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Summary

Forniamo un protocollo che può essere generalmente applicato a selezionare aptameri che si legano solo a virus infettivi e non a virus che sono stati resi non infettivi da un metodo di disinfezione o ad altri virus simili. Ciò apre la possibilità di determinare lo stato di infettività nei test portatili e rapidi.

Abstract

Le infezioni virali hanno un impatto importante sulla società; La maggior parte dei metodi di rilevamento ha difficoltà a determinare se un virus rilevato è infettivo, causando ritardi nel trattamento e ulteriore diffusione del virus. Lo sviluppo di nuovi sensori in grado di informare sull’infettività dei campioni clinici o ambientali soddisferà questa sfida insoddisfatta. Tuttavia, pochissimi metodi possono ottenere molecole sensibili in grado di riconoscere un virus infettivo intatto e differenziarlo dallo stesso virus che è stato reso non infettivo dai metodi di disinfezione. Qui, descriviamo un protocollo per selezionare gli aptameri in grado di distinguere i virus infettivi dai virus non infettivi utilizzando l’evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX). Sfruttiamo due caratteristiche di SELEX. In primo luogo, SELEX può essere personalizzato per rimuovere bersagli concorrenti, come virus non infettivi o altri virus simili, utilizzando la selezione dei contatori. Inoltre, l’intero virus può essere utilizzato come bersaglio per SELEX, anziché, ad esempio, di una proteina virale di superficie. L’intero virus SELEX consente la selezione di aptameri che si legano specificamente allo stato nativo del virus, senza la necessità di interrompere il virus. Questo metodo consente quindi di ottenere agenti di riconoscimento sulla base di differenze funzionali nella superficie dei patogeni, che non devono essere conosciute in anticipo.

Introduction

Le infezioni da virus hanno enormi impatti economici e sociali in tutto il mondo, come è diventato sempre più evidente dalla recente pandemia di COVID-19. Una diagnosi tempestiva e accurata è fondamentale nel trattamento delle infezioni virali e nella prevenzione della diffusione di virus a persone sane. Mentre sono stati sviluppati molti metodi di rilevamento dei virus, come i test PCR^1,2 e i saggi inmunoassays^3, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati non sono in grado di determinare se il virus rilevato è effettivamente infettivo o meno. Questo perché la presenza di componenti del virus da solo, come l’acido nucleico virale o le proteine, non indica che il virus infettivo intatto sia presente e i livelli di questi biomarcatori hanno mostrato una scarsa correlazione con l’infettività ^4,5,6. Ad esempio, l’RNA virale, comunemente usato per gli attuali test COVID-19 basati sulla PCR, ha livelli molto bassi nelle prime fasi dell’infezione quando il paziente è contagioso, mentre il livello di RNA è spesso ancora molto alto quando i pazienti sono guariti dall’infezione e non sono più contagiosi ^7,8. I biomarcatori della proteina virale o dell’antigene seguono una tendenza simile, ma in genere appaiono anche più tardi dell’RNA virale e quindi sono ancora meno predittivi di infettività ^6,9. Per ovviare a questa limitazione, sono stati sviluppati alcuni metodi che possono informare sullo stato di infettività del virus, ma si basano su tecniche di microbiologia di coltura cellulare che richiedono molto tempo (giorni o settimane) per ottenere risultati ^4,10. Pertanto, lo sviluppo di nuovi sensori in grado di informare sull’infettività dei campioni clinici o ambientali può evitare ritardi nel trattamento e un’ulteriore diffusione del virus. Tuttavia, pochissimi metodi possono ottenere molecole di rilevamento in grado di riconoscere un virione infettivo intatto e differenziarlo dallo stesso virus che è stato reso non infettivo.

In questo contesto, gli aptameri sono particolarmente adatti come strumento biomolecolare unico^11,12,13,14. Gli aptameri sono molecole corte di DNA o RNA a singolo filamento con una specifica sequenza nucleotidica che consente loro di formare una specifica conformazione 3D per riconoscere un bersaglio con elevata affinità e selettività^15,16. Sono ottenuti mediante un processo di selezione combinatoria chiamato evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX), noto anche come selezione in vitro, che viene effettuato in provette con una grande libreria di campionamento casuale del DNA di 10 14-10¹⁵ sequenze^17,18,19. In ogni ciclo di questo processo iterativo, il pool di DNA viene prima sottoposto a una pressione di selezione attraverso l’incubazione con il bersaglio nelle condizioni desiderate. Tutte le sequenze che non sono legate al bersaglio vengono quindi rimosse, lasciando dietro di sé solo quelle poche sequenze che sono in grado di legarsi nelle condizioni date. Infine, le sequenze che sono state selezionate nella fase precedente vengono amplificate dalla PCR, arricchendo la popolazione del pool con le sequenze funzionali desiderate per il prossimo round di selezione, e il processo viene ripetuto. Quando l’attività del pool di selezione raggiunge un plateau (tipicamente dopo 8-15 round), la biblioteca viene analizzata mediante sequenziamento del DNA per identificare le sequenze vincenti che mostrano la massima affinità.

SELEX ha vantaggi unici che possono essere sfruttati per ottenere una maggiore selettività contro altri bersagli simili^20,21, come ad esempio per lo stato di infettività del virus ²². In primo luogo, un’ampia varietà di diversi tipi di bersagli può essere utilizzata per la selezione, da piccole molecole e proteine a interi patogeni e cellule¹⁶. Pertanto, per ottenere un aptamero che si lega a un virus infettivo, un virus intatto può essere utilizzato come bersaglio, invece di una proteina di superficie virale¹⁹. L’intero virus SELEX consente la selezione di aptameri che si legano specificamente allo stato nativo del virus, senza la necessità di interrompere il virus. In secondo luogo, SELEX può essere personalizzato per rimuovere bersagli concorrenti 21,23, come altri virus simili o virus inattivati non infettivi^, utilizzando fasi di selezione del contatore in ogni round di selezione²². Durante le fasi di selezione del contatore, il pool di DNA viene esposto a bersagli per i quali non è desiderato il legame e tutte le sequenze che si legano vengono scartate.

In questo lavoro, forniamo un protocollo che può essere generalmente applicato per selezionare gli aptameri che si legano a un virus infettivo ma non allo stesso virus che è stato reso non infettivo da un particolare metodo di disinfezione o da un altro virus correlato. Questo metodo consente di ottenere agenti di riconoscimento in base alle differenze funzionali della superficie del virus, che non devono essere conosciute in anticipo, e offre quindi un ulteriore vantaggio per l’individuazione di agenti patogeni di recente emersione o per malattie poco studiate.

Protocol

1. Preparazione di reagenti e tamponi Preparare 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) aggiungendo 0,9 M Tris-base, 0,9 M acido borico, 20 mM EDTA (sale disodico) e acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L. Mescolare fino a quando tutti i componenti sono sciolti. Preparare una soluzione madre di poliacrilammide denaturante al 10% come segue. In una bottiglia di vetro da 250 ml, aggiungere 120 g di urea (8 M), 25 ml di 10x TBE, 62,5 ml di soluzione al 40% di acrilammide/bisacrilammide (29:…

Representative Results

Poiché gli aptameri del DNA possono essere ottenuti utilizzando SELEX in una provetta15, questa strategia SELEX è stata attentamente progettata per includere sia le fasi di selezione positiva verso il virus infettivo intatto e intero (cioè, mantenere le molecole di DNA che si legano al virus infettivo), sia le fasi di controselezione per lo stesso virus che è stato reso non infettivo da un particolare metodo di disinfezione, in particolare il trattamento UV, scartando le sequenze di DNA che p…

Discussion

SELEX permette non solo l’identificazione di aptameri ad alta affinità, nell’intervallo pM-nM 22,43,44,45^, ma anche con selettività elevata e sintonizzabile. Sfruttando la controselezione, è possibile ottenere aptameri con selettività impegnativa. Ad esempio, il gruppo Li ha dimostrato la capacità di ottenere sequenze in grado di differenziare i ceppi batterici patogeni dai ceppi non pato…

Materials

10% Ammonium persulfate (APS)	BioRad	1610700
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
1x PBS without calcium & magnesium	Corning	21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution	BioRad	1610146
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC501024	cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC510024	cut-off 100 kDa
Boric Acid	Sigma-Aldrich	100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module	BioRad	1851148
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters	Thermo Scientific	88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Thermo Fisher	65001	streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt	Sigma-Aldrich	324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661	1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit	Takara Bio USA, Inc.	632200	Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube	Thermo Scientific	MR02
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	BioRad	MSB1001	non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels	BioRad	1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates	BioRad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers	BioRad	1653310
Molecular Biology Grade Water	Lonza	51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear	BioRad	MLP9611
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase	New England BioLab	M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI	Tecan	0344NB-A01	High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL)	Gilson	F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets	Labconco	4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32850	fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)	Thomas Scientific	1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002440
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	1725201	qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8	USA scientific	AB1183	PCR tubes
Urea	Sigma-Aldrich	U5128