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Bioengineering

감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별하기 위한 압타머의 시험관 내 선택

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin
* These authors contributed equally

Summary

우리는 일반적으로 감염성 바이러스에만 결합하는 앱타머를 선택하고 소독 방법에 의해 비감염성이 된 바이러스 또는 기타 유사한 바이러스에는 결합하지 않는 앱타머를 선택할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이것은 휴대용 및 신속한 테스트에서 감염성 상태를 결정할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

Abstract

바이러스 감염은 사회에 큰 영향을 미칩니다. 대부분의 검출 방법은 검출 된 바이러스가 전염성이 있는지 여부를 판단하는 데 어려움이있어 치료가 지연되고 바이러스가 더 확산됩니다. 임상 또는 환경 샘플의 감염 가능성을 알려줄 수 있는 새로운 센서를 개발하면 이러한 미충족 과제를 해결할 수 있습니다. 그러나 온전한 감염성 바이러스를 인식하고 소독 방법으로 비감염성이 된 동일한 바이러스와 구별할 수 있는 감지 분자를 얻을 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 지수 농축(SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화를 사용하여 감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별할 수 있는 앱타머를 선택하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 SELEX의 두 가지 기능을 활용합니다. 첫째, SELEX는 카운터 선택을 사용하여 비감염성 바이러스 또는 기타 유사한 바이러스와 같은 경쟁 표적을 제거하도록 맞춤 제작할 수 있습니다. 추가로, 전체 바이러스는 예를 들어 바이러스 표면 단백질 대신에 SELEX에 대한 표적으로서 사용될 수 있다. 전체 바이러스 SELEX는 바이러스를 파괴할 필요 없이 바이러스의 본래 상태에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택할 수 있습니다. 따라서이 방법은 사전에 알 필요가없는 병원체 표면의 기능적 차이에 기초하여 인식 제제를 얻을 수있게한다.

Introduction

바이러스 감염은 최근 COVID-19 대유행으로 인해 점점 더 분명해진 바와 같이 전 세계적으로 막대한 경제적, 사회적 영향을 미칩니다. 시기 적절하고 정확한 진단은 건강한 사람들에게 바이러스가 퍼지는 것을 방지하면서 바이러스 감염을 치료하는 데 가장 중요합니다. PCR 검사1,2 및 면역검사3와 같은 많은 바이러스 검출 방법이 개발되었지만, 현재 사용되는 대부분의 방법은 검출된 바이러스가 실제로 감염되는지 여부를 판단할 수 없습니다. 이는 바이러스 핵산이나 단백질과 같은 바이러스 단독의 성분의 존재가 손상되지 않은 감염성 바이러스가 존재한다는 것을 나타내지 않고 이러한 바이오마커의 수준이 감염성과 빈약한 상관관계를 나타내기 때문입니다 4,5,6. 예를 들어, 현재 PCR 기반 COVID-19 검사에 일반적으로 사용되는 바이러스 RNA는 환자가 전염성이 있을 때 감염 초기 단계에서 매우 낮은 수준을 갖는 반면, 환자가 감염에서 회복되어 더 이상 전염성이 없을 때 RNA 수준은 여전히 매우 높은 경우가 많습니다 7,8. 바이러스 단백질 또는 항원 바이오마커는 유사한 경향을 따르지만 일반적으로 바이러스 RNA보다 훨씬 늦게 나타나므로 감염 가능성을 예측할 수 훨씬 적습니다 6,9. 이러한 한계를 해결하기 위해, 바이러스의 감염성 상태를 알려줄 수 있는 몇 가지 방법이 개발되었지만, 결과를 얻기 위해 오랜 시간(일 또는 몇 주)을 필요로 하는 세포 배양 미생물학 기술을 기반으로 한다 4,10. 따라서 임상 또는 환경 샘플의 감염 가능성을 알릴 수 있는 새로운 센서를 개발하면 치료 지연 및 바이러스의 추가 확산을 방지할 수 있습니다. 그러나 손상되지 않은 감염성 비리온을 인식하고 비감염성이 된 동일한 바이러스와 구별할 수 있는 감지 분자를 얻을 수 있는 방법은 거의 없습니다.

이러한 맥락에서, 앱타머는 독특한 생체 분자 도구로서 특히 매우 적합하다(11,12,13,14). 앱타머는 특정 뉴클레오티드 서열을 가진 짧은 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자로, 높은 친화력과 선택성을 가진 표적을 인식하기 위해 특정 3D 형태를 형성할 수 있습니다15,16. 이들은 10 14-10 15 서열17,18,19의 큰 무작위 DNA 샘플링 라이브러리를 가진 시험관에서 수행되는 시험관 내 선택으로도 알려진 지수 농축에 의한 리간드의 체계적 진화 (SELEX)라고하는 조합 선택 과정에 의해 얻어진다. 이 반복 과정의 각 라운드에서 DNA 풀은 먼저 원하는 조건에서 표적과의 배양을 통해 선택 압력을 받습니다. 그런 다음 대상에 바인딩되지 않은 모든 시퀀스가 제거되고 주어진 조건에서 바인딩할 수 있는 몇 개의 시퀀스만 남게 됩니다. 마지막으로, 이전 단계에서 선택된 서열은 PCR에 의해 증폭되어 다음 선택 라운드를 위해 원하는 기능 서열로 풀의 모집단을 풍부하게 하고 프로세스가 반복됩니다. 선택 풀의 활성이 고원에 도달하면(일반적으로 8-15라운드 후) 라이브러리를 DNA 시퀀싱으로 분석하여 가장 높은 친화도를 나타내는 우승 서열을 식별합니다.

SELEX는 바이러스(22)의 감염성 상태와 같은 다른 유사한 표적(20,21)에 대해 증가된 선택성을 얻기 위해 이용될 수 있는 독특한 이점을 갖는다. 첫째, 소분자 및 단백질로부터 전체 병원체 및 세포에 이르기까지 매우 다양한 유형의 표적이 선택에 사용될 수 있다16. 따라서, 감염성 바이러스에 결합하는 앱타머를 얻기 위해, 바이러스 표면 단백질19 대신에 온전한 바이러스를 표적으로 사용할 수 있다. 전체 바이러스 SELEX를 사용하면 바이러스를 파괴할 필요 없이 바이러스의 본래 상태에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택할 수 있습니다. 둘째로, SELEX는 선택(22)의 각 라운드에서 카운터 선택 단계들을 사용하여, 다른 유사한 바이러스 또는 비감염성 불활성화 바이러스와 같은 경쟁 타겟(21, 23)을 제거하도록 맞춤형으로 제작될 수 있다. 카운터 선택 단계 동안, DNA 풀은 결합이 바람직하지 않은 표적에 노출되고, 결합하는 임의의 서열은 폐기된다.

이 작업에서 우리는 감염성 바이러스에 결합하지만 특정 소독 방법에 의해 비감염성이 된 동일한 바이러스 또는 다른 관련 바이러스에는 결합하지 않는 앱타머를 선택하는 데 일반적으로 적용할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 사전에 알 필요가 없는 바이러스 표면의 기능적 차이를 기반으로 인식 제제를 얻을 수 있으므로 새로 출현한 병원체의 검출 또는 연구가 부족한 질병에 대한 추가적인 이점을 제공합니다.

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Protocol

1. 시약 및 완충액의 제조

  1. 0.9 M 트리스-염기, 0.9 M 붕산, 20 mM EDTA (디소듐 염) 및 탈이온수를 1 L의 최종 부피에 첨가하여 10x 트리스-보레이트 EDTA(10x TBE)를 준비한다.
  2. 다음과 같이 10% 변성 폴리아크릴아미드 원액을 준비한다. 250mL 유리병에 요소(8M) 120g, 10x TBE 25mL, 40% 아크릴아마이드/비스아크릴아미드(29:1) 용액 62.5mL, 최종 부피 250mL에 도달할 때까지 충분한 증류수를 넣습니다. 모든 성분이 녹을 때까지 섞는다.
  3. 다음과 같이 2x 로딩 버퍼를 준비합니다. 50mL 튜브에 요소(8M) 21.636g, EDTA(1mM) 1.675g, 10x TBE 4.5mL를 넣습니다. 증류수로 45mL를 채우고 모든 성분이 녹을 때까지 섞는다.
  4. 100 mM 소듐 아세테이트와 1 mM EDTA(디소듐 염)를 가하여 추출 완충액을 준비한다. 최종 pH를 5로 설정합니다.
  5. 다음과 같이 에탄올 침전 용액을 준비한다. 3M 아세트산나트륨을 준비하고 pH 5.2로 조정한 후 4°C에서 보관합니다. 70% 에탄올 v/v를 준비하고 -20°C에서 보관합니다. 100 % 에탄올을 준비하고 -20 °C에서 보관하십시오.
  6. 1x PBS, 2.5mM MgCl2 및 0.5mMCaCl2를 포함하는 500mL의 SELEX 완충액을 준비합니다. pH 7.4로 조절합니다. 1x PBS, 2.5mM MgCl2, 0.5mMCaCl2 및 8M 요소를 첨가하여 8M 요소로 100mL의 SELEX 완충액을 준비합니다. pH 7.4로 조절합니다.
    알림: SELEX 버퍼의 선택은 선택한 앱타머가 최종 샘플에서 작동하는지 확인하는 데 중요합니다.amp앱타머가 적용될 위치. 예를 들어, SARS-CoV-2에 특이적인 앱타머는 생물학적 샘플(예: 타액 또는 비인두 면봉)에 사용됩니다. 따라서 의도한 생물학적 샘플에서 이러한 조건을 밀접하게 모방하는 이온 농도, pH 및 완충액을 선택하는 것이 중요합니다.
  7. 다음과 같이 바인딩 및 세척 버퍼를 준비합니다. 50mL 튜브에서 5mM Tris, 0.5mM EDTA(이나트륨염) 및 2M NaCl을 준비합니다. pH 7.5로 조정하십시오.

2. DNA 라이브러리 및 프라이머의 설계 및 합성

  1. 다음 기준에 따라 초기 ssDNA 라이브러리 및 프라이머를 설계합니다(예시 ssDNA 라이브러리 및 프라이머 세트는 표 1 참조, 여기서 N은 무작위 뉴클레오티드 위치를 나타냄).
    1. 라이브러리에 증폭을 위한 프라이머 영역 역할을 하는 3' 및 5' 말단에 2개의 상수 서열이 있는 35-60개 뉴클레오티드의 중앙 무작위 영역이 포함되어 있는지 확인합니다. 일반적인 라이브러리 길이는 45개의 무작위 뉴클레오티드입니다.
    2. 시험관 내 선택 과정에서 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 증폭된 이중 가닥 PCR 산물에서 ssDNA를 분리하기 위한 역방향 프라이머에 비오틴 변형이 포함되어 있는지 확인합니다.
  2. 표준 탈염 정제를 통해 상업적 공급원에서 DNA 올리고를 구입하십시오. ssDNA 라이브러리 및 프라이머를 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (dPAGE)에 의해 정제하고, 이어서 표준 절차24에 따라 에탄올 침전시켰다.
    주의: 아크릴아마이드 모노머와 브롬화 에티듐은 유해 화학 물질(인체 발암 물질)이므로 PAGE를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 장갑 및 보안경)를 사용하십시오. 가능하면 브롬화 에티듐 사용을 피하고 더 안전한 염료로 교체하십시오.
    참고: 이 정제 단계를 수행하지 않도록 HPLC 정제로 올리고를 주문할 수 있지만 짧은 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 제거하지는 않습니다.
  3. 에탄올 침전 후 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 원하는 농도(100μM)까지 ssDNA를 재현탁합니다. ssDNA 라이브러리 및 프라이머의 농도를 λ = 260 nm에서 UV 흡수로 측정한다. -20 °C에서 보관하십시오.
  4. 고처리량 염기서열분석 라이브러리 준비 및 qPCR 정량화에 사용할 변형되지 않은 역방향 프라이머를 구입하십시오.

3. 감염성 및 비감염성 바이러스 샘플

주의 : 감염성 및 비감염성 바이러스 샘플은 생물 안전 레벨 2(BSL2) 샘플로amp안전하고 적절하게 취급하기 위해 각별한 주의가 필요합니다. 이러한 샘플을 포함하는 절차의 모든 단계는 생물 안전 캐비닛에서 수행되거나 바이러스 용액이 밀봉된 용기(예: 캡이 있는 플라스틱 튜브)에 있어야 합니다.

  1. 감염성 바이러스의 원액을 얻거나 각 바이러스에 해당하는 프로토콜에 따라 준비하십시오. 여기에 사용된 SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 및 H5N1 유사바이러스는 PBS 버퍼에서 Lijun Rong 교수의 연구실(UIC)에서 제공되었으며 보고된 프로토콜22,25,26에 따라 준비되었습니다.
    참고: 손상되지 않은 감염성 바이러스를 처리하기 위해 생물학적 안전성 레벨 3 시설이 필요한 바이러스의 경우 유사 바이러스와 함께 작업할 수 있습니다. 유사형 바이러스는 바이러스 외피 내에서 바이러스의 표면 단백질을 표시하는 렌티바이러스(HIV)에서 생성되므로 바이러스의 표면 및 진입 메커니즘을 밀접하게 모방하지만 지속적인 바이러스 복제에는 결함이 있습니다.
  2. 비감염성 바이러스 원액을 얻거나 소독 절차에 따라 준비하십시오. 여기에 사용된 UV-불활성화 SARS-CoV-2 유사바이러스(p-SARS-CoV-2) 스톡은 PBS 완충액의 Rong 연구실(UIC) 교수에 의해 제공되었으며, 이전에 보고된 프로토콜은 UV-불활성화에 사용되었습니다22.
    참고: 가능하면 분석을 수행하여 바이러스의 감염성을 테스트하여 바이러스가 완전히 비활성화되었는지 확인하십시오.
  3. 바이러스 재고 정량화
    1. 표준 절차27,28,29에 따라 플라크 검정을 사용하여 바이러스를 정량화한다. 이 분석은 바이러스의 정량화를 가능하게 할 뿐만 아니라 바이러스의 감염 상태를 나타내어 감염성 바이러스의 농도를 확인합니다.
    2. 플라크 분석을 사용할 수 없는 유사바이러스 또는 바이러스의 경우 시중에서 판매되는 정량적 렌티바이러스 ELISA 키트를 사용하여 바이러스를 정량화합니다.
    3. p-SARS-CoV-10, p-SARS-CoV-2 및 p-H1N1에 대한1 x 1 copies/mL의 원액을 준비합니다. 각 원액을 각각 50 μL씩 함유된 분취액으로 분리하고 -80°C에서 유지한다. 각 실험 전에 새 부분 표본을 해동합니다.

4. 시험관 내 선택 또는 SELEX 공정 : 초기 라운드

알림: 감염성 바이러스를 사용하는 모든 단계에 대해 BSL2 캐비닛에서 작업하십시오.

  1. ssDNA 라이브러리를 변성시킵니다. 10μL의 ssDNA 라이브러리(1nmol) 100μL를 취하여 240μL의 SELEX 완충액과 혼합합니다. 건조에서 95°C에서 15분 동안 가열한 다음 튜브를 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.
  2. 감염성 바이러스와 함께 ssDNA 라이브러리를 배양(양성 선택 단계)하여 다음과 같이 한다. 4.1단계의 SELEX 버퍼에 있는 250μL의 ssDNA 라이브러리를 50μL의 감염성 바이러스(1 x 108 copies/mL)와 혼합합니다. 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
  3. 다음과 같이 원심분리기 필터에서 비특이적 부위를 차단합니다. 4.2단계를 기다리는 동안 다음 단계를 위해 원심분리기 필터를 준비합니다.
    1. 400μL의 1mM T20 시퀀스(표 1)를 사용할 각 0.5mL 원심분리기 필터(컷오프가 100kDa인 원심분리기 필터 1개와 컷오프가 10kDa인 필터 1개)에 추가합니다.
    2. 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 필터에서 T20 용액을 제거하였다. SELEX 버퍼로 3x 세척하여 과도한 T20 서열을 제거합니다.
  4. 바인딩되지 않은 시퀀스를 다음과 같이 세척합니다. 단계 4.2에서 인큐베이션된 혼합물을 블록화된 100 kDa 원심분리 필터에 첨가하고, 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 400 μL의 SELEX 완충액을 첨가하고 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 3x 세척한다. 필터에 분획을 유지하고 플로우 스루를 버립니다.
  5. 아래에 설명된 대로 결합된 시퀀스를 용리합니다.
    1. 원심분리기 필터의 수집 튜브를 교체하고 300단계에서 8M 요소가 포함된 SELEX 버퍼 4.4μL를 원심분리기 필터에 추가합니다. 원심분리기 필터를 95°C의 건식 수조에서 15분 동안 가열한 다음 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
    2. 용리된 염기서열을 포함하는 필터를 통해 흐른 분획을 수집합니다. 세 번 더 반복하십시오. BSL2 캐비닛에서 작업하고 재료를 폐기하기 전에 바이러스를 비활성화하기 위해 10% 표백제로 모든 재료를 씻으십시오.
  6. 다음과 같이 농축하고 탈염하십시오. 4.5에서 수집된 용액을 차단된 10kDa 원심분리기 필터에 추가합니다. 14,000 x g 에서 15분 동안 원심분리기 필터를 통과한 분획을 버립니다.
    알림: 이전 단계에서 필터에 8M 요소로 바이러스가 유지되고 비활성화되므로 생물 안전 캐비닛에서 이 단계와 다음 단계를 수행할 필요가 없습니다. 이 절차는 0.5 단계에서와 같이 모든 용액이 수집 될 때까지 4.5 mL 원심 분리 튜브를 사용하는 경우 1.2 mL가 필터를 통해 흐릅니다.
  7. 300 μL의 SELEX 완충액으로 3x 세척하여 14,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하여 요소를 제거하였다. 필터를 통과한 분획을 버립니다. 깨끗한 수집 튜브에서 거꾸로 뒤집고 5분 동안 원심분리하여 필터의 용액을 회수합니다.
  8. 플라스틱 튜브에서 피펫을 사용하여 4.7에서 회수된 용액의 최종 부피를 측정합니다. 이 해의 이름은 R i a이며, 여기서i는 라운드 번호에 해당합니다. 전형적으로, 30 μL 내지 50 μL 사이의 부피가 얻어진다. 용출된 ssDNA 1μL를 취하여 qPCR로 DNA의 양을 정량합니다.
    참고: 이것은R1a 샘플을 -20°C에서 보관하여 다른 시간에 계속할 수 있는 가능한 일시 중지 지점입니다.
  9. 아래에 설명된 대로 PCR 증폭을 수행합니다.
    1. 첫 번째 라운드에서R1a 샘플의 90%를 PCR 템플릿으로 사용합니다. 다음 라운드에서 4.8단계에서 총 부피의 60%를 취하여 PCR을 수행하고 나머지 분획을 -20°C에서 보관합니다.
    2. 지정된 최종 농도를 갖는 50μL PCR 반응을 설정합니다: 1x PCR 반응 완충액, 200μM dNTP, 10μL의 DNA 주형(R 1 a 샘플), 200nM 각 프라이머 및 1.25U 중합효소(2.5U/μL 스톡).
    3. 각 프라이머 세트와 ssDNA 라이브러리에 대한 사이클 수 및 어닐링 온도를 포함한 PCR 조건을 최적화합니다. 프라이머-다이머와 같은 원치 않는 PCR 하위 산물을 생성하는 너무 많은 사이클을 사용하지 마십시오. 프라이머의 용융 온도에 따라 다양한 어닐링 온도를 테스트합니다.
    4. 95°C에서 5분 동안 최적화된 조건을 사용하여 PCR을 실행한 후 95°C에서 1분, 52°C에서 30초, 72°C에서 1분의 18사이클을 실행하고 72°C에서 10분 동안 최종 확장 단계를 수행하여 dsDNA 풀을 얻었습니다.
      참고: 이것은 PCR 산물을 -20°C에서 보관하여 다른 시간에 계속할 수 있는 또 다른 가능한 일시 중지 지점입니다.
  10. 스트렙타비딘 변형 마그네틱 비드를 사용하여 ssDNA를 회수합니다.
    1. PCR 산물의 80 %를 섭취하십시오. 나머지 분획을 -20°C에서 보관한다.
    2. PCR 산물을 50μL의 분취량으로 분할하고 50μL의 스트렙타비딘 변형 자기 비드(MB)가 들어 있는 마이크로분리기 튜브에 추가합니다. 실온에서 가벼운 교반(예: 회전식 셰이커 사용)으로 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 마이크로퍼지 튜브를 마그네틱 랙에 놓아 MB를 분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다(투명한 용액이어야 함).
    3. 200 μL의 결합 및 세척 완충액을 튜브에 첨가하여 세척한다. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 튜브를 두드린 다음 피펫팅을 통해 MB를 균질 용액에 다시 일시 중단합니다. 마이크로퍼지 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓아 MB를 분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다.
    4. 세척이 완료되면 총 100μL의 SELEX 완충액에 MB를 재현탁하고 용액을 10분 동안 95°C로 가열합니다. 튜브가 냉각되기 전에 즉시 튜브를 마그네틱 랙에 넣고 ssDNA 풀이 포함된 상층액을 채취합니다. 50 μL의 SELEX 버퍼를 추가하면서 이 회수 단계를 반복한다.
  11. 피펫을 사용하여 4.10에서 회수된 분획의 최종 부피를 측정합니다. 이 분수의 이름은 R ix이며, 여기서 i는 라운드 번호에 해당합니다. 일반적으로, 140 내지 150 μL 사이의 부피가 얻어진다. 1 μL의R1x를 취하여 qPCR로 DNA의 양을 정량화한다.

5. 후속 선발 라운드

  1. ssDNA 풀을 변성시킵니다. 샘플 R1x의 60 %를 취하여 50 μL의 SELEX 완충액과 혼합하십시오. 건조한 수조에서 95°C로 15분 동안 가열합니다. 튜브를 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.
  2. ssDNA 풀을 비감염성 바이러스 및 기타 잠재적인 간섭 바이러스와 함께 배양합니다(카운터 선택 단계). 5.1의 SELEX 완충액에서 변성된 ssDNA 풀을 각 바이러스 50μL(5 x 109 copies/mL, 예: 비감염성 p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 및 p-H5N1)와 혼합합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  3. 원심분리기 필터에서 비특이적 부위를 차단합니다. 5.2 단계를 기다리는 동안 다음 단계를 위해 원심 분리기 필터를 준비합니다. 일반적으로 차단 필터가 100kDa이고 차단 필터가 10kDa인 두 개의 원심분리기 필터를 사용합니다. 4.3에서와 동일한 절차를 따르십시오.
  4. 비표적 바이러스에 결합된 서열을 씻어냅니다. 단계 5.2에서 배양된 혼합물을 블록된 100 kDa 원심분리 필터에 추가한다. 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 원심분리기 필터를 통해 흐르는 분획을 회수합니다. 100 μL의 SELEX 완충액을 첨가하고 14,000 x g 에서 10 분 동안 원심 분리하여 2 배 세척한다. 필터를 통과한 분획을 유지합니다.
  5. 감염성 바이러스와 함께 ssDNA 풀을 배양합니다(양성 선택 단계). 5.4단계에서 300μL의 분획을 취하여 50μL의 감염성 바이러스(1 x 108 copies/mL)와 혼합합니다. 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 4.4 - 4.11 단계를 따릅니다.

6. SELEX 프로세스 모니터링

참고: 풀의 농축을 모니터링하기 위해 qPCR은 두 가지 방법으로 사용됩니다. 첫째, 절대적인 정량화에 의해, 풀의 농축도(용출 수율)를 시험할 수 있다. 둘째, 용융 곡선을 모니터링하여, 풀의 다양성(압타머 종의 수렴)을 평가할 수 있다(30).

  1. qPCR용으로 설계된 96웰 플레이트에서 10μL 반응 부피로 모든 qPCR 분석을 수행합니다.
  2. 5 μL의 마스터 믹스, 0.3 μL의 500 nM의 각 표지되지 않은 프라이머, 3.4 μL의H2O, 및 1 μL의 DNA 주형을 함유하는 표준 qPCR 혼합물을 준비한다.
    1. 표준 곡선을 실행하기 위해 정제된 ssDNA 라이브러리의 희석액(단계 2.3)을 준비합니다.
    2. DNA 샘플을 희석하여 농도가 표준 곡선에 맞도록 합니다. Ria 샘플의 경우, 희석하지 않은 샘플 1 μL과 1:10 희석 1 μL를 qPCR 혼합물에 첨가하십시오. Rix 샘플의 경우, 1:10 또는 1:100 희석을 포함한다.
  3. 다음 프로토콜을 설정하여 qPCR을 실행합니다. 먼저, 초기 변성 단계를 98°C에서 2분 동안 설정합니다. 그런 다음 98°C에서 5초 동안 변성 40주기를 설정하고 52°C에서 10초 동안 어닐링 및 연장합니다. 최종적으로 용융곡선 해석을 65°C에서 95°C로 설정하였다. 자동화된 임계값 분석을 통해 임계값 주기(Ct) 값을 결정합니다.
  4. 표준 곡선을 사용하여, Ri 및Rix샘플 중의 ssDNA의 양을 정량화한다.
  5. 용출 수율을 결합된 DNA의 양(Ri a의몰수)을 초기 DNA의 양(Ri-1x의 몰수)으로 나눈 값으로 계산한다. 용출 수율 대 라운드 수를 플로팅하여 라운드에 걸친 농축이 관찰되는지 확인합니다.
  6. 여러 라운드에 대한 용융 곡선을 플로팅합니다. 라운드 수가 증가함에 따라 75/85 °C 근처의 피크에서 더 높은 용융 온도로의 전환이 예상됩니다. 이것은 풀의 다양성이 감소한다는 것을 의미합니다.

7. 고처리량 시퀀싱

  1. 라이브러리 준비 방법을 결정할 수 있는 시퀀싱 유형 및 스케일에 대해 고처리량 시퀀싱 시설에 문의하십시오.
    참고: 이 결정은 시퀀싱할 풀의 길이(프라이머 포함)와 제출할 풀 수(일반적으로 풀당 최소 1 x 105-10 6 시퀀스를 목표로 함)를 모두 고려합니다. 특정 시퀀싱 스케일이 풀의 전체 길이를 읽을 수 없는 경우 한쪽 끝에서만 읽는 단일 끝과 달리 쌍 끝 시퀀싱을 사용하여 시퀀스의 양쪽 끝에서 읽을 수 있습니다.
  2. 시퀀싱 시설과 상의하여 시퀀싱 유형에 따라 시중에서 판매되는 적절한 키트를 선택하십시오. 하나의 레인을 사용하여 모든 라운드의 샘플 분석을 허용하는 각 풀의 어댑터에서 서로 다른 인덱스 쌍을 사용하여 높음, 중간 및 낮음 농축을 나타내는 여러 선택 라운드 풀과 최종 풀을 준비합니다.
    참고: PCR 증폭은 고처리량 염기서열 분석에 필요한 어댑터와 인덱스를 통합하는 데에도 사용할 수 있지만 일반적으로 상용 키트와 비용이 비슷하고 성능이 더 좋지 않습니다.
    1. 다음 단계에 따라 라이브러리 준비를 수행합니다: 단편화된 DNA의 최종 복구, 어댑터 결찰 및 최종 라이브러리를 생성하기 위한 PCR 증폭.
    2. 제조업체의 지침에 따라 자기 DNA 클린업 비드로 PCR 산물을 정제합니다.
    3. 형광 기반 정량 키트를 사용하여 DNA를 정량합니다. 소량의 UV 측정과 같이 덜 정확한 방법을 사용하지 마십시오.
    4. 특정 인덱스를 포함하는 각 풀 라이브러리의 거의 동일한 양(부피가 아닌 DNA의 양에 따라)을 혼합합니다.
    5. qPCR 정량 분석 및 DNA 단편 분석기로 최종 라이브러리의 품질을 확인합니다. 이 단계는 종종 시퀀싱 시설에 의해 수행됩니다.
      참고: 시퀀싱 시설 직원은 라이브러리를 준비하는 방법과 제안된 품질 관리에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 라이브러리를 준비하기 전에 그들과 논의해야합니다.
  3. 준비된 최종 라이브러리를 요구 사항에 따라 시퀀싱 시설로 보냅니다.

8. 염기서열 분석

  1. 시퀀싱 분석에 사용할 수 있는 대부분의 소프트웨어는 Linux 운영 체제의 명령줄에서 실행되도록 설계되었습니다. 작은 데이터 세트의 경우 원하는 Linux 운영 체제를 설정하고 개인용 컴퓨터에 필요한 프로그램을 설치합니다. 더 큰 데이터 세트의 경우 HTS 분석은 고성능 컴퓨팅 리소스 또는 슈퍼 컴퓨터(권장)에서 실행됩니다.
    참고: 고성능 컴퓨팅 리소스를 사용하려면 액세스 및 교육이 필요하며, 이를 얻는 데 다소 시간이 걸릴 수 있습니다. 또한 UNIX 명령줄 사용에 대한 기본 지식이 필요합니다. 기본 명령줄 사용에 대한 많은 무료 리소스를 온라인에서 사용할 수 있으며 컴퓨팅 리소스는 해당 시스템 사용에 대한 추가 정보를 제공할 수 있습니다.
  2. 시퀀싱 기능에서 제공하는 정보를 사용하여 일반적으로 압축된 FastQ 파일 형식의 시퀀싱 파일에 액세스합니다.
    1. FTP 클라이언트를 사용하여 파일을 자신의 컴퓨터 및/또는 고성능 컴퓨팅 리소스로 전송합니다. 많은 시퀀스 분석 프로그램은 압축 파일을 직접 사용할 수 있으므로 가능하면 파일을 압축된 상태로 유지하여 파일 크기를 제한합니다(압축되지 않은 경우 50M+ 시퀀스의 큰 시퀀스 읽기는 100Gb+의 파일 공간을 차지할 수 있음).
    2. 시퀀스 파일의 압축을 풀어야 하는 경우 대부분의 Linux 설치에서 표준인 gzip 함수를 사용합니다. 명령줄에 "man gzip"을 입력하여 설치된 설명서에서 gzip 및 해당 옵션에 대한 추가 정보를 얻으십시오.
  3. 역다중화, 시퀀싱 어댑터 제거, 저품질 판독 제거, 순방향 및 역방향 판독을 모두 포함하여 분석 전에 시퀀스를 정리합니다.
    1. 각 정화 단계의 효과를 평가하기 위해 시퀀스에 대한 기본 품질 관리 정보를 얻기 위해 다음의 각 단계 후에 FastQC 프로그램(31 )을 사용한다.
    2. 시퀀스를 역멀티플렉싱하여 단일 읽기 파일의 모든 시퀀스를 시퀀싱 어댑터에 포함된 인덱스에 따라 다른 풀로 분리합니다. 이 단계는 종종 시퀀싱 시설에서 수행하며, 정확한 절차는 사용되는 시퀀싱 기계에 따라 다르므로 시퀀싱 시설과 상의해야 합니다.
    3. 명령줄 프로그램인 Cutadapt32를 사용하여 시퀀싱 어댑터를 제거합니다. 선택 프라이머(시퀀싱 어댑터 대신)를 연결된 어댑터 모드의 입력으로 사용합니다. --discard-untrimmed 옵션을 사용하여 선택 프라이머가 포함되지 않은 시퀀스를 삭제합니다.
    4. 어댑터와 일치하도록 최대 오류율에 대한 옵션과 허용할 시퀀스의 최소 및 최대 길이를 설정합니다. 쌍을 이루는 끝 읽기를 사용하는 경우 사용 가능한 특정 매개 변수를 입력하고 읽기 1 및 읽기 2 시퀀싱 파일을 모두 제공합니다. Cutadapt 매뉴얼32를 참조하여 필요에 따라 추가 매개변수를 설정합니다.
      참고: 풀에 대한 시퀀싱 어댑터의 결찰은 방향에 독립적이며 시퀀스의 약 50%를 순방향으로, 50%를 역방향으로 통합합니다. 역방향으로 시퀀스의 50%가 손실되는 것을 방지하기 위해 선택 프라이머의 역보수를 입력으로 사용하여 Cutadapt를 두 번째로 실행할 수 있습니다.
    5. (선택 사항) 쌍단 시퀀싱을 사용하는 경우 Read 1 및 Read 2 파일을 PEAR33 프로그램과 병합합니다.
    6. FASTX-툴킷 프로그램(34 )을 사용하여 임의의 뉴클레오티드에서 특정 임계치 미만의 품질을 갖는 저품질 서열을 제거한다. 품질 컷오프 점수 30점은 좋은 출발점입니다. 전반적인 품질이 일반적으로 양호한 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
    7. 역방향의 시퀀스 파일과 정방향의 시퀀스 파일을 병합하려면 역방향 파일에서 FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement 함수를 사용합니다. 그런 다음 내장 cat 프로그램 (대부분의 Linux 설치에서 표준)을 사용하여 정방향 및 역방향 보완 - 역방향 파일을 단일 파일로 병합합니다.
  4. 상이한 선택 풀에 걸친 서열의 농축을 분석하기 위해, FASTAptamer 분석 툴킷(35)을 사용한다.
    1. FASTAptamer-Count를 사용하여 각 시퀀스가 나타나는 횟수를 계산합니다. 그런 다음 시퀀스의 순위를 매기고 풍부하게 정렬합니다. 카운트 출력 파일은 다른 모든 FASTAptamer 프로그램에 대한 입력으로 필요합니다.
    2. FASTAptamer-Clust를 사용하여 파일의 모든 시퀀스를 밀접하게 관련된 시퀀스의 클러스터로 그룹화합니다. "distance" 파라미터를 사용하여 클러스터로 그룹화할 수 있는 단일 뉴클레오티드 돌연변이 또는 인델의 수를 정의합니다.
      참고: FASTAptamer-Clust 프로그램은 많은 수의 고유 시퀀스가 있는 경우(특히 초기 라운드의 경우) 계산 비용이 매우 많이 들 수 있으며, 완전히 완료하는 데 며칠 또는 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 컷오프 필터 파라미터는 클러스터링에서 낮은 존재비의 시퀀스를 제외하는 데 사용할 수 있습니다. 일반적으로 10 또는 5 백만당 읽기 수(RPM)와 같이 더 높은 컷오프로 시작하여 프로그램이 빨리 끝나면 줄이는 것이 좋습니다. 풀이 매우 이질적인 경우 적절한 시간 내에 시퀀스를 클러스터링하는 것이 불가능할 수 있습니다.
    3. FASTAptamer-Enrich를 사용하여 두 개 이상의 선택 라운드에 있는 각 시퀀스의 보강을 계산합니다. 한 모집단의 시퀀스 RPM과 다른 모집단의 RPM을 비교합니다. Count 또는 Cluster 파일에서 보강 프로그램을 사용합니다. 출력은 탭으로 구분된 값(.tsv) 파일로, 추가 분석 및 쉬운 정렬을 위해 모든 스프레드시트 소프트웨어에서 열 수 있습니다.
      참고: FASTAptamer-Enrich 프로그램은 고유한 시퀀스 수가 많은 경우 계산 비용이 매우 많이 들 수도 있습니다. 컷오프 필터 파라미터를 사용하면 너무 커서 스프레드시트 소프트웨어에서 열 수 없는 파일을 방지하기 위해 출력에서 낮은 존재비 시퀀스를 제외할 수 있습니다.
    4. (선택 사항) 많은 풀이 너무 이질적인 경우(고유한 시퀀스가 많고 중복 시퀀스가 거의 없음) Clust 또는 Enrich 프로그램을 사용하지 못할 수 있습니다. 이 경우 시퀀스를 풍부도(맨 위에 가장 많음)별로 정렬하고 RPM과 같은 중요한 정보를 포함하도록 시퀀스 식별자의 이름을 바꾸는 Count 출력 파일을 사용하여 수동 보강 검사를 수행합니다.
      1. Count 파일의 표준 Linux "head" 프로그램을 사용하여 가장 풍부한 시퀀스 목록을 가져옵니다. 그런 다음 표준 Linux "grep" 프로그램을 사용하여 다른 모든 관련 풀의 Count 파일에서 가장 풍부한 시퀀스 각각을 검색합니다. 일치하는 항목이 있는 경우 수정된 시퀀스 식별자를 사용하여 해당 풀의 RPM을 결정하고 보강 정보를 수동으로 구성합니다.
        참고: 모든 시퀀싱 분석 단계에 대한 스크립트는 보충 코딩 파일 1-11에서 찾을 수 있습니다.

9. 압타머 결합 검증 및 분석

  1. 서열 분석을 통해 얻은 농축 정보로부터, 후속 선택 라운드에서 가장 농축된 서열 및/또는 최종 선택 라운드에서 가장 풍부한 서열을 갖는 서열을 기반으로 후보 앱타머 서열을 식별한다. 추가 테스트를 위해 여러 가지 다른 후보 서열(최소 10-20개)을 선택하는데, 이는 가장 고농축된 압타머가 반드시 최고 성능의 앱타머가 아닐 수도 있기 때문입니다.
  2. 여러 샘플에 대해 신속하게 수행할 수 있는 결합 분석을 사용하여 후보 앱타머의 초기 스크리닝을 수행합니다. 컬럼-기반 한외여과 결합 분석법36 또는 효소-결합 올리고뉴클레오티드 분석법 (ELONA)은 이러한 초기 스크리닝을 위한 좋은 방법이다.
  3. 최소 2개의 독립적인 결합 분석(예: MicroScale Thermophoresis(MST)37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay(ELONA)39, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon referometry, BLI)41)을 사용하여 초기 스크리닝에서 최상의 결합 활성을 나타내는 서열의 특이성 및 친화도를 분석합니다.

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Representative Results

DNA 앱타머는 시험관(15)에서 SELEX를 사용하여 얻을 수 있기 때문에, 이 SELEX 전략은 온전한 전체 감염성 바이러스에 대한 양성 선택 단계(즉, 감염성 바이러스에 결합하는 DNA 분자를 보유함)뿐만 아니라 특정 소독 방법에 의해 비감염성이 된 동일한 바이러스에 대한 반대 선택 단계를 모두 포함하도록 신중하게 설계되었습니다. 특히 자외선 처리는 비감염성 바이러스에 결합할 수 있는 DNA 서열을 폐기한다. 선택 프로세스의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다.

이 프로토콜의 대표적인 결과로 감염성 SARS-CoV-2에 대한 압타머 선택을 선택했습니다. 손상되지 않은 전염성 SARS-CoV-3를 처리하기 위한 생물안전 수준 3(BSL2) 작업 조건의 요구 사항으로 인해 우리는 대신 유사형 바이러스를 사용하기로 결정했습니다. 유사형 바이러스는 상대적으로 무해한 백본 바이러스(이 경우 렌티바이러스(HIV)의 일종)에서 생성되며, 이 바이러스는 바이러스 외피 내에서 관심 있는 다른 바이러스의 표면 단백질을 표시하도록 변형되어 위험한 인간 병원체와 관련된 위험 없이 원하는 바이러스의 표면 및 진입 메커니즘을 밀접하게 모방할 수 있습니다. 중요하게도, 이들 슈도바이러스는 연속적인 바이러스 복제에서 결함이 있는 것으로 변형된다25,42. 이 연구에서는 SARS-CoV-2 스파이크 (S) 단백질이 외피에 통합 된 p-SARS-CoV-2의 세 가지 유사 형 바이러스가 사용되었습니다. SARS-CoV-1 스파이크(S) 단백질을 포함하는 p-SARS-CoV-1; 및 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 A/Goose/Qinghai/59/05(H5N1) 균주에서 분리된 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제를 포함하는 p-H5N1.

처음 두 라운드의 선택에서는 일반적으로 시작 라운드에서 단일 카피로만 존재하는 DNA 결합제의 비특이적 제거를 최소화하기 위해 카운터 선택 단계가 포함되지 않았습니다. 처음 두 라운드 후, 높은 선택성에 도달하기 위해 각 라운드에 포지티브 및 카운터 선택 단계가 포함되었습니다. 카운터 선택을 위해 자외선 처리로 비감염성이 된 p-SARS-CoV-2와 p-SARS-CoV-1 및 p-H5N1을 사용하여 다른 바이러스에 대한 선택성을 얻었습니다.

선택 진행을 모니터링하기 위해 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 사용했습니다. 이 기술은 풀의 라벨링을 필요로 하지 않는 간단한 방법을 나타내며, 일반적으로 거의 모든 타겟(30)에 적용될 수 있다. qPCR 기술의 두 가지 특징을 활용합니다. 첫째, 총 첨가된 ssDNA에 대해 감염성 바이러스에 결합된 ssDNA에 의해 정의되는 용출 수율을 계산하기 위해 표준 곡선을 사용한 절대 정량 가능성. 우리의 결과는 용출 수율이 SELEX의 초기 라운드마다 초기에 증가했다가 라운드 8과 9 (R8 및 R9)에서 평준화되어 감염성 바이러스에 결합하는 시퀀스에서 풀이 풍부 해졌음을 시사합니다 (그림 2A). 둘째, DNA 풀의 모든 라운드의 용융 곡선은 풀30의 서열 다양성에 대한 추가 증거를 제공한다. 용융 곡선을 비교함으로써, 77°C에서 79°C로의 높은 용융 온도(Tm)에서의 피크로부터의 이동이 관찰될 수 있으며, 이는 DNA 풀이 낮은Tm을 갖는 랜덤 서열로부터 더높은 Tm을 갖는 보다 보존된 서열로 수렴되었음을 시사한다 (도 2B). 더욱이, 마지막 라운드 (R8 및 R9)에서,낮은 Tm에서의 피크가 나타난다 (~70°C). 이것은 PCR 동안 프라이머-다이머의 생산과 관련이 있을 수 있습니다. 이를 피할 수 있는 한 가지 가능한 해결책은 PCR 중 사이클 수를 줄이는 것입니다(예: 18 사이클에서 12 또는 15 사이클로).

qPCR에 의한 풀의 농축을 확인한 후, 우리는 SELEX의 3, 5, 7, 8 및 9 라운드에 대해 고처리량 시퀀싱(HTS)을 사용하여 어떤 서열이 바이러스 표적의 결합을 담당하는지 알아냈습니다. 기존의 클로닝-시퀀싱 절차와 비교하여 HTS를 사용하면 여러 선택 라운드에 걸쳐 개별 서열의 진화를 모니터링하여 후속 라운드에서 농축된 앱타머 서열을 최종적으로 식별할 수 있습니다. 그림 3A 는 연속 선택 라운드를 통해 얻은 시퀀스 SARS2-AR10에 대한 상대적 존재비(백만 회당 판독 수)를 보여줍니다. SARS2-AR10의 2차 구조는 Mfold 소프트웨어에 의해 예측되며, 결과(그림 3B)는 바이러스 인식에 관여할 수 있는 줄기 루프 영역을 포함하는 구조화된 2차 구조를 보여줍니다. 이 서열의 친화성 결합의 추가의 특성화는 이전에 보고되었다22. 마이크로스케일 열영동(MST) 및 효소 결합 올리고뉴클레오티드 분석(ELONA)은 SARS2-AR10 앱타머가 Kd = 79 ± 28nM으로 감염성 p-SARS-CoV-2에 결합하고 비감염성 p-SARS-CoV-2 또는 p-SARS-CoV-1 및 229E와 같은 다른 코로나바이러스에 결합하지 않음을 입증했습니다.

Figure 1
그림 1: 감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별하는 앱타머의 SELEX 과정을 개략적으로 표현한 것입니다. 감염성 바이러스에 대한 높은 특이성에 도달하기 위해 두 번째 라운드 이후 각 라운드에서 양성 및 카운터 선택 단계가 추가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 감염성 SARS-CoV-2 특이적 압타머의 SELEX 진행 상황 모니터링. (A) qPCR을 사용하여 SELEX의 각 라운드에 대한 용출 수율(즉, 첨가된 ssDNA에 결합된 ssDNA)의 정량화. (B) SARS-CoV-2 압타머 선택 중 다른 풀에 대한 용융 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: SARS2-AR10 압타머의 농축 및 2차 구조. FASTAptamer-Count를 사용하여 선택 라운드의 함수로 SARS2-AR10 시퀀스에 대한 HTS 데이터를 분석하여 얻은 백만당 읽기 수(RPM). 삽입: UNAFold 소프트웨어를 기반으로 SARS2-AR10 서열의 예측된 가장 안정적인 2차 구조입니다. 계산은 25°C, 100 mM NaCl, 및 2 mMMgCl2에서 이루어졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이름 DNA 서열 (5′ 내지 3′)
티20 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
DNA 라이브러리 ACCGTCAGTTACAATGCT-N45 -GGCTGGACTATCTGTGTA
정방향 프라이머(FwdP) ACCGTCAGTTACAATGCT
역방향 프라이머(RevP) 비오-TACACAGATAGTCCAGCC
사스-AR10 CCCGACCAGCCACCATCAGCAACTCTTCCGCGTCCATCCCTGCTG
N: 무작위 뉴클레오티드를 나타내고; 비오트: 5'말단의 비오틴 변형.

표 1: DNA 서열 목록.

보충 코딩 파일 1: Cutadapt_script.txt 지정된 입력 파일에서 지정된 정방향 및 역방향 프라이머가 있는 모든 시퀀스를 식별하고, 프라이머가 없는 시퀀스를 버리고, 프라이머가 있는 시퀀스에서 프라이머를 제거합니다. Cutadapt에 대한 자세한 내용은 참조31 을 참조하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 2: FASTAptamer_cluster_script.txt는 단일 카운트 파일의 모든 시퀀스를 밀접하게 관련된/유사한 시퀀스의 패밀리/클러스터로 클러스터링합니다. 이는 후보 서열이 식별되어 동일한 클러스터 내의 다른 유사한 서열도 잠재적 후보로 식별될 수 있는 경우에 유용합니다. FASTAptamer에 대한 자세한 내용은 참조34 를 참조하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 3: FASTAptamer_count_script.txt는 주어진 입력 FASTA/FASTQ 파일에서 각 고유 시퀀스의 발생 횟수를 계산하고 각 고유 시퀀스의 출력 파일을 내림차순으로 생성합니다(최고 존재비에서 최저 존재비까지). Count 출력 파일은 다른 모든 FASTAptamer 프로그램에 대한 입력으로 필요합니다. FASTAptamer에 대한 자세한 내용은 참조34 를 참조하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 4: FASTAptamer_enrich_script.txt 두 개 또는 세 개의 입력 파일의 모든 시퀀스를 비교하고, 모든 파일 간에 모든 고유한 시퀀스를 풍부하게 제공하고, 여러 파일에 있는 모든 시퀀스의 쌍별 보강 값(RPM)의 모든 조합을 제공합니다. FASTAptamer에 대한 자세한 내용은 참조34 를 참조하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Supplementary Coding File 5: fastqc_script.txt는 중복 수준, 읽기 길이 및 품질 점수와 같은 고처리량 시퀀싱 데이터에 대한 읽기 쉬운 품질 정보를 제공하는 FastQ 파일용 품질 관리 도구입니다. FastQC에 대한 자세한 내용은 참조30 을 참조하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 6: FASTX_fwd_rev_merge_script.txt는 FASTX-Toolkit을 사용하여 주어진 역방향 파일에서 모든 시퀀스의 역보수를 출력합니다. 그런 다음 cat 명령(대부분의 UNIX 운영 체제에서 표준)을 사용하여 이 역방향 보수 파일을 지정된 시퀀스 순방향 파일과 병합하여 모든 시퀀스가 포함된 단일 파일을 제공합니다. FASTX-Toolkit에 대한 자세한 내용은 참고 문헌33 을 참조하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 7: FASTX_quality_filter_script.txt는 FASTX-Toolkit을 사용하여 지정된 FastQ 파일의 시퀀스 품질을 확인하고 품질이 낮은 시퀀스를 삭제할 수 있습니다. 이 방법은 일반적으로 시험관내 선택 서열의 분석을 위한 품질 필터링의 트리밍 방법보다 낫다. 트리밍은 게놈 시퀀싱에 허용되는 낮은 품질을 기반으로 서열의 염기(일반적으로 말단 근처)를 제거하는 것을 포함하지만 기능적 DNA에는 전체 서열이 필요하기 때문에 말단을 트리밍하는 것은 유용하지 않습니다. 대신, 시퀀스의 염기가 너무 많으면 품질이 낮으면 전체 시퀀스가 삭제됩니다. FASTX-Toolkit에 대한 자세한 내용은 참고 문헌33 을 참조하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 8: grep_searcher_script.txt는 특정 입력 파일에서 특정 입력 시퀀스를 검색하고 출력 파일에서 ID와 시퀀스를 모두 출력하는 데 사용됩니다(입력에서 발견된 경우). 이 스크립트는 매우 이질적인(즉, 고유한 시퀀스가 많음) 풀에 유용하며, 이로 인해 FASTAptamer Clust를 제대로 실행하는 데 너무 오래 걸리고 분석을 위해 일반적인 스프레드시트 프로그램에서 열 수 없을 정도로 큰 FASTAptamer Enrich 파일이 생성됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 9: gzip_compress_decompress_script.txt Gzip을 사용하여 파일을 압축하거나 압축 해제합니다. 압축 파일에는 일반적으로 파일 이름에 .gz 확장자가 추가됩니다. 파일 공간을 절약하기 위해 대용량 파일을 압축하는 것이 좋습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 10: PEAR_script.txt는 쌍단 시퀀싱 파일에만 사용되며 읽기 1 파일을 해당 읽기 2 파일과 병합합니다. PEAR에 대한 자세한 내용은 참조32 를 참조하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 11: tar_extraction_creation_script.txt는 여러 파일 및/또는 디렉토리를 단일 파일로 대조하는 데 사용되는 Tar 아카이브를 추출하거나 생성합니다. 또한 이 스크립트에 포함된 대로 bz2 압축과 같이 파일 크기를 줄이기 위해 압축되는 경우가 많습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

SELEX는 pM-nM 범위 22,43,44,45에서 높은 친화력을 가진 압타머를 식별할 수 있을 뿐만 아니라 높고 조정 가능한 선택성도 제공합니다. 카운터 선택을 활용하면 선택성이 어려운 압타머를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, Li 그룹은 병원성 박테리아 균주와 비병원성 균주를 구별할 수 있는 서열을 얻을 수 있는 능력을 입증했다21. 또한, Le et al. Streptococcus pyogenes 박테리아46의 혈청형을 구별할 수 있는 압타머를 확인했습니다. 이것은 새로운 나노 기술 22,51,52와 함께 상이한 기능적 DNA 센서 12,47,48,49,50에서 고유 한 선택성을 가진 압타머 분자를 통합하여 휴대용 및 신속한 진단 테스트 또는 환경 검출과 같은 다양한 응용 분야를위한 센서를 구성 할 수있는 가능성을 열어줍니다.

여기에 제시된 프로토콜은 비활성화되어 비감염성인 동일한 바이러스에 대해 감염성 바이러스에 대해 높은 선택성으로 압타머를 얻을 수 있도록 합니다. 이러한 선택성을 얻기 위해 이 작업에서 SELEX 접근 방식은 카운터 선택 단계의 설계를 기반으로 합니다. 첫째, 성공적인 카운터 선택 단계를 위해서는 비표적 샘플의 올바른 선택과 특성화가 수행되어야 합니다. 따라서이 방법은 잘 알려진 감염성 및 비 감염성 손상되지 않은 바이러스 스톡으로 시작하는 것에 달려 있습니다. 둘째, 1차 선정 후 각 라운드에 카운터 선별 단계를 포함하여, 선별 초기부터 엄격한 조건을 적용하고, 바이러스 입자 표면의 미세한 차이와 동일 바이러스의 감염성 및 비감염성 상태를 구별할 수 있는 앱타머 식별 확률을 극대화한다.

이 프로토콜에서는 압타머의 선택성에 중점을 둡니다. 더 강한 압타머 친화도가 필요한 경우 특정 SELEX 라운드 후에 공정의 엄격성을 높일 수 있습니다. 예를 들어, 양성 선택 동안 감염성 바이러스 농도 및 배양 시간을 감소시킴으로써, 더 강한 결합 친화도44를 갖는 앱타머를 얻을 수 있다.

SELEX 프로토콜을 설계할 때 고려해야 할 또 다른 중요한 사항은 앱타머가 적용될 최종 샘플입니다. 바이러스에 특이적인 앱타머는 일반적으로 복잡한 샘플(예: 혈청, 타액 및 실제 물 샘플)에 포함되며, 최종 샘플에서 기능성 앱타머를 얻을 가능성을 높이기 위해 앱타머 선택 중에 이를 고려해야 합니다. 따라서 특히 양이온 농도 및 pH와 관련하여 이러한 샘플을 밀접하게 모방하는 완충액에서 SELEX를 수행하는 것이 중요합니다. 예를 들어, SARS-CoV-2 앱타머의 경우 생물학적 샘플을 밀접하게 모방하기 위해 2mM MgCl2 및 0.5mMCaCl2를 포함하는 PBS 완충액(pH 7.4)을 선택했습니다. 또한, 앱타머가 적용될 샘플의 다른 종들이 압타머를 결합하기 위해 표적과 잠재적으로 경쟁할 수 있는 경우, 이들을 카운터 선택 단계에 포함시킴으로써, 이들 종에 결합할 수 있는 서열을 제거함으로써 이들 종으로부터의 간섭을 최소화할 수 있다.

다양한 바이러스(아데노바이러스 및 SARS-CoV-2)와 다양한 비활성화 방법(UV 처리 및 유리 염소)에 적용된 이 SELEX 공정22의 성공적인 결과는 이 방법이 다른 바이러스 및 기타 비활성화 방법에 널리 적용될 수 있음을 나타냅니다. 감염성 바이러스를 구별하는 압타머는 여전히 전염성이 있는 환자를 식별할 수 있는 진단 응용 분야뿐만 아니라 이러한 샘플의 병원체가 여전히 활성 상태인 경우 샘플이 오염된 것으로 정의되는 환경 응용 분야에서도 잠재력이 있습니다. 따라서 신속한 센서에서 감염성 바이러스를 식별할 수 있는 앱타머의 통합은 소독 처리를 모니터링할 수 있는 기회를 제공합니다.

또한, 두 감염 상태 간의 구조적 차이에 대한 정보 없이 바이러스의 감염 상태를 구별할 수 있었다. 필요한 유일한 정보는 두 상태 간의 차이가 손상되지 않은 바이러스 입자 표면의 분자 구조 차이와 관련이 있다는 것을 아는 것입니다. 따라서 우리는 동일한 접근 방식을 사용하여 동일한 바이러스의 변이체와 혈청형을 구별할 수 있다고 확신하며, 여기서 차이점은 바이러스의 감염 상태를 구별하는 것과 유사한 바이러스 입자 표면의 단백질 잔류물의 작은 돌연변이로 인한 것입니다. 예를 들어, SARS-CoV-2 또는 인플루엔자와 같은 다른 바이러스의 우려되는 변종에 특이적인 압타머를 얻을 수 있어 사회에 가장 큰 위협이 되는 변종을 신속하게 모니터링할 수 있는 가능성이 열릴 것으로 예상합니다.

마지막으로, 감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별할 수 있는 앱타머를 얻기 위한 SELEX 전략은 이들 사이에 어떤 특정 구조적 차이가 존재하는지에 대한 사전 지식이 필요하지 않기 때문에 이러한 선택성을 가진 앱타머를 사용하여 다양한 소독 방법에서 감염성 손실의 원인이 되는 특정 표면 변화를 식별하는 것이 가능할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 프로토콜에 사용된 유사바이러스 샘플(SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1)을 제공한 시카고 일리노이 대학의 Ms. Laura M. Cooper와 Dr. Lijun Rong, 그리고 고처리량 시퀀싱에 도움을 주신 일리노이 대학교 어바나-샴페인에 있는 Roy J. Carver Biotechnology Center의 DNA 서비스 시설의 Dr. Alvaro Hernandez와 Dr. Chris Wright에게 감사드립니다. 그리고 시험관 내 선택 및 압타머 특성화 기술로 우리를 도운 Lu 그룹의 많은 구성원. 이 연구는 국립 과학 재단 (CBET 20-29215)의 RAPID 보조금과 일리노이 대학교 어 바나 샴페인 및 일리노이 – JITRI 연구소 (JITRI 23965)의 지속 가능성, 에너지 및 환경 연구소의 종자 보조금으로 지원되었습니다. ASP는 재정 지원에 대해 PEW Latin American Fellowship에 감사드립니다. 또한 오스틴에 있는 텍사스 대학교의 Lu 그룹 연구 프로그램을 지원해 주신 Robert A. Welch Foundation(보조금 F-0020)에도 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128

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Bioengineering 시험관 내 선택 압타머 바이러스 감염 상태 카운터 선택 온전한 바이러스
감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별하기 위한 압타머의 시험관 내 선택
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Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., … More

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).

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