Summary

Selezione in vitro di aptameri per differenziare i virus infettivi da quelli non infettivi

Published: September 07, 2022
doi:

Summary

Forniamo un protocollo che può essere generalmente applicato a selezionare aptameri che si legano solo a virus infettivi e non a virus che sono stati resi non infettivi da un metodo di disinfezione o ad altri virus simili. Ciò apre la possibilità di determinare lo stato di infettività nei test portatili e rapidi.

Abstract

Le infezioni virali hanno un impatto importante sulla società; La maggior parte dei metodi di rilevamento ha difficoltà a determinare se un virus rilevato è infettivo, causando ritardi nel trattamento e ulteriore diffusione del virus. Lo sviluppo di nuovi sensori in grado di informare sull’infettività dei campioni clinici o ambientali soddisferà questa sfida insoddisfatta. Tuttavia, pochissimi metodi possono ottenere molecole sensibili in grado di riconoscere un virus infettivo intatto e differenziarlo dallo stesso virus che è stato reso non infettivo dai metodi di disinfezione. Qui, descriviamo un protocollo per selezionare gli aptameri in grado di distinguere i virus infettivi dai virus non infettivi utilizzando l’evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX). Sfruttiamo due caratteristiche di SELEX. In primo luogo, SELEX può essere personalizzato per rimuovere bersagli concorrenti, come virus non infettivi o altri virus simili, utilizzando la selezione dei contatori. Inoltre, l’intero virus può essere utilizzato come bersaglio per SELEX, anziché, ad esempio, di una proteina virale di superficