belangrijk om specifieke biologische vragen aan te pakken die te complex zijn om bij mensen te bestuderen. De spoelworm C. elegans is bijvoorbeeld een uitstekend model voor het uitvoeren van genetische analyse om biologische processen te ontleden die relevant zijn voor menselijke voeding en ziekte10. De sterk geconserveerde moleculaire paden die relevant zijn voor de menselijke fysiologie, complexe weefsels, gedragspatronen en overvloedige genetische manipulatietools maken C. elegans een opmerkelijk modelorganisme11. C. elegans is bijvoorbeeld uitstekend in het doorsturen van genetische schermen om fenotype-specifieke genen te identificeren, evenals in genoombrede omgekeerde genetische schermen via RNA-interferentie12.

In laboratoria worden de nematoden gekweekt op agar petriplaten bezaaid met een gazon van Escherichia coli-bacteriën, die macronutriënten zoals eiwitten, koolhydraten en verzadigde en onverzadigde vetzuren leveren als bronnen van energie en bouwstenen, en micronutriënten zoals co-factoren envitamines 13. Net als bij zoogdieren synthetiseren nematoden vetzuurmoleculen uit zowel palmitinezuur als stearinezuur (respectievelijk verzadigde 16-koolstof- en 18-koolstofmoleculen) die sequentieel verzadigd en langwerpig zijn tot een verscheidenheid aan enkelvoudig onverzadigde vetzuren (MUFA's) en meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA's)14,15,16,17,18. Interessant is dat C. elegans in staat is tot de novo synthese van alle vereiste vetzuren en kernenzymen die betrokken zijn bij de biosynthese, desaturatie en rek van vetzuren, waardoor de synthese van pufa's met langeketens wordt vergemakkelijkt 19. Anders dan andere diersoorten kan C. elegans 18-koolstof en 20-koolstof ω-6 vetzuren omzetten in ω-3 vetzuren met zijn eigen ω-3 desaturase enzymen. Bovendien bezitten wormen een Δ12-desaturase dat de vorming van linolzuur (LA) uit oliezuur katalyseert (OA, 18:1)20,21. De meeste dieren of planten missen zowel Δ12- als ω-3-desaturasen en zijn dus afhankelijk van de inname via de voeding van ω-6 en ω-3 om hun PUFA's te verkrijgen, terwijl C. elegans geen voedingsvetzuren nodig heeft22. Geïsoleerde mutanten zonder functionele desaturase-enzymen zijn gebruikt om de functies van specifieke vetzuren in verschillende biologische processen te bestuderen, waaronder reproductie, groei, levensduur en neurotransmissie. Het effect van individuele vetzuren op specifieke biologische routes kan worden aangepakt met behulp van zowel een genetische benadering als voedingssuppletie 16,17,23. Tot op heden heeft lipidenonderzoek zich gericht op het karakteriseren van genen die betrokken zijn bij de lipidesynthese, afbraak, opslag en afbraak in neurologische en ontwikkelingsstoornissen24. De rol van lipiden in de regulering van de levensduur begint echter net te worden onthuld.

Lipide signalering bij levensduurregulatie
Lipiden spelen een cruciale rol bij de regulering van de levensduur door cellulaire signaleringscascades in verschillende weefsels en celtypen te activeren. Recente studies hebben de actieve rol van lipiden benadrukt bij het moduleren van transcriptie en cel-celcommunicatie via lipidebindende eiwitten of herkenning van membraanreceptoren25. Bovendien biedt lipidensuppletie in de voeding een uitstekend hulpmiddel om te ontleden hoe het lipidenmetabolisme de levensduur in C. elegans beïnvloedt. Van verschillende MUFA's en PUFA's is aangetoond dat ze de levensduur bevorderen door transcriptiefactoren 26,27 te activeren.

Levensduurmodellen, waaronder de insuline/IGF-1-signalering en de ablatie van kiembaanvoorlopercellen, zijn geassocieerd met de MUFA-biosyntheseroute en MUFA-suppletie, inclusief oliezuur, palmitoleïnezuur en cis-vacceenzuur, is voldoende om de levensduur van C. elegans te verlengen26. Hoewel het levensduureffect van de MUFA-administratie verder onderzoek vereist, zal het onderliggende mechanisme waarschijnlijk worden gemedieerd door de SKN-1 / Nrf2-transcriptiefactor, die een belangrijke activator is van oxidatieve stressrespons en levensduurregulatie28,29. Onder MUFA's speelt een bepaalde klasse van vetacylethanolamiden genaamd N-acylethanolamines (NAE's) een cruciale rol in verschillende mechanismen, waaronder ontsteking, allergieën, leren, geheugen en energiemetabolisme30. Met name het lipidemolecuul dat bekend staat als oleoylethanolamide (OEA) is geïdentificeerd als een positieve regulator van de levensduur door de translocatie van het lipidebindende eiwit 8 (LBP-8) in de kern te bevorderen om de nucleaire hormoonreceptoren NHR-49 en NHR-807 te activeren. Suppletie van het OEA analoge KDS-5104 is voldoende om de levensduur te verlengen en induceert de expressie van genen die betrokken zijn bij oxidatieve stressreacties en mitochondriale β-oxidatie 7,8.

Tegelijkertijd is de rol van PUFA's ook gekoppeld aan regulering van de levensduur. Toediening van PUFA ω-3 vetzuur α-linoleenzuur (ALA) bevordert de levensduur door de NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF transcriptiefactoren te activeren en mitochondriale β-oxidatie te induceren31. Interessant is dat geperoxideerde producten van ALA, aangeduid als oxylipines, SKN-1 / NRF activeren, wat suggereert dat zowel PUFA's als hun oxidatieve derivaten voordelen voor de levensduur kunnen opleveren23. Suppletie van ω-6 vetzuur arachidonzuur (AA) en dihomo-γ-linoleenzuur (DGLA) verlengt de levensduur via autofagie-activering, bevordert de kwaliteitscontrole van eiwitten en resulteert in de afbraak van verspilde en toxische eiwitaggregaten27,32. Meer recent is aangetoond dat een cel-niet-autonome signaleringsregulatie gemedieerd door het lipidebindende eiwit 3 (LBP-3) en DGLA cruciaal is voor het bevorderen van de levensduur door perifere signalen naar neuronen te sturen, wat een langeafstandsrol van lipidemoleculen in interweefselcommunicatie op systemische niveaussuggereert 33. De huidige studie rapporteert elke stap om lipidensuppletie uit te voeren met bacteriën die op platen zijn gezaaid of bacteriële suspensie in vloeibare cultuur. Deze methodologieën worden gebruikt om de levensduur en transcriptionele analyse te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de inhoud van het hele lichaam of ontleedde weefsels die zijn afgeleid van een paar wormen. De volgende technieken kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid aan voedingsstudies en bieden een geldig hulpmiddel om te ontleden hoe lipidemetabolisme de levensduur en gezond ouder worden beïnvloedt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figuur 1 toont een schema van lipidenvoeding met behulp van verschillende experimentele instellingen.

