Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lipidtilskudd for lang levetid og gentranskripsjonsanalyse i Caenorhabditis elegans

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64092
Automatic Translation
*1,2, 2,3,4, 2,4,5, *2
1Graduate Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 3Integrative Program of Molecular and Biochemical Sciences, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Den nåværende protokollen beskriver lipidtilskuddsmetoder i flytende og on-plate kulturer for Caenorhabditis elegans, kombinert med longitudinelle studier og gentranskripsjonsanalyse fra bulk eller noen få ormer og ormvev.

Abstract

Aldring er en kompleks prosess preget av progressive fysiologiske endringer som følge av både miljømessige og genetiske bidrag. Lipider er avgjørende for å utgjøre strukturelle komponenter i cellemembraner, lagre energi og som signalmolekyler. Regulering av lipidmetabolisme og signalering er viktig for å aktivere forskjellige levetidsveier. Rundorm Caenorhabditis elegans er en utmerket og kraftig organisme for å dissekere bidraget av lipidmetabolisme og signalering i levetidsregulering. Flere forskningsstudier har beskrevet hvordan dietttilskudd av spesifikke lipidmolekyler kan forlenge C. elegans levetid; Imidlertid kan mindre forskjeller i tilskuddsbetingelsene forårsake reproduserbarhetsproblemer blant forskere i forskjellige laboratorier. Her rapporteres to detaljerte tilskuddsmetoder for C. elegans ved bruk av lipidtilskudd enten med bakterier frøet på plater eller bakteriell suspensjon i flytende kultur. Også gitt her er detaljene for å utføre levetidsanalyser med livslang lipidtilskudd og qRT-PCR-analyse ved hjelp av et helt ormlysat eller dissekert vev avledet fra noen få ormer. Ved hjelp av en kombinasjon av longitudinelle studier og transkripsjonsundersøkelser ved lipidtilskudd, gir fôringsanalysene pålitelige tilnærminger for å dissekere hvordan lipider påvirker levetid og sunn aldring. Denne metoden kan også tilpasses ulike ernæringsmessige screeningtilnærminger for å vurdere endringer i en delmengde av transkripsjoner ved hjelp av enten et lite antall dissekerte vev eller noen få dyr.

Introduction

Lipider
Lipider er små hydrofobe eller amfipatiske molekyler som er oppløselige i organiske løsningsmidler, men uoppløselige i vann 1,2. Distinkte lipidmolekyler skiller seg fra hverandre basert på antall karboner inneholdt i deres kjeder, plassering, antall dobbeltbindinger og bundne strukturer, inkludert glyserol eller fosfater. Lipider spiller avgjørende roller i og på tvers av forskjellige celler for å regulere organismefunksjoner, inkludert konstituering av membran dobbeltlag, gir energilagring og fungerer som signalmolekyler 3,4.

For det første er lipider strukturelle komponenter av biologiske membraner, inkludert plasmamembranen og intracellulære subcellulære membraner som deler de indre rommene fra det ekstracellulære miljøet. For det andre er lipider den viktigste formen for energilagring hos virveldyr og virvelløse dyr. Nøytrale lipider, inkludert triacylglyceroler, lagres i lengre tid i forskjellige vev, inkludert i fettvev. I nematoden Caenorhabditis elegans er tarmen det viktigste metabolske fettlagringsorganet; Dens funksjon er ikke bare involvert i fordøyelse og absorpsjon av næringsstoffer, men også i avgiftningsprosessen, som ligner aktiviteten til pattedyrs hepatocytter. Andre fettlagringsvev inkluderer kimlinjen, der lipider er essensielle for å utvikle oocytter, og hypodermis, som består av hudlignende epidermale celler 3,5. For det tredje har flere bevis de siste årene antydet at lipider er kraftige signalmolekyler involvert i intra- og ekstracellulær signalering ved å virke direkte på en rekke reseptorer, inkludert G-proteinkoblede og nukleære reseptorer, eller indirekte via membranfluiditetsmodulasjon eller posttranslasjonelle modifikasjoner 6,7,8,9 . Videre studier vil fortsette å belyse de underliggende molekylære mekanismene for lipidsignalering for å fremme lang levetid og helsespan.

Modellorganismer er viktige for å løse spesifikke biologiske spørsmål som er for komplekse til å studere hos mennesker. For eksempel er rundorm C. elegans en utmerket modell for å gjennomføre genetisk analyse for å dissekere biologiske prosesser som er relevante for menneskelig ernæring og sykdom10. De svært konserverte molekylære veiene som er relevante for menneskelig fysiologi, komplekse vev, atferdsmønstre og rikelig genetiske manipulasjonsverktøy gjør C. elegans til en bemerkelsesverdig modellorganisme11. For eksempel er C. elegans utmerket i å videresende genetiske skjermer for å identifisere fenotypespesifikke gener, så vel som i genom-brede omvendte genetiske skjermer via RNA-interferens12.

I laboratorier dyrkes nematodene på agar petriplater frøet med en plen av Escherichia coli-bakterier, som gir makronæringsstoffer som proteiner, karbohydrater og mettede og umettede fettsyrer som energikilder og byggesteiner, og mikronæringsstoffer som kofaktorer og vitaminer13. I likhet med pattedyr syntetiserer nematoder fettsyremolekyler fra både palmitinsyre og stearinsyre (henholdsvis mettet 16-karbon og 18-karbonmolekyler) som er sekvensielt desaturert og langstrakt til en rekke mono-umettede fettsyrer (MUFA) og poly-umettede fettsyrer (PUFA) 14,15,16,17,18. Interessant nok er C. elegans i stand til de novo syntese av alle nødvendige fettsyrer og kjerneenzymer involvert i fettsyrebiosyntese, desaturasjon og forlengelse, noe som letter syntesen av langkjedede PUFA19. Forskjellig fra andre dyrearter, kan C. elegans konvertere 18-karbon og 20-karbon ω-6 fettsyrer til ω-3 fettsyrer med egne ω-3 desaturase enzymer. I tillegg har ormer en Δ12 desaturase som katalyserer dannelsen av linolsyre (LA) fra oljesyre (OA, 18: 1) 20,21. De fleste dyr eller planter mangler både Δ12 og ω-3 desaturaser og er dermed avhengige av diettinntak på ω-6 og ω-3 for å få sine PUFAer, mens C. elegans ikke krever diettfettsyrer22. Isolerte mutanter som mangler funksjonelle desaturase enzymer har blitt brukt til å studere funksjonene til spesifikke fettsyrer i forskjellige biologiske prosesser, inkludert reproduksjon, vekst, lang levetid og nevrotransmisjon. Effekten av individuelle fettsyrer på spesifikke biologiske veier kan løses ved hjelp av både en genetisk tilnærming og dietttilskudd16,17,23. Hittil har lipidforskning fokusert på å karakterisere gener involvert i lipidsyntese, nedbrytning, lagring og nedbrytning i nevrologiske og utviklingsmessige forhold24. Imidlertid begynner lipidens roller i levetidsregulering bare å bli avslørt.

Lipidsignalering i levetidsregulering
Lipider spiller avgjørende roller i levetidsregulering ved å aktivere cellulære signalkaskader i forskjellige vev og celletyper. Nylige studier har fremhevet lipidens aktive roller i modulering av transkripsjon og cellecellekommunikasjon via lipidbindende proteiner eller anerkjennelse av membranreseptorer25. I tillegg tilbyr kosttilskudd lipidtilskudd et utmerket verktøy for å dissekere hvordan lipidmetabolismen påvirker levetiden i C. elegans. Distinkte MUFAer og PUFAer har vist seg å fremme lang levetid ved å aktivere transkripsjonsfaktorer26,27.

Levetidsmodeller, inkludert insulin / IGF-1-signalering og ablasjon av kimlinjeforløperceller, er assosiert med MUFA-biosynteseveien, og MUFA-tilskudd, inkludert oljesyre, palmitolsyre og cis-vaccenic, er tilstrekkelig til å forlenge C. elegans levetid26. Selv om levetidseffekten gitt av MUFA-administrasjonen krever ytterligere undersøkelser, vil den underliggende mekanismen sannsynligvis bli formidlet av SKN-1/Nrf2-transkripsjonsfaktoren, som er en nøkkelaktivator for oksidativ stressrespons og levetidsregulering28,29. Blant MUFA spiller en bestemt klasse av fete acyletanolamider kalt N-acyletanolaminer (NAE) avgjørende roller i forskjellige mekanismer, inkludert betennelse, allergier, læring, minne og energimetabolisme30. Spesielt har lipidmolekylet kjent som oleoyletanolamid (OEA) blitt identifisert som en positiv regulator av lang levetid ved å fremme translokasjonen av det lipidbindende proteinet 8 (LBP-8) inn i kjernen for å aktivere nukleære hormonreseptorer NHR-49 og NHR-807. Tilskudd av OEA-analogen KDS-5104 er tilstrekkelig til å forlenge levetiden, og induserer uttrykket av gener involvert i oksidative stressresponser og mitokondriell β-oksidasjon 7,8.

Samtidig har PUFA-rollen også vært knyttet til levetidsregulering. Administrering av PUFA ω-3 fettsyre α-linolensyre (ALA) fremmer lang levetid ved å aktivere transkripsjonsfaktorene NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF og indusere mitokondriell β-oksidasjon31. Interessant nok aktiverer peroksiderte produkter av ALA, referert til som oksylipiner, SKN-1 / NRF, noe som tyder på at både PUFA og deres oksidative derivater kan gi levetidsfordeler23. Tilskudd av ω-6 fettsyre arakidonsyre (AA) og dihomo-γ-linolensyre (DGLA) forlenger levetiden via autofagiaktivering, fremmer proteinkvalitetskontroll og resulterer i nedbrytning av bortkastede og giftige proteinaggregater27,32. Mer nylig har en celle-ikke-autonom signalregulering mediert av lipidbindende protein 3 (LBP-3) og DGLA vist seg å være avgjørende for å fremme lang levetid ved å sende perifere signaler til nevroner, noe som tyder på en langdistanserolle av lipidmolekyler i kommunikasjon mellom vev på systemiske nivåer33. Den foreliggende studien rapporterer hvert trinn for å utføre lipidtilskudd med bakterier frøet på plater eller bakteriell suspensjon i flytende kultur. Disse metodene brukes til å vurdere levetid og transkripsjonsanalyse, ved hjelp av helkroppsinnhold eller dissekert vev avledet fra noen få ormer. Følgende teknikker kan tilpasses en rekke ernæringsstudier og tilbyr et gyldig verktøy for å dissekere hvordan lipidmetabolismen påvirker lang levetid og sunn aldring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figur 1 viser et skjema for lipidfôring ved hjelp av forskjellige eksperimentelle innstillinger.

1. Fremstilling av lipidbetingede bakterier

  1. Forbered bakteriell fortynning diettbegrensning (BDR) baseløsning ved å oppløse 5,85 g NaCl, 1,0 g K 2 HPO 4 og6,0 g KH2PO4 (se materialtabell) i 999 ml avionisert vann. Juster pH til 6,0 med 0,5 M KOH, og filtrer deretter gjennom et 0,22 μm filter.
    MERK: BDR-løsningen kan oppbevares ved romtemperatur for langtidsoppbevaring.
  2. Forbered BDR-mediet ved å tilsette 10 μL 5 mg / ml kolesterol (oppløst i 200-bevis etanol) til hver 10 ml BDR-baseoppløsning.
  3. Strek OP50-bakteriene (se materialtabell) fra -80 °C til LB-agarplater og inkuber ved 37 °C over natten.
    MERK: Etter inkubasjon over natten ved 37 °C kan OP50-platen oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke for jevne fôringsresultater.
  4. Inokulere OP50-bakteriene fra OP50 LB-agarplaten til LB-medium og inkubere i en 37 °C shaker over natten (16 timer).
    MERK: LB-middelvolumet som trengs, avhenger av de eksperimentelle innstillingene. Det anbefales å bruke 200 μL av 5x konsentrerte bakterier sådd på hver av de 6 cm platene og 1 ml 5x konsentrerte bakterier for hver av de 10 cm platene og hver replikere av væskefôringsforholdene. Dermed må 1 ml og 5 ml innledende LB-inokulasjon fremstilles for hver lipidfôringskultur.
  5. Samle bakterier ved sentrifugering ved 4000 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten.
  6. Suspender bakteriepelleten i 20 ml BDR-base, og sentrifuger ved 4000 x g i 10 minutter. Kast supernatanten.
    MERK: Dette trinnet er avgjørende for å vaske av rester av LB i bakteriepelleten.
  7. Suspender hver bakteriepellet i BDR-mediet for å lage en 20x BDR-bakteriestamme. Fortynn 20x BDR-bakteriestammen med BDR-medium til 5x før bruk.
    MERK: Bruk et 1/20 volum BDR-medium av det opprinnelige LB-volumet for å nå en 20x konsentrasjon for bakteriene. 20x bakteriestammen kan lagres ved 4 °C i opptil 1 uke.
  8. Forbered en lipidstamløsning, ved bruk etanol eller dimetylsulfoksid (DMSO) som løsningsmiddel i et nytt autoklavert glassflaske, og fyll hetteglasset med argon eller nitrogen for å forhindre oksidasjon.
    MERK: Konsentrasjonen av stamløsning er vanligvis mellom 250 mM og 1 mM.
  9. Overfør lipidstamløsningen til ønsket mengde BDR-bakterieløsning for å oppnå ønsket sluttkonsentrasjon under fôringsforhold. Bland grundig ved vortexing i 20 s.
    NOTAT: Den endelige konsentrasjonen av lipidene i fôring er vanligvis 1 μM til 1 mM, avhengig av lipid- og testforholdene. Det anbefales å kjøre et piloteksperiment først for å teste forskjellige konsentrasjoner fra 0,1 μM til 1 mM hvis du arbeider med nye lipider. Bland lipidlagerløsningen med BDR-bakterier umiddelbart før du sådde den på platen eller legger den i flytende ormkulturer. Forbered de lipidkondisjonerte bakteriene ikke lenger enn 1 time før du fôrer til ormene.
  10. Bland de samme volumene filtrert etanol eller DMSO (avhengig av hvilken som brukes til lipidfôringsgruppen) med BDR-bakterier for å tjene som kjøretøykontroll.

2. Fremstilling av synkroniserte C. elegans for lipidtilskudd

  1. Forbered M9-bufferen ved å blande (ved hjelp av spesifiserte sluttkonsentrasjoner) 22 mM KH 2 PO 4, 22 mM Na 2 HPO 4, 85 mM NaCl og2mM MgSO 4 (se Materialtabell). Autoklave bufferen for å sterilisere.
  2. Forbered en frisk blekemiddelløsning med 60% husblekemiddel (v / v, se materialtabell) og en endelig konsentrasjon på 1,6 M NaOH.
  3. Samle gravide voksne i et 15 ml konisk rør ved å bruke 10 ml M9-buffer.
    MERK: Antall ormer og plater som trengs for synkronisering, avhenger av eksperimentelle innstillinger (dvs. antall forhold og replikasjoner og fôringsmetoder). Ideelt sett bør hver full 6 cm plate av voksne ormer kunne gi minst 600 L1 ormer etter synkronisering.
  4. Spinn ned ormene ved 1,450 x g i 30 s. Fjern supernatanten og skyll ormene en gang til med 10 ml M9-buffer.
  5. Spinn ned ormene ved 1,450 x g i 30 s. Aspirer supernatanten, og etterlater en 4 ml aliquot i det koniske røret. Tilsett 2 ml blekemiddelløsning og rist kraftig i 1 min.
  6. Spinn ned ormene ved 1,450 x g i 30 s ved romtemperatur.
  7. Fjern supernatanten og tilsett 4 ml M9-buffer og 2 ml blekemiddelløsning. Rist røret til ormlegemene er oppløst.
  8. Spinn ned eggene ved 1,450 x g i 30 s ved romtemperatur.
  9. Fjern supernatanten og vask eggene med 10 ml M9 buffer.
  10. Gjenta trinn 2.8 og 2.9 3x.
  11. Suspender embryoene med 6 ml M9-buffer. Rock embryoene på en rotator ved 20 ° C i 2 dager for å la dem luke og synkronisere.
  12. Overfør L1 larver til OP50 seeded plater. Inkuber ved 20 ° C i 48 timer for å samle synkroniserte L4 ormer, 72 timer for dag-1 voksne og 96 timer for dag-2 voksne.
    MERK: OP50 plater fremstilles ved å tilsette 1 ml 20x OP50 bakterier til hver 10 cm nematode vekstmedium (NGM) plate34. 30 000 L1-ormer kan sås til hver av OP50-platene hvis de tar sikte på å høste ormene på L4-stadiet, og 20 000 L1-ormer kan sås til hver av OP50-platene hvis de tar sikte på å høste dag-1 voksne i dagens eksperimentelle innstillinger. Det kan være forskjellig for forskjellige laboratorieinnstillinger, så det anbefales å teste ormnumrene som kan sås for å sikre at ormene har nok mat igjen før de høstes.
  13. Samle L4, dag-1 voksen eller dag-2 voksne ormer i et 15 ml konisk rør ved å bruke 10 ml M9 buffer. Bruk en annen 5 ml M9-buffer for å skylle de resterende ormene av platene.
  14. Spinn ned ormene ved 1,450 x g i 30 s og kast supernatanten. Vask ormepelleten med 10 ml BDR-medium, sentrifuger ved 1,450 x g i 30 s, og kast supernatanten.
  15. For ormer i væskefôringsmetoden, overfør BDR-mediet til ormene for å oppnå en ormkonsentrasjon på 3000 ormer / ml. For ormer i fôringsmetoder på tallerkenen, reduser volumet av BDR-medium tilsatt ormene for å redusere tørketiden på platen.

3. Lipidtilskudd for C. elegans

  1. Utfør lipidtilskudd i flytende kultur ved å følge trinnene nedenfor.
    MERK: Denne metoden er egnet for å teste transkripsjonsendringer ved bruk av bulk ormer supplert med lipider.
    1. Overfør ønsket mengde lipid- eller kjøretøykontroll til hver av brønnene i en 12-brønns plate. Forbered tre til fire brønner for hver fôringstilstand som en biologisk replikasjon.
    2. Bland ormesuspensjonen fra trinn 2.15 med 5x BDR-bakterier i et 1:1-forhold for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 500 ormer/ml og 2,5x for bakterier.
    3. Overfør 2 ml av orm-bakterieblandingen i BDR-medium til hver brønn på 12-brønnsplaten.
    4. Pakk tallerkenen med 12 brønner med folie og rist i en 20 °C inkubator ved 100 o/min for ønsket inkubasjonslengde.
      MERK: For å teste forskjellige fôringsforhold, inkuber lipidene med ormer i forskjellige tidsperioder, for eksempel i 6 timer, 12 timer og 24 timer. I tillegg kan forskjellige ormstadier testes for optimale resultater, inkludert lipidfôring fra L4 eller dag-1 voksenstadiet.
  2. Utfør lipidtilskudd på 10 cm NGM-agarplatene ved å følge trinnene nedenfor.
    MERK: Denne metoden er egnet for å teste transkripsjonsendringer ved bruk av bulk ormer supplert med lipider.
    1. Frø 1 ml av de lipidkondisjonerte bakteriene fra trinn 1.9 til midten av hver av de 10 cm platene. Når et høyt antall plater er klargjort, hvirvel den endelige arbeidsløsningen flere ganger mellom såing. Tørk platene i mørket med en biosikkerhetshette.
    2. Overfør 3 000 ormer fra trinn 2,15 til hver av 10 cm-platene. Tørk platene i en biosikkerhetshette til ormene kan krype på lipidsupplerte plater i stedet for å svømme.
    3. Inkuber ormene på de lipidkondisjonerte platene i en 20 °C inkubator i ønsket tidsperiode. Beskytt mot lys hvis du bruker flerumettede lipider.
      MERK: For å teste forskjellige fôringsforhold, inkuber lipidene med ormer i forskjellige tidsperioder, for eksempel 6 timer, 12 timer og 24 timer. I tillegg kan forskjellige ormstadier testes for optimale resultater, inkludert lipidfôring på L4 eller dag-1 voksenstadiet.
  3. Utfør lipidtilskudd på 6 cm NGM-agarplatene for transkripsjonsanalyse.
    MERK: Denne metoden er egnet for å teste transkripsjonsendringer i noen få ormer supplert med lipider.
    1. Frø 300 μL lipidkondisjonerte bakterier fra trinn 1.9 til midten av hver av 6 cm plate. Når et høyt antall plater er klargjort, hvirvel den endelige arbeidsløsningen flere ganger mellom såing. Tørk platene i mørket med en biosikkerhetshette.
    2. Overfør opptil 300 ormer fra trinn 2.15 til hver av de 6 cm platene. Tørk platene i en biosikkerhetshette til ormer kan krype på lipidsupplerte plater i stedet for å svømme.
    3. Inkuber ormene på de lipidkondisjonerte platene i en 20 °C inkubator i ønsket tidsperiode. Beskytt mot lys hvis du bruker flerumettede lipider.
      MERK: For å teste forskjellige fôringsforhold, inkuber lipidene med ormer på forskjellige tidspunkter, for eksempel 6 timer, 12 timer og 24 timer. I tillegg kan forskjellige ormstadier testes for optimale resultater, inkludert lipidfôring på L4 eller dag-1 voksenstadiet.
  4. Utfør lipidtilskudd på 6 cm NGM-agarplatene for langsgående levetidsanalyse.
    1. Frø 200 μL lipidkondisjonerte bakterier (med 1x lipidkonsentrasjon og 5x konsentrerte bakterier) på midten av hver av de 6 cm NGM-platene. Forbered tre plater for hver fôringstilstand.
      MERK: Platene må tilberedes ferskt på bruksdagen (ideelt sett rett før bruk).
    2. Tørk platene i en biosikkerhetshette. Hold lysene i hetten og rommet av hvis du bruker flerumettede lipider.
    3. Velg 30-40 synkroniserte L4 ormer til hver av platene. Oppbevar platene med ormene i en 20 °C inkubator. Ved fôring med flerumettede lipider, hold platene i en lysbeskyttet boks i 20 °C-inkubatoren.
      MERK: Det er mulig å bruke OP50 fra en vanlig 6 cm passasjeplate (ubetinget OP50) som lim for å plukke opp ormer, men det er avgjørende å ikke legge igjen en bulkmengde av den ubetingede OP50 i analyseplaten.
    4. Overfør ormene til nye, nystekte lipidkondisjonerte plater daglig eller annenhver dag, avhengig av ønsket fôringstilstand. Overlevelse skåres på samme måte som tidligere beskrevet4.

4. RNA-ekstraksjon for transkripsjonsanalyse

  1. Utfør RNA-ekstraksjon fra et stort antall hele ormer.
    1. Overfør ormer i væskekulturen fra trinn 3,1 til 1,5 ml mikrosentrifugerør. Vask ormene av 10 cm-platene fra trinn 3.2 ved hjelp av M9-bufferen og overfør ormene i M9-bufferen til 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    2. Sentrifuger ormene kort med en mini-sentrifuge på bordplaten (se materialtabell) i 10 s og aspirer raskt supernatanten.
    3. Overfør rester av ormer fra de flytende fôringsbrønnene eller vask fra platefôringene til samme rør og spinn ned. Fjern supernatanten.
    4. Vask ormpellets med 1 ml iskald M9, spinn kort i 10 s med en mini-sentrifuge, og aspirer supernatanten. Gjenta 1x eller 2x avhengig av gjennomsiktigheten til supernatanten.
    5. Sett mikrosentrifugerørene på is i 2 minutter og fjern så mye supernatant som mulig med en 200 μL pipette, og la en pakket ormpellet på ikke mer enn 15 μL volum.
    6. Overfør 15 μL RNA-ekstraksjonsløsning som inneholder fenol og guanidinisotiocyanat (materialtabell) til hvert av mikrosentrifugerørene og slip ormene med en motorkvern i ca. 30 s til ingen intakte ormer er synlige.
      FORSIKTIG: RNA-ekstraksjonsløsningen er giftig og brannfarlig, og ethvert trinn som involverer en åpen beholder med dette reagenset, må betjenes i en kjemisk hette.
    7. Overfør 285 μL av RNA-ekstraksjonsløsningen til mikrosentrifugerøret mens du skyller eventuelt orminnhold fra motorkvernspissen til mikrosentrifugerøret. Vortex å blande grundig.
      MERK: Dette er et pausepunkt. Prøvene kan lagres i RNA-ekstraksjonsløsningen ved -80 °C i et par måneder. Når prøvene tas ut av -80 °C, tines de ved romtemperatur.
    8. Overfør 60 μL kloroform til hver prøve og virvel kraftig. La prøvene slå seg ned ved romtemperatur i 10 minutter.
      FORSIKTIG: Kloroform er giftig og må håndteres i en kjemisk hette.
    9. Sentrifuge ved 21 000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Overfør forsiktig 140 μL av det vandige laget på toppen til et nytt og RNasefritt mikrosentrifugerør ved hjelp av en 200 μL pipette, og overfør 2x med 70 μL hver gang.
      MERK: Fra dette trinnet fremover må alle pipettespisser og beholdere som har direkte kontakt med prøven, være RNase-frie. Det foreslås også å bruke RNase dekontamineringsløsning for å tørke ned alt utstyr og arbeidsområdet.
    10. Overfør 140 μL isopropanol til prøverøret. Vortex kraftig og la prøven sette seg ved romtemperatur i 10 minutter. Sentrifuge ved 21 000 x g i 20 minutter ved 4 °C, og fjern forsiktig all supernatant.
    11. Overfør 0,5 ml iskald 80% etanol (v / v) til prøverøret med RNA-pelleten. Vortex kraftig til RNA-pelleten forlater bunnen av røret og flyter rundt i etanoloppløsningen. Sentrifuge ved 21 000 x g i 10 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten.
    12. Sentrifuger prøverørene kort i mini-sentrifugen i 15 s for å spinne ned ethvert løsningsmiddel som fester seg til rørveggen, og fjern deretter så mye etanoloppløsning som mulig med en pipette.
    13. La rørhetten være åpen for å tørke RNA-pelleten. Hvis pelleten ble vasket grundig med etanoloppløsningen, bør tørketrinnet ta mindre enn 10 minutter.
      MERK: Dette er et pausepunkt. Den tørkede RNA-pelleten kan lagres ved -80 °C i opptil 1 måned.
    14. Oppløs den tørre RNA-pelleten med 40 μL nukleasefritt vann og kjør med et DNA-fjerningssett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell).
      MERK: Det anbefales å oppløse RNA i nukleasefritt vann først. Hvis 40 μL vann blandes med 10x DNase-bufferen før overføring til RNA-røret, vil RNA-pelleten ikke oppløses helt. RNA-prøvene må holdes på is når RNA-pelleten oppløses i vann. Fryse-tine sykluser reduserer RNA-kvaliteten; Fortsett derfor til trinnet for revers transkripsjon samme dag som DNase-behandlingen.
  2. RNA-ekstraksjon fra et lite antall hele ormer.
    1. Plukk 15-20 ormer fra bakterieplenen i en fersk useedet NGM-plate for å fjerne bakteriene fra ormen.
    2. Ifølge produsenten av qRT-PCR 2-trinns sett (se materialtabell), lag 20 μL endelig lysisløsning for hver prøve ved å blande 0,2 μL DNase med 19,8 μL lysisoppløsning i PCR-rør. Bland lysisløsningen ved å pipettere opp og ned 5x.
    3. Overfør 15-20 ormer fra den useedede NGM-platen til PCR-røret som inneholder 20 μL av den endelige lysisoppløsningen med det minste antall bakterier. Inkuber lysisreaksjonen i 5 minutter ved romtemperatur.
    4. Sonde-sonikere (se tabell over materialer) ormene med 30% amplitude ved hjelp av følgende program: sonikering i 5 s, pause i 5 s og gjenta 4x med en total sonikeringstid på 20 s. Hold prøvene i et iskaldt vannbad under sonikering.
    5. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
      MERK: Legg til mer DNase før inkubasjon hvis no-RT negativ kontroll viser DNA-forurensning på et bekymringsfullt nivå.
    6. Overfør 2 μL stoppoppløsning til lysisreaksjonen og bland ved å trykke forsiktig. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur, og sett deretter på is.
      MERK: Prøvene kan stå på is i opptil 2 timer før du fortsetter til trinnet for revers transkripsjon.
  3. Utfør RNA-ekstraksjon fra ormvev ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Plukk rundt 20 ormer fra bakterieplenen og legg dem på en ny, useedet NGM-plate for å fjerne bakteriene fra dem.
    2. Flytt de 20 ormene (med så få bakterier som mulig) til et klokkeglass som inneholder 500 μL M9-oppløsning som inneholder 4 μM levamisol (se materialtabell). Immobiliseringen vil skje i løpet av sekunder.
    3. Når ormene er immobilisert, disseker du kimlinjen eller tarmen ved hjelp av en 25 G nål som kan festes til 1 ml sprøyten.
      1. Under disseksjonsomfanget, utfør et kutt i posisjonen til den andre svelgpæren for å tillate naturlig ekstrudering av tarmen og kimlinjen. De to vevene kan lett skilles ut fra deres morfologi og forskjellige kontraster. Bruk pinsett eller nåler for å forsiktig skille vevet, og unngå å skade dem.
        MERK: Det anbefales å dissekere innen 5-10 min. Hvis kuttet ikke gir en god vevsekstrudering, anbefales det å flytte til neste orm og dissekere så mange som mulig innen 10 minutter. Denne prosedyren krever en kort tidsramme for å unngå transkripsjonsendringer fra miljøet.
    4. I henhold til produsenten av qRT-PCR 2-trinns sett, lag 20 μL sluttlyseløsning for hver prøve ved å blande 0,2 μL DNase I til 19,8 μL lysisoppløsning i PCR-rørene. Bland lysisløsningen ved å pipettere opp og ned 5x.
    5. Bruk en autoklavert glasspipette til å overføre det dissekerte vevet til et PCR-rør. Sett PCR-rørene på is i 2 minutter for å tillate materialavsetning i bunnen. Fjern supernatanten, tilsett 20 μL endelig lyseoppløsning i PCR-røret, og bland ved å banke.
    6. Inkuber lysisreaksjonen i 5 minutter ved romtemperatur. Overfør deretter 2 μL stoppoppløsning til lysereaksjonen og bland ved å tappe. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur.
      MERK: Prøvene kan stå på is i opptil 2 timer før du fortsetter til trinnet for revers transkripsjon.

5. Omvendt transkripsjon og qRT-PCR

  1. Utfør revers transkripsjon og qRT-PCR fra bulk ormer.
    1. Mål RNA-konsentrasjonen og forbered 5 μg totalt RNA for revers transkripsjon.
    2. Forbered en samlet RNA-prøve ved å blande like mengder RNA fra hver prøve og justere den endelige RNA-konsentrasjonen til 0,556 g / L (5 μg / 9 μL). Bruk den samlede RNA-prøven for qRT-PCR-standardkurven og RT-negative kontroller.
    3. Utfør revers transkripsjon i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialtabell). Kjør følgende kvalitetskontroll revers transkripsjonsreaksjoner sammen med de enkelte RNA-prøvene.
      1. Utfør revers transkripsjon med den samlede RNA-prøven som mal (for qRT-PCR-standardkurve).
      2. Utfør revers transkripsjon med den samlede RNA-prøven som mal, uten revers transkriptase (RT-negativ kontroll; kvalitetskontroll for potensiell genom-DNA-forurensning).
      3. Utfør revers transkripsjon med det nukleasefrie vannet som mal (RT-negativ kontroll; kvalitetskontroll for potensiell RNA-forurensning i reagenser).
        MERK: Dette er et pausepunkt. Prøvene kan legges igjen i termosyklusen over natten eller lagres ved -20 °C i noen måneder.
    4. Fortynn cDNA generert fra de samlede RNA-prøvene fire ganger, 20 ganger, 100 ganger og 500 ganger med nukleasefritt vann for qRT-PCR-standardkurver.
    5. Fortynn cDNA generert fra hver RNA-prøve 20-100 ganger for å bruke som maler for qRT-PCR-reaksjonene.
      MERK: Fortynningsforholdet avhenger av overflod av genet av interesse. For høyt uttrykte gener, som rengjøringsgener eller egl-3 og egl-21 brukt i denne studien, anbefales en 100x fortynning. For lavt uttrykte gener, som lbp-8, anbefales en 20x fortynning.
    6. Utfør qRT-PCR med qRT-PCR-reagenser i henhold til produsentens instruksjoner som følger: 95 °C i 10 minutter, gjenta 40 ganger med 95 °C i 15 s og 60 °C i 1 min, etterfulgt av standard smeltekurveprogram, og hold ved 8 °C på ubestemt tid.
  2. Utfør revers transkripsjon og qRT-PCR fra noen få ormer eller ormvev.
    1. Overfør 25 μL RT-buffer og 2,5 μL 20x RT-enzymblanding fra qPCR 2-trinns sett (se materialtabell) til hvert rør som inneholder ormlysat fra enten trinn 4.2.6 eller trinn 4.3.6.
      MERK: En RT-negativ kontroll er kritisk for qRT-PCR fra noen få ormer. Hvert eksperiment må inkludere en prøve av ormlysat (fra trinn 4.2.6) med RT-buffer, men uten RT-enzym for å undersøke DNA-forurensningen i prøvene. Hvis DNA-forurensning er et problem, bør du vurdere å legge til mer DNase til lysisbufferen eller mer DNase til prøven etter at ormene er lyset. Alternativt kan man utføre RT-negativ kontroll for hver prøve ved å bruke halvparten av lysatet i en normal RT-reaksjon og den andre halvparten i en RT-reaksjon uten revers transkriptase.
    2. Bland ved å trykke forsiktig. Spinn ned med en mini sentrifuge for 10 s.
    3. Legg prøvene i termosyklusmaskinen i henhold til produsentens instruksjoner: 37 °C i 60 minutter, 95 °C i 5 minutter og 8 °C på ubestemt tid.
      MERK: Dette er et pausepunkt. Prøvene kan legges igjen i termosyklusen over natten eller lagres ved -20 °C i noen måneder.
    4. Hold alle reagenser og prøver på is og beskytt qRT-PCR-reagensene mot lys.
    5. Forbered en 96-brønns qPCR-plate, og bland i hver brønn 6 μL nukleasefritt vann, 10 μL qRT-PCR-reagens, 2 μL 5 μM primerblanding (fremover og bakover) og 2 μL cDNA. Dekk 96-brønns qPCR-plateoverflaten med en beskyttende optisk film og trykk ned for å forsegle.
    6. Kjør qRT-PCR-programmet på en termisk syklus ved å følge produsentens instruksjoner som følger: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 2 minutter, gjenta 40 ganger med 95 ° C i 3 s og 60 ° C i 30 s, etterfulgt av 8 ° C på ubestemt tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering av transkripsjonsendringer ved bruk av noen få hele ormer ved lipidtilskudd
For å undersøke om protokollen for å trekke ut og retrotranskribere RNA til cDNA fra noen få hele ormer er reproduserbar og sammenlignbar med dataene fra bulkormer, ble en langlivet ormstamme som overuttrykker lysosomalsyrelipase lipl-4 i tarmen ansatt 7,8,33,35. Transkripsjonsinduksjonen av nevropeptidbehandlingsgenene egl-3 og egl-21 rapportert i tidligere studier 7,8,33 ble validert (figur 2A,B). Denne induksjonen indikerer at RNA-ekstraksjonsmetoden fra noen få dyr er et gyldig alternativ til standard cDNA-synteseteknikker fra bulkormkulturer.

Validering av transkripsjonsevalueringer ved bruk av dissekert ormvev ved lipidtilskudd
I C. elegans er syntesen av 20-karbon PUFA avhengig av aktiviteten til desaturase FAT-316,17. Tidligere studier har rapportert at fett-3 mutanter mangler 20-karbon PUFA, inkludert DGLA16. Tidligere ble det oppdaget at tapet av Δ6-desaturase FAT-3 i lipl-4g ormer undertrykker transkripsjonsinduksjonen av neuropeptidbehandlingsgenene egl-3 og egl-2133. I tillegg redder DGLA-tilskudd slik induksjon33. Genet som koder for egl-21 uttrykkes i nevroner, mens egl-3 påvises i både nevroner og tarmer 36,37. For ytterligere å teste om DGLA-tilskudd gjenoppretter induksjonen av egl-3 og egl-21 i tarmen eller i nevronene, ble tarmen dissekert ut og deres transkripsjonsnivåer ble vurdert ved hjelp av qRT-PCR-analyse beskrevet i trinn 4.3 og 5.2 i denne protokollen. DGLA ble supplert i kildematen i 12 timer ved dag-1 voksen alder. Det ble ikke funnet transkripsjonsinduksjon av verken egl-3 eller egl-21 i tarmen (figur 2C), noe som samsvarer med tidligere funn36,38.

Validering av levetidsanalyse ved lipidtilskudd
Forholdet mellom 20-karbon PUFA og levetidsmekanismen som inaktiverer fett-3 ble tidligere utforsket, spesielt i tarmen av lipl-4g ormer33. Det ble funnet at fett-3 knockdown fullstendig undertrykker levetidsforlengelsen gitt av lipl-433. For å vurdere om DGLA gjenoppretter levetiden som formidles av lipl-4, ble DGLA supplert ferskt annenhver dag i kildematen på dag 1 i voksen alder. Det ble funnet at ved fett-3 knockdown redder DGLA-tilskuddet levetidsforlengelsen (figur 2D) 33, noe som indikerer en vellykket lipidtilskuddsprosedyre kombinert med levetidsanalysen.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk lipidfôring ved hjelp av forskjellige eksperimentelle innstillinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Validering av nevropeptidbehandlingsgenenes transkripsjonsevaluering ved hjelp av en stor populasjon av ormer, noen få ormer og dissekert vev. (A) RNA ekstrahert fra en stor populasjon av ormer viser induksjonen av neuropeptidbehandlingsgenenes egl-3 og egl-21 transkriptnivåeri lipl-4 Tg-dyr. Feilfelt representerer ±1 SEM. **** p < 0,0001 av tosidig Student t-test. (B) RNA-ekstraksjon fra noen få ormer bekrefter induksjonen av neuropeptidbehandlingsgenenes egl-3- og egl-21-transkripsjonsnivåer i lipl-4 Tg-ormer. Feilfelt representerer ±1 SEM. **** p < 0,0001 av tosidig Student t-test. (C) Neuronale neuropeptidbehandlingsgener EGL-3 og EGL-21 induseres ikke i dissekerte tarmer. Feilfelt representerer ±1 SEM. Statistisk analyse med tosidig Student t-test. (D) DGLA-tilskudd ved forskjellige konsentrasjoner, inkludert 10 μm, 100 μm og 1 mM, redder lipl-4Tg levetidseffekten på fett-3 RNAi. p < 0,001 av log-rank test. Denne figuren er tilpasset fra Savini et al.33. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lipidtilskudd har blitt brukt i aldringsforskning for å belyse den direkte effekten av visse lipidarter på sunn aldring 6,7,23,26,27,31. Imidlertid kan lipidtilskuddsprosedyren være utfordrende, og enhver inkonsekvens mellom eksperimenter kan forårsake ikke-reproduserbare resultater. Her er den første detaljerte trinnvise protokollen dokumentert for å veilede nye forskere for å unngå potensielle fallgruver forårsaket av teknisk upresishet. De kritiske trinnene i denne protokollen vil bli diskutert i detalj i de følgende avsnittene. Lipidforskningsverktøykassen utvides også ved å introdusere RNA-isolasjon fra bare noen få ormer og spesifikke ormvev etter lipidtilskudd. Når man vurderer metodikken for å undersøke transkripsjonsnivåer, er qRT-PCR med noen få ormer eller dissekert vev enestående for å analysere noen få transkripsjoner eller undersøke visse vevsspesifikke transkripsjonsendringer. Videre kan bruk av disse metodene overvinne trinnet med ormforsterkning som kan ta omtrent 5-6 ekstra dager. Samtidig er lipidfôring etterfulgt av bulk RNA-ekstraksjon mer kostnadseffektiv og et gyldig alternativ når et større sett med målgener må analyseres.

Flere trinn kan være kritiske for reproduserbarheten av lipidfôringseffekter. Det første aspektet er relatert til bakterielle forhold. Det anbefales å bruke friske bakterieplater som ikke er eldre enn 7 dager for inokulering. Det anbefales å bruke bakterier tilberedt i BDR-medium innen 1 uke. Bakterier som har blitt blandet med lipider må brukes med en gang. Lipider med bakterier bør ikke lagres selv ved 4 °C, da bakteriene vil metabolisere lipidene. Vasketrinnene i BDR-basen og resuspendering i BDR-mediet er kritiske for bakterieforhold, da bakterier ble dyrket i LB, og matet direkte til ormer eliminerer alltid de dype effektene av lipidtilskudd. Den andre faktoren er forbundet med ormforhold. C. elegans må ikke sultes i minst tre generasjoner før bleketrinnet for eggpreparasjon for å sikre at de er i en sunn og stabil metabolsk tilstand. Det er også viktig å dyrke C. elegans på agarplater før lipidtilskudd; Dette inkluderer før og etter synkroniseringstrinnet.

Ormer som tilpasset flytende kulturer i lengre tid er delvis sultet; Sult øker grunnlinjen for pro-levetidsgener, noe som fører til en svekket effekt av lipidtilskudd. Hvis metabolsk drift og endringer ved bruk av arresterte L1 larver er bekymringer, ville et gyldig alternativ være å direkte plate eggene. Når bare noen få ormer er nødvendig for å utføre levetids- eller genuttrykksanalyse, er det mulig å plate egg direkte på lipidkondisjonerte plater og synkronisere dem ved håndplukking på L4-scenen for påfølgende eksperimenter. Men hvis det er behov for store mengder ormer når håndplukking av L4 ikke er aktuelt, er det ikke ideelt å plating egg direkte. Eggklekking etter bleking fra gravide voksne kan forekomme på forskjellige tidspunkter og føre til at befolkningen blir usynkronisert, noe som vil forstyrre transkripsjonsanalysen. Den tredje kritiske delen er knyttet til lipidlagringsforholdene; Når du supplerer PUFA, er det nødvendig med ekstra oppmerksomhet, da disse molekylene er følsomme for lys og utsatt for oksidasjon i luften.

Flere lipidfôringsforhold, inkludert ormstadier, tilskuddslengde og konsentrasjoner, krever ytterligere undersøkelser ved testing av nye lipidmolekyler. L4, dag-1 voksen og dag-2 voksne ormer er vanligvis utgangspunktet for testing på forskjellige ormstadier. Spesielt ved fôring av L4-ormer, hvis inkubasjonstiden slutter rundt nematode-smeltefasen, forventes det en stor variasjon, noe som i stor grad påvirker betydningen og reproduserbarheten av resultatene. En ekstra utfordring for bruk av dag-1 eller dag-2 voksne ormer er relatert til avkom som kan komplisere genuttrykksanalysen. I dette tilfellet er RNA-ekstraksjon fra noen få hele ormer mer pålitelig enn bulkpopulasjoner. Ulike lipidmolekyler har forskjellige konsentrasjonsområder for å produsere fysiologiske effekter; Dermed foreslås en serie konsentrasjoner fra 1 μM til 1 mM å bli testet.

Det er noen begrensninger som må vurderes ved valg av fôringsmetode. For det første, når lipider ikke kan absorberes eller inntas av ormene, er det utfordrende å bruke en tilskuddsmetode for å teste deres biologiske effekt i C. elegans. Med dagens teknologi er massespektrometri eller SRS kombinert med 13C- eller 2H-merkede lipidforbindelser39 gyldige verktøy for å teste lipidopptak i ormlegemet. For det andre er disse fôringsmetodene ikke optimalisert for undersøkelsesteknikker med høy gjennomstrømning. For lipidtilskudd med bulk ormer, er prøvepreparering fra væskefôringsmetoden raskere enn fôring på tallerkenen, fordi væskekulturene kan overføres direkte til mikrocentrifugerør i stedet for å vaske av fra fôringsplatene. For å sikre at RNA ekstrahert er i høstingstilstanden, foreslås det ikke å la mer enn 15-20 minutter passere mellom punktet for å sette ormene på is for å male dem i RNA-ekstraksjonsløsningen. Det anbefales å behandle færre forhold hvert 15. minutt når et høyt antall prøver må behandles. For RNA-ekstraksjon av hele ormer fra noen få dyr er håndplukkingstrinnet det hastighetsbegrensende trinnet, mens for dissekering av vev er det avgjørende å handle på en tidseffektiv måte for å unngå langvarig eksponering for et ikke-fysiologisk miljø. I likhet med bulk RNA-ekstraksjon er det å foretrekke å plukke ormer eller dissekere vevsprøver innen 10 minutter.

Til tross for begrensningene, kan disse tilskuddsmetodene brukes utover lipidforskning for å hjelpe til med å identifisere eventuelle ernæringsmessige og medisinske effekter. Prosedyrene som rapporteres her er ikke bare begrenset til aldringsforskning, men alternative fenotyper for å vurdere organell kondisjon og cellemetabolsk homeostase. Tilskuddsmetoden med bulkpopulasjon kan kombineres med RNA-seq for transkriptomanalyse, massespektrometri for metabolomisk og proteomisk analyse, eller Western blot for analyse av spesifikke proteinmarkører, mens lipidtilskuddet med noen få ormer kan kombineres med bildebehandling og atferdsanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker P. Svay for vedlikeholdsstøtte. Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (M.C.W.) og NIH T32 ES027801 pre-doctoral student fellow (MS). Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Pestle Genesee Scientific 93-165P15 For worm grinding with Trizol
Agarose Sigma A9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix GenDEPOT R5600 For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR ThermoFisher A28567 For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge Benchmark Scientific C1248 For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip Branson Ultrasonic Corporation 100-132-888R
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cholesterol Sigma C8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifuge Eppendorf 22620444R For RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler pro Eppendorf 950030010 For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate Neta Scientific 665180 12-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm Neta Scientific 664161 For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm Neta Scientific 628161 For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free water ThermoFisher AM9937
Isoproanol Sigma PX1835-2
Levamisole hydrochloride VWR SPCML1054
lipl-4Tg MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22) MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
Luria Broth Base ThermoFisher 12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma M2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode ThermoFisher 4483354 96-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied BioSystem 4311971 For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System Sigma Z00Q0V0WW Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2 Caenorhabditis Genetics Center N/A C. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher N/A For measuring RNA concentration
OP50 Caenorhabditis Genetics Center N/A Bacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) Sigma P5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma P0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kit ThermoFisher 4402953 For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher 4367659 For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach  KIK International LLC. 59647210143 6% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA Watch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination Solution ThermoFisher AM9780
Sodium cloride (NaCl) Sigma S7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma SX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) Sigma S9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge Thermo 7500-4337 For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge Thermo 7500-7200 For worm egg preparation
TRIzol Reagent TheroFisher 15596018 RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kit ThermoFisher AM1907 For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59 Denville Scientific INV S7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor VWR 47747-370 For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 VWR N/A For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm picker WormStuff 59-AWP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
  2. Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures. Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).
  3. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  4. Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism. Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).
  5. Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity. Olsen, A., Gill, M. , Springer. Cham. 307-329 (2017).
  6. Lesa, G. M., et al. Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).
  7. Folick, A., et al. Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans. Science. 347 (6217), 83-86 (2015).
  8. Ramachandran, P. V., et al. Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity. Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).
  9. Byrne, E. F. X., et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).
  10. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  11. Nigon, V. M., Félix, M. -A. History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms. WormBook. , 1-84 (2017).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PloS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  14. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (2), 865-875 (2007).
  15. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PloS Genetics. 2 (7), 108 (2006).
  16. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants. Genetics. 163 (2), 581-589 (2003).
  17. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).
  18. Watts, J. L., Browse, J. A. Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).
  19. Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).
  20. Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).
  21. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).
  23. Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (81), e50879 (2013).
  24. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  25. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).
  26. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  27. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).
  28. Steinbaugh, M. J., et al. Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence. eLife. 4, 07836 (2015).
  29. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).
  30. Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. Fatty acid amide signaling molecules. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).
  31. Qi, W., et al. The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins. Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).
  32. Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254 (2017).
  33. Savini, M., et al. Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity. Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).
  34. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  35. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322 (5903), 957-960 (2008).
  36. Jacob, T. C., Kaplan, J. M. The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).
  37. Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).
  38. Bael, S. V., et al. Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).
  39. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).

Tags

Biologi utgave 190
Lipidtilskudd for lang levetid og gentranskripsjonsanalyse i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., … More

Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., Zhou, Y. Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (190), e64092, doi:10.3791/64092 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter