Summary
本プロトコルは、 カエノラブディティスエレガンスの液体およびオンプレート培養における脂質補給方法を、バルクまたは少数のワームおよびワーム組織からの縦断的研究および遺伝子転写分析と組み合わせて説明しています。
Abstract
老化は、環境的および遺伝的寄与の両方に起因する進行性の生理学的変化を特徴とする複雑なプロセスです。脂質は、細胞膜の構造成分を構成し、エネルギーを蓄え、シグナル伝達分子として極めて重要です。脂質代謝とシグナル伝達の調節は、明確な長寿経路を活性化するために不可欠です。回虫 Caenorhabditis elegans は、長寿調節における脂質代謝とシグナル伝達の寄与を解剖するための優れた強力な生物です。複数の調査研究により、特定の脂質分子の食事補給がどのように C.エレガンス の寿命を延ばすことができるかが説明されています。ただし、補充条件のわずかな違いは、異なる研究室の科学者間で再現性の問題を引き起こす可能性があります。ここでは、プレートに播種した細菌または液体培養中の細菌懸濁液のいずれかを用いた脂質補給を採用した C.elegans の2つの詳細な補充方法を報告する。また、全線虫溶解物または少数の線虫由来の解剖組織を用いて生涯脂質補給およびqRT−PCR分析を伴う寿命アッセイを実行するための詳細も本明細書に提供される。脂質補給時の縦断的研究と転写調査を組み合わせて使用 することで、脂質が長寿と健康的な老化にどのように影響するかを分析するための信頼できるアプローチを提供します。この方法論は、少数の解剖組織または少数の動物のいずれかを使用して転写産物のサブセットの変化を評価するための様々な栄養スクリーニングアプローチにも適用することができる。
Introduction
脂質
脂質は、有機溶媒に可溶であるが水には不溶性の小さな疎水性または両親媒性分子である1,2。異なる脂質分子は、それらの鎖に含まれる炭素の数、位置、二重結合の数、およびグリセロールまたはリン酸塩を含む結合構造に基づいて互いに区別します。脂質は、膜二重層の構成、エネルギー貯蔵の提供、シグナル伝達分子としての作用など、生物機能を調節するために、異なる細胞内および細胞間で重要な役割を果たします3,4。
まず、脂質は、細胞外環境から内部区画を隔てる原形質膜や細胞内膜を含む生体膜の構造成分である。第二に、脂質は脊椎動物および無脊椎動物のエネルギー貯蔵の主要な形態です。トリアシルグリセロールを含む中性脂質は、脂肪組織を含む様々な組織に長期間貯蔵される。線虫のカエノラブディティスエレガンスでは、腸は主要な代謝脂肪貯蔵器官です。その機能は、栄養素の消化と吸収だけでなく、哺乳類の肝細胞の活動に似た解毒の過程にも関与しています。他の脂肪貯蔵組織には、卵母細胞の発達に脂質が必須である生殖細胞系列、および皮膚様表皮細胞で構成される皮下組織が含まれます3,5。第三に、近年、脂質は、Gタンパク質共役型受容体や核内受容体などのさまざまな受容体に直接作用したり、膜流動性調節や翻訳後修飾を介して間接的に作用したりすることにより、細胞内外のシグナル伝達に関与する強力なシグナル伝達分子であることが示唆されています6,7,8,9。.さらなる研究は、長寿と健康寿命を促進する脂質シグナル伝達の根底にある分子メカニズムを解明し続けます。
モデル生物は、人間で研究するには複雑すぎる特定の生物学的問題に対処するために重要です。たとえば、回虫 C.エレガンスは 、人間の栄養と病気に関連する生物学的プロセスを解剖するための遺伝子分析を行うための優れたモデルです10。ヒトの生理学、複雑な組織、行動パターン、および豊富な遺伝子操作ツールに関連する高度に保存された分子経路により、 C.エレガンスは 注目に値するモデル生物となっています11。たとえば、 C. elegans は、表現型特異的遺伝子を特定するための遺伝子スクリーニングの転送、およびRNA干渉 を介した ゲノム全体の逆遺伝子スクリーニングに優れています12。
実験室では、線虫は大腸菌の芝生を播種した寒天ペトリプレートで成長し、タンパク質、炭水化物、飽和および不飽和脂肪酸などの主要栄養素をエネルギー源およびビルディングブロックとして提供し、補因子やビタミン13などの微量栄養素を提供します。哺乳類と同様に、線虫はパルミチン酸とステアリン酸の両方(それぞれ飽和16炭素分子と18炭素分子)から脂肪酸分子を合成し、順次不飽和不飽和脂肪酸(MUFA)と多価不飽和脂肪酸(PUFA)に伸長します14,15,16,17,18。興味深いことに、C. elegansは、脂肪酸生合成、不飽和化、および伸長に関与する必要なすべての脂肪酸およびコア酵素のde novo合成が可能であり、長鎖PUFAの合成を容易にします19。他の動物種とは異なり、C.エレガンスは、独自のω-3デサチュラーゼ酵素を使用して、18炭素および20炭素のω-6脂肪酸をω-3脂肪酸に変換できます。さらに、ワームはオレイン酸からのリノール酸(LA)の形成を触媒するΔ12デサチュラーゼを持っています(OA、18:1)20,21。ほとんどの動物または植物は、Δ12およびω-3デサチュラーゼの両方を欠いているため、PUFAを得るためにω-6およびω-3の食事摂取に依存しているのに対し、C.エレガンスは食事性脂肪酸を必要としない22。機能的なデサチュラーゼ酵素を欠く単離された変異体は、生殖、成長、寿命、神経伝達などの異なる生物学的プロセスにおける特定の脂肪酸の機能を研究するために使用されています。特定の生物学的経路に対する個々の脂肪酸の影響は、遺伝的アプローチと食事補給の両方を使用して対処できます16,17,23。今日まで、脂質研究は、神経学的および発達的条件における脂質合成、分解、貯蔵、および分解に関与する遺伝子の特性評価に焦点を合わせてきました24。しかし、長寿調節における脂質の役割は明らかになり始めたばかりです。
長寿制御における脂質シグナル伝達
脂質は、異なる組織や細胞型で細胞シグナル伝達カスケードを活性化することにより、長寿調節に重要な役割を果たします。最近の研究では、脂質結合タンパク質を介した転写および細胞間コミュニケーションの調節または膜受容体の認識における脂質の積極的な役割が強調されています25。さらに、食事療法の脂質補給は、脂質代謝がC.エレガンスの寿命にどのように影響するかを分析するための優れたツールを提供します。異なるMUFAおよびPUFAは、転写因子を活性化することによって長寿を促進することが示されている26,27。
インスリン/IGF-1シグナル伝達や生殖細胞前駆細胞のアブレーションなどの長寿モデルは、MUFA生合成経路に関連しており、オレイン酸、パルミトレイン酸、シスバクセン酸などのMUFA補給は、C.エレガンスの寿命を延ばすのに十分です26。MUFA投与によってもたらされた長寿効果はさらなる調査が必要ですが、根底にあるメカニズムは、酸化ストレス応答と長寿調節の重要な活性化因子であるSKN-1 / Nrf2転写因子によって媒介される可能性があります28,29。MUFAの中で、N-アシルエタノールアミン(NAE)と呼ばれる特定のクラスの脂肪酸アシルエタノールアミドは、炎症、アレルギー、学習、記憶、エネルギー代謝などの明確なメカニズムにおいて重要な役割を果たします30。特に、オレオイルエタノールアミド(OEA)として知られる脂質分子は、脂質結合タンパク質8(LBP-8)の核への転座を促進して核ホルモン受容体NHR-49およびNHR-80を活性化することにより、長寿の正の調節因子として同定されている7。OEAアナログKDS-5104の補充は、寿命を延ばすのに十分であり、酸化ストレス応答およびミトコンドリアβ酸化に関与する遺伝子の発現を誘導する7,8。
同時に、PUFAの役割は長寿規制にも関連しています。PUFAのω-3脂肪酸α-リノレン酸(ALA)の投与は、NHR-49 / PPARα、SKN-1 / NRF転写因子を活性化し、ミトコンドリアβ酸化を誘導することにより、長寿を促進します31。興味深いことに、オキシリピンと呼ばれるALAの過酸化生成物はSKN-1 / NRFを活性化し、PUFAとその酸化的誘導体の両方が長寿の利点をもたらす可能性があることを示唆しています23。ω-6脂肪酸アラキドン酸(AA)およびジホモ-γ-リノレン酸(DGLA)の補給は、オートファジー活性化を介して寿命を延ばし、タンパク質品質管理を促進し、無駄で有毒なタンパク質凝集体の分解をもたらす27,32。最近では、脂質結合タンパク質3(LBP-3)とDGLAによって媒介される細胞非自律的なシグナル伝達調節が、末梢信号をニューロンに送ることによって長寿を促進するのに重要であることが示され、全身レベルでの組織間コミュニケーションにおける脂質分子の長期的な役割を示唆しています33。本研究では、プレートに播種した細菌または液体培養中の細菌懸濁液で脂質補給を行う各ステップを報告する。これらの方法論は、寿命と転写分析を評価するために使用され、全身の内容物またはいくつかのワームに由来する解剖組織を使用します。以下の技術は、さまざまな栄養研究に適応させることができ、脂質代謝が長寿と健康的な老化にどのように影響するかを分析するための有効なツールを提供します。
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Protocol
図1 は、さまざまな実験設定を使用した脂質供給の概略図を示しています。
1. 脂質調整菌の調製
- 5.85 gのNaCl、1.0 gのK 2 HPO 4、および6.0 gのKH2PO4(材料の表を参照)を999 mLの脱イオン水に溶解することにより、細菌希釈食事制限(BDR)ベース溶液を調製します。pHを0.5 M KOHで6.0に調整し、0.22 μmのフィルターでろ過します。
注意: BDR溶液は、長期保存のために室温で保存できます。 - BDR塩基溶液10 mLごとに10 μLの5 mg / mLコレステロール(200プルーフエタノールに溶解)を加えて、BDR培地を準備します。
- OP50細菌( 材料の表を参照)をストックから-80°CのストックからLB-寒天プレートにストリークし、37°Cで一晩インキュベートします。
注:37°Cで一晩インキュベートした後、OP50プレートを4°Cで最大1週間保存して、安定した給餌結果を得ることができます。 - OP50 LB寒天プレートからLB培地にOP50細菌を接種し、37°Cのシェーカーで一晩(16時間)インキュベートします。
注意: 必要なLB培地容量は、実験設定によって異なります。6 cmプレートのそれぞれに播種した200 μLの5倍濃縮細菌と、10 cmプレートのそれぞれと各液体供給条件の複製に1 mLの5倍濃縮細菌を使用することをお勧めします。したがって、脂質供給培養ごとにそれぞれ1 mLおよび5 mLの初期LB接種を準備する必要があります。 - 室温で4,000 x g で10分間遠心分離して細菌を回収します。上澄み液を捨てる。
- 細菌ペレットを20 mLのBDRベースに懸濁し、4,000 x g で10分間遠心分離します。上澄み液を捨てる。
注:このステップは、細菌ペレット中のLBの残りの残留物を洗い流すために重要です。 - 各細菌ペレットをBDR培地に懸濁して、20倍のBDR細菌ストックを作ります。使用前に、20倍のBDRバクテリアストックをBDR培地で5倍に希釈してください。.
注意: 元のLBボリュームの1/20ボリュームのBDR培地を使用して、細菌の20倍の濃度に到達します。20倍のバクテリアストックは、4°Cで最大1週間保存できます。 - 新しいオートクレーブ滅菌ガラスバイアルの溶媒としてエタノールまたはジメチルスルホキシド(DMSO)を使用して脂質ストック溶液を調製し、酸化を防ぐためにガラスバイアルにアルゴンまたは窒素を充填します。
注:原液の濃度は通常250mMから1mMの間です。 - 脂質ストック溶液を所望の量のBDR細菌溶液に移し、給餌条件下で所望の最終濃度を達成する。20秒間ボルテックスして完全に混合します。
注:摂食中の脂質の最終濃度は、脂質および試験条件に応じて、通常1μMから1mMです。新しい脂質を扱う場合は、最初にパイロット実験を実行して、0.1 μMから1 mMの範囲のさまざまな濃度をテストすることをお勧めします。脂質ストック溶液をプレートに播種するか、液体ワーム培養物に入れる直前に、脂質ストック溶液をBDR細菌と混合します。ワームに餌を与える前に1時間以内に脂質調整細菌を準備します。 - 同量のろ過エタノールまたはDMSO(脂質供給グループに使用されるものによって異なります)をBDR細菌と混合して、ビヒクルコントロールとして機能します。
2.脂質補給のための同期C.エレガンスの 調製
- 22 mM KH 2 PO 4、22 mM Na 2 HPO 4、85 mM NaCl、および2mM MgSO 4を(指定された最終濃度を使用して)混合することにより、M9バッファーを調製します(材料の表を参照)。バッファーをオートクレーブして滅菌します。
- 60%ハウス漂白剤(v / v、 材料表を参照)と最終濃度1.6 M NaOHを含む新鮮な漂白剤溶液を調製します。
- 10 mLのM9バッファーを使用して、15 mLのコニカルチューブで妊娠した成虫を収集します。
注:同期に必要なワームとプレートの数は、実験設定(つまり、条件と反復の数、および給餌方法)によって異なります。理想的には、成虫の6 cmプレートごとに、同期後に少なくとも600匹のL1ワームを生成できる必要があります。 - ワームを1,450 x g で30秒間スピンダウンします。上清を取り除き、10 mLのM9バッファーでワームをもう一度すすぎます。
- ワームを1,450 x g で30秒間スピンダウンします。上清を吸引し、コニカルチューブに4 mLのアリコートを残します。2mLの漂白剤溶液を加え、1分間激しく振とうします。
- ワームを1,450 x g で室温で30秒間スピンダウンします。
- 上清を取り除き、4 mLのM9バッファーと2 mLの漂白剤溶液を追加します。ワームの体が溶けるまでチューブを振ってください。
- 卵を1,450 x g で室温で30秒間回転させます。
- 上清を取り除き、10 mLのM9バッファーで卵を洗います。
- 手順 2.8 と 2.9 を 3 回繰り返します。
- 胚を6 mLのM9バッファーで懸濁します。胚を20°Cのローテーターで2日間揺り動かし、孵化させて同期させます。
- L1幼虫をOP50播種プレートに移します。20°Cで48時間インキュベートして同期L4ワームを収集し、1日目の成虫で72時間、2日目の成虫で96時間インキュベートします。
注:OP50プレートは、各10cm線虫増殖培地(NGM)プレート34に1mLの20x OP50細菌を添加することによって調製される。L4段階でワームを収穫することを目指す場合は、各OP50プレートに30,000匹のL1ワームを播種でき、現在の実験環境で1日目の成虫を収穫することを目指す場合は、各OP50プレートに20,000匹のL1ワームを播種できます。ラボの設定によって異なる場合があるため、シードできるワームの数をテストして、ワームが収集される前に十分な食料が残っていることを確認することをお勧めします。 - 10 mLのM9バッファーを使用して、L4、1日目の成虫、または2日目の成虫を15 mLのコニカルチューブに収集します。別の5 mLのM9バッファーを使用して、残りのワームをプレートから洗い流します。
- ワームを1,450 x g で30秒間スピンダウンし、上清を廃棄します。ワームペレットを10 mLのBDR培地で洗浄し、1,450 x g で30秒間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 液体供給法のワームの場合、BDR培地をワームに移し、ワーム濃度3,000ワーム/mLを達成します。プレート上の供給方法のワームの場合、ワームに添加するBDR培地の量を減らして、プレート上の乾燥時間を短縮します。
3. C.エレガンスに対する脂質補給
- 以下の手順に従って、液体培養で脂質補給を行います。
注:この方法は、脂質を添加したバルクワームを使用して転写変化をテストするのに適しています。- 所望の量の脂質またはビヒクルコントロールを12ウェルプレート内の各ウェルに移します。生物学的複製として、給餌条件ごとに3〜4ウェルを準備します。
- ステップ2.15のワーム懸濁液を5倍のBDR細菌と1:1の比率で混合して、最終濃度1,500ワーム/ mL、細菌の2.5倍を達成します。
- BDR培地中の2 mLの虫-細菌混合物を12ウェルプレートの各ウェルに移します。
- 12ウェルプレートをホイルで包み、20°Cのインキュベーター内で100 rpmで目的のインキュベーション長になるまで振とうします。
注意: さまざまな摂食条件をテストするには、脂質をワームと一緒に6時間、12時間、24時間など、さまざまな時間インキュベートします。さらに、L4または1日目の成人期からの脂質摂食など、最適な結果を得るためにさまざまなワーム段階をテストできます。
- 以下の手順に従って、10 cm NGM寒天プレートで脂質補給を行います。
注:この方法は、脂質を添加したバルクワームを使用して転写変化をテストするのに適しています。- ステップ1.9の脂質馴化細菌1mLをそれぞれの10cmプレートの中心に播種する。多数のプレートが準備されたら、播種の間に最終的な作業溶液を複数回ボルテックスします。バイオセーフティフードを使用して、暗闇でプレートを乾燥させます。
- ステップ2.15から3,000匹のワームを各10cmプレートに移します。ワームが泳ぐ代わりに脂質補給プレートの上を這うことができるまで、バイオセーフティフードでプレートを乾燥させます。
- 脂質調整プレート上のワームを20°Cのインキュベーター内で所望の時間インキュベートします。多価不飽和脂質を使用する場合は、光から保護してください。
注意: さまざまな摂食条件をテストするには、脂質をワームと一緒に6時間、12時間、24時間などのさまざまな時間インキュベートします。さらに、L4または1日目の成人段階での脂質摂食など、さまざまなワームステージをテストして最適な結果を得ることができます。
- 転写分析のために6 cm NGM寒天プレートで脂質補給を行います。
注:この方法は、脂質を補充したいくつかのワームの転写変化をテストするのに適しています。- ステップ1.9の脂質馴化細菌300 μLを各6 cmプレートの中心に播種します。多数のプレートが準備されたら、播種の間に最終的な作業溶液を複数回ボルテックスします。バイオセーフティフードを使用して、暗闇でプレートを乾燥させます。
- ステップ2.15から最大300匹のワームを6 cmプレートのそれぞれに移します。ワームが泳ぐ代わりに脂質を補給したプレートの上を這うことができるまで、バイオセーフティフードでプレートを乾燥させます。
- 脂質調整プレート上のワームを20°Cのインキュベーター内で所望の時間インキュベートします。多価不飽和脂質を使用する場合は、光から保護してください。
注意: さまざまな摂食条件をテストするには、6時間、12時間、24時間などのさまざまな時点で脂質をワームとインキュベートします。さらに、L4または1日目の成人段階での脂質摂食など、さまざまなワームステージをテストして最適な結果を得ることができます。
- 6 cm NGM寒天プレートで脂質補給を行い、縦方向の寿命アッセイを行います。
- 200 μLの脂質コンディショニング細菌(脂質濃度1倍、濃縮菌5倍)を6 cm NGMプレートの中央に播種します。給餌条件ごとに3枚のプレートを用意します。
注意: プレートは、使用日(理想的には使用直前)に作りたての準備をする必要があります。 - バイオセーフティフードでプレートを乾燥させます。多価不飽和脂質を使用する場合は、フード内の照明を消して部屋を消してください。
- 各プレートに30〜40個の同期L4ワームを選択します。ワームの入ったプレートを20°Cのインキュベーターに保管します。多価不飽和脂質を給餌する場合は、プレートを20°Cのインキュベーター内の光保護されたボックスに保管してください。
注:通常の6 cm継代プレート(無条件OP50)のOP50をワームを拾うための接着剤として使用することは可能ですが、アッセイプレートに無条件のOP50を大量に残さないことが重要です。 - 希望する摂食条件に応じて、毎日または隔日で、ワームを新しい、作りたての脂質調整プレートに移します。生存率は、前述の4と同じ方法でスコアリングされます。
- 200 μLの脂質コンディショニング細菌(脂質濃度1倍、濃縮菌5倍)を6 cm NGMプレートの中央に播種します。給餌条件ごとに3枚のプレートを用意します。
4. 転写解析のためのRNA抽出
- 大量のワーム全体からRNA抽出を実行します。
- 液体培養中のワームをステップ3.1から1.5 mLの微量遠心チューブに移します。M9バッファーを使用してステップ3.2の10 cmプレートからワームを洗い流し、M9バッファー中のワームを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
- 卓上ミニ遠心分離機( 材料の表を参照)でワームを10秒間短時間遠心分離し、上清をすばやく吸引します。
- 残りのワームを液体供給ウェルから移すか、プレート供給から同じチューブに洗浄してスピンダウンします。上清を取り除きます。
- ワームペレットを1 mLの氷冷M9で洗浄し、ミニ遠心分離機で10秒間短時間回転させ、上清を吸引します。上清の透明度に応じて1回または2回繰り返します。
- 微量遠心チューブを氷上に2分間置き、200 μLのピペットでできるだけ多くの上清を取り除き、15 μL以下の容量の充填ワームペレットを残します。
- フェノールとグアニジンイソチオシアネートを含むRNA抽出溶液15 μL(材料の表)を各マイクロ遠心チューブに移し、無傷のワームが見えなくなるまでモーターグラインダーで約30秒間ワームを粉砕します。
注意: RNA抽出溶液は有毒で可燃性であり、この試薬を含む開いた容器を含むステップは、化学フードで操作する必要があります。 - 285 μLのRNA抽出溶液をマイクロ遠心チューブに移し、モーターグラインダーの先端からマイクロ遠心チューブにワームの内容物を洗い流します。完全に混合する渦。
注: これは一時停止ポイントです。サンプルは、RNA抽出溶液に-80°Cで数ヶ月間保存できます。-80°Cから取り出したら、室温で試料を解凍させる。 - 60 μLのクロロホルムを各サンプルに移し、激しくボルテックスします。サンプルを室温で10分間沈降させます。
注意: クロロホルムは有毒であり、化学フードで取り扱う必要があります。 - 21,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 200 μLのピペットを使用して、上部の水層140 μLを新しいRNaseフリーのマイクロ遠心チューブに慎重に移し、毎回70 μLで2倍移します。
注:このステップ以降、サンプルと直接接触するすべてのピペットチップと容器はRNaseフリーである必要があります。また、RNase除染ソリューションを使用して、すべての機器と作業スペースを拭き取ることをお勧めします。 - 140 μLのイソプロパノールをサンプルチューブに移します。激しくボルテックスし、サンプルを室温で10分間沈降させます。21,000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、上清をすべて慎重に除去します。
- 0.5 mLの氷冷80%エタノール(v / v)をRNAペレットと一緒にサンプルチューブに移します。RNAペレットがチューブの底を離れ、エタノール溶液中に浮遊するまで激しく渦巻きます。21,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去します。
- ミニ遠心分離機でサンプルチューブを15秒間短時間遠心分離して、チューブ壁に付着している溶媒をスピンダウンしてから、ピペットでできるだけ多くのエタノール溶液を取り除きます。
- チューブキャップを開いたままにして、RNAペレットを乾燥させます。ペレットをエタノール溶液で十分に洗浄した場合、乾燥工程は10分未満で完了するはずである。
注: これは一時停止ポイントです。乾燥したRNAペレットは、-80°Cで最大1ヶ月間保存できます。 - 乾燥RNAペレットを40 μLのヌクレアーゼフリー水で溶解し、製造元の指示に従ってDNA除去キットで処理します(材料表を参照)。
注:最初にRNAをヌクレアーゼフリーの水に溶解することをお勧めします。RNAチューブに移す前に40 μLの水を10x DNaseバッファーと混合すると、RNAペレットは完全には溶解しません。RNAペレットを水に溶解するときは、RNAサンプルを氷上に保つ必要があります。凍結融解サイクルはRNA品質を低下させます。したがって、DNase処理の同日に逆転写ステップに進む。
- 少数の全ワームからのRNA抽出。
- バクテリアの芝生から15〜20匹のワームを選んで、新しいシードされていないNGMプレートに入れて、ワームからバクテリアを取り除きます。
- qRT-PCR 2ステップキットの製造元( 材料の表を参照)によると、PCRチューブ内で0.2 μLのDNaseと19.8 μLの溶解溶液を混合することにより、各サンプルに対して20 μLの最終溶解溶液を調製します。溶解溶液を上下に5回ピペッティングして混合します。
- 播種されていないNGMプレートから、細菌数を最小限に抑えた20 μLの最終溶解溶液を含むPCRチューブに15〜20匹のワームを移します。溶解反応を室温で5分間インキュベートします。
- プローブ超音波処理( 材料の表を参照)次のプログラムを使用して30%の振幅でワーム:5秒間超音波処理、5秒間一時停止し、20秒の合計超音波処理時間で4回を繰り返します。超音波処理中は、サンプルを氷冷水浴に保管してください。
- 室温で5分間インキュベートします。
注:ノーRT陰性対照が懸念レベルのDNA汚染を示している場合は、インキュベーション前にDNaseを追加してください。 - 2 μLの停止液を溶解反応に移し、軽くたたいて混合します。室温で2分間インキュベートしてから、氷の上に置きます。
注:サンプルは、逆転写ステップに進む前に、最大2時間氷上に放置できます。
- 以下の手順に従って、ワーム組織からRNA抽出を実行します。
- バクテリアの芝生から約20匹のワームを選び、それらを新しい播種されていないNGMプレートに置いて、それらからバクテリアを取り除きます。
- 20匹のワーム(できるだけバクテリアが少ない)を、4 μMレバミゾールを含む500 μLのM9溶液を含む時計のグラスに移動します( 材料の表を参照)。固定化は数秒以内に起こります。
- ワームが固定されたら、1 mLシリンジに取り付けることができる25 G針を使用して生殖系列または腸を解剖します。
- 解剖スコープの下で、腸と生殖細胞系列の自然な押し出しを可能にするために、第2咽頭球の位置で切断を行います。2つの組織は、それらの形態および異なるコントラストに基づいて容易に区別することができる。ピンセットまたは針を使用して組織を優しく分離し、損傷を防ぎます。
注意: 5〜10分以内に解剖することをお勧めします。カットで良好な組織押し出しが得られない場合は、次のワームに移動し、10分以内にできるだけ多く解剖することをお勧めします。この手順では、環境からの転写の変化を回避するために短い時間枠が必要です。
- 解剖スコープの下で、腸と生殖細胞系列の自然な押し出しを可能にするために、第2咽頭球の位置で切断を行います。2つの組織は、それらの形態および異なるコントラストに基づいて容易に区別することができる。ピンセットまたは針を使用して組織を優しく分離し、損傷を防ぎます。
- qRT-PCRの2ステップキットメーカーによると、PCRチューブ内で0.2 μLのDNase Iを19.8 μLの溶解溶液に混合することにより、各サンプルに対して20 μLの最終溶解溶液を調製します。溶解溶液を上下に5回ピペッティングして混合します。
- オートクレーブ処理したガラスピペットを使用して、解剖した組織をPCRチューブに移します。PCRチューブを氷上に2分間沈降させ、底部に材料を堆積させます。上清を除去し、20 μLの最終溶解溶液をPCRチューブに加え、タップして混合します。
- 溶解反応を室温で5分間インキュベートします。次に、2 μLの停止液を溶解反応に移し、タップして混合します。室温で2分間インキュベートします。
注:サンプルは、逆転写ステップに進む前に、最大2時間氷上に放置できます。
5. 逆転写とqRT-PCRの解析
- バルクワームからの逆転写とqRT-PCRを実行します。
- RNA濃度を測定し、逆転写用に5 μgの総RNAを調製します。
- 各サンプルから等量のRNAを混合し、最終RNA濃度を0.556 g / L(5 μg / 9 μL)に調整して、プールされたRNAサンプルを準備します。qRT-PCR標準曲線およびRT陰性対照には、プールされたRNAサンプルを使用してください。
- 製造元の指示に従って逆転写を実行します( 材料表を参照)。以下の品質管理逆転写反応を個々のRNAサンプルと一緒に実行します。
- プールされたRNAサンプルをテンプレートとして逆転写を実行します(qRT-PCR標準曲線の場合)。
- プールされたRNAサンプルを鋳型として、逆転写酵素を使用せずに逆転写を実行します(RT陰性対照;潜在的なゲノムDNA汚染に対する品質管理)。
- ヌクレアーゼフリーの水を鋳型として逆転写を行います(RTネガティブコントロール、試薬中の潜在的なRNA汚染に対する品質管理)。
注: これは一時停止ポイントです。サンプルは、サーモサイクラーに一晩放置するか、-20°Cで数ヶ月間保存できます。
- プールされたRNAサンプルから生成されたcDNAをヌクレアーゼフリー水で4回、20回、100回、および500倍希釈して、qRT-PCR標準曲線を作成します。
- 各RNAサンプルから生成されたcDNAを20〜100倍に希釈して、qRT-PCR反応のテンプレートとして使用します。
注:希釈率は、目的の遺伝子の存在量に依存します。この研究で使用されたハウスキーピング遺伝子やegl-3およびegl-21などの高発現遺伝子の場合、100倍希釈が推奨されます。 lbp-8などの低発現遺伝子の場合、20倍希釈が推奨されます。 - 製造元の指示に従ってqRT-PCR試薬を使用してqRT-PCRを実行します:95°Cで10分間、95°Cで15秒間、60°Cで1分間40回繰り返し、その後デフォルトの融解曲線プログラムに従い、8°Cで無期限に保持します。
- いくつかのワームまたはワーム組織から逆転写およびqRT-PCRを実行します。
- qPCRの2ステップキット( 材料の表を参照)から25 μLのRTバッファーと2.5 μLの20x RT酵素ミックスを、ステップ4.2.6またはステップ4.3.6のいずれかのワームライセートを含む各チューブに移します。
注:RT陰性対照は、いくつかのワームからのqRT-PCRにとって重要です。各実験には、サンプル中のDNA汚染を調べるために、RTバッファーを含むがRT酵素を含まないワームライセートのサンプル(ステップ4.2.6から)を含める必要があります。DNA汚染が問題になる場合は、ワームが溶解した後に、溶解バッファーにDNaseを追加するか、サンプルにDNaseを追加することを検討してください。あるいは、通常のRT反応でライセートの半分を使用し、逆転写酵素なしでRT反応で残りの半分を使用することにより、各サンプルに対してRT陰性対照を行うことができます。 - 軽くたたいて混ぜます。ミニ遠心分離機を使用して10秒間スピンダウンします。
- 製造元の指示に従って、サンプルをサーモサイクラーマシンにロードします:37°Cで60分間、95°Cで5分間、8°Cで無期限。
注: これは一時停止ポイントです。サンプルは、サーモサイクラーに一晩放置するか、-20°Cで数ヶ月間保存できます。 - すべての試薬とサンプルを氷上に保ち、qRT-PCR試薬を光から保護します。
- 96ウェルqPCRプレートを準備し、各ウェルに6 μLのヌクレアーゼフリー水、10 μLのqRT-PCR試薬、2 μLの5 μMプライマーミックス(順方向および逆方向)、および2 μLのcDNAを混合します。96ウェルqPCRプレートの表面を保護光学フィルムで覆い、押し下げて密封します。
- 製造元の指示に従って、サーマルサイクラーでqRT-PCRプログラムを実行します:50°Cで2分間、95°Cで2分間、95°Cで3秒間、60°Cで30秒間40回繰り返し、その後8°Cで無期限に繰り返します。
- qPCRの2ステップキット( 材料の表を参照)から25 μLのRTバッファーと2.5 μLの20x RT酵素ミックスを、ステップ4.2.6またはステップ4.3.6のいずれかのワームライセートを含む各チューブに移します。
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Representative Results
脂質補給時の数例全線虫を用いた転写変化の検証
いくつかの全線虫からRNAを抽出してcDNAにレトロ転写するプロトコルが再現性があり、バルク線虫からのデータと同等であるかどうかを調べるために、腸内でリソソーム酸リパーゼlipl-4を過剰発現する長寿命の線虫株を採用しました7、8、33、35。以前の研究7、8、33で報告された神経ペプチドプロセシング遺伝子egl-3およびegl-21の転写誘導が検証された(図2A、B)。この誘導は、数匹の動物からのRNA抽出法が、バルクワーム培養からの標準的なcDNA合成技術に代わる有効な代替手段であることを示しています。
脂質補充時の解剖虫組織を用いた転写評価の検証
C.エレガンスでは、20炭素PUFAの合成はデサチュラーゼFAT-316,17の活性に依存する。以前の研究では、脂肪3変異体はDGLA16を含む20炭素PUFAを欠いていることが報告されています。以前、lipl-4gワームにおけるΔ6-デサチュラーゼFAT-3の喪失が、神経ペプチドプロセシング遺伝子egl-3およびegl-21の転写誘導を抑制することが発見された33。 さらに、DGLA補給は、そのような誘導33を救助する。egl-21をコードする遺伝子はニューロンで発現し、egl-3はニューロンと腸の両方で検出されます36,37。DGLA補給が腸またはニューロンにおけるegl-3およびegl-21の誘導を回復させるかどうかをさらに試験するために、腸を解剖し、それらの転写レベルを、このプロトコルのステップ4.3および5.2に記載されているqRT-PCR分析を使用して評価した。 DGLAは、成人期1日目に12時間ソース食品に補給されました。腸ではegl-3またはegl-21のいずれかの転写誘導は見られず(図2C)、これは以前の所見と一致している36,38。
脂質補給時の寿命アッセイの検証
20炭素PUFAと脂肪3を不活性化する長寿メカニズムとの関係は、特にlipl-4gワームの腸で以前に調査されました33。脂肪3ノックダウンは、lipl-433によって与えられる寿命延長を完全に抑制することがわかった。DGLAがlipl-4によって媒介される長寿を回復するかどうかを評価するために、DGLAは成人期の1日目にソースフードに1日おきに新たに補充されました。脂肪3ノックダウン時に、DGLA補給が寿命延長を救済することがわかりました(図2D)33、寿命アッセイと組み合わせた脂質補給手順の成功を示しています。
図1:異なる実験設定を使用した脂質供給の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:多数のワーム、少数のワーム、および解剖組織を使用した神経ペプチドプロセシング遺伝子の転写評価の検証。 (A)大量の線虫から抽出したRNAは、lipl-4 Tg動物における神経ペプチドプロセシング遺伝子のegl-3およびegl-21転写レベルの誘導を示しています。 誤差範囲は、両側スチューデントのt検定による±1 SEMを表します。 **** p < 0.0001。(B)いくつかの線虫からのRNA抽出により、lipl-4 Tg線虫における神経ペプチドプロセシング遺伝子のegl-3およびegl-21転写レベルの誘導が確認されました。 誤差バーは、両側スチューデントのt検定による±1 SEMを表します。 **** p < 0.0001(C)ニューロン神経ペプチドプロセシング遺伝子egl-3およびegl-21は、解剖された腸では誘導されない。 エラーバーは±1 SEMを表します。 両側スチューデントのt検定による統計分析。(D)10 μm、100 μm、および1 mMを含むさまざまな濃度でのDGLA補給は、脂肪-3 RNAiに対するlipl-4Tgの寿命効果を救済します。p<ログランク検定で0.001。この図は、Saviniら33から適応されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
脂質補給は、健康的な老化に対する特定の脂質種の直接的な影響を解明するための老化研究に採用されています6,7,23,26,27,31。ただし、脂質補給手順は困難な場合があり、実験間の不一致は再現性のない結果を引き起こす可能性があります。ここでは、技術的な不正確さによって引き起こされる潜在的な落とし穴を回避するために、新しい科学者を導くために、最初の詳細なステップバイステップのプロトコルが文書化されています。このプロトコルの重要な手順については、次の段落で詳しく説明します。脂質研究ツールボックスは、脂質補給後に少数のワームおよび特定のワーム組織からのみRNA単離を導入することによっても拡張されます。転写産物レベルを調べる方法論を検討する場合、いくつかの線虫または解剖組織を用いたqRT-PCRは、いくつかの転写産物の分析または特定の組織特異的転写変化の検査に優れています。さらに、これらの方法論を使用すると、約5〜6日余分にかかる可能性のあるワーム増幅のステップを克服できます。同時に、脂質供給とそれに続くバルクRNA抽出は、より費用効果が高く、より多くの標的遺伝子セットを分析する必要がある場合に有効な代替手段です。
脂質摂食効果の再現性には、いくつかのステップが重要です。第一の側面は細菌の状態に関連しています。接種には7日以内の新鮮なバクテリアプレートを使用することをお勧めします。1週間以内にBDR培地で調製した細菌を使用することをお勧めします。脂質と混合された細菌はすぐに使用する必要があります。細菌を含む脂質は、細菌が脂質を代謝するため、4°Cでも保存しないでください。細菌はLBで増殖し、ワームに直接給餌されるため、BDRベースの洗浄ステップとBDR培地への再懸濁は、脂質サプリメントの深い影響を常に排除するため、細菌の状態にとって重要です。2番目の要因は、ワームの状態に関連しています。 C.エレガンスは 、健康で安定した代謝状態にあることを確認するために、卵の準備のための漂白ステップの前に少なくとも3世代飢餓状態になっていなければなりません。また、脂質補給の前に寒天プレート上で C.エレガンス を培養することも重要です。これには、同期ステップの前と後が含まれます。
液体培養に長期間適応したワームは部分的に飢えています。飢餓は長寿促進遺伝子のベースラインを上昇させ、脂質補給の効果を弱めます。代謝ドリフトと停止したL1幼虫を使用した変化が懸念される場合、有効な代替手段は卵を直接プレートすることです。寿命や遺伝子発現解析に必要なワームが数匹しかない場合は、脂質馴化プレートに直接卵をプレートし、L4段階でハンドピッキングして再同期させ、その後の実験に役立てることができます。ただし、L4を手で摘むことができないときに大量のワームが必要な場合、卵を直接メッキすることは理想的ではありません。妊娠した成虫からの漂白後の卵の孵化は、異なる時点で発生し、集団が同期しなくなり、転写分析を妨げる可能性があります。3番目の重要な部分は、脂質貯蔵条件に関連しています。PUFAを補う場合、これらの分子は光に敏感で空気中で酸化しやすいため、特に注意が必要です。
線虫の段階、補給の長さ、濃度など、複数の脂質摂食条件は、新しい脂質分子をテストする際にさらに調査する必要があります。L4、1日目の成虫、および2日目の成虫は、通常、さまざまなワーム段階でのテストの開始点です。特に、L4ワームを給餌する場合、インキュベーション時間が線虫脱皮期付近で終了すると、大きな変動が予想され、結果の意義と再現性に大きく影響します。1日目または2日目の成虫を使用する際の追加の課題は、遺伝子発現分析を複雑にする可能性のある子孫に関連しています。この場合、いくつかの全線虫からのRNA抽出は、バルク集団よりも信頼性が高い。異なる脂質分子は、生理学的効果を生み出すために異なる濃度範囲を有する。したがって、1μMから1mMまでの一連の濃度をテストすることが提案されています。
給餌方法を選択する際に考慮すべきいくつかの制限があります。第一に、脂質がワームに吸収または摂取できない場合、補充法を使用して C.エレガンスの生物学的効果をテストすることは困難です。現在の技術では、質量分析またはSRSと 13のCまたは 2H標識脂質化合物39 を組み合わせることは、線虫の体内への脂質の取り込みをテストするための有効なツールです。第二に、これらの給餌方法は、ハイスループットの調査技術に最適化されていません。バルクワームによる脂質補給の場合、液体培養物をフィードプレートから洗い流す代わりにマイクロ遠心チューブに直接移すことができるため、液体供給法によるサンプル調製はオンプレート供給よりも高速です。抽出されたRNAが収穫状態であることを確実にするために、ワームを氷上に置いた点からRNA抽出溶液中でそれらを粉砕するまでの間に15〜20分以上経過させないことが推奨される。多数のサンプルを処理する必要がある場合は、15分ごとに処理する条件を減らすことをお勧めします。数匹の動物からの全線虫RNAを抽出する場合、ハンドピッキングステップは律速ステップですが、組織を解剖する場合、非生理学的環境への長期暴露を避けるために時間効率の良い方法で行動することが重要です。バルクRNA抽出と同様に、ワームを摘み取るか、10分以内に組織サンプルを解剖することが好ましい。
制限にもかかわらず、これらの補給方法は、脂質研究を超えて、栄養的および薬効の特定を支援するために使用できます。ここで報告する手順は、老化研究だけでなく、オルガネラの適応度と細胞代謝の恒常性を評価するための代替表現型に限定されています。バルク集団による補充法は、トランスクリプトーム解析のためのRNA-seq、メタボロームおよびプロテオミクス解析のための質量分析、または特定のタンパク質マーカーの分析のためのウェスタンブロットと組み合わせることができ、少数のワームによる脂質補給は、イメージングおよび行動解析と組み合わせることができます。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
メンテナンスサポートを提供してくださったP. Svayに感謝します。この研究は、NIH助成金R01AG045183(MCW)、R01AT009050(MCW)、R01AG062257(MCW)、DP1DK113644(MCW)、マーチオブダイムズ財団(MCW)、ウェルチ財団(MCW)、HHMI研究者(M.C.W.)、およびNIH T32 ES027801博士課程前学生フェロー(M.S.)によってサポートされました。一部の菌株は、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されているCGCによって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
| Agarose | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
| Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
| Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
| Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
| Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
| Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
| Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
| Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
| TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
| Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
| VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
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