1. Bereiding van lipide-geconditioneerde bacteriën

  1. Bereid de bacteriële verdunningsvoedingsrestrictie (BDR) basisoplossing door 5,85 g NaCl, 1,0 g K2HPO4 en 6,0 g KH2PO4 (zie materiaaltabel) op te lossen in 999 ml gedeïoniseerd water. Stel de pH in op 6,0 met 0,5 M KOH en filter vervolgens door een filter van 0,22 μm.
    OPMERKING: De BDR-oplossing kan bij kamertemperatuur worden bewaard voor langdurige opslag.
  2. Bereid het BDR-medium door 10 μL 5 mg/ml cholesterol (opgelost in 200-proof ethanol) toe te voegen aan elke 10 ml BDR-basisoplossing.
  3. Streep de OP50-bacteriën (zie materiaaltabel) van -80 °C-voorraad naar LB-agarplaten en incubeer 's nachts bij 37 °C.
    OPMERKING: Na de nachtelijke incubatie bij 37 °C kan de OP50-plaat maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard voor stabiele voedingsresultaten.
  4. Ent de OP50-bacteriën van de OP50 LB-agarplaat tot LB-medium en incubeer 's nachts (16 uur) in een schudder van 37 °C.
    OPMERKING: Het benodigde LB-mediumvolume is afhankelijk van de experimentele instellingen. Het wordt aanbevolen om 200 μL 5x geconcentreerde bacteriën te gebruiken die op elk van de platen van 6 cm zijn gezaaid en 1 ml 5x geconcentreerde bacteriën voor elk van de platen van 10 cm en elke replica van de vloeibare voedingsomstandigheden. Zo moeten respectievelijk 1 ml en 5 ml initiële LB-inenting worden voorbereid voor elke lipidenvoedingscultuur.
  5. Verzamel bacteriën door centrifugeren bij 4.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.
  6. Suspensie de bacteriële pellet in 20 ml BDR-basis en centrifugeer op 4.000 x g gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om de overgebleven resten van LB in de bacteriële pellet af te wassen.
  7. Suspensie elke bacteriële pellet in het BDR-medium om een 20x BDR-bacterievoorraad te maken. Verdun de 20x BDR bacteriebouillon met BDR medium tot 5x voor gebruik.
    OPMERKING: Gebruik een 1/20 volume BDR-medium van het oorspronkelijke LB-volume om een concentratie van 20x voor de bacteriën te bereiken. De 20x bacterievoorraad kan maximaal 1 week bij 4 °C bewaard worden.
  8. Bereid een lipide stockoplossing, met behulp van ethanol of dimethylsulfoxide (DMSO) als oplosmiddel in een nieuwe injectieflacon met autoclaven, en vul de glazen injectieflacon met argon of stikstof om oxidatie te voorkomen.
    OPMERKING: De concentratie van de voorraadoplossing ligt meestal tussen 250 mM en 1 mM.
  9. Breng de lipidevoorraadoplossing over naar de gewenste hoeveelheid BDR-bacterieoplossing om de gewenste eindconcentratie in voedingsomstandigheden te bereiken. Meng grondig door 20 s te vortexen.
    OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van de lipiden in voeding is meestal 1 μM tot 1 mM, afhankelijk van de lipide- en testomstandigheden. Het wordt aanbevolen om eerst een proefexperiment uit te voeren om verschillende concentraties te testen, variërend van 0,1 μM tot 1 mM als u met nieuwe lipiden werkt. Meng de lipide stockoplossing met BDR-bacteriën onmiddellijk voordat u deze op het bord zaait of in vloeibare wormculturen plaatst. Bereid de lipide-geconditioneerde bacteriën niet langer dan 1 uur voordat ze aan de wormen worden gevoerd.
  10. Meng dezelfde volumes gefilterde ethanol of DMSO (afhankelijk van welke wordt gebruikt voor de lipidenvoedingsgroep) met BDR-bacteriën om als voertuigcontrole te dienen.

2. Bereiding van gesynchroniseerde C. elegans voor lipidensuppletie

  1. Bereid M9-buffer door menging (met behulp van gespecificeerde eindconcentraties)22mM KH 2 PO4,22mM Na 2 HPO4, 85 mM NaCl en 2 mM MgSO4 (zie Materiaaltabel). Autoclaaf de buffer om te steriliseren.
  2. Bereid een verse bleekoplossing met 60% huisbleekmiddel (v/v, zie Materiaaltabel) en een eindconcentratie van 1,6 M NaOH.
  3. Verzamel gravid volwassenen in een conische buis van 15 ml met behulp van 10 ml M9-buffer.
    OPMERKING: Het aantal wormen en platen dat nodig is voor synchronisatie is afhankelijk van de experimentele instellingen (d.w.z. het aantal voorwaarden en replicaties en voedingsmethoden). Idealiter zou elke volledige 6 cm plaat van volwassen wormen na synchronisatie ten minste 600 L1-wormen moeten kunnen opleveren.
  4. Draai de wormen op 1.450 x g gedurende 30 s. Verwijder het supernatant en spoel de wormen nog een keer af met 10 ml M9-buffer.
  5. Draai de wormen op 1.450 x g gedurende 30 s. Adem het supernatant aan en laat een aliquot van 4 ml achter in de conische buis. Voeg 2 ml bleekoplossing toe en schud krachtig gedurende 1 min.
  6. Draai de wormen op 1.450 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
  7. Verwijder het supernatant en voeg 4 ml M9-buffer en 2 ml bleekoplossing toe. Schud de buis totdat de wormlichamen zijn opgelost.
  8. Draai de eieren op 1.450 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
  9. Verwijder het supernatant en was de eieren met 10 ml M9-buffer.
  10. Herhaal stap 2.8 en 2.9 3x.
  11. Suspensie de embryo's met 6 ml M9-buffer. Schommel de embryo's gedurende 2 dagen op een rotator bij 20 °C om ze te laten uitkomen en synchroniseren.
  12. Breng L1-larven over naar OP50-gezaaide platen. Incubeer bij 20 °C gedurende 48 uur om gesynchroniseerde L4-wormen te verzamelen, 72 uur voor volwassenen van dag 1 en 96 uur voor volwassenen van dag 2.
    OPMERKING: OP50-platen worden bereid door 1 ml 20x OP50-bacteriën toe te voegen aan elke 10 cm nematodegroeimedium (NGM) plaat34. 30.000 L1-wormen kunnen op elk van de OP50-platen worden gezaaid als ze de wormen in het L4-stadium willen oogsten, en 20.000 L1-wormen kunnen op elk van de OP50-platen worden gezaaid als ze ernaar streven dag-1-volwassenen te oogsten in de huidige experimentele omgevingen. Het kan verschillen voor verschillende laboratoriuminstellingen, dus het wordt aanbevolen om de wormnummers te testen die kunnen worden gezaaid om ervoor te zorgen dat de wormen voldoende voedsel over hebben voordat ze worden geoogst.
  13. Verzamel L4, dag-1 volwassen of dag-2 volwassen wormen in een conische buis van 15 ml met behulp van 10 ml M9-buffer. Gebruik nog eens 5 ml M9-buffer om de overgebleven wormen van de platen te spoelen.
  14. Draai de wormen op 1.450 x g gedurende 30 s en gooi het supernatant weg. Was de wormkorrel met 10 ml BDR-medium, centrifugeer op 1.450 x g gedurende 30 s en gooi het supernatant weg.
  15. Voor wormen in de vloeibare voedingsmethode, breng het BDR-medium over naar de wormen om een wormconcentratie van 3.000 wormen / ml te bereiken. Voor wormen in voermethoden op de plaat, vermindert u het volume van het BDR-medium dat aan de wormen wordt toegevoegd om de droogtijd op de plaat te verkorten.

3. Lipidensuppletie voor C. elegans

  1. Voer lipidensuppletie uit in vloeibare cultuur volgens de onderstaande stappen.
    OPMERKING: Deze methode is geschikt voor het testen van transcriptionele veranderingen met behulp van bulkwormen aangevuld met lipiden.
    1. Breng de gewenste hoeveelheid lipide of voertuigcontrole over naar elk van de putten in een 12-wellsplaat. Bereid drie tot vier putten voor elke voedingsconditie voor als een biologische replicatie.
    2. Meng de wormensuspensie uit stap 2.15 met 5x BDR bacteriën in een verhouding van 1:1 om een eindconcentratie van 1.500 wormen/ml en 2,5x voor bacteriën te bereiken.
    3. Breng 2 ml van het worm-bacteriemengsel in BDR-medium over naar elk putje van de 12-wellsplaat.
    4. Wikkel de 12-wells plaat met folie en schud in een incubator van 20 °C bij 100 rpm voor de gewenste incubatielengte.
      OPMERKING: Om verschillende voedingsomstandigheden te testen, incubeer de lipiden met wormen gedurende verschillende tijdsduur, zoals gedurende 6 uur, 12 uur en 24 uur. Bovendien kunnen verschillende wormstadia worden getest op optimale resultaten, waaronder lipidenvoeding vanaf het L4- of dag-1-volwassen stadium.
  2. Voer lipidensuppletie uit op de 10 cm NGM-agarplaten volgens de onderstaande stappen.
    OPMERKING: Deze methode is geschikt voor het testen van transcriptionele veranderingen met behulp van bulkwormen aangevuld met lipiden.
    1. Zaai 1 ml van de lipide-geconditioneerde bacteriën vanaf stap 1.9 op het midden van elk van de platen van 10 cm. Wanneer een groot aantal platen is bereid, vortex de uiteindelijke werkoplossing meerdere keren tussen het zaaien. Droog de platen in het donker met behulp van een bioveiligheidskap.
    2. Breng 3.000 wormen over van stap 2.15 naar elk van de 10 cm platen. Droog de platen in een bioveiligheidskap totdat de wormen op de met lipiden aangevulde platen kunnen kruipen in plaats van te zwemmen.
    3. Incubeer de wormen op de lipide-geconditioneerde platen in een incubator van 20 °C gedurende de gewenste tijdsduur. Bescherm tegen licht bij gebruik van meervoudig onverzadigde lipiden.
      OPMERKING: Om verschillende voedingsomstandigheden te testen, incubeer de lipiden met wormen gedurende verschillende tijdsduur, zoals 6 uur, 12 uur en 24 uur. Bovendien kunnen verschillende wormstadia worden getest op optimale resultaten, waaronder lipidenvoeding in het L4- of dag-1-volwassen stadium.
  3. Voer lipidensuppletie uit op de 6 cm NGM-agarplaten voor transcriptionele analyse.
    OPMERKING: Deze methode is geschikt voor het testen van transcriptionele veranderingen in een paar wormen aangevuld met lipiden.
    1. Zaai 300 μL lipide-geconditioneerde bacteriën vanaf stap 1.9 op het midden van elk van de 6 cm plaat. Wanneer een groot aantal platen is bereid, vortex de uiteindelijke werkoplossing meerdere keren tussen het zaaien. Droog de platen in het donker met behulp van een bioveiligheidskap.
    2. Breng tot 300 wormen over van stap 2.15 naar elk van de 6 cm platen. Droog de platen in een bioveiligheidskap totdat wormen op de met lipiden aangevulde platen kunnen kruipen in plaats van te zwemmen.
    3. Incubeer de wormen op de lipide-geconditioneerde platen in een incubator van 20 °C gedurende de gewenste tijdsduur. Bescherm tegen licht bij gebruik van meervoudig onverzadigde lipiden.
      OPMERKING: Om verschillende voedingsomstandigheden te testen, incubeer de lipiden met wormen op verschillende tijdstippen, zoals 6 uur, 12 uur en 24 uur. Bovendien kunnen verschillende wormstadia worden getest op optimale resultaten, waaronder lipidenvoeding in het L4- of dag-1-volwassen stadium.
  4. Voer lipidensuppletie uit op de 6 cm NGM-agarplaten voor longitudinale levensduurtest.
    1. Zaai 200 μL lipide-geconditioneerde bacteriën (met 1x lipideconcentratie en 5x geconcentreerde bacteriën) op het midden van elk van de 6 cm NGM-platen. Bereid drie platen voor elke voedingsconditie voor.
      OPMERKING: De borden moeten vers worden bereid op de dag van gebruik (idealiter vlak voor gebruik).
    2. Droog de platen in een bioveiligheidskap. Houd de lichten in de motorkap en de kamer uit als u meervoudig onverzadigde lipiden gebruikt.
    3. Kies 30-40 gesynchroniseerde L4-wormen naar elk van de platen. Bewaar de platen met de wormen in een incubator van 20 °C. Als u voedt met meervoudig onverzadigde lipiden, bewaar dan platen in een lichtbeschermde doos in de incubator van 20 °C.
      OPMERKING: Het is mogelijk om OP50 van een normale 6 cm passageplaat (ongeconditioneerde OP50) te gebruiken als lijm om wormen op te pikken, maar het is cruciaal om geen bulkhoeveelheid van de ongeconditioneerde OP50 in de testplaat achter te laten.
    4. Breng de wormen dagelijks of om de andere dag over naar nieuwe, vers gemaakte lipidenplaten, afhankelijk van de gewenste voedingsconditie. Overleving wordt op dezelfde manier gescoord als eerder beschreven4.

4. RNA-extractie voor transcriptionele analyse

  1. Voer RNA-extractie uit een groot aantal hele wormen uit.
    1. Breng wormen over in de vloeistofcultuur van stap 3,1 naar 1,5 ml microcentrifugebuizen. Was wormen van de 10 cm platen uit stap 3.2 met behulp van M9 buffer en breng de wormen over in M9 buffer naar 1,5 ml microcentrifugebuizen.
    2. Centrifugeer de wormen kort met een tafelblad minicentrifuge (zie Materiaaltabel) gedurende 10 s en zuig het supernatant snel aan.
    3. Breng overgebleven wormen over van de vloeibare voedingsputten of was van de plaatvoedingen naar dezelfde buis en spin naar beneden. Verwijder het supernatant.
    4. Was de wormkorrels met 1 ml ijskoude M9, draai kort gedurende 10 s met een minicentrifuge en aspirateer het supernatant. Herhaal 1x of 2x, afhankelijk van de transparantie van het supernatant.
    5. Zet de microcentrifugebuizen 2 min op ijs en verwijder zoveel mogelijk supernatant met een pipet van 200 μL, waardoor een verpakte wormkorrel van niet meer dan 15 μL volume overblijft.
    6. Breng 15 μL RNA-extractieoplossing met fenol en guanidine-isothiocyanaat (tabel met materialen) over naar elk van de microcentrifugebuizen en maal de wormen met een motormolen gedurende ongeveer 30 s totdat er geen intacte wormen zichtbaar zijn.
      LET OP: De RNA-extractieoplossing is giftig en ontvlambaar en elke stap waarbij een open container met dit reagens betrokken is, moet in een chemische kap worden gebruikt.
    7. Breng 285 μL van de RNA-extractieoplossing over naar de microcentrifugebuis terwijl u het wormgehalte van de punt van de motormolen naar de microcentrifugebuis spoelt. Vortex om grondig te mengen.
      OPMERKING: Dit is een pauzepunt. Monsters kunnen een paar maanden in de RNA-extractieoplossing bij -80 °C worden bewaard. Wanneer genomen uit de -80 °C, laat de monsters ontdooien bij kamertemperatuur.
    8. Breng 60 μL chloroform over naar elk monster en vortex krachtig. Laat de monsters 10 min op kamertemperatuur bezinken.
      LET OP: Chloroform is giftig en moet worden behandeld in een chemische kap.
    9. Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Breng voorzichtig 140 μL van de waterige laag aan de bovenkant over naar een nieuwe en RNase-vrije microcentrifugebuis met behulp van een pipet van 200 μL, waarbij elke keer 2x met 70 μL wordt overgebracht.
      OPMERKING: Vanaf deze stap moeten alle pipetpunten en containers die direct contact hebben met het monster RNase-vrij zijn. Er wordt ook voorgesteld om de RNase-decontaminatieoplossing te gebruiken om alle apparatuur en de werkruimte af te vegen.
    10. Breng 140 μL isopropanol over in de monsterbuis. Vortex krachtig en laat het monster gedurende 10 minuten op kamertemperatuur bezinken. Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C en verwijder voorzichtig alle supernatant.
    11. Breng 0,5 ml ijskoude 80% ethanol (v/v) over naar de monsterbuis met de RNA-pellet. Vortex krachtig totdat de RNA-pellet de bodem van de buis verlaat en rondzweeft in de ethanoloplossing. Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant.
    12. Centrifugeer de monsterbuizen kort in de minicentrifuge gedurende 15 s om elk oplosmiddel dat zich aan de buiswand hecht te laten draaien en verwijder vervolgens de zoveel mogelijk ethanoloplossing met een pipet.
    13. Laat de buisdop open om de RNA-pellet te drogen. Als de pellet grondig is gewassen met de ethanoloplossing, moet de droogstap minder dan 10 minuten duren.
      OPMERKING: Dit is een pauzepunt. De gedroogde RNA-pellet kan maximaal 1 maand bij -80 °C worden bewaard.
    14. Los de droge RNA-pellet op met 40 μL nucleasevrij water en verwerk met een DNA-verwijderkit volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om eerst RNA op te lossen in nucleasevrij water. Als 40 μL water wordt gemengd met de 10x DNase-buffer voordat het naar de RNA-buis wordt overgebracht, lost de RNA-pellet niet volledig op. De RNA-monsters moeten op ijs worden bewaard bij het oplossen van de RNA-pellet in water. Vries-dooicycli verminderen de RNA-kwaliteit; ga daarom verder met de reverse transcriptiestap op dezelfde dag van de DNase-behandeling.
  2. RNA-extractie uit een klein aantal hele wormen.
    1. Pluk 15-20 wormen van hun bacteriële gazon in een verse ongezaaide NGM-plaat om de bacteriën uit de worm te verwijderen.
    2. Volgens de fabrikant van de qRT-PCR 2-stappenkit (zie Materiaaltabel), bereidt u 20 μL uiteindelijke lysisoplossing voor elk monster door 0,2 μL DNase te mengen met 19,8 μL lysisoplossing in PCR-buizen. Meng de lysisoplossing door 5x op en neer te pipetteren.
    3. Breng 15-20 wormen van de ongezaaide NGM-plaat over in de PCR-buis die 20 μL van de uiteindelijke lysisoplossing met het minimale aantal bacteriën bevat. Incubeer de lysereactie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Sonde-sonicate (zie Tabel van Materialen) de wormen met 30% amplitude met behulp van het volgende programma: ultrasoonapparaat gedurende 5 s, pauzeer gedurende 5 s en herhaal 4x met een totale ultrasoonapparaattijd van 20 s. Bewaar de monsters in een ijskoud waterbad tijdens ultrasoonapparaat.
    5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
      OPMERKING: Voeg meer DNase toe vóór incubatie als de no-RT negatieve controle DNA-besmetting op een zorgwekkend niveau laat zien.
    6. Breng 2 μL stopoplossing over in de lysereactie en meng door zachtjes te tikken. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en zet vervolgens op ijs.
      OPMERKING: De monsters kunnen maximaal 2 uur op ijs worden achtergelaten voordat ze doorgaan met de omgekeerde transcriptiestap.
  3. Voer RNA-extractie uit wormweefsels uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Pluk ongeveer 20 wormen uit hun bacteriële gazon en plaats ze op een verse ongezaaide NGM-plaat om de bacteriën eruit te verwijderen.
    2. Verplaats de 20 wormen (met zo min mogelijk bacteriën) naar een horlogeglas met 500 μL M9-oplossing met 4 μM levamisol (zie Materiaaltabel). De immobilisatie vindt binnen enkele seconden plaats.
    3. Wanneer de wormen zijn geïmmobiliseerd, ontleedt u de kiembaan of darm met behulp van een naald van 25 G die aan de spuit van 1 ml kan worden bevestigd.
      1. Voer onder de dissectiescope een snede uit op de positie van de tweede faryngeale bol om natuurlijke extrusie van de darm en kiembaan mogelijk te maken. De twee weefsels kunnen gemakkelijk worden onderscheiden op basis van hun morfologie en verschillende contrast. Gebruik een pincet of naalden om de weefsels voorzichtig te scheiden en te voorkomen dat ze worden beschadigd.
        OPMERKING: Het wordt aanbevolen om binnen 5-10 minuten te ontleden. Als de snee geen goede weefselextrusie produceert, wordt voorgesteld om naar de volgende worm te gaan en er binnen 10 minuten zoveel mogelijk te ontleden. Deze procedure vereist een kort tijdsbestek om transcriptionele veranderingen van de omgeving te voorkomen.
    4. Volgens de fabrikant van de qRT-PCR 2-stappenkit bereidt u 20 μL uiteindelijke lysisoplossing voor elk monster door 0,2 μL DNase I te mengen met 19,8 μL lysisoplossing in de PCR-buizen. Meng de lysisoplossing door 5x op en neer te pipetteren.
    5. Gebruik een geautoclaveerde glazen pipet om de ontleedde weefsels over te brengen in een PCR-buis. Zet de PCR-buizen gedurende 2 minuten op ijs om materiaalafzetting op de bodem mogelijk te maken. Verwijder het supernatant, voeg 20 μL uiteindelijke lysisoplossing toe aan de PCR-buis en meng door te tikken.
    6. Incubeer de lysereactie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng vervolgens 2 μL stopoplossing over in de lysereactie en meng door te tikken. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: De monsters kunnen maximaal 2 uur op ijs worden achtergelaten voordat ze doorgaan met de omgekeerde transcriptiestap.

5. Reverse transcriptie en qRT-PCR

  1. Voer reverse transcriptie en qRT-PCR uit van bulkwormen.
    1. Meet de RNA-concentratie en bereid 5 μg totaal RNA voor op reverse transcriptie.
    2. Bereid een gepoold RNA-monster voor door gelijke hoeveelheden RNA uit elk monster te mengen en de uiteindelijke RNA-concentratie aan te passen aan 0,556 g /L (5 μg / 9 μL). Gebruik het gepoolde RNA-monster voor de qRT-PCR-standaardcurve en RT-negatieve controles.
    3. Voer reverse transcriptie uit volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Voer de volgende omgekeerde transcriptiereacties voor kwaliteitscontrole uit naast de afzonderlijke RNA-monsters.
      1. Voer omgekeerde transcriptie uit met het gepoolde RNA-monster als sjabloon (voor qRT-PCR-standaardcurve).
      2. Voer reverse transcriptie uit met het gepoolde RNA-monster als sjabloon, zonder de reverse transcriptase (RT-negatieve controle; kwaliteitscontrole voor potentiële genoom-DNA-besmetting).
      3. Voer reverse transcriptie uit met het nucleasevrije water als sjabloon (RT-negatieve controle; kwaliteitscontrole voor mogelijke RNA-verontreiniging in reagentia).
        OPMERKING: Dit is een pauzepunt. Monsters kunnen 's nachts in de thermocycler worden achtergelaten of enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.
    4. Verdun het cDNA gegenereerd uit de gepoolde RNA-monsters vier keer, 20 keer, 100 keer en 500 keer met nucleasevrij water voor qRT-PCR-standaardcurven.
    5. Verdun het cDNA gegenereerd uit elk RNA-monster 20-100 keer om te gebruiken als sjablonen voor de qRT-PCR-reacties.
      OPMERKING: De verdunningsverhouding hangt af van de overvloed van het gen van belang. Voor hoogexpressiegenen, zoals huishoudgenen of egl-3 en egl-21 die in deze studie worden gebruikt, wordt een verdunning van 100x aanbevolen. Voor laag tot expressie gebrachte genen, zoals lbp-8, wordt een verdunning van 20x aanbevolen.
    6. Voer qRT-PCR uit met qRT-PCR-reagentia volgens de instructies van de fabrikant als volgt: 95 °C gedurende 10 minuten, herhaal 40 keer met 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door het standaard smeltcurveprogramma en houd het voor onbepaalde tijd op 8 °C.
  2. Voer reverse transcriptie en qRT-PCR uit van een paar wormen of wormweefsels.
    1. Breng 25 μL RT-buffer en 2,5 μL 20x RT-enzymmengsel uit de qPCR 2-stappenkit (zie Materiaaltabel) over in elke buis die wormlysaat bevat uit stap 4.2.6 of stap 4.3.6.
      OPMERKING: Een RT-negatieve controle is van cruciaal belang voor qRT-PCR van een paar wormen. Elk experiment moet een monster van wormlysaat bevatten (vanaf stap 4.2.6) met RT-buffer maar zonder RT-enzym om de DNA-besmetting in de monsters te onderzoeken. Als DNA-besmetting een probleem is, overweeg dan om meer DNase toe te voegen aan de lysisbuffer of meer DNase aan het monster nadat de wormen zijn gelyseerd. Als alternatief kan men RT-negatieve controle uitvoeren voor elk monster door de helft van het lysaat te gebruiken in een normale RT-reactie en de andere helft in een RT-reactie zonder reverse transcriptase.
    2. Mix door zachtjes te tikken. Spin down met behulp van een minicentrifuge gedurende 10 s.
    3. Laad de monsters in de thermocyclermachine volgens de instructies van de fabrikant: 37 °C gedurende 60 minuten, 95 °C gedurende 5 minuten en 8 °C voor onbepaalde tijd.
      OPMERKING: Dit is een pauzepunt. Monsters kunnen 's nachts in de thermocycler worden achtergelaten of enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.
    4. Bewaar alle reagentia en monsters op ijs en bescherm de qRT-PCR-reagentia tegen licht.
    5. Bereid een 96-well qPCR-plaat en meng in elke put 6 μL nucleasevrij water, 10 μL qRT-PCR-reagens, 2 μL 5 μM primermix (vooruit en achteruit) en 2 μL cDNA. Bedek het 96-well qPCR-plaatoppervlak met een beschermende optische film en druk naar beneden om af te dichten.
    6. Voer het qRT-PCR-programma uit op een thermische cycler volgens de instructies van de fabrikant als volgt: 50 °C gedurende 2 min, 95 °C gedurende 2 minuten, herhaal 40 keer met 95 °C gedurende 3 s en 60 °C gedurende 30 s, gevolgd door 8 °C voor onbepaalde tijd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validatie van transcriptionele veranderingen met behulp van een paar hele wormen bij lipidensuppletie
Om te onderzoeken of het protocol om RNA in cDNA te extraheren en retrotranscriberen van een paar hele wormen reproduceerbaar is en vergelijkbaar is met de gegevens van bulkwormen, werd een langlevende wormenstam gebruikt die het lysosomale zure lipase lipl-4 in de darm overexpressie gaf 7,8,33,35. De transcriptionele inductie van de neuropeptideverwerkingsgenen egl-3 en egl-21 gerapporteerd in eerdere studies 7,8,33 werd gevalideerd (figuur 2A,B). Deze inductie geeft aan dat de RNA-extractiemethode van enkele dieren een geldig alternatief is voor standaard cDNA-synthesetechnieken uit bulkwormculturen.

Validatie van transcriptionele evaluaties met behulp van ontleed wormweefsels bij lipidensuppletie
Bij C. elegans is de synthese van 20-koolstof PUFA's afhankelijk van de activiteit van het desaturase FAT-316,17. Eerdere studies hebben gemeld dat vet-3-mutanten 20-koolstof PUFA's missen, waaronder DGLA16. Eerder werd ontdekt dat het verlies van Δ6-desaturase FAT-3 in lipl-4g-wormen de transcriptionele inductie van de neuropeptideverwerkingsgenen egl-3 en egl-2133 onderdrukt. Bovendien redt DGLA-suppletie dergelijke inductie33. Het gen dat codeert voor egl-21 komt tot expressie in neuronen, terwijl egl-3 wordt gedetecteerd in zowel neuronen als darmen36,37. Om verder te testen of DGLA-suppletie de inductie van egl-3 en egl-21 in de darm of in de neuronen herstelt, werd de darm ontleed en werden hun transcriptionele niveaus beoordeeld met behulp van qRT-PCR-analyse beschreven in stappen 4.3 en 5.2 van dit protocol. DGLA werd aangevuld in het bronvoedsel gedurende 12 uur op dag-1 volwassenheid. Er werd geen transcriptionele inductie van egl-3 of egl-21 gevonden in de darm (figuur 2C), wat consistent is met eerdere bevindingen36,38.

Validatie van levensduurtest op lipidensuppletie
De relatie tussen 20-koolstof PUFA's en het levensduurmechanisme dat vet-3 inactiveert, werd eerder onderzocht, met name in de darm van lipl-4g-wormen 33. Het bleek dat de fat-3 knockdown de levensduurverlenging van lipl-433 volledig onderdrukt. Om te beoordelen of DGLA de levensduur herstelt die wordt beïnvloed door lipl-4, werd DGLA om de andere dag vers aangevuld in het bronvoedsel op dag- 1 van de volwassenheid. Het bleek dat bij fat-3 knockdown, de DGLA-suppletie de levensduurverlenging redt (figuur 2D) 33, wat wijst op een succesvolle lipidensuppletieprocedure in combinatie met de levensduurtest.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van lipidenvoeding met verschillende experimentele instellingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Validatie van de transcriptionele evaluatie van de neuropeptideverwerkingsgenen met behulp van een grote populatie wormen, een paar wormen en ontleedde weefsels. (A) RNA geëxtraheerd uit een grote populatie wormen toont de inductie van de egl-3- en egl-21-transcriptniveaus van de neuropeptideverwerkingsgenenbij lipl-4 Tg-dieren. Foutbalken vertegenwoordigen ±1 SEM. **** p < 0,0001 door de t-test van de student met twee staarten. (B) RNA-extractie uit een paar wormen bevestigt de inductie van de egl-3- en egl-21-transcriptniveaus van neuropeptideverwerkingsgenen in lipl-4 Tg-wormen. Foutbalken vertegenwoordigen ±1 SEM. **** p < 0,0001 door de t-test van de student met twee staarten. (C) Neuronale neuropeptideverwerkingsgenen egl-3 en egl-21 worden niet geïnduceerd in ontlede darmen. Foutbalken vertegenwoordigen ±1 SEM. Statistische analyse met tweezijdige Student's t-test. (D) DGLA-suppletie in verschillende concentraties, waaronder 10 μm, 100 μm en 1 mM, redt het lipl-4Tg levensduureffect op vet-3 RNAi. p < 0,001 door log-rank test. Dit cijfer is overgenomen uit Savini et al.33. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lipidensuppletie is gebruikt in verouderingsonderzoek om de directe impact van bepaalde lipidensoorten op gezond ouder worden op te helderen 6,7,23,26,27,31. De lipidensuppletieprocedure kan echter een uitdaging zijn en elke inconsistentie tussen experimenten kan niet-reproduceerbare resultaten veroorzaken. Hier wordt het eerste gedetailleerde stapsgewijze protocol gedocumenteerd om nieuwe wetenschappers te begeleiden om de potentiële valkuilen veroorzaakt door technische onnauwkeurigheid te vermijden. De kritieke stappen in dit protocol zullen in de volgende paragrafen in detail worden besproken. De gereedschapskist voor lipidenonderzoek wordt ook uitgebreid door RNA-isolatie van slechts een paar wormen en specifieke wormweefsels te introduceren na lipidensuppletie. Bij het overwegen van de methodologie om transcriptniveaus te onderzoeken, is de qRT-PCR met een paar wormen of ontleedde weefsels uitstekend voor het analyseren van een paar transcripties of het onderzoeken van bepaalde weefselspecifieke transcriptionele veranderingen. Bovendien kan het gebruik van deze methoden de stap van wormversterking overwinnen die ongeveer 5-6 extra dagen kan duren. Tegelijkertijd is lipidenvoeding gevolgd door bulk-RNA-extractie kosteneffectiever en een geldig alternatief wanneer een grotere set doelgenen moet worden geanalyseerd.

Verschillende stappen kunnen van cruciaal belang zijn voor de reproduceerbaarheid van lipidevoedingseffecten. Het eerste aspect is gerelateerd aan de bacteriële omstandigheden. Het wordt aanbevolen om verse bacteriële platen te gebruiken die niet ouder zijn dan 7 dagen voor inenting. Het wordt aanbevolen om bacteriën te gebruiken die binnen 1 week in BDR-medium zijn bereid. Bacteriën die zijn gemengd met lipiden moeten meteen worden gebruikt. Lipiden met bacteriën mogen niet worden bewaard, zelfs niet bij 4 °C, omdat de bacteriën de lipiden zullen metaboliseren. De wasstappen in de BDR-basis en resuspensie in het BDR-medium zijn van cruciaal belang voor bacterieomstandigheden, omdat bacteriën in LB werden gekweekt en rechtstreeks aan wormen werden gevoerd, elimineert altijd de diepgaande effecten van lipidesupplementen. De tweede factor is geassocieerd met wormaandoeningen. C. elegans moeten gedurende ten minste drie generaties voorafgaand aan de bleekstap voor de bereiding van eieren niet worden uitgehongerd om ervoor te zorgen dat ze zich in een gezonde en stabiele metabole toestand bevinden. Het is ook cruciaal om C. elegans op agarplaten te kweken voorafgaand aan lipidensuppletie; dit omvat voor en na de synchronisatiestap.

Wormen die zich langdurig hebben aangepast aan vloeibare culturen zijn gedeeltelijk uitgehongerd; uithongering verhoogt de basislijn voor pro-levensduurgenen, wat leidt tot een verzwakt effect van lipidensuppletie. Als de metabole drift en veranderingen met behulp van gearresteerde L1-larven zorgen zijn, zou een geldig alternatief zijn om de eieren direct te platen. Wanneer slechts een paar wormen nodig zijn om levensduur- of genexpressieanalyse uit te voeren, is het mogelijk om eieren rechtstreeks op lipide-geconditioneerde platen te plaatsen en ze opnieuw te synchroniseren door ze met de hand te plukken in het L4-stadium voor volgende experimenten. Als er echter grote hoeveelheden wormen nodig zijn wanneer het met de hand plukken van L4 niet van toepassing is, is het direct plateren van eieren niet ideaal. Eieren die uitkomen na het bleken van gravid volwassenen kunnen op verschillende tijdstippen optreden en ervoor zorgen dat de populatie niet gesynchroniseerd is, wat de transcriptionele analyse zou verstoren. Het derde kritieke deel is gekoppeld aan de lipideopslagomstandigheden; bij het aanvullen van PUFA's is extra aandacht nodig omdat deze moleculen gevoelig zijn voor licht en gevoelig zijn voor oxidatie in de lucht.

Meerdere lipidenvoedingsomstandigheden, waaronder wormstadia, suppletielengte en concentraties, vereisen verder onderzoek bij het testen van nieuwe lipidemoleculen. L4, dag-1 volwassen en dag-2 volwassen wormen zijn meestal het startpunt voor het testen in verschillende wormstadia. Met name bij het voeren van L4-wormen, als de incubatietijd eindigt rond de ruifase van de nematoden, wordt een grote variatie verwacht, die de betekenis en reproduceerbaarheid van de resultaten sterk beïnvloedt. Een extra uitdaging voor het gebruik van dag-1 of dag-2 volwassen wormen is gerelateerd aan de nakomelingen die de genexpressieanalyse kunnen bemoeilijken. In dit geval is RNA-extractie uit een paar hele wormen betrouwbaarder dan bulkpopulaties. Verschillende lipidemoleculen hebben verschillende concentratiebereiken om fysiologische effecten te produceren; daarom wordt voorgesteld een reeks concentraties van 1 μM tot 1 mM te testen.

Er zijn een paar beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het kiezen van de voedingsmethode. Ten eerste, wanneer lipiden niet kunnen worden geabsorbeerd of ingenomen door de wormen, is het een uitdaging om een suppletiemethode te gebruiken om hun biologische effect in C. elegans te testen. Met de huidige technologieën zijn massaspectrometrie of SRS in combinatie met 13C- of 2H-gelabelde lipideverbindingen39 geldige hulpmiddelen om de opname van lipiden in het wormlichaam te testen. Ten tweede zijn deze voedingsmethoden niet geoptimaliseerd voor onderzoekstechnieken met een hoge doorvoer. Voor lipidensuppletie met bulkwormen is de monstervoorbereiding van de vloeibare voedingsmethode sneller dan voeding op de plaat, omdat de vloeistofculturen rechtstreeks kunnen worden overgebracht naar microcentrifugebuizen in plaats van af te spoelen van de voedingsplaten. Om ervoor te zorgen dat het geëxtraheerde RNA in de staat van oogst is, wordt voorgesteld om niet meer dan 15-20 minuten te laten passeren tussen het punt van het zetten van de wormen op ijs tot het malen ervan in de RNA-extractieoplossing. Het wordt aanbevolen om elke 15 minuten minder omstandigheden te verwerken wanneer een groot aantal monsters moet worden verwerkt. Voor hele worm-RNA-extractie van een paar dieren is de handplukstap de snelheidsbeperkende stap, terwijl het voor het ontleden van weefsels cruciaal is om op een tijdsefficiënte manier te handelen om langdurige blootstelling aan een niet-fysiologische omgeving te voorkomen. Net als bij bulk RNA-extractie heeft het plukken van wormen of het ontleden van weefselmonsters binnen 10 minuten de voorkeur.

Ondanks de beperkingen kunnen deze suppletiemethoden worden gebruikt buiten lipidenonderzoek om de identificatie van eventuele voedings- en medicinale effecten te helpen. De hier gerapporteerde procedures zijn niet alleen beperkt tot verouderingsonderzoek, maar ook tot alternatieve fenotypen om organelconditie en celstofwisseling homeostase te beoordelen. De suppletiemethode met bulkpopulatie kan worden gekoppeld aan RNA-seq voor transcriptoomanalyse, massaspectrometrie voor metabolomische en proteomische analyse, of Western blot voor analyse van specifieke eiwitmarkers, terwijl de lipidensuppletie met een paar wormen kan worden gecombineerd met beeldvorming en gedragsanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Wij danken P. Svay voor de onderhoudsondersteuning. Dit werk werd ondersteund door NIH-beurzen R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI-onderzoeker (M.C.W.) en NIH T32 ES027801 predoctorale student fellow (MS). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Pestle Genesee Scientific 93-165P15 For worm grinding with Trizol
Agarose Sigma A9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix GenDEPOT R5600 For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR ThermoFisher A28567 For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge Benchmark Scientific C1248 For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip Branson Ultrasonic Corporation 100-132-888R
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cholesterol Sigma C8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifuge Eppendorf 22620444R For RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler pro Eppendorf 950030010 For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate Neta Scientific 665180 12-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm Neta Scientific 664161 For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm Neta Scientific 628161 For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free water ThermoFisher AM9937
Isoproanol Sigma PX1835-2
Levamisole hydrochloride VWR SPCML1054
lipl-4Tg MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22) MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
Luria Broth Base ThermoFisher 12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma M2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode ThermoFisher 4483354 96-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied BioSystem 4311971 For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System Sigma Z00Q0V0WW Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2 Caenorhabditis Genetics Center N/A C. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher N/A For measuring RNA concentration
OP50 Caenorhabditis Genetics Center N/A Bacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) Sigma P5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma P0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kit ThermoFisher 4402953 For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher 4367659 For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach  KIK International LLC. 59647210143 6% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA Watch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination Solution ThermoFisher AM9780
Sodium cloride (NaCl) Sigma S7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma SX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) Sigma S9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge Thermo 7500-4337 For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge Thermo 7500-7200 For worm egg preparation
TRIzol Reagent TheroFisher 15596018 RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kit ThermoFisher AM1907 For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59 Denville Scientific INV S7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor VWR 47747-370 For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 VWR N/A For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm picker WormStuff 59-AWP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
  2. Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures. Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).
  3. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  4. Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism. Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).
  5. Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity. Olsen, A., Gill, M. , Springer. Cham. 307-329 (2017).
  6. Lesa, G. M., et al. Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).
  7. Folick, A., et al. Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans. Science. 347 (6217), 83-86 (2015).
  8. Ramachandran, P. V., et al. Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity. Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).
  9. Byrne, E. F. X., et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).
  10. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  11. Nigon, V. M., Félix, M. -A. History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms. WormBook. , 1-84 (2017).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PloS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  14. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (2), 865-875 (2007).
  15. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PloS Genetics. 2 (7), 108 (2006).
  16. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants. Genetics. 163 (2), 581-589 (2003).
  17. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).
  18. Watts, J. L., Browse, J. A. Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).
  19. Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).
  20. Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).
  21. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).
  23. Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (81), e50879 (2013).
  24. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  25. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).
  26. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  27. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).
  28. Steinbaugh, M. J., et al. Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence. eLife. 4, 07836 (2015).
  29. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).
  30. Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. Fatty acid amide signaling molecules. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).
  31. Qi, W., et al. The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins. Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).
  32. Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254 (2017).
  33. Savini, M., et al. Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity. Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).
  34. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  35. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322 (5903), 957-960 (2008).
  36. Jacob, T. C., Kaplan, J. M. The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).
  37. Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).
  38. Bael, S. V., et al. Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).
  39. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).

Tags

Biologie Nummer 190
Lipidensuppletie voor een lange levensduur en gentranscriptionele analyse bij <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., … More

Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., Zhou, Y. Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (190), e64092, doi:10.3791/64092 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter