Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

في المختبر اختيار أبتامر للتمييز بين الفيروسات المعدية وغير المعدية

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin
* These authors contributed equally

Summary

نحن نقدم بروتوكولا يمكن تطبيقه بشكل عام على مجموعة مختارة من الأبتامير التي ترتبط بالفيروسات المعدية فقط وليس للفيروسات التي أصبحت غير معدية بطريقة التطهير أو أي فيروسات أخرى مماثلة. هذا يفتح إمكانية تحديد حالة العدوى في الاختبارات المحمولة والسريعة.

Abstract

العدوى الفيروسية لها تأثير كبير على المجتمع. تواجه معظم طرق الكشف صعوبات في تحديد ما إذا كان الفيروس المكتشف معديا ، مما يتسبب في تأخير العلاج وزيادة انتشار الفيروس. إن تطوير أجهزة استشعار جديدة يمكنها الإبلاغ عن قابلية العدوى للعينات السريرية أو البيئية سيواجه هذا التحدي الذي لم تتم تلبيته بعد. ومع ذلك ، يمكن لعدد قليل جدا من الطرق الحصول على جزيئات استشعار يمكنها التعرف على فيروس معد سليم وتمييزه عن نفس الفيروس الذي أصبح غير معدي بطرق التطهير. هنا ، نصف بروتوكولا لاختيار الأبتامير يمكنه التمييز بين الفيروسات المعدية والفيروسات غير المعدية باستخدام التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX). نحن نستفيد من ميزتين من SELEX. أولا ، يمكن تصميم SELEX خصيصا لإزالة الأهداف المنافسة ، مثل الفيروسات غير المعدية أو الفيروسات المماثلة الأخرى ، باستخدام الاختيار المضاد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفيروس بأكمله كهدف ل SELEX ، بدلا من ، على سبيل المثال ، بروتين السطح الفيروسي. يسمح الفيروس الكامل SELEX باختيار الأبتامير التي ترتبط على وجه التحديد بالحالة الأصلية للفيروس ، دون الحاجة إلى تعطيل الفيروس. وبالتالي تسمح هذه الطريقة بالحصول على عوامل التعرف بناء على الاختلافات الوظيفية في سطح مسببات الأمراض ، والتي لا تحتاج إلى معرفتها مسبقا.

Introduction

للعدوى الفيروسية آثار اقتصادية واجتماعية هائلة في جميع أنحاء العالم ، كما أصبح واضحا بشكل متزايد من جائحة COVID-19 الأخيرة. التشخيص الدقيق في الوقت المناسب أمر بالغ الأهمية في علاج الالتهابات الفيروسية مع منع انتشار الفيروسات إلى الأشخاص الأصحاء. في حين تم تطوير العديد من طرق الكشف عن الفيروسات ، مثل اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل 1,2 ومقايساتinmunoassay 3 ، فإن معظم الطرق المستخدمة حاليا غير قادرة على تحديد ما إذا كان الفيروس المكتشف معديا بالفعل أم لا. وذلك لأن وجود مكونات الفيروس وحده ، مثل الحمض النووي الفيروسي أو البروتينات ، لا يشير إلى وجود الفيروس السليم والمعدي ، وقد أظهرت مستويات هذه المؤشرات الحيوية ارتباطا ضعيفا بالعدوى4،5،6. على سبيل المثال ، يحتوي الحمض النووي الريبي الفيروسي ، الذي يشيع استخدامه في اختبارات COVID-19 الحالية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، على مستويات منخفضة جدا في المراحل المبكرة من العدوى عندما يكون المريض معديا ، في حين أن مستوى الحمض النووي الريبي غالبا ما يكون مرتفعا جدا عندما يتعافى المرضى من العدوى ولم يعودوا معديين 7,8. يتبع البروتين الفيروسي أو المؤشرات الحيوية للمستضد اتجاها مشابها ، ولكنه يظهر عادة في وقت متأخر عن الحمض النووي الريبي الفيروسي وبالتالي فهو أقل تنبؤا بالعدوى 6,9. لمعالجة هذا القيد ، تم تطوير بعض الطرق التي يمكن أن تبلغ عن حالة العدوى للفيروس ، ولكنها تستند إلى تقنيات علم الأحياء الدقيقة لزراعة الخلايا التي تتطلب وقتا طويلا (أيام أو أسابيع) للحصول على النتائج 4,10. وبالتالي ، فإن تطوير أجهزة استشعار جديدة يمكنها الإبلاغ عن قابلية العدوى للعينات السريرية أو البيئية يمكن أن يتجنب التأخير في العلاج وزيادة انتشار الفيروس. ومع ذلك ، يمكن لعدد قليل جدا من الطرق الحصول على جزيئات استشعار يمكنها التعرف على virion المعدية السليمة وتمييزها عن نفس الفيروس الذي أصبح غير معدي.

في هذا السياق ، تعتبر الأبتامير مناسبة بشكل خاص كأداة جزيئية حيوية فريدة11،12،13،14. Aptamers عبارة عن جزيئات DNA أو RNA قصيرة مفردة تقطعت بها السبل مع تسلسل نيوكليوتيدات محدد يسمح لها بتكوين شكل ثلاثي الأبعاد محدد للتعرف على هدف ذو تقارب وانتقائية عالية15,16. يتم الحصول عليها من خلال عملية اختيار اندماجية تسمى التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX) ، المعروف أيضا باسم الانتقاء في المختبر ، والذي يتم إجراؤه في أنابيب اختبار مع مكتبة عينات عشوائية كبيرة من الحمض النووي من 10 14-1015 تسلسل 17،18،19. في كل جولة من هذه العملية التكرارية ، يتعرض تجمع الحمض النووي أولا لضغط اختيار من خلال الحضانة مع الهدف في ظل الظروف المطلوبة. ثم تتم إزالة أي تسلسلات غير مرتبطة بالهدف ، تاركة وراءها فقط تلك التسلسلات القليلة القادرة على الارتباط في ظل الظروف المحددة. أخيرا ، يتم تضخيم التسلسلات التي تم اختيارها في الخطوة السابقة بواسطة PCR ، مما يثري سكان التجمع بالتسلسلات الوظيفية المطلوبة للجولة التالية من الاختيار ، وتتكرر العملية. عندما يصل نشاط مجموعة الاختيار إلى هضبة (عادة بعد 8-15 جولة) ، يتم تحليل المكتبة عن طريق تسلسل الحمض النووي لتحديد التسلسلات الفائزة التي تظهر أعلى تقارب.

تتمتع SELEX بمزايا فريدة يمكن استغلالها للحصول على انتقائية متزايدة مقابل أهداف أخرى مماثلة 20,21 ، مثل حالة العدوى للفيروس22. أولا ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الأنواع المختلفة من الأهداف للاختيار ، من الجزيئات الصغيرة والبروتينات إلى مسببات الأمراض والخلاياالكاملة 16. وبالتالي ، للحصول على أبتامير يرتبط بفيروس معدي ، يمكن استخدام فيروس سليم كهدف ، بدلا من بروتين السطح الفيروسي19. يسمح الفيروس الكامل SELEX باختيار aptamers التي ترتبط على وجه التحديد بالحالة الأصلية للفيروس ، دون الحاجة إلى تعطيل الفيروس. ثانيا ، يمكن تصميم SELEX خصيصا لإزالة الأهداف المتنافسة 21,23 ، مثل الفيروسات المماثلة الأخرى أو الفيروسات المعطلة غير المعدية ، باستخدام خطوات الاختيار المضادة في كل جولة من الاختيار22. أثناء خطوات الاختيار المضاد ، يتعرض تجمع الحمض النووي لأهداف لا يرغب في الارتباط بها ، ويتم تجاهل أي تسلسلات مرتبطة.

في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا يمكن تطبيقه بشكل عام لاختيار الأبتامير الذي يرتبط بفيروس معدي ولكن ليس بنفس الفيروس الذي أصبح غير معدي بواسطة طريقة تطهير معينة أو بفيروسات أخرى ذات صلة. تسمح هذه الطريقة بالحصول على عوامل التعرف بناء على الاختلافات الوظيفية لسطح الفيروس ، والتي لا تحتاج إلى معرفتها مسبقا ، وبالتالي توفر ميزة إضافية للكشف عن مسببات الأمراض الناشئة حديثا أو للأمراض غير المدروسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكواشف والمخازن المؤقتة

  1. قم بإعداد 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) بإضافة 0.9 M Tris-base ، 0.9 M حمض البوريك ، 20 mM EDTA (ملح الصوديوم) ، والماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي 1 L. امزج حتى تذوب جميع المكونات.
  2. قم بإعداد محلول مخزون بولي أكريلاميد لتغيير طبيعة 10٪ على النحو التالي. في زجاجة زجاجية سعة 250 مل ، أضف 120 جم من اليوريا (8 م) ، و 25 مل من 10x TBE ، و 62.5 مل من محلول 40٪ أكريلاميد / بيساكريلاميد (29: 1) ، وما يكفي من الماء المقطر للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 250 مل. تخلط حتى تذوب جميع المكونات.
  3. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحميل 2x على النحو التالي. في أنبوب سعة 50 مل ، أضف 21.636 جم من اليوريا (8 م) ، و 1.675 جم من EDTA (1 مللي مول) ، و 4.5 مل من 10x TBE. املأ إلى 45 مل بالماء المقطر واخلطه حتى تذوب جميع المكونات.
  4. قم بإعداد المخزن المؤقت للاستخراج بإضافة 100 مللي متر من أسيتات الصوديوم و 1 مللي متر EDTA (ملح ثنائي الصوديوم). اضبط الرقم الهيدروجيني النهائي على 5.
  5. تحضير حلول ترسيب الإيثانول على النحو التالي. تحضير 3 M أسيتات الصوديوم، وضبط إلى درجة الحموضة 5.2، وتخزينها في 4 °C. تحضير 70٪ إيثانول v / v وتخزينها في -20 درجة مئوية. تحضير الإيثانول 100٪ وتخزينه في -20 درجة مئوية.
  6. قم بإعداد 500 مل من المخزن المؤقت SELEX الذي يحتوي على 1x PBS و 2.5 mM MgCl 2 و 0.5 mM CaCl2. اضبط على الرقم الهيدروجيني 7.4. تحضير 100 مل من المخزن المؤقت SELEX مع 8 M اليوريا عن طريق إضافة 1x PBS ، 2.5 mM MgCl2 ، 0.5 mM CaCl2 ، و 8 M اليوريا. اضبط على الرقم الهيدروجيني 7.4.
    ملاحظة: يعد اختيار المخزن المؤقت SELEX أمرا بالغ الأهمية لضمان عمل aptamer المحدد على العينة النهائية حيث سيتم تطبيق aptamer. على سبيل المثال ، سيتم استخدام الأبتامير الخاصة ب SARS-CoV-2 في العينات البيولوجية (على سبيل المثال ، مسحات اللعاب أو البلعوم الأنفي). وبالتالي ، من المهم اختيار تركيزات الأيونات والأس الهيدروجيني والمخزن المؤقت الذي يحاكي عن كثب تلك الظروف في العينات البيولوجية المقصودة.
  7. تحضير العازلة ملزمة والغسيل على النحو التالي. في أنبوب سعة 50 مل ، قم بإعداد 5 mM Tris و 0.5 mM EDTA (ملح ثنائي الصوديوم) و 2 M NaCl. اضبط على الرقم الهيدروجيني 7.5.

2. تصميم وتوليف مكتبة الحمض النووي والاشعال

  1. صمم مكتبة ssDNA الأولية والبادئات بالمعايير التالية (انظر الجدول 1 للحصول على مثال لمكتبة ssDNA ومجموعة من البادئات ، حيث يشير N إلى موضع نيوكليوتيد عشوائي).
    1. تأكد من أن المكتبة تحتوي على منطقة عشوائية مركزية من 35 إلى 60 نيوكليوتيدات محاطة بتسلسلين ثابتين عند النهايات 3 'و 5' التي تعمل كمناطق أولية للتضخيم. طول المكتبة النموذجي هو 45 نيوكليوتيدات عشوائية.
    2. تأكد من أن التمهيدي العكسي يحتوي على تعديل البيوتين لفصل ssDNA عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المزدوج المضخم باستخدام حبات مغلفة بالستربتافيدين أثناء عملية الاختيار في المختبر .
  2. شراء oligos الحمض النووي من مصادر تجارية مع تنقية تحلية قياسية. تنقية مكتبة ssDNA والاشعال بنسبة 10 ٪ تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (dPAGE) ، تليها ترسيب الإيثانول وفقا للإجراءات القياسية24.
    تنبيه: مونومر الأكريلاميد وبروميد الإيثيديوم من المواد الكيميائية الخطرة (المواد المسرطنة البشرية) ، لذا استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة (معاطف المختبر والقفازات وحماية العين) أثناء إجراء PAGE. عندما يكون ذلك ممكنا ، تجنب استخدام بروميد الإيثيديوم واستبدله بصبغة أكثر أمانا.
    ملاحظة: من الممكن طلب oligos مع تنقية HPLC لتجنب تنفيذ خطوة التنقية هذه ، على الرغم من أن هذا لن يزيل oligonucleotides القصيرة بشكل فعال.
  3. أضف الماء الخالي من النيوكلياز لإعادة تعليق ssDNA بعد ترسيب الإيثانول حتى التركيز المطلوب (100 ميكرومتر). تحديد تركيز مكتبة ssDNA والبادئات عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند λ = 260 نانومتر. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  4. قم بشراء برايمر عكسي غير معدل لاستخدامه في إعداد مكتبة التسلسل عالي الإنتاجية والقياس الكمي qPCR.

3. عينات الفيروسات المعدية وغير المعدية

تنبيه: عينات الفيروسات المعدية وغير المعدية هي عينات من مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL2) التي تتطلب عناية إضافية للتعامل معها بأمان وبشكل مناسب. يجب تنفيذ جميع خطوات الإجراء التي تشمل هذه العينات في خزانة السلامة البيولوجية ، أو يجب أن يكون محلول الفيروس في حاوية محكمة الغلق (على سبيل المثال ، أنابيب بلاستيكية مغطاة).

  1. الحصول على حل مخزون من الفيروسات المعدية أو إعدادها ، باتباع البروتوكول المقابل لكل فيروس. تم توفير الفيروسات الكاذبة SARS-CoV-2 و SARS-CoV-1 و H5N1 المستخدمة هنا من قبل مختبر البروفيسور ليجون رونغ (UIC) في مخزن PBS المؤقت ، وتم إعدادها وفقا للبروتوكولات المبلغ عنها22،25،26.
    ملاحظة: بالنسبة للفيروسات التي تتطلب مرافق السلامة البيولوجية من المستوى 3 للتعامل مع الفيروس المعدي السليم ، من الممكن العمل مع الفيروسات الزائفة. يتم إنشاء فيروس من النمط الكاذب من فيروس lentivirus (HIV) الذي يعرض البروتينات السطحية للفيروس داخل الغلاف الفيروسي ، وبالتالي يحاكي عن كثب سطح الفيروس وآلية دخوله ولكنه معيب في التكاثر الفيروسي المستمر.
  2. احصل على محلول مخزون فيروسات غير معدي أو قم بإعداده باتباع إجراء التطهير. تم توفير مخزون الفيروس الكاذب SARS-CoV-2 المعطل بالأشعة فوق البنفسجية (p-SARS-CoV-2) المستخدم هنا من قبل مختبر البروفيسور رونغ (UIC) في مخزن PBS المؤقت ، وتم استخدام البروتوكول المبلغ عنه سابقا لتعطيل الأشعة فوق البنفسجية22.
    ملاحظة: إذا أمكن ، قم بإجراء فحص لاختبار عدوى الفيروس للتأكد من تعطيل الفيروس تماما.
  3. تحديد مخزون الفيروس
    1. تحديد كمية الفيروس باستخدام مقايسة البلاك وفقا للإجراءات القياسية27،28،29. لا يسمح هذا الفحص بالقياس الكمي للفيروس فحسب ، بل يشير أيضا إلى حالة العدوى للفيروس ، مما يؤكد تركيز الفيروس المعدي.
    2. بالنسبة للفيروسات الكاذبة أو الفيروسات التي لا يتوفر فيها فحص اللويحات ، قم بقياس الفيروس باستخدام مجموعة ELISA الكمية المتاحة تجاريا.
    3. قم بإعداد 1 × 108 نسخ / مل من محلول المخزون ل p-SARS-CoV-2 و p-SARS-CoV-1 و p-H5N1. افصل كل محلول مخزون في قسوم تحتوي على 50 ميكرولتر لكل منها واحتفظ بها عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة قسمة جديدة قبل كل تجربة.

4. الاختيار في المختبر أو عملية SELEX: الجولة الأولية

ملاحظة: بالنسبة لجميع الخطوات التي تستخدم الفيروس المعدي ، اعمل في خزانة BSL2.

  1. تشويه مكتبة ssDNA. خذ 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر من مكتبة ssDNA (1 نانومول) واخلطها مع 240 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX. يسخن على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام جاف ، ثم يوضع الأنبوب على الثلج لمدة 15 دقيقة.
  2. احتضان مكتبة ssDNA بالفيروس المعدي (خطوة الاختيار الإيجابية) على النحو التالي. امزج 250 ميكرولتر من مكتبة ssDNA في المخزن المؤقت SELEX من الخطوة 4.1 مع 50 ميكرولتر من الفيروسات المعدية (1 × 108 نسخ / مل). احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. حظر المواقع غير المحددة في مرشحات الطرد المركزي على النحو التالي. أثناء انتظار الخطوة 4.2 ، قم بإعداد مرشحات أجهزة الطرد المركزي للخطوات التالية.
    1. أضف 400 ميكرولتر من تسلسل 1 mM T20 (الجدول 1) إلى كل مرشح طرد مركزي سعة 0.5 مل سيتم استخدامه - مرشح طرد مركزي واحد بقطع 100 كيلو دالتون وواحد بقطع 10 كيلو دالتون.
    2. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وأجهزة الطرد المركزي في 14000 × غرام لمدة 10 دقائق لإزالة محلول T20 في الفلتر. اغسل 3x باستخدام المخزن المؤقت SELEX لإزالة تسلسلات T20 الزائدة.
  4. اغسل التسلسلات غير المنضمة على النحو التالي. أضف المزيج المحتضن في الخطوة 4.2 إلى مرشح الطرد المركزي المحظور 100 كيلو دالتون وأجهزة الطرد المركزي عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق. اغسل 3 مرات ، مع إضافة 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX والطرد المركزي عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق. احتفظ بالكسر في الفلتر وتجاهل التدفق.
  5. تسلسلات Elute المرتبطة كما هو موضح أدناه.
    1. قم بتغيير أنبوب التجميع لمرشح الطرد المركزي وأضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX الذي يحتوي على 8 M من اليوريا إلى مرشح الطرد المركزي في الخطوة 4.4. قم بتسخين مرشح الطرد المركزي عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام جاف ثم جهاز طرد مركزي عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق.
    2. اجمع الكسر الذي تدفق عبر المرشح الذي يحتوي على التسلسلات المستخلصة. كرر ثلاث مرات أخرى. اعمل في خزانة BSL2 واغسل جميع المواد باستخدام مبيض بنسبة 10٪ لتعطيل الفيروس قبل التخلص من المواد.
  6. التركيز والملح على النحو التالي. أضف المحلول الذي تم جمعه في 4.5 إلى مرشح طرد مركزي 10 كيلو دالتون محظور. أجهزة الطرد المركزي عند 14000 × غرام لمدة 15 دقيقة. تجاهل الكسر الذي تدفق عبر الفلتر.
    ملاحظة: نظرا للاحتفاظ بالفيروسات وتعطيلها باستخدام 8 ملايين يوريا في المرشح في الخطوة السابقة ، لا يلزم تنفيذ هذه الخطوة والخطوات التالية في خزانة السلامة الحيوية. يجب تكرار هذا الإجراء إذا تم استخدام أنبوب طرد مركزي سعة 0.5 مل حتى يتم جمع كل المحلول كما في الخطوة 4.5 ، يتدفق 1.2 مل عبر الفلتر.
  7. اغسل 3 مرات ب 300 ميكرولتر من محلول SELEX لإزالة اليوريا عن طريق الطرد المركزي عند 14000 × جم لمدة 15 دقيقة. تجاهل الكسر الذي تدفق عبر الفلتر. استرجع المحلول في الفلتر عن طريق قلبه رأسا على عقب في أنبوب تجميع نظيف والطرد المركزي لمدة 5 دقائق.
  8. قم بقياس الحجم النهائي للمحلول المسترد من 4.7 باستخدام ماصة في أنبوب بلاستيكي. يسمى هذا الحل R i a ، حيث iيتوافق مع الرقم الدائري. عادة ، يتم الحصول على أحجام تتراوح بين 30 ميكرولتر إلى 50 ميكرولتر. خذ 1 ميكرولتر من ssDNA المستوحى لتحديد كمية الحمض النووي بواسطة qPCR.
    ملاحظة: هذه نقطة توقف محتملة ، حيث يمكن الاحتفاظ بعينة R1عند -20 درجة مئوية للاستمرار في وقت آخر.
  9. قم بإجراء تضخيم PCR كما هو موضح أدناه.
    1. في الجولة الأولى ، خذ 90٪ من عينة R1كقالب PCR. في الجولات التالية ، خذ 60٪ من الحجم الكلي في الخطوة 4.8 لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل وتخزين الكسر الآخر عند -20 درجة مئوية.
    2. قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل 50 ميكرولتر مع وجود التركيز النهائي المحدد لما يلي: 1x مخزن مؤقت لتفاعل تفاعل PCR ، 200 ميكرومتر dNTPs ، 10 ميكرولتر من قالب الحمض النووي(R 1 عينة) ، 200 نانومتر لكل مادة أولية ، و 1.25 U بوليميراز (مخزون 2.5 وحدة / ميكرولتر).
    3. قم بتحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل بما في ذلك عدد الدورات ودرجة حرارة التلدين لكل مجموعة من البادئات ومكتبة ssDNA. تجنب استخدام الكثير من الدورات ، والتي ستنتج منتجات فرعية غير مرغوب فيها من تفاعل البوليميراز المتسلسل مثل الدايمرات الأولية. اختبر درجات حرارة التلدين المختلفة بناء على درجة حرارة انصهار البادئات.
    4. قم بتشغيل PCR باستخدام ظروف محسنة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق متبوعة ب 18 دورة من 1 دقيقة عند 95 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 52 درجة مئوية ، و 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ، مع خطوة تمديد نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، للحصول على تجمع dsDNA.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف أخرى محتملة ، حيث يمكن الاحتفاظ بمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل عند -20 درجة مئوية للاستمرار في وقت آخر.
  10. استعادة ssDNA باستخدام الخرز المغناطيسي المعدل بالستربتافيدين .
    1. خذ 80٪ من منتج PCR. قم بتخزين الجزء المتبقي في -20 درجة مئوية.
    2. تقسيم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل في قسوم 50 ميكرولتر وإضافتها إلى أنابيب الميكروفوج التي تحتوي على 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المعدل بالستربتافيدين (MB). احتضن لمدة 30 دقيقة مع تحريض خفيف (على سبيل المثال ، استخدم شاكر دوار) في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع أنبوب microfuge على الرف المغناطيسي لعزل MB وإزالة المادة الطافية عن طريق السحب (يجب أن يكون حلا واضحا).
    3. اغسل بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط والغسيل إلى الأنبوب. قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي ، وانقر فوق الأنبوب ، وأعد تعليق MB إلى محلول متجانس عن طريق الماصة. ضع أنبوب microfuge مرة أخرى على الرف المغناطيسي لعزل MB وإزالة المادة الطافية عن طريق الماصة. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين.
    4. بمجرد اكتمال الغسيل ، أعد تعليق MB في إجمالي 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX وقم بتسخين المحلول إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ضع الأنبوب على الفور في الرف المغناطيسي قبل أن يبرد الأنبوب وخذ المادة الطافية التي تحتوي على تجمع ssDNA. كرر خطوة الاسترداد هذه ، مع إضافة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX.
  11. قم بقياس الحجم النهائي للكسر المسترد من 4.10 باستخدام ماصة. يسمى هذا الكسر R i x ، حيث يتوافق iمع الرقم الدائري. بشكل عام ، يتم الحصول على أحجام تتراوح بين 140 إلى 150 ميكرولتر. خذ 1 ميكرولتر من R1x لتحديد كمية الحمض النووي بواسطة qPCR.

5. جولات الاختيار اللاحقة

  1. تشويه تجمع ssDNA. خذ 60٪ من العينة R1x واخلطها مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX. يسخن على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام جاف. ضع الأنبوب على الثلج لمدة 15 دقيقة.
  2. احتضان تجمع ssDNA مع الفيروس غير المعدية وغيرها من الفيروسات المتداخلة المحتملة (خطوة اختيار العداد). امزج تجمع ssDNA المشوه في المخزن المؤقت SELEX من 5.1 مع 50 ميكرولتر من كل فيروس (5 × 109 نسخ / مل ؛ على سبيل المثال ، p-SARS-CoV-2 غير المعدية ، p-SARS-CoV-1 ، و p-H5N1). احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. حظر المواقع غير المحددة في مرشحات الطرد المركزي. أثناء انتظار الخطوة 5.2 ، قم بإعداد مرشحات أجهزة الطرد المركزي للخطوات التالية. عادة ، استخدم مرشحين لأجهزة الطرد المركزي ، أحدهما بقطع 100 كيلو دالتون والآخر بقطع 10 كيلو دالتون. اتبع نفس الإجراء كما في 4.3.
  4. اغسل التسلسلات المرتبطة بالفيروسات غير المستهدفة. أضف المزيج المحتضن في الخطوة 5.2 إلى مرشح طرد مركزي 100 كيلو دالتون محظور. أجهزة الطرد المركزي عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق واستعادة الجزء الذي يتدفق عبر مرشح الطرد المركزي. اغسل 2x ، مع إضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX والطرد المركزي عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق. احتفظ بالكسر الذي تدفق عبر الفلتر.
  5. احتضان تجمع ssDNA بالفيروس المعدي (خطوة اختيار إيجابية). خذ 300 ميكرولتر من الكسر من الخطوة 5.4 واخلطها مع 50 ميكرولتر من الفيروس المعدي (1 × 108 نسخ / مل). احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اتبع الخطوات من 4.4 إلى 4.11.

6. مراقبة عملية SELEX

ملاحظة: لمراقبة إثراء المجمع ، يتم استخدام qPCR بطريقتين. أولا ، من خلال القياس الكمي المطلق ، من الممكن اختبار إثراء المسابح (عائد الشطف). ثانيا ، من خلال مراقبة منحنى الذوبان ، يمكن تقييم تنوع الأحواض (تقارب أنواع الأبتامر)30.

  1. قم بإجراء جميع فحوصات qPCR بحجم تفاعل 10 ميكرولتر في لوحات 96 بئر مصممة ل qPCR.
  2. قم بإعداد خليط qPCR قياسي يحتوي على 5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ، و 0.3 ميكرولتر من 500 نانومتر من كل برايمر غير مسمى ، و 3.4 ميكرولتر من H2O ، و 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي.
    1. قم بإعداد تخفيفات مكتبة ssDNA المنقاة (الخطوة 2.3) لتشغيل المنحنى القياسي.
    2. خفف عينات الحمض النووي لجعل تركيزها مناسبا للمنحنى القياسي. بالنسبة لعينات Ria ، أضف 1 ميكرولتر من العينة بدون تخفيف و 1 ميكرولتر من تخفيف 1:10 إلى خليط qPCR. بالنسبة لعينات Rix ، قم بتضمين التخفيفات 1:10 أو 1:100.
  3. قم بتشغيل qPCR عن طريق تعيين البروتوكول التالي. أولا ، اضبط خطوة تمسخ أولية عند 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك ، اضبط 40 دورة من التمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 5 ثوان والتلدين والتمديد عند 52 درجة مئوية لمدة 10 ثوان. أخيرا ، اضبط تحليل منحنى الذوبان من 65 إلى 95 درجة مئوية. تحديد قيم دورة العتبة (Ct) عن طريق تحليل العتبة الآلي.
  4. باستخدام المنحنى القياسي ، حدد كمية ssDNA في عينات R ia و Rix.
  5. احسب ناتج الشطف على أنه كمية الحمض النووي المرتبط (عدد المولات في R i a) مقسوما على كمية الحمض النووي الأولي (عدد الشامات في Ri-1x). ارسم عائد الشطف مقابل الرقم الدائري لمعرفة ما إذا كان قد لوحظ إثراء خلال الجولات.
  6. ارسم منحنيات الذوبان لجولات مختلفة. من المتوقع حدوث تحول إلى درجات حرارة انصهار أعلى في الذروة بالقرب من 75/85 درجة مئوية مع زيادة عدد الجولات. هذا يعني أن تنوع المسبح يتناقص.

7. تسلسل عالي الإنتاجية

  1. استشر مرفق التسلسل عالي الإنتاجية حول أنواع التسلسل والمقاييس المتاحة ، والتي ستحدد طريقة إعداد المكتبة.
    ملاحظة: سيأخذ هذا القرار في الاعتبار كلا من طول المجمعات التي سيتم تسلسلها (بما في ذلك البادئات) وعدد المجمعات التي سيتم تقديمها (بشكل عام ، تهدف إلى تسلسل 1 × 10 5-10 6 على الأقل لكل مجموعة). إذا لم يتمكن مقياس تسلسل معين من قراءة طول التجمع بالكامل ، فيمكن استخدام تسلسل الطرف المزدوج للقراءة من طرفي التسلسل ، على عكس الطرف الفردي الذي يقرأ من طرف واحد فقط.
  2. اختر مجموعة مناسبة متاحة تجاريا بناء على نوع التسلسل ، بالتشاور مع مرفق التسلسل. قم بإعداد مجموعات متعددة من جولات التحديد التي تمثل الإثراء العالي والمتوسط والمنخفض ، بالإضافة إلى التجمع النهائي ، باستخدام زوج مختلف من الفهارس في المحولات لكل تجمع يسمح بتحليل عينة جميع الجولات باستخدام حارة واحدة.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لدمج المحولات والفهارس المطلوبة للتسلسل عالي الإنتاجية ، ولكن هذا يكلف عموما نفس تكلفة المجموعات التجارية ولا يعمل بشكل أفضل.
    1. قم بإعداد المكتبة باتباع الخطوات التالية: الإصلاح النهائي للحمض النووي المجزأ ، وربط المحول ، وتضخيم PCR لإنتاج المكتبات النهائية.
    2. قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام حبات تنظيف الحمض النووي المغناطيسي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    3. تحديد كمية الحمض النووي باستخدام مجموعة القياس الكمي القائمة على التألق. تجنب استخدام طرق أقل دقة ، مثل قياسات الأشعة فوق البنفسجية صغيرة الحجم.
    4. امزج كميات متساوية تقريبا (حسب كمية الحمض النووي ، وليس الحجم) لكل مكتبة تجمع تحتوي على فهارس محددة.
    5. تحقق من جودة المكتبة النهائية باستخدام القياس الكمي qPCR ومحلل شظايا الحمض النووي. غالبا ما يتم تنفيذ هذه الخطوة بواسطة مرفق التسلسل.
      ملاحظة: يمكن لموظفي مرفق التسلسل تقديم معلومات مفيدة حول كيفية إعداد المكتبة وضوابط الجودة المقترحة. مطلوب المناقشة معهم قبل إعداد المكتبات.
  3. إرسال المكتبة النهائية المعدة إلى مرفق التسلسل وفقا لمتطلباتهم.

8. تحليل التسلسل

  1. تم تصميم معظم البرامج المتاحة لتحليل التسلسل ليتم تشغيلها على سطر الأوامر على نظام التشغيل Linux. بالنسبة لمجموعات البيانات الصغيرة ، قم بإعداد نظام التشغيل Linux المطلوب وتثبيت البرامج المطلوبة على جهاز كمبيوتر شخصي ؛ بالنسبة لمجموعات البيانات الأكبر حجما ، يتم تشغيل تحليل HTS على موارد الحوسبة عالية الأداء أو أجهزة الكمبيوتر الفائقة (موصى به).
    ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى الوصول والتدريب لاستخدام موارد الحوسبة عالية الأداء ، والتي قد تستغرق بعض الوقت للحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك ، ستكون هناك حاجة إلى معرفة أساسية باستخدام سطر أوامر UNIX. تتوفر العديد من الموارد المجانية حول استخدام سطر الأوامر الأساسي عبر الإنترنت ، ومن المحتمل أن توفر موارد الحوسبة معلومات إضافية لاستخدام أنظمتها.
  2. قم بالوصول إلى ملفات التسلسل ، عادة بتنسيق ملف FastQ مضغوط ، باستخدام المعلومات التي يوفرها مرفق التسلسل.
    1. استخدم عميل FTP لنقل الملفات إلى جهاز الكمبيوتر الخاص بك و / أو مورد الحوسبة عالي الأداء. يمكن للعديد من برامج تحليل التسلسل استخدام الملفات المضغوطة مباشرة ، لذا احتفظ بالملفات مضغوطة ، إن أمكن ، للحد من أحجام ملفاتها (يمكن أن تشغل قراءات التسلسل الكبيرة التي تبلغ 50 M + 100 جيجابايت + من مساحة الملف عند فك ضغطها).
    2. إذا كانت ملفات التسلسل بحاجة إلى فك ضغطها ، فاستخدم وظيفة gzip القياسية في معظم عمليات تثبيت Linux. احصل على معلومات إضافية حول gzip وخياراته من الدليل المثبت عن طريق كتابة "man gzip" في سطر الأوامر.
  3. قم بتنظيف التسلسلات قبل التحليل عن طريق إلغاء تعدد الإرسال ، وإزالة محولات التسلسل ، وإزالة القراءات منخفضة الجودة ، وتضمين قراءات الاتجاه الأمامي والعكسي.
    1. استخدم برنامج FastQC31 بعد كل خطوة من الخطوات التالية للحصول على معلومات مراقبة الجودة الأساسية حول التسلسلات لتقييم فعالية كل خطوة تنظيف.
    2. قم بإلغاء تعدد التسلسلات لفصل جميع التسلسلات من ملف قراءة واحد إلى تجمعات مختلفة بناء على الفهارس المضمنة في محولات التسلسل. غالبا ما يتم تنفيذ هذه الخطوة بواسطة مرفق التسلسل ، الذي يجب استشارته لأن الإجراء الدقيق سيعتمد على آلة التسلسل المستخدمة.
    3. قم بإزالة محولات التسلسل باستخدام برنامج سطر الأوامر Cutadapt32. استخدم بادئات التحديد (بدلا من محولات التسلسل) كمدخل في وضع المحول المرتبط. استخدم الخيار --discard-untrimmed لتجاهل أي تسلسلات لا تحتوي على بادئات التحديد.
    4. قم بتعيين خيارات للحد الأقصى لمعدل الخطأ لمطابقة المحولات، والحد الأدنى والحد الأقصى لطول التسلسلات المراد قبولها. في حالة استخدام قراءات النهاية المقترنة ، أدخل معلمات محددة متاحة وقم بإعطاء كل من ملفات تسلسل القراءة 1 والقراءة 2. قم بتعيين معلمات إضافية حسب الحاجة بالرجوع إلى دليل Cutadapt32.
      ملاحظة: يكون ربط محولات التسلسل بالتجمعات مستقلا عن الاتجاه وسيتضمن حوالي 50٪ من التسلسلات في الاتجاه الأمامي و 50٪ في الاتجاه العكسي. لتجنب فقدان 50٪ من التسلسلات في الاتجاه العكسي ، يمكن تشغيل Cutadapt مرة ثانية باستخدام المكمل العكسي لبادئات التحديد كمدخلات.
    5. (اختياري) إذا تم استخدام تسلسل الطرف المقترن ، فقم بدمج ملفات Read 1 و Read 2 مع البرنامج PEAR33.
    6. استخدم برنامج FASTX-Toolkit34 لإزالة التسلسلات منخفضة الجودة التي لها جودة أقل من عتبة معينة عند أي نيوكليوتيد. تعد درجة قطع الجودة 30 نقطة انطلاق جيدة. إذا كانت الجودة الشاملة جيدة بشكل عام ، فيمكن تخطي هذه الخطوة.
    7. لدمج ملفات التسلسل في الاتجاه العكسي مع تلك الموجودة في الاتجاه الأمامي، استخدم الدالة FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement في ملفات الاتجاه العكسي. ثم استخدم برنامج cat المدمج (قياسي في معظم عمليات تثبيت Linux) لدمج الملفات الخلفية للأمام والمكمل العكسي في ملف واحد.
  4. لتحليل إثراء التسلسلات عبر تجمعات التحديد المختلفة ، استخدم مجموعة أدوات تحليل FASTAptamer35.
    1. استخدم FASTAptamer-Count لحساب عدد مرات ظهور كل تسلسل. ثم قم بترتيب وفرز التسلسلات حسب الوفرة. مطلوب ملف إخراج العد كإدخال لكافة برامج FASTAptamer الأخرى.
    2. استخدم FASTAptamer-Clust لتجميع كافة التسلسلات في ملف في مجموعات من التسلسلات وثيقة الصلة. استخدم معلمة "المسافة" لتحديد عدد طفرات النوكليوتيدات المفردة أو الإندل المسموح لها بالتجمع في مجموعة.
      ملاحظة: يمكن أن يكون برنامج FASTAptamer-Clust مكلفا للغاية من الناحية الحسابية في حالة وجود عدد كبير من التسلسلات الفريدة (خاصة للجولات المبكرة) ، الأمر الذي قد يستغرق أياما أو حتى أسابيع حتى يكتمل بالكامل. يمكن استخدام معلمة مرشح القطع لاستبعاد تسلسلات الوفرة المنخفضة من التجميع. بشكل عام ، من الجيد البدء بقطع أعلى ، مثل 10 أو 5 قراءات لكل مليون (RPM) وتقليله إذا انتهى البرنامج بسرعة. إذا كانت التجمعات غير متجانسة للغاية ، فقد لا يكون من الممكن تجميع التسلسلات في إطار زمني معقول.
    3. استخدم FASTAptamer-Enrich لحساب إثراء كل تسلسل موجود في أكثر من جولة واحدة من التحديد. قارن RPM للتسلسل من مجتمع واحد مع RPM في آخر. استخدم برنامج الإثراء على ملفات العد أو نظام المجموعة. الإخراج عبارة عن ملف قيمة مفصولة بعلامات جدولة (.tsv) يمكن فتحه في أي برنامج جدول بيانات لمزيد من التحليل والفرز السهل.
      ملاحظة: يمكن أن يكون برنامج FASTAptamer-Enrich مكلفا جدا من الناحية الحسابية في حالة وجود عدد كبير من التسلسلات الفريدة. يمكن استخدام معلمة مرشح القطع لاستبعاد تسلسلات الوفرة المنخفضة من الإخراج لتجنب الملفات الكبيرة جدا بحيث لا يمكن فتحها في برنامج جداول البيانات.
    4. (اختياري) إذا كانت العديد من التجمعات غير متجانسة للغاية (العديد من التسلسلات الفريدة وعدد قليل من التسلسلات المكررة) ، فقد لا يكون من الممكن استخدام برامج Clust أو Rich. في هذه الحالة ، قم بإجراء فحص إثراء يدوي باستخدام ملف إخراج Count الذي يقوم بفرز التسلسلات حسب الوفرة (الأكثر وفرة في الأعلى) ويعيد تسمية معرف التسلسل لتضمين معلومات مهمة مثل RPM.
      1. استخدم برنامج Linux "head" القياسي على ملفات Count للحصول على قائمة بالتسلسلات الأكثر وفرة. ثم استخدم برنامج Linux "grep" القياسي للبحث في كل من التسلسلات الأكثر وفرة في ملفات Count لجميع التجمعات الأخرى ذات الصلة. في حالة وجود أي تطابقات، استخدم معرف التسلسل المعدل لتحديد عدد الدورات في هذا التجمع لإنشاء معلومات الإثراء يدويا.
        ملاحظة: يمكن العثور على البرامج النصية لجميع خطوات تحليل التسلسل في ملفات الترميز التكميلية 1-11.

9. التحقق من صحة ربط أبتامر والمقايسات

  1. من معلومات الإثراء التي تم الحصول عليها من خلال تحليل التسلسل ، حدد تسلسلات أبتامير المرشحة بناء على التسلسلات التي تتمتع بأكبر قدر من الإثراء خلال جولات الاختيار اللاحقة و / أو التسلسلات الأكثر وفرة في جولة الاختيار النهائية. حدد عدة تسلسلات مرشحة مختلفة (على الأقل 10-20) لمزيد من الاختبارات لأن الأكثر إثراء قد لا يكون بالضرورة أفضل الأبتامر أداء.
  2. قم بإجراء الفحص الأولي للأبتامرز المرشح باستخدام مقايسة ملزمة يمكن إجراؤها بسرعة لعينات متعددة. يعد اختبار ربط الترشيح الفائقالقائم على العمود 36 أو مقايسة قليل النوكليوتيد المرتبط بالإنزيم (ELONA) طرقا جيدة لهذا الفحص الأولي.
  3. قم بتحليل خصوصية وتقارب التسلسلات التي تظهر أفضل نشاط ربط من الفحص الأولي ، باستخدام مقايستين مستقلتين على الأقل (على سبيل المثال ، MicroScale Thermophoresis (MST) 37،38 ، مقايسة قليل النوكليوتيد المرتبط بالإنزيم (ELONA) 39 ، رنين البلازمون السطحي 40 ، أو قياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI)41).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نظرا لأنه يمكن الحصول على أبتامير الحمض النووي باستخدام SELEX في أنبوب اختبار15 ، فقد تم تصميم استراتيجية SELEX هذه بعناية لتشمل كلا من خطوات الانتقاء الإيجابي نحو الفيروس المعدي الكامل السليم (أي الاحتفاظ بجزيئات الحمض النووي التي ترتبط بالفيروس المعدي) ، وكذلك خطوات الاختيار المضاد لنفس الفيروس الذي أصبح غير معدي بواسطة طريقة تطهير معينة ، على وجه التحديد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية ، عن طريق التخلص من تسلسل الحمض النووي الذي يمكن أن يرتبط بالفيروس غير المعدي. يظهر تمثيل تخطيطي لعملية الاختيار في الشكل 1.

كنتائج تمثيلية لهذا البروتوكول ، اخترنا اختيار أبتامير ل SARS-CoV-2 المعدية. نظرا لمتطلبات ظروف عمل مستوى السلامة البيولوجية 3 (BSL3) للتعامل مع SARS-CoV-2 السليم والمعدي ، فقد اخترنا بدلا من ذلك العمل مع فيروس من النوع الكاذب. يتم إنشاء الفيروسات الزائفة من فيروس العمود الفقري غير ضار نسبيا ، في هذه الحالة نوع من الفيروسات العدسية (HIV) ، تم تعديله لعرض البروتين السطحي لفيروس مختلف مهم داخل غلافه الفيروسي ، مما يسمح له بمحاكاة سطح وآلية دخول الفيروس المطلوب عن كثب دون المخاطر المرتبطة بالعمل مع مسببات الأمراض البشرية الخطرة. الأهم من ذلك ، يتم تعديل هذه الفيروسات الزائفة لتكون معيبة في التكاثر الفيروسي المستمر25,42. في هذا العمل ، تم استخدام ثلاثة فيروسات زائفة مختلفة: p-SARS-CoV-2 ، حيث يتم دمج بروتينات ارتفاع SARS-CoV-2 (S) في المغلف. p-SARS-CoV-1 ، يحتوي على بروتين ارتفاع SARS-CoV-1 (S) ؛ و p-H5N1 ، الذي يحتوي على الهيماجلوتينين والنورامينيداز المعزولين من سلالة فيروس أنفلونزا الطيور A / Goose / Qinghai / 59/05 (H5N1) شديدة الإمراض.

في الجولتين الأوليين من الاختيار ، لم يتم تضمين أي خطوة اختيار مضادة لتقليل الإزالة غير المحددة لروابط الحمض النووي التي عادة ما تكون موجودة فقط كنسخ مفردة في الجولات الأولى. بعد الجولتين الأوليين ، تم تضمين خطوات الاختيار الإيجابي والمضاد في كل جولة للوصول إلى انتقائية عالية. للاختيار المضاد ، تم استخدام p-SARS-CoV-2 التي أصبحت غير معدية بسبب العلاج بالأشعة فوق البنفسجية ، وكذلك p-SARS-CoV-1 و p-H5N1 للحصول على انتقائية ضد الفيروسات الأخرى.

لمراقبة تقدم الاختيار ، تم استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR). وتمثل هذه التقنية طريقة بسيطة لا تتطلب وضع علامات على المجمع ويمكن تطبيقها عموما على أي هدف30 تقريبا. يستفيد من ميزتين لتقنية qPCR. أولا ، إمكانية القياس الكمي المطلق باستخدام منحنى قياسي لحساب عائد الشطف ، المحدد بواسطة ssDNA المرتبط بالفيروس المعدي على إجمالي ssDNA المضافة. أظهرت نتائجنا أن عائد الشطف زاد في البداية مع كل جولة مبكرة من SELEX واستقر في الجولتين 8 و 9 (R8 و R9) ، مما يشير إلى إثراء المجمعات في تسلسلات ترتبط بالفيروس المعدي (الشكل 2 أ). ثانيا ، توفر منحنيات الذوبان لكل جولة من تجمع الحمض النووي دليلا إضافيا على تنوع تسلسل المجمعات30. من خلال مقارنة منحنيات الانصهار ، يمكن ملاحظة تحول من الذروة عند درجة حرارة انصهار عالية (T m) من 77 درجة مئوية إلى 79 درجة مئوية ، مما يشير إلى أن تجمع الحمض النووي قد تقارب من تسلسلات عشوائية ذات Tm منخفضة إلى تسلسلات أكثر حفظامع T m أعلى (الشكل 2B). علاوة على ذلك ، في الجولات الأخيرة (R8 و R9) ، تظهر قمة عند انخفاض Tm (~ 70 درجة مئوية). يمكن أن يكون هذا مرتبطا بإنتاج دايمرات التمهيدي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. أحد الحلول الممكنة لتجنب ذلك هو تقليل عدد الدورات أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل (على سبيل المثال ، من 18 دورة إلى 12 أو 15 دورة).

بعد التأكد من إثراء المجمع بواسطة qPCR ، استخدمنا التسلسل عالي الإنتاجية (HTS) للجولات 3 و 5 و 7 و 8 و 9 من SELEX لمعرفة التسلسلات المسؤولة عن ربط هدف الفيروس. وبالمقارنة مع إجراءات الاستنساخ والتسلسل التقليدية، تسمح «هيئة تحرير الشام» بمراقبة تطور التسلسلات الفردية عبر جولات اختيار متعددة، لتحديد تسلسلات الأبتامير التي يتم إثراؤها خلال الجولات اللاحقة. يوضح الشكل 3 أ الوفرة النسبية (بالقراءة لكل مليون) لتسلسل SARS2-AR10 ، الذي تم الحصول عليه عبر جولات اختيار متتالية. يتم التنبؤ بالبنية الثانوية ل SARS2-AR10 بواسطة برنامج Mfold ، وتظهر النتائج (الشكل 3B) بنية ثانوية منظمة تحتوي على منطقة حلقة جذعية قد تكون متورطة في التعرف على الفيروس. تم الإبلاغ عن مزيد من التوصيف لربط التقارب لهذا التسلسل سابقا22. أظهر الرحلان الحراري المجهري (MST) ومقايسة قليل النوكليوتيد المرتبط بالإنزيم (ELONA) أن أبتامير SARS2-AR10 يرتبط بالعدوى p-SARS-CoV-2 مع Kd = 79 ± 28 نانومتر ، ولا يرتبط ب p-SARS-CoV-2 غير المعدية أو بفيروسات كورونا الأخرى مثل p-SARS-CoV-1 و 229E.

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لعملية SELEX للأبتامير التي تميز الفيروسات المعدية عن الفيروسات غير المعدية. تمت إضافة خطوات الاختيار الإيجابي والمضاد في كل جولة بعد الجولة الثانية للوصول إلى خصوصية عالية تجاه الفيروس المعدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: رصد تقدم SELEX للأبتامير المعدية الخاصة ب SARS-CoV-2. (أ) التحديد الكمي لعائد الشطف (أي ssDNA المرتبط على ssDNA المضاف) لكل جولة من SELEX باستخدام qPCR. (ب) منحنى الانصهار للبرك المختلفة أثناء اختيار أبتامير SARS-CoV-2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التخصيب والهيكل الثانوي لأبتامير SARS2-AR10. قراءات لكل مليون (RPM) تم الحصول عليها من خلال تحليل بيانات HTS لتسلسل SARS2-AR10 كدالة لجولات الاختيار ، باستخدام FASTAptamer-Count. أقحم: الهيكل الثانوي الأكثر استقرارا المتوقع لتسلسل SARS2-AR10 استنادا إلى برنامج UNAFold. تم إجراء الحسابات عند 25 درجة مئوية و 100 مللي متر كلوريد الصوديوم و 2 مللي مول MgCl2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم تسلسل الحمض النووي (5 إلى 3)
تي 20 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
مكتبة الحمض النووي ACCGTCAGTTACAATGCT- N45 -GGCTGGACTATCTGTGTA
التمهيدي الأمامي (FwdP) ACCGTCAGTTACAATGCT
التمهيدي العكسي (RevP) بيوت-تاكاكاجاتاجتكاجاج
سارس-AR10 CCCGACCAGCCACCATCACACTCTTCCGCGTCCATCCCTGCTGCTG
N: تمثل نيوكليوتيد عشوائي ؛ Biot: تعديل البيوتين في 5'end.

الجدول 1: قائمة تتابعات الحمض النووي.

ملف الترميز التكميلي 1: Cutadapt_script.txt يحدد أي تسلسلات في ملف إدخال معين تحتوي على البادئات الأمامية والعكسية المحددة ، ويتجاهل أي تسلسلات لا تحتوي على البادئات ، ويزيل البادئات من التسلسلات التي تحتوي عليها. انظر المرجع31 لمزيد من المعلومات حول Cutadapt. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 2: سيقوم FASTAptamer_cluster_script.txt بتجميع جميع التسلسلات من ملف عد واحد في عائلات / مجموعات من التسلسلات وثيقة الصلة / المتشابهة. هذا مفيد إذا تم تحديد تسلسل مرشح ، بحيث يمكن أيضا تحديد تسلسلات أخرى مماثلة في نفس المجموعة كمرشحين محتملين أيضا. انظر المرجع34 لمزيد من المعلومات حول FASTAptamer. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 3: سيحسب FASTAptamer_count_script.txt عدد تكرارات كل تسلسل فريد من ملف إدخال FASTA / FASTQ معين وينتج ملف إخراج لكل تسلسل فريد بترتيب تنازلي (أعلى وفرة إلى أقل وفرة). ملفات إخراج العد مطلوبة كمدخلات لكافة برامج FASTAptamer الأخرى. انظر المرجع34 لمزيد من المعلومات حول FASTAptamer. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 4: يقارن FASTAptamer_enrich_script.txt جميع التسلسلات من أي ملفين أو ثلاثة ملفات إدخال ، ويعطي وفرة جميع التسلسلات الفريدة بين جميع الملفات ، ويعطي جميع مجموعات قيم الإثراء الزوجي (في RPM) لجميع التسلسلات الموجودة في ملفات متعددة. انظر المرجع34 لمزيد من المعلومات حول FASTAptamer. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 5: fastqc_script.txt هو أداة لمراقبة الجودة لملفات FastQ توفر معلومات عالية الجودة سهلة القراءة لبيانات التسلسل عالية الإنتاجية ، مثل مستويات الازدواجية وأطوال القراءة ودرجات الجودة. راجع المرجع30 لمزيد من المعلومات حول FastQC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 6: يستخدم FASTX_fwd_rev_merge_script.txt مجموعة أدوات FASTX لإخراج المكمل العكسي لجميع التسلسلات من ملف عكسي معين. ثم يستخدم الأمر cat (قياسي في معظم أنظمة تشغيل UNIX) لدمج ملف المكمل العكسي العكسي هذا مع ملف معين من التسلسلات الأمامية ، لإعطاء ملف واحد مع جميع التسلسلات. انظر المرجع33 لمزيد من المعلومات حول مجموعة أدوات FASTX. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 7: يستخدم FASTX_quality_filter_script.txt مجموعة أدوات FASTX للتحقق من جودة التسلسلات في ملف FastQ معين ويمكنه تجاهل أي تسلسلات ذات جودة منخفضة. هذه الطريقة أفضل بشكل عام من طرق التشذيب لتصفية الجودة لتحليل تسلسلات الاختيار في المختبر . يتضمن التشذيب إزالة القواعد (عادة بالقرب من النهايات) من التسلسلات بناء على الجودة المنخفضة ، وهو أمر مقبول للتسلسل الجينومي ، ولكن نظرا لأن التسلسل بأكمله ضروري للحمض النووي الوظيفي ، فإن تقليم النهايات ليس مفيدا. بدلا من ذلك ، إذا كان عدد كبير جدا من قواعد التسلسل منخفضة الجودة ، تجاهل التسلسل بأكمله. انظر المرجع33 لمزيد من المعلومات حول مجموعة أدوات FASTX. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 8: يستخدم grep_searcher_script.txt للبحث عن تسلسل إدخال محدد في ملف إدخال معين ، وإخراج كل من المعرف والتسلسل في ملف إخراج (إذا تم العثور عليه في الإدخال). هذا البرنامج النصي مفيد للتجمعات غير المتجانسة للغاية (أي التي تحتوي على الكثير من التسلسلات الفريدة) ، مما يجعل FASTAptamer Clust يستغرق وقتا طويلا للتشغيل بشكل صحيح وينتج عنه ملفات FASTAptamer Enrich كبيرة جدا بحيث لا يمكن فتحها في برامج جداول البيانات النموذجية للتحليل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 9: يستخدم gzip_compress_decompress_script.txt Gzip لضغط الملفات أو فك ضغطها. عادة ما يكون للملف المضغوط ملحق .gz ملحق باسم الملف. يوصى بضغط الملفات الكبيرة لتوفير مساحة الملف. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 10: يتم استخدام PEAR_script.txt فقط لملفات التسلسل ذات النهاية المزدوجة وسيقوم بدمج ملف Read 1 مع ملف Read 2 المقابل. انظر المرجع32 لمزيد من المعلومات حول PEAR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 11: سيقوم tar_extraction_creation_script.txt باستخراج أو إنشاء أرشيفات Tar ، والتي تستخدم لجمع ملفات و / أو أدلة متعددة في ملف واحد. غالبا ما يتم ضغطها أيضا لتقليل حجم الملف ، كما هو الحال مع ضغط bz2 ، كما هو مضمن في هذا البرنامج النصي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لا يسمح SELEX فقط بتحديد الأبتامير ذات التقارب العالي ، في نطاق pM-nM22،43،44،45 ، ولكن أيضا مع انتقائية عالية وقابلة للضبط. من خلال الاستفادة من الاختيار المضاد ، يمكن الحصول على aptamers مع انتقائية صعبة. على سبيل المثال ، أثبتت مجموعة Li القدرة على الحصول على تسلسلات يمكنها التمييز بين السلالات البكتيرية المسببة للأمراض والسلالات غير المسببة للأمراض21. أيضا ، حدد Le et al. أبتامير قادر على التمييز بين الأنماط المصلية للبكتيريا العقدية المقيحة 46. هذا يفتح إمكانية دمج جزيئات الأبتامر مع انتقائية فريدة في مستشعرات الحمض النووي الوظيفية المختلفة12،47،48،49،50 مع تقنيات النانو الجديدة22،51،52 لبناء أجهزة استشعار لتطبيقات مختلفة ، مثل الاختبارات التشخيصية المحمولة والسريعة أو للكشف البيئي.

يسمح البروتوكول المقدم هنا بالحصول على aptamers بانتقائية عالية لفيروس معدي على نفس الفيروس الذي تم تعطيله وبالتالي فهو غير معدي. للحصول على هذه الانتقائية ، يعتمد نهج SELEX في هذا العمل على تصميم خطوة الاختيار المضادة. أولا ، من أجل خطوة اختيار مضادة ناجحة ، يجب إجراء الاختيار والتوصيف الصحيحين للعينات غير المستهدفة. وبالتالي ، تعتمد هذه الطريقة على البدء بمخزونات الفيروسات السليمة المعدية وغير المعدية المعروفة. ثانيا ، يتم دمج خطوة الاختيار المضاد في كل جولة من الاختيار بعد الجولة الأولى ، لتطبيق شروط صارمة من بداية الاختيار وتعظيم احتمال تحديد aptamers التي يمكن أن تفرق بين الاختلافات الطفيفة في سطح جسيم الفيروس من الحالة المعدية وغير المعدية لنفس الفيروس.

في هذا البروتوكول ، ينصب التركيز على انتقائية aptamer. إذا كانت هناك حاجة إلى تقارب أبتامير أقوى ، فمن الممكن زيادة صرامة العملية بعد جولات SELEX معينة. على سبيل المثال ، من خلال تقليل تركيز الفيروس المعدي ووقت الحضانة أثناء الاختيار الإيجابي ، من الممكن الحصول على أبتامير مع تقارب ربط أقوى44.

هناك اعتبار مهم آخر عند تصميم بروتوكول SELEX وهو العينة النهائية التي سيتم فيها تطبيق الأبتامر. عادة ما يتم دمج الأبتامير الخاص بالفيروسات في عينات معقدة (على سبيل المثال ، عينات المصل واللعاب والمياه الحقيقية) ، ويجب مراعاة ذلك أثناء اختيار الأبتامير لزيادة فرصة الحصول على أبتامير وظيفي في العينات النهائية. لذلك ، من المهم إجراء SELEX في مخزن مؤقت يحاكي هذه العينات عن كثب ، لا سيما فيما يتعلق بتركيز الكاتيون ودرجة الحموضة. على سبيل المثال ، بالنسبة ل SARS-CoV-2 aptamer ، اخترنا المخزن المؤقت PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) الذي يحتوي على 2 mM MgCl 2 و 0.5 mM CaCl2 لتقليد العينات البيولوجية عن كثب. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان بإمكان الأنواع الأخرى في العينات التي سيتم فيها تطبيق الأبتامير أن تتنافس مع الهدف لربط الأبتامير ، فمن الممكن تقليل التداخل من هذه الأنواع عن طريق تضمينها في خطوة الاختيار المضاد ، للقضاء على التسلسلات التي يمكن أن تربط هذه الأنواع.

تشير النتائج الناجحة لعملية SELEX22 ، والتي تم تطبيقها على فيروسات مختلفة (الفيروس الغدي و SARS-CoV-2) وطرق التعطيل المختلفة (المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية والكلور الحر) إلى أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع على الفيروسات الأخرى وطرق التعطيل الأخرى ، مما يفتح مجموعة واسعة من التطبيقات في المستقبل. الأبتامير التي تميز الفيروسات المعدية لديها القدرة ليس فقط في التطبيقات التشخيصية لتحديد المرضى الذين لا يزالون معديين ، ولكن أيضا في التطبيقات البيئية حيث يتم تعريف العينة على أنها ملوثة إذا كانت مسببات الأمراض في هذه العينات لا تزال نشطة. وبالتالي ، فإن دمج الأبتامير مع القدرة على تحديد الفيروسات المعدية في أجهزة الاستشعار السريعة يوفر فرصا لمراقبة علاجات التطهير.

علاوة على ذلك ، كان من الممكن التمييز بين حالة العدوى للفيروس دون أي معلومات عن الاختلافات الهيكلية بين حالتي العدوى. المعلومات الوحيدة المطلوبة هي معرفة أن الاختلافات بين الحالتين مرتبطة بالاختلافات في بنية الجزيئات على سطح الجسيمات الفيروسية السليمة. وبالتالي ، نحن واثقون من أنه يمكن استخدام نفس النهج للتمييز بين المتغيرات والأنماط المصلية لنفس الفيروس ، حيث ترجع الاختلافات إلى طفرات صغيرة في بقايا البروتينات على سطح الجسيمات الفيروسية ، على غرار تلك التي تميز حالة العدوى للفيروس. على سبيل المثال ، نتصور أنه سيكون من الممكن الحصول على أبتامير خاص بالمتغيرات المثيرة للقلق من SARS-CoV-2 أو الفيروسات الأخرى ، مثل الأنفلونزا ، مما يفتح إمكانية المراقبة السريعة للمتغيرات التي تشكل أكبر تهديد للمجتمع.

أخيرا ، نظرا لأن استراتيجية SELEX للحصول على aptamers التي يمكن أن تميز الفيروسات المعدية عن الفيروسات غير المعدية لا تتطلب أي معرفة مسبقة حول الاختلافات الهيكلية المحددة الموجودة بينها ، فقد يكون من الممكن استخدام aptamers بهذه الانتقائية لتحديد التغيرات السطحية المحددة المسؤولة عن فقدان العدوى من طرق التطهير المختلفة من خلال توصيف مفصل وتحديد الأهداف الملزمة ل aptamers لدينا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

كوبر والدكتور ليجون رونغ من جامعة إلينوي في شيكاغو على تقديم عينات الفيروس الزائف المستخدمة في هذا البروتوكول (SARS-CoV-2 و SARS-CoV-1 و H5N1) ، وكذلك الدكتور ألفارو هيرنانديز والدكتور كريس رايت من مرفق خدمات الحمض النووي التابع لمركز روي ج. كارفر للتكنولوجيا الحيوية بجامعة إلينوي في أوربانا شامبين لمساعدتهم في التسلسل عالي الإنتاجية ، والعديد من أعضاء مجموعة Lu الذين ساعدونا في الاختيار في المختبر وتقنيات توصيف الأبتامر. تم دعم هذا العمل بمنحة RAPID من المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET 20-29215) ومنحة أولية من معهد الاستدامة والطاقة والبيئة في جامعة إلينوي في أوربانا شامبين ومعهد إلينوي جيتري (JITRI 23965). تشكر A.S.P. زمالة PEW لأمريكا اللاتينية على الدعم المالي. كما نشكر مؤسسة روبرت أ. ويلش (Grant F-0020) على دعم برنامج أبحاث مجموعة Lu في جامعة تكساس في أوستن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678 (2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230 (2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070 (2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334 (2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966 (2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 187 ، الاختيار في المختبر ، aptamer ، حالة العدوى الفيروسية ، الاختيار المضاد ، الفيروس السليم
في المختبر اختيار أبتامر للتمييز بين الفيروسات المعدية وغير المعدية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., … More

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter