Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Отбор аптамеров in vitro для дифференциации инфекционных вирусов от неинфекционных

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin
* These authors contributed equally

Summary

Мы предоставляем протокол, который обычно может применяться к отдельным аптамерам, которые связываются только с инфекционными вирусами, а не с вирусами, которые стали неинфекционными с помощью метода дезинфекции, или с любыми другими подобными вирусами. Это открывает возможность определения инфекционного статуса в портативных и экспресс-тестах.

Abstract

Вирусные инфекции оказывают серьезное влияние на общество; Большинство методов обнаружения испытывают трудности с определением того, является ли обнаруженный вирус заразным, что приводит к задержкам в лечении и дальнейшему распространению вируса. Разработка новых датчиков, которые могут информировать о заразности клинических образцов или образцов окружающей среды, позволит решить эту нерешенную задачу. Однако очень немногие методы могут получить чувствительные молекулы, которые могут распознавать интактный инфекционный вирус и отличать его от того же вируса, который был сделан неинфекционным методами дезинфекции. Здесь мы описываем протокол выбора аптамеров, которые могут различать инфекционные вирусы и неинфекционные вирусы, используя систематическую эволюцию лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX). Мы воспользуемся двумя особенностями SELEX. Во-первых, SELEX может быть адаптирован для удаления конкурирующих целей, таких как неинфекционные вирусы или другие подобные вирусы, с помощью встречного отбора. Кроме того, весь вирус может быть использован в качестве мишени для SELEX вместо, например, вирусного поверхностного белка. Цельный вирус SELEX позволяет подбирать аптамеры, которые связываются конкретно с нативным состоянием вируса, без необходимости разрушения вируса. Таким образом, этот метод позволяет получать агенты распознавания на основе функциональных различий на поверхности патогенов, которые не нужно знать заранее.

Introduction

Вирусные инфекции оказывают огромное влияние на экономику и общество во всем мире, что становится все более очевидным в связи с недавней пандемией COVID-19. Своевременная и точная диагностика имеет первостепенное значение в лечении вирусных инфекций при предотвращении распространения вирусов среди здоровых людей. Несмотря на то, что было разработано множество методов обнаружения вирусов, таких как ПЦР-тесты1,2 и иммуноанализы3, большинство используемых в настоящее время методов не способны определить, действительно ли обнаруженный вирус заразен или нет. Это связано с тем, что наличие компонентов вируса само по себе, таких как вирусная нуклеиновая кислота или белки, не указывает на присутствие интактного инфекционного вируса, и уровни этих биомаркеров показали плохую корреляцию с инфекционностью 4,5,6. Например, вирусная РНК, обычно используемая для текущих тестов на COVID-19 на основе ПЦР, имеет очень низкие уровни на ранних стадиях инфекции, когда пациент заразен, в то время как уровень РНК часто все еще очень высок, когда пациенты выздоровели от инфекции и больше не заразны 7,8. Вирусный белок или антигенные биомаркеры следуют аналогичной тенденции, но обычно появляются даже позже, чем вирусная РНК, и, таким образом, еще менее прогностируют инфекционность 6,9. Чтобы устранить это ограничение, были разработаны некоторые методы, которые могут информировать о статусе инфекционности вируса, но основаны на методах микробиологии клеточных культур, которые требуют длительного времени (дни или недели) для получения результатов 4,10. Таким образом, разработка новых датчиков, которые могут информировать о заразности клинических образцов или образцов окружающей среды, может избежать задержек в лечении и дальнейшего распространения вируса. Тем не менее, очень немногие методы могут получить чувствительные молекулы, которые могут распознавать интактный инфекционный вирион и отличать его от того же вируса, который был признан незаразным.

В этом контексте аптамеры особенно хорошо подходят в качестве уникального биомолекулярного инструмента11,12,13,14. Аптамеры представляют собой короткие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК со специфической нуклеотидной последовательностью, которая позволяет им формировать специфическую 3D-конформацию для распознавания мишени с высоким сродством и селективностью15,16. Они получены с помощью комбинаторного процесса отбора, называемого систематической эволюцией лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX), также известного как отбор in vitro, который проводится в пробирках с большой библиотекой случайной выборки ДНК из 10 14-10 15 последовательностей17,18,19. В каждом раунде этого итеративного процесса пул ДНК сначала подвергается давлению отбора путем инкубации с мишенью в желаемых условиях. Любые последовательности, которые не связаны с целью, затем удаляются, оставляя только те немногие последовательности, которые могут связываться при данных условиях. Наконец, последовательности, которые были выбраны на предыдущем шаге, амплифицироваются с помощью ПЦР, обогащая популяцию пула желаемыми функциональными последовательностями для следующего раунда отбора, и процесс повторяется. Когда активность пула отбора достигает плато (обычно после 8-15 раундов), библиотека анализируется с помощью секвенирования ДНК для выявления выигрышных последовательностей, проявляющих наибольшее сродство.

SELEX обладает уникальными преимуществами, которые могут быть использованы для повышения селективности по отношению к другим аналогичным мишеням 20,21, например, по инфекционному статусу вируса22. Во-первых, для селекции можно использовать широкий спектр различных типов мишеней, от малых молекул и белков до целых патогенов и клеток16. Таким образом, для получения аптамера, который связывается с инфекционным вирусом, в качестве мишени может быть использован интактный вирус вместо вирусного поверхностного белка19. Whole virus SELEX позволяет подбирать аптамеры, которые специфически связываются с нативным состоянием вируса, без необходимости разрушения вируса. Во-вторых, SELEX может быть адаптирован для удаления конкурирующих мишеней 21,23, таких как другие аналогичные вирусы или неинфекционные инактивированные вирусы, с использованием этапов встречного отбора в каждом раунде отбора22. Во время этапов отбора счетчиков пул ДНК подвергается воздействию мишеней, для которых связывание нежелательно, и любые последовательности, которые связываются, отбрасываются.

В этой работе мы приводим протокол, который в целом может быть применен для выбора аптамеров, которые связываются с инфекционным вирусом, но не с тем же вирусом, который был сделан неинфекционным с помощью конкретного метода дезинфекции, или с другими родственными вирусами. Этот метод позволяет получать распознавающие агенты на основе функциональных различий поверхности вируса, которые не нужно знать заранее, и, таким образом, дает дополнительное преимущество для обнаружения вновь появившихся патогенов или для недостаточно изученных заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление реагентов и буферов

  1. Приготовьте 10x трис-борат ЭДТА (10x TBE), добавив 0,9 М трис-основания, 0,9 М борной кислоты, 20 мМ ЭДТА (динатриевая соль) и деионизированную воду до конечного объема 1 л. Перемешивайте до тех пор, пока все компоненты не растворятся.
  2. Приготовьте 10% денатурирующий раствор полиакриламида следующим образом. В стеклянную бутылку объемом 250 мл добавьте 120 г мочевины (8 М), 25 мл 10x TBE, 62,5 мл 40% раствора акриламида/бисакриламида (29:1) и достаточное количество дистиллированной воды для достижения конечного объема 250 мл. Перемешивайте до тех пор, пока все компоненты не растворятся.
  3. Подготовьте 2-кратный загрузочный буфер следующим образом. В пробирку объемом 50 мл добавьте 21,636 г мочевины (8 М), 1,675 г ЭДТА (1 мМ) и 4,5 мл 10x TBE. Залейте до 45 мл дистиллированной водой и перемешивайте до полного растворения всех компонентов.
  4. Приготовьте экстракционный буфер, добавив 100 мМ ацетата натрия и 1 мМ ЭДТА (динатриевая соль). Установите окончательный рН на 5.
  5. Готовят растворы для осаждения этанола следующим образом. Приготовьте 3 М ацетата натрия, отрегулируйте до pH 5,2 и храните при температуре 4 ° C. Приготовьте 70% этанол v/v и храните при -20 °C. Приготовьте 100% этанол и храните при температуре -20 °C.
  6. Приготовьте 500 мл буфера SELEX, содержащего 1x PBS, 2,5 мМ MgCl2 и 0,5 мМ CaCl2. Отрегулируйте до pH 7,4. Приготовьте 100 мл буфера SELEX с 8 М мочевиной, добавив 1x PBS, 2,5 мМ MgCl 2, 0,5 мМ CaCl2 и 8 М мочевины. Отрегулируйте до pH 7,4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор буфера SELEX имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы выбранный аптамер работал на конечном образце, на который будет применяться аптамер. Например, аптамеры, специфичные для SARS-CoV-2, будут использоваться в биологических образцах (например, мазки из слюны или носоглотки). Таким образом, важно выбрать концентрацию ионов, рН и буфер, которые точно имитируют эти условия в предполагаемых биологических образцах.
  7. Подготовьте буфер для обвязки и промывки следующим образом. В пробирке объемом 50 мл приготовьте 5 мМ триса, 0,5 мМ ЭДТА (динатриевая соль) и 2 М NaCl. Отрегулируйте до pH 7,5.

2. Разработка и синтез библиотеки ДНК и праймеров

  1. Разработайте исходную библиотеку ssDNA и праймеры со следующими критериями (см. Таблицу 1 для примера библиотеки ssDNA и набора праймеров, где N указывает случайное положение нуклеотидов).
    1. Убедитесь, что библиотека содержит центральную случайную область от 35 до 60 нуклеотидов, окруженную двумя постоянными последовательностями на концах 3' и 5', которые действуют как области праймера для амплификации. Типичная длина библиотеки составляет 45 случайных нуклеотидов.
    2. Убедитесь, что обратный праймер содержит модификацию биотина для отделения ssDNA от амплифицированных двухцепочечных продуктов ПЦР с использованием шариков с покрытием стрептавидина во время процесса отбора in vitro .
  2. Приобретайте олиго ДНК из коммерческих источников со стандартной обессоливающей очисткой. Очистите библиотеку ssDNA и праймеры 10%-ным денатурирующим электрофорезом полиакриламидного геля (dPAGE) с последующим осаждением этанола в соответствии со стандартными процедурами24.
    ВНИМАНИЕ: Акриламидный мономер и бромид этидия являются опасными химическими веществами (канцерогенами для человека), поэтому при выполнении PAGE используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторные халаты, перчатки и средства защиты глаз). По возможности избегайте использования бромида этидия и замените его более безопасным красителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно заказать олиго с очисткой ВЭЖХ, чтобы избежать выполнения этого этапа очистки, хотя это не приведет к столь эффективному удалению коротких олигонуклеотидов.
  3. Добавьте воду без нуклеазы для ресуспендирования ssDNA после осаждения этанола до желаемой концентрации (100 мкМ). Определяют концентрацию библиотеки ssDNA и праймеров по УФ-поглощению при λ = 260 нм. Хранить при температуре -20 °C.
  4. Приобретите немодифицированный обратный праймер для использования для высокопроизводительной подготовки библиотеки секвенирования и количественного определения кПЦР.

3. Образцы инфекционных и неинфекционных вирусов

ВНИМАНИЕ: Образцы инфекционных и неинфекционных вирусов являются образцами уровня биобезопасности 2 (BSL2), которые требуют особой осторожности для безопасного и надлежащего обращения. Все этапы процедуры, включающие эти образцы, должны выполняться в шкафу биобезопасности, или раствор вируса должен находиться в герметичном контейнере (например, в закрытых пластиковых пробирках).

  1. Получите исходный раствор инфекционных вирусов или приготовьте их, следуя соответствующему протоколу для каждого вируса. Используемые здесь псевдовирусы SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 и H5N1 были предоставлены лабораторией профессора Лицзюнь Ронга (UIC) в буфере PBS и были подготовлены в соответствии с протоколами22,25,26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для вирусов, для которых требуются средства уровня биобезопасности 3 для обработки интактного инфекционного вируса, можно работать с псевдовирусами. Псевдотипированный вирус генерируется из лентивируса (ВИЧ), который отображает поверхностные белки вируса в вирусной оболочке и, таким образом, близко имитирует поверхностный и входной механизм вируса, но имеет дефект в непрерывной репликации вируса.
  2. Приобретите неинфекционный исходный раствор вируса или приготовьте его, следуя процедуре дезинфекции. Использованный здесь материал псевдовируса SARS-CoV-2 (p-SARS-CoV-2), инактивированный ультрафиолетом, был предоставлен лабораторией профессора Ронга (UIC) в буфере PBS, а ранее описанный протокол использовался для УФ-инактивации22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, проведите анализ, чтобы проверить инфекционность вируса, чтобы убедиться, что вирус был полностью инактивирован.
  3. Количественная оценка запасов вируса
    1. Количественно определите вирус с помощью анализа бляшек в соответствии со стандартными процедурами27,28,29. Этот анализ не только позволяет количественно определить вирус, но и указывает на инфекционный статус вируса, подтверждая концентрацию инфекционного вируса.
    2. Для псевдовирусов или вирусов, для которых анализ бляшек недоступен, количественно определите вирус с помощью коммерчески доступного количественного набора ИФА лентивируса.
    3. Приготовьте 1 x 108 копий/мл исходного раствора для p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 и p-H5N1. Разделите каждый исходный раствор на аликвоты, содержащие по 50 мкл каждый, и храните при -80 ° C. Размораживайте новую аликвоту перед каждым экспериментом.

4. Отбор in vitro или процесс SELEX: начальный раунд

ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех шагов с использованием инфекционного вируса работайте в шкафу BSL2.

  1. Денатурируйте библиотеку ssDNA. Возьмите 10 мкл 100 мкМ библиотеки ssDNA (1 нмоль) и смешайте с 240 мкл буфера SELEX. Нагрейте до 95 °C в течение 15 минут в сухой ванне, а затем поместите трубку на лед на 15 минут.
  2. Инкубируйте библиотеку ssDNA с инфекционным вирусом (этап положительного отбора) следующим образом. Смешайте 250 мкл библиотеки ssDNA в буфере SELEX с шага 4.1 с 50 мкл инфекционного вируса (1 x 108 копий/мл). Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  3. Блокируйте неспецифические участки в центрифужных фильтрах следующим образом. В ожидании шага 4.2 подготовьте фильтры центрифуги к следующим шагам.
    1. Добавьте 400 мкл последовательности 1 мМ Т20 (таблица 1) к каждому центрифужному фильтру объемом 0,5 мл, который будет использоваться: один центрифужный фильтр с отсечкой 100 кДа и один с отсечкой 10 кДа.
    2. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифуге при 14 000 x g в течение 10 мин, чтобы удалить раствор Т20 из фильтра. Промойте 3 раза буфером SELEX, чтобы удалить лишние последовательности T20.
  4. Вымойте несвязанные последовательности следующим образом. Добавьте смесь, инкубированную на этапе 4.2, в заблокированный центрифужный фильтр мощностью 100 кДа и центрифугу при 14 000 x g в течение 10 мин. Промыть 3 раза, добавив 400 мкл буфера SELEX и центрифугируя при 14 000 x g в течение 10 мин. Держите фракцию в фильтре и отбрасывайте проточную.
  5. Элютные связанные последовательности, как описано ниже.
    1. На шаге 4.4 замените сборную трубку центрифужного фильтра и добавьте 300 мкл буфера SELEX, содержащего 8 М мочевины, в центрифужный фильтр. Нагрейте центрифужный фильтр при 95 °C в течение 15 мин в сухой ванне, а затем центрифугу при 14 000 x g в течение 10 мин.
    2. Соберите фракцию, которая протекала через фильтр, содержащий элюированные последовательности. Повторите еще три раза. Работайте в шкафу BSL2 и вымойте все материалы 10% отбеливателем, чтобы инактивировать вирус, прежде чем выбрасывать материалы.
  6. Сконцентрировать и обессолить следующим образом. Добавьте раствор, собранный в 4,5 кДа, в заблокированный центрифужный фильтр мощностью 10 кДа. Центрифуга при 14 000 x g в течение 15 мин. Откажитесь от фракции, которая протекала через фильтр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку вирусы сохраняются и инактивируются 8 М мочевиной в фильтре на предыдущем этапе, этот и последующие этапы не нужно выполнять в шкафу биобезопасности. Эту процедуру необходимо повторить, если используется центрифужная пробирка объемом 0,5 мл до тех пор, пока весь раствор не будет собран, как на этапе 4,5, 1,2 мл проходит через фильтр.
  7. Промыть 3 раза 300 мкл буфера SELEX для удаления мочевины центрифугированием при 14 000 x g в течение 15 минут. Откажитесь от фракции, которая протекала через фильтр. Восстановите раствор в фильтре, перевернув его вверх дном в чистой сборной трубке и центрифугируя в течение 5 минут.
  8. Измерьте конечный объем восстановленного раствора от 4,7 с помощью пипетки в пластиковой трубке. Это решение называется R i a, где i соответствует круглому числу. Как правило, получаются объемы от 30 мкл до 50 мкл. Возьмите 1 мкл элюированной ссДНК для количественного определения количества ДНК с помощью кПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это возможная точка паузы, когда образец R1может поддерживаться при -20 ° C, чтобы продолжить в другое время.
  9. Выполните ПЦР-амплификацию, как описано ниже.
    1. В первом раунде возьмите 90% образца R1в качестве шаблона ПЦР. В следующих раундах возьмите 60% от общего объема на шаге 4.8 для выполнения ПЦР и храните другую фракцию при -20 ° C.
    2. Настройте реакцию ПЦР 50 мкл со следующей концентрацией, имеющей указанную конечную концентрацию: 1x буфер реакции ПЦР, 200 мкМ dNTP, 10 мкл матрицы ДНК (R 1 образец), 200 нМ каждый праймер и1,25U-полимеразы (запас 2,5 ЕД/мкл).
    3. Оптимизируйте условия ПЦР, включая количество циклов и температуру отжига для каждого набора праймеров и библиотеки ssDNA. Избегайте использования слишком большого количества циклов, которые могут привести к образованию нежелательных субпродуктов ПЦР, таких как праймеры-димеры. Испытайте различные температуры отжига в зависимости от температуры плавления грунтовок.
    4. Запустите ПЦР с использованием оптимизированных условий при 95 ° C в течение 5 мин, а затем 18 циклов по 1 мин при 95 ° C, 30 с при 52 ° C и 1 мин при 72 ° C с заключительным этапом расширения при 72 ° C в течение 10 мин, чтобы получить пул дцДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это еще одна возможная точка паузы, когда продукт ПЦР можно хранить при -20 ° C, чтобы продолжить в другое время.
  10. Восстановите ssDNA с помощью магнитных шариков, модифицированных стрептавидином.
    1. Возьмите 80% продукта ПЦР. Оставшуюся фракцию хранить при температуре -20 °C.
    2. Разделите продукт ПЦР на аликвоты по 50 мкл и добавьте их в микрофуговые пробирки, содержащие 50 мкл магнитных шариков (МБ), модифицированных стрептавидином. Инкубировать в течение 30 минут при легком перемешивании (например, с помощью вращающегося шейкера) при комнатной температуре. Затем поместите микрофугу на магнитную стойку, чтобы изолировать MB и удалить надосадочную жидкость путем пипетки (это должно быть прозрачное решение).
    3. Промыть, добавив в тюбик 200 мкл связующего и промывочного буфера. Извлеките трубку из магнитной стойки, постучите по трубке и ресуспендируйте MB до однородного раствора с помощью пипетки. Поместите микрофугу обратно на магнитную стойку, чтобы изолировать MB и удалить надосадочную жидкость с помощью пипетки. Повторите этот этап стирки дважды.
    4. После завершения промывки ресуспендируйте MB в 100 мкл буфера SELEX и нагрейте раствор до 95 °C в течение 10 минут. Немедленно поместите трубку в магнитную стойку, прежде чем трубка остынет, и возьмите надосадочную жидкость, содержащую пул ssDNA. Повторите этот шаг восстановления, добавив 50 мкл буфера SELEX.
  11. Измерьте конечный объем восстановленной фракции от 4,10 с помощью пипетки. Эта дробь называется R i x, где i соответствует круглому числу. Как правило, получаются объемы от 140 до 150 мкл. Возьмите 1 мкл R1x, чтобы количественно определить количество ДНК с помощью кПЦР.

5. Последующие отборочные туры

  1. Денатурируйте пул ssDNA. Возьмите 60% образца R1x и смешайте с 50 мкл буфера SELEX. Нагрейте при температуре 95 °C в течение 15 минут в сухой ванне. Поместите тюбик на лед на 15 минут.
  2. Инкубируйте пул ssDNA с неинфекционным вирусом и другими потенциально мешающими вирусами (шаг контротбора). Смешайте денатурированный пул ssDNA в буфере SELEX из 5.1 с 50 мкл каждого вируса (5 x 109 копий/мл; например, неинфекционный p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 и p-H5N1). Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Блокировка неспецифических участков в центрифужных фильтрах. В ожидании шага 5.2. подготовьте центрифужные фильтры к следующим шагам. Как правило, используют два центрифужных фильтра, один с отсечкой 100 кДа, а другой с отсечкой 10 кДа. Выполните ту же процедуру, что и в 4.3.
  4. Смойте последовательности, связанные с нецелевыми вирусами. Добавьте смесь, инкубированную на этапе 5.2, в заблокированный центрифужный фильтр мощностью 100 кДа. Центрифуга при 14 000 x g в течение 10 мин и извлекает фракцию, которая проходит через центрифужный фильтр. Промыть 2 раза, добавив 100 мкл буфера SELEX и центрифугируя при 14 000 x g в течение 10 мин. Сохраняйте ту фракцию, которая протекала через фильтр.
  5. Инкубируйте пул ssDNA с инфекционным вирусом (положительный этап отбора). Возьмите 300 мкл фракции из шага 5.4 и смешайте с 50 мкл инфекционного вируса (1 x 108 копий/мл). Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре. Выполните шаги с 4.4 по 4.11.

6. Мониторинг процесса SELEX

ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля обогащения пула кПЦР используется двумя способами. Во-первых, путем абсолютной количественной оценки можно проверить обогащение бассейнов (выход элюирования). Во-вторых, путем мониторинга кривой таяния можно оценить разнообразие бассейнов (конвергенцию видов аптамеров)30.

  1. Выполните все анализы кПЦР с реакционным объемом 10 мкл в 96-луночных планшетах, предназначенных для кПЦР.
  2. Приготовьте стандартную смесь для кПЦР, содержащую 5 мкл основной смеси, 0,3 мкл 500 нМ каждого немеченого праймера, 3,4 мкл H2O и 1 мкл матрицы ДНК.
    1. Подготовьте разведения очищенной библиотеки ssDNA (шаг 2.3) для запуска стандартной кривой.
    2. Разбавьте образцы ДНК, чтобы их концентрация соответствовала стандартной кривой. Для образцов Ria добавьте 1 мкл образца без разбавления и 1 мкл разбавления 1:10 в смесь для кПЦР. Для образцов Rix включите разведения 1:10 или 1:100.
  3. Запустите qPCR, установив следующий протокол. Сначала установите начальный этап денатурации при 98 °C в течение 2 минут. Затем установите 40 циклов денатурации при 98 ° C в течение 5 с и отжиг и расширение при 52 ° C в течение 10 с. Наконец, установите анализ кривой плавления от 65 до 95 ° C. Определите значения порогового цикла (Ct) с помощью автоматизированного анализа порогов.
  4. Используя стандартную кривую, количественно определите количество ssDNA в образцах Ri a и Rix.
  5. Рассчитайте выход элюирования как количество связанной ДНК (количество молей в R i a), деленное на количество исходной ДНК (количество молей в Ri-1x). Постройте график зависимости выхода элюирования от числа раундов, чтобы увидеть, наблюдается ли обогащение в раундах.
  6. Постройте кривые плавления для разных раундов. Ожидается переход к более высоким температурам плавления на пике около 75/85 ° C по мере увеличения количества раундов. Это означает, что разнообразие бассейна уменьшается.

7. Высокопроизводительное секвенирование

  1. Проконсультируйтесь с высокопроизводительным центром секвенирования о том, какие типы секвенирования и масштабы доступны, что определит метод подготовки библиотеки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом решении будет учитываться как длина пулов, подлежащих секвенированию (включая праймеры), так и количество пулов, которые должны быть представлены (как правило, стремитесь к тому, чтобы на пул приходилось не менее 1 x 105-10 6 последовательностей). Если определенная шкала последовательности не может считывать всю длину пула, можно использовать секвенирование с парным концом для чтения с обоих концов последовательности, в отличие от одностороннего, которое считывает только с одного конца.
  2. Выберите подходящий коммерчески доступный набор в зависимости от типа секвенирования по согласованию с центром секвенирования. Подготовьте несколько пулов отборочных раундов, представляющих высокое, среднее и низкое обогащение, а также окончательный пул, используя разные пары индексов в адаптерах для каждого пула, что позволило провести выборочный анализ всех раундов с использованием одной полосы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР-амплификация также может быть использована для включения адаптеров и индексов, необходимых для высокопроизводительного секвенирования, но это, как правило, стоит аналогично коммерческим наборам и не работает лучше.
    1. Выполните подготовку библиотеки, выполнив следующие действия: прекращение репарации фрагментированной ДНК, лигирование адаптеров и амплификация ПЦР для получения окончательных библиотек.
    2. Очистите продукт ПЦР с помощью магнитных шариков для очистки ДНК, следуя инструкциям производителя.
    3. Количественно определите ДНК с помощью набора для количественного определения на основе флуоресценции. Избегайте использования менее точных методов, таких как УФ-измерения малого объема.
    4. Смешайте примерно равные количества (по количеству ДНК, а не по объему) каждой библиотеки пула, содержащей определенные индексы.
    5. Проверьте качество конечной библиотеки с помощью количественного определения кПЦР и анализатора фрагментов ДНК. Этот шаг часто выполняется центром секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Персонал центра секвенирования может предоставить полезную информацию о том, как подготовить библиотеку и какие меры контроля качества предлагаются. Перед подготовкой библиотек необходимо обсудить с ними.
  3. Отправьте подготовленную окончательную библиотеку в центр секвенирования в соответствии с их требованиями.

8. Анализ секвенирования

  1. Большая часть программного обеспечения, доступного для анализа последовательности, предназначена для запуска в командной строке в операционной системе Linux. Для небольших наборов данных настройте нужную операционную систему Linux и установите необходимые программы на персональный компьютер; для больших наборов данных HTS-анализ выполняется на высокопроизводительных вычислительных ресурсах или суперкомпьютерах (рекомендуется).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для использования высокопроизводительных вычислительных ресурсов потребуется доступ и обучение, получение которых может занять некоторое время. Кроме того, потребуются базовые знания об использовании командной строки UNIX. Многие бесплатные ресурсы по базовому использованию командной строки доступны в Интернете, и вычислительные ресурсы, вероятно, предоставят дополнительную информацию для использования их систем.
  2. Получите доступ к файлам виртуализации, обычно в сжатом формате файла FastQ, используя информацию, предоставленную средством виртуализации.
    1. Используйте FTP-клиент для передачи файлов на свой компьютер и/или высокопроизводительный вычислительный ресурс. Многие программы анализа последовательностей могут напрямую использовать сжатые файлы, поэтому держите файлы сжатыми, если это возможно, чтобы ограничить их размеры (большие последовательности, считывающие последовательности 50 M+, могут занимать 100 Гб+ файлового пространства в несжатом виде).
    2. Если файлы последовательностей необходимо распаковать, используйте функцию gzip, которая является стандартной для большинства установок Linux. Получите дополнительную информацию о gzip и его параметрах из установленного руководства, набрав «man gzip» в командной строке.
  3. Очистите последовательности перед анализом путем демультиплексирования, удаления адаптеров секвенирования, удаления считывания низкого качества и включения чтения как в прямом, так и в обратном направлении.
    1. Используйте программуFastQC 31 после каждого из следующих шагов, чтобы получить основную информацию о контроле качества последовательностей для оценки эффективности каждого этапа очистки.
    2. Демультиплексируйте последовательности, чтобы разделить все последовательности из одного файла чтения на разные пулы на основе индексов, включенных в адаптеры виртуализации. Этот шаг часто выполняется центром секвенирования, с которым следует проконсультироваться, поскольку точная процедура будет зависеть от используемой машины секвенирования.
    3. Удалите адаптеры виртуализации с помощью программы командной строки Cutadapt32. Используйте праймеры выделения (а не адаптеры виртуализации) в качестве входных данных в режиме связанного адаптера. Используйте параметр --discard-untrimmed, чтобы удалить все последовательности, не содержащие праймеры выделения.
    4. Задайте параметры максимальной частоты ошибок в соответствии с адаптерами, а также минимальную и максимальную длину принимаемых последовательностей. При использовании парного конечного чтения введите доступные параметры и укажите файлы последовательности чтения 1 и чтения 2. При необходимости установите дополнительные параметры, обратившись к руководствуCutadapt 32.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лигирование адаптеров секвенирования в пулы не зависит от направления и будет включать примерно 50% последовательностей в прямом направлении и 50% в обратном направлении. Чтобы избежать потери 50% последовательностей в обратном направлении, Cutadapt можно запустить во второй раз, используя обратное дополнение праймеров выделения в качестве входных данных.
    5. (Необязательно) Если используется парное секвенирование, объедините файлы Read 1 и Read 2 с программой PEAR33.
    6. Используйте программу34 FASTX-Toolkit для удаления некачественных последовательностей, которые имеют качество ниже определенного порога при любом нуклеотиде. Отсечка качества 30 является хорошей отправной точкой. Если общее качество в целом хорошее, этот шаг можно пропустить.
    7. Чтобы объединить файлы последовательностей в обратном направлении с файлами в прямом направлении, используйте функцию FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement для файлов обратного направления. Затем используйте встроенную программу cat (стандартную для большинства установок Linux), чтобы объединить файлы forward и reverse-supplement - reverse в один файл.
  4. Для анализа обогащения последовательностей в различных пулах выборки используйте наборинструментов анализа FASTAptamer 35.
    1. Используйте FASTAptamer-Count, чтобы подсчитать, сколько раз появляется каждая последовательность. Затем ранжируйте и сортируйте последовательности по изобилию. Выходной файл count требуется в качестве входных данных для всех других программ FASTAptamer.
    2. Используйте FASTAptamer-Clust для группировки всех последовательностей в файле в кластеры тесно связанных последовательностей. Используйте параметр «расстояние», чтобы определить количество однонуклеотидных мутаций или инделов, которые могут сгруппироваться в кластер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа FASTAptamer-Clust может быть очень вычислительно затратной, если присутствует большое количество уникальных последовательностей (особенно для ранних раундов), что может занять несколько дней или даже недель для полного завершения. Параметр фильтра отсечки можно использовать для исключения последовательностей с низкой численностью из кластеризации. Как правило, хорошо начинать с более высокого порогового значения, например, 10 или 5 чтений на миллион (RPM), и уменьшать его, если программа завершается быстро. Если пулы очень неоднородны, может оказаться невозможным сгруппировать последовательности в разумные сроки.
    3. Используйте FASTAptamer-Enrich, чтобы вычислить обогащение каждой последовательности, присутствующей более чем в одном раунде выборки. Сравните RPM последовательности из одной популяции с RPM в другой. Используйте программу Enrich для файлов Count или Cluster. На выходе получается файл с разделенными табуляцией значениями (.tsv), который можно открыть в любом программном обеспечении для работы с электронными таблицами для дальнейшего анализа и удобной сортировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа FASTAptamer-Enrich также может быть очень вычислительно затратной, если присутствует большое количество уникальных последовательностей. Параметр фильтра отсечения можно использовать для исключения последовательностей с низким содержанием из выходных данных, чтобы избежать файлов, которые слишком велики для открытия в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
    4. (Необязательно) Если многие пулы слишком разнородны (много уникальных последовательностей и мало повторяющихся последовательностей), может оказаться невозможным использовать программы Clust или Enrich. В этом случае выполните ручную проверку обогащения с помощью выходного файла Count, который сортирует последовательности по количеству (наиболее распространенный вверху) и переименовывает идентификатор последовательности, чтобы включить важную информацию, такую как RPM.
      1. Используйте стандартную программу Linux «head» для файлов Count, чтобы получить список наиболее распространенных последовательностей. Затем используйте стандартную программу Linux "grep" для поиска каждой из наиболее распространенных последовательностей в файлах Count всех других соответствующих пулов. Если есть какие-либо совпадения, используйте измененный идентификатор последовательности, чтобы определить RPM в этом пуле, чтобы вручную создать сведения о обогащении.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Сценарии для всех этапов анализа секвенирования можно найти в файлах дополнительного кодирования 1-11.

9. Валидация и анализы связывания аптамеров

  1. На основе информации об обогащении, полученной в результате анализа последовательностей, определите последовательности аптамеров-кандидатов на основе последовательностей, которые имеют наибольшее обогащение в последующих раундах отбора и/или наиболее распространенные последовательности в окончательном раунде отбора. Выберите несколько различных последовательностей-кандидатов (по крайней мере, 10-20) для дальнейшего тестирования, поскольку наиболее высокообогащенные не обязательно могут быть наиболее эффективными аптамерами.
  2. Проведите первоначальный скрининг кандидатов на аптамеры с использованием связывающего анализа, который можно быстро выполнить для нескольких образцов. Ультрафильтрационный связывающий анализ36 на основе колонки или связанный с ферментом олигонуклеотидный анализ (ELONA) являются хорошими методами для этого первоначального скрининга.
  3. Проанализируйте специфичность и аффинность последовательностей, которые показывают наилучшую связывающую активность при первоначальном скрининге, используя, по крайней мере, два независимых анализа связывания (например, микромасштабный термофорез (MST)37,38, ферментно-связанный олигонуклеотидный анализ (ELONA)39, поверхностный плазмонный резонанс 40 или биослойная интерферометрия (BLI)41).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Поскольку ДНК-аптамеры могут быть получены с использованием SELEX в пробирке15, эта стратегия SELEX была тщательно разработана, чтобы включить как положительные этапы отбора к интактному, цельному инфекционному вирусу (т.е. сохранить молекулы ДНК, которые связываются с инфекционным вирусом), так и этапы встречного отбора для того же вируса, который был сделан неинфекционным с помощью конкретного метода дезинфекции. в частности, УФ-обработка, путем отказа от последовательностей ДНК, которые могут связываться с неинфекционным вирусом. Схематическое изображение процесса выбора показано на рисунке 1.

В качестве репрезентативных результатов этого протокола мы выбрали подбор аптамера для инфекционного SARS-CoV-2. Из-за требования условий работы уровня биобезопасности 3 (BSL3) для работы с интактным инфекционным SARS-CoV-2 мы решили вместо этого работать с псевдотипированным вирусом. Псевдотипированные вирусы генерируются из относительно безвредного системного вируса, в данном случае типа лентивируса (ВИЧ), который был модифицирован для отображения поверхностного белка другого интересующего вируса в его вирусной оболочке, что позволяет ему точно имитировать поверхность и механизм проникновения желаемого вируса без рисков, связанных с работой с опасными патогенами человека. Важно отметить, что эти псевдовирусы модифицируются, чтобы быть дефектными в непрерывной репликации вируса25,42. В этой работе использовались три различных псевдотипированных вируса: p-SARS-CoV-2, где белки-шипы (S) SARS-CoV-2 включены в оболочку; p-SARS-CoV-1, содержащий спайковый (S) белок SARS-CoV-1; и p-H5N1, содержащий гемагглютинин и нейраминидазу, выделенные из высокопатогенного штамма вируса птичьего гриппа A/Goose/Qinghai/59/05 (H5N1).

В первых двух раундах отбора не был включен этап контротбора, чтобы свести к минимуму неспецифическое удаление ДНК-связывающих веществ, которые обычно присутствуют только в виде единичных копий в начальных раундах. После первых двух раундов в каждый раунд были включены положительные и встречные этапы отбора для достижения высокой селективности. Для контротбора использовали p-SARS-CoV-2, который стал неинфекционным с помощью УФ-обработки, а также p-SARS-CoV-1 и p-H5N1 для получения селективности против других вирусов.

Для контроля за ходом селекции использовали количественную полимеразную цепную реакцию (кПЦР). Этот метод представляет собой простой метод, который не требует маркировки пула и может быть применен практически к любой цели30. Он использует две особенности метода кПЦР. Во-первых, возможность абсолютного количественного определения с использованием стандартной кривой для расчета выхода элюирования, определяемого ssDNA, связанной с инфекционным вирусом, по сравнению с общей добавленной ssDNA. Наши результаты показали, что выход элюирования первоначально увеличивался с каждым ранним раундом SELEX и выравнивался в раундах 8 и 9 (R8 и R9), что свидетельствует об обогащении пулов последовательностями, которые связываются с инфекционным вирусом (рис. 2A). Во-вторых, кривые плавления каждого раунда пула ДНК являются еще одним доказательством разнообразия последовательностей пулов30. Сравнивая кривые плавления, можно наблюдать сдвиг от пика при высокой температуре плавления (T m) с 77 ° C до 79 ° C, что позволяет предположить, что пул ДНК сходился от случайных последовательностей с низким T m к более консервативным последовательностям с более высоким Tm (рис. 2B). Более того, в последних раундах (R8 и R9) появляется пик при низкомTm (~70 °C). Это может быть связано с получением праймеров-димеров во время ПЦР. Одним из возможных решений, позволяющих избежать этого, является сокращение количества циклов во время ПЦР (например, с 18 циклов до 12 или 15 циклов).

После подтверждения обогащения пула с помощью кПЦР мы использовали высокопроизводительное секвенирование (HTS) для раундов 3, 5, 7, 8 и 9 SELEX, чтобы выяснить, какие последовательности отвечают за связывание вирусной мишени. По сравнению с традиционными процедурами клонирования-секвенирования, HTS позволяет отслеживать эволюцию отдельных последовательностей в течение нескольких раундов выборки, чтобы, наконец, идентифицировать последовательности аптамеров, которые обогащаются в последующих раундах. На рисунке 3A показано относительное содержание (в чтениях на миллион) последовательности SARS2-AR10, полученное в ходе последовательных раундов отбора. Вторичная структура SARS2-AR10 предсказывается программным обеспечением Mfold, и результаты (рис. 3B) показывают структурированную вторичную структуру, которая содержит область стволовой петли, которая может быть вовлечена в распознавание вируса. Дальнейшая характеристика аффинного связывания этой последовательности была сообщена ранее22. Микромасштабный термофорез (MST) и ферментно-связанный олигонуклеотидный анализ (ELONA) продемонстрировали, что аптамер SARS2-AR10 связывается с инфекционным p-SARS-CoV-2 с Kd = 79 ± 28 нМ и не связывается с неинфекционным p-SARS-CoV-2 или с другими коронавирусами, такими как p-SARS-CoV-1 и 229E.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение процесса APTAMERS SELEX, отличающего инфекционные вирусы от неинфекционных. Положительные и встречные этапы отбора добавлялись в каждом раунде после второго раунда для достижения высокой специфичности по отношению к инфекционному вирусу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Мониторинг прогресса SELEX инфекционных SARS-CoV-2-специфических аптамеров. (A) Количественная оценка выхода элюирования (т.е. связанной ссДНК поверх добавленной ссДНК) для каждого раунда SELEX с использованием кПЦР. (B) Кривая плавления для различных пулов во время выбора аптамера SARS-CoV-2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Обогащение и вторичная структура аптамера SARS2-AR10. Количество считываний на миллион (RPM), полученное при анализе данных HTS для последовательности SARS2-AR10 в зависимости от раундов отбора с использованием FASTAptamer-Count. Вставка: Прогнозируемая наиболее стабильная вторичная структура последовательности SARS2-AR10 на основе программного обеспечения UNAFold. Расчеты проводились при 25 °C, 100 мМ NaCl и 2 мМ MgCl2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Имя Последовательность ДНК (от 5′ до 3′)
Т20 ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ
Библиотека ДНК ACCGTCAGTTACAATGCT- N45 -GGCTGGACTATCTGTGTA
Передний праймер (FwdP) ACCGTCAGTTACAATGCT
Обратный праймер (RevP) Biot-TACACAGATAGTCCAGCC
САРС-АР10 CCCACCAGCCACCATCAGCAACTCTTCCGCGTCCATCCCTGCTG
N: представляют собой случайный нуклеотид; Biot: Модификация биотина в 5'энде.

Таблица 1: Список последовательностей ДНК.

Дополнительный файл кодирования 1: Cutadapt_script.txt идентифицирует все последовательности в данном входном файле, которые имеют указанные прямые и обратные праймеры, отбрасывает те, у которых нет праймеров, и удаляет праймеры из последовательностей, в которых они были. Дополнительную информацию о Cutadapt см. в ссылке31 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 2: FASTAptamer_cluster_script.txt сгруппируем все последовательности из одного файла счетчика в семейства/кластеры тесно связанных/похожих последовательностей. Это полезно, если идентифицирована последовательность-кандидат, так что другие подобные последовательности в том же кластере также могут быть идентифицированы как потенциальные кандидаты. Дополнительную информацию о FASTAptamer см. в ссылке34 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 3: FASTAptamer_count_script.txt подсчитывает количество вхождений каждой уникальной последовательности из заданного входного файла FASTA/FASTQ и создает выходной файл каждой уникальной последовательности в порядке убывания (от наибольшей численности к наименьшей численности). Выходные файлы Count необходимы в качестве входных данных для всех других программ FASTAptamer. Дополнительную информацию о FASTAptamer см. в ссылке34 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 4: FASTAptamer_enrich_script.txt сравнивает все последовательности из любых двух или трех входных файлов, дает обилие всех уникальных последовательностей между всеми файлами и дает все комбинации значений попарного обогащения (в RPM) всех последовательностей, найденных в нескольких файлах. Дополнительную информацию о FASTAptamer см. в ссылке34 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 5: fastqc_script.txt — это инструмент контроля качества для файлов FastQ, который предоставляет легко читаемую информацию о качестве данных высокопроизводительного секвенирования, такую как уровни дублирования, продолжительность чтения и показатели качества. Дополнительную информацию о FastQC см. в ссылке30 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 6: FASTX_fwd_rev_merge_script.txt использует FASTX-Toolkit для вывода обратного дополнения всех последовательностей из заданного обратного файла. Затем он использует команду cat (стандартную в большинстве операционных систем UNIX) для объединения этого обратного файла обратного дополнения с заданным прямым файлом последовательностей, чтобы получить один файл со всеми последовательностями. Дополнительную информацию о FASTX-Toolkit см. в ссылке33 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 7: FASTX_quality_filter_script.txt использует FASTX-Toolkit для проверки качества последовательностей в данном файле FastQ и может отбрасывать любые последовательности низкого качества. Этот метод, как правило, лучше, чем обрезные методы фильтрации качества для анализа последовательностей отбора in vitro . Обрезка включает в себя удаление оснований (обычно около концов) последовательностей на основе низкого качества, что приемлемо для геномного секвенирования, но поскольку вся последовательность необходима для функциональной ДНК, обрезка концов бесполезна. Вместо этого, если слишком много оснований последовательности имеют низкое качество, вся последовательность отбрасывается. Дополнительную информацию о FASTX-Toolkit см. в ссылке33 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 8: grep_searcher_script.txt используется для поиска определенной входной последовательности в определенном входном файле и вывода как идентификатора, так и последовательности в выходном файле (если он был найден во входе). Этот скрипт полезен для пулов, которые очень неоднородны (т. е. имеют много уникальных последовательностей), из-за чего FASTAptamer Clust работает слишком долго и приводит к тому, что файлы FASTAptamer Enrich слишком велики для открытия в типичных программах для работы с электронными таблицами для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 9: gzip_compress_decompress_script.txt использует Gzip для сжатия или распаковки файлов. Сжатый файл обычно имеет расширение .gz, добавленное к имени файла. Рекомендуется сжимать большие файлы, чтобы сэкономить место на файле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 10: PEAR_script.txt используется только для файлов парной последовательности и объединяет файл Read 1 с соответствующим файлом Read 2. Дополнительную информацию о PEAR см. в ссылке32 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 11: tar_extraction_creation_script.txt будет извлекать или создавать архивы Tar, которые используются для сопоставления нескольких файлов и/или каталогов в один файл. Они также часто сжимаются для уменьшения размера файла, например, при сжатии bz2, как указано в этом сценарии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SELEX позволяет не только идентифицировать аптамеры с высоким сродством, в диапазоне pM-nM 22,43,44,45, но и с высокой и перестраиваемой селективностью. Воспользовавшись встречным отбором, можно получить аптамеров со сложной селективностью. Например, группа Ли продемонстрировала способность получать последовательности, которые могут дифференцировать патогенные бактериальные штаммы от непатогенных штаммов21. Кроме того, Le et al. идентифицировали аптамер, способный дифференцировать серотипы бактерий Streptococcus pyogenes 46. Это открывает возможность интеграции молекул аптамеров с уникальной селективностью в различных функциональных сенсорахДНК 12,47,48,49,50 с новыми нанотехнологиями 22,51,52 для создания датчиков для различных применений, таких как портативные и быстрые диагностические тесты или для обнаружения окружающей среды.

Представленный здесь протокол позволяет получать аптамеры с высокой селективностью для инфекционного вируса по сравнению с тем же вирусом, который был инактивирован и, таким образом, является неинфекционным. Для получения такой селективности подход SELEX в данной работе основан на проектировании шага выбора счетчика. Во-первых, для успешного этапа встречного отбора необходимо выполнить правильный выбор и характеристику нецелевых образцов. Таким образом, этот метод зависит от начала работы с хорошо известными инфекционными и неинфекционными интактными вирусными запасами. Во-вторых, этап встречного отбора включается в каждый раунд отбора после первого раунда, чтобы применить строгие условия с самого начала отбора и максимизировать вероятность идентификации аптамеров, которые могут отличить незначительные различия на поверхности вирусной частицы от инфекционного и неинфекционного состояния одного и того же вируса.

В этом протоколе основное внимание уделяется селективности аптамера. Если требуется более сильное сродство с аптамерами, можно увеличить строгость процесса после определенных раундов SELEX. Например, уменьшая концентрацию инфекционного вируса и время инкубации во время положительной селекции, можно получить аптамеры с более сильным сродством к связыванию44.

Еще одним важным соображением при разработке протокола SELEX является окончательный образец, в котором будет применяться аптамер. Аптамеры, специфичные для вирусов, обычно включаются в сложные образцы (например, сыворотку, слюну и образцы реальной воды), и это необходимо учитывать при выборе аптамера, чтобы увеличить вероятность получения функциональных аптамеров в окончательных образцах. Поэтому важно проводить SELEX в буфере, который точно имитирует эти образцы, особенно в отношении концентрации катионов и рН. Например, для аптамера SARS-CoV-2 мы выбрали буфер PBS (pH 7,4), содержащий 2 мМ MgCl2и 0,5 мМ CaCl2, чтобы точно имитировать биологические образцы. Кроме того, если другие виды в образцах, где будет применяться аптамер, могут потенциально конкурировать с мишенью за связывание аптамера, можно свести к минимуму помехи от этих видов, включив их в стадию встречного отбора, чтобы исключить последовательности, которые могли бы связывать эти виды.

Успешные результаты этого процессаSELEX 22, который был применен к различным вирусам (аденовирус и SARS-CoV-2) и различным методам инактивации (УФ-обработка и свободный хлор), указывают на то, что этот метод может быть широко применен для других вирусов и других методов инактивации, открывая широкий спектр применений в будущем. Аптамеры, которые различают инфекционные вирусы, имеют потенциал не только в диагностических приложениях для выявления пациентов, которые все еще заразны, но и в приложениях окружающей среды, где образец определяется как загрязненный, если патогены в этих образцах все еще активны. Таким образом, включение аптамеров, способных идентифицировать инфекционные вирусы, в экспресс-датчики открывает возможности для мониторинга дезинфицирующих процедур.

Кроме того, можно было дифференцировать инфекционный статус вируса без какой-либо информации о структурных различиях между двумя состояниями инфекционности. Единственная информация, которая требуется, это знать, что различия между обоими состояниями связаны с различиями в структуре молекул на поверхности интактных вирусных частиц. Таким образом, мы уверены, что один и тот же подход может быть использован для дифференциации вариантов и серотипов одного и того же вируса, где различия обусловлены небольшими мутациями в остатках белков на поверхности вирусных частиц, аналогичными тем, которые дифференцируют инфекционный статус вируса. Например, мы предполагаем, что можно будет получить аптамеры, специфичные для вызывающих беспокойство вариантов SARS-CoV-2 или других вирусов, таких как грипп, что откроет возможность быстрого мониторинга вариантов, которые представляют наибольшую угрозу для общества.

Наконец, поскольку стратегия SELEX по получению аптамеров, которые могут дифференцировать инфекционные вирусы от неинфекционных, не требует каких-либо предварительных знаний о том, какие конкретные структурные различия присутствуют между ними, можно использовать аптамеры с этой селективностью для идентификации специфических поверхностных изменений, ответственных за потерю инфекционности от различных методов дезинфекции, путем детальной характеристики и идентификации мишеней связывания наших аптамеров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить г-жу Лауру М. Купер и д-ра Лицзюнь Ронга из Иллинойского университета в Чикаго за предоставление образцов псевдовируса, используемых в этом протоколе (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), а также д-ра Альваро Эрнандеса и д-ра Криса Райта из Центра ДНК-услуг Биотехнологического центра Роя Дж. и многие члены группы Lu, которые помогли нам с селекцией in vitro и методами характеристики аптамеров. Эта работа была поддержана грантом RAPID от Национального научного фонда (CBET 20-29215) и начальным грантом от Института устойчивого развития, энергетики и окружающей среды Университета Иллинойса в Урбана-Шампейн и Института Иллинойс-JITRI (JITRI 23965). A.S.P. благодарит Латиноамериканское братство PEW за финансовую поддержку. Мы также благодарим Фонд Роберта А. Уэлча (грант F-0020) за поддержку исследовательской программы группы Лу в Техасском университете в Остине.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678 (2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230 (2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070 (2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334 (2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966 (2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Tags

Биоинженерия выпуск 187 отбор in vitro аптамер статус вирусной инфекционности контротбор интактный вирус
Отбор аптамеров in vitro для дифференциации инфекционных вирусов от неинфекционных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., … More

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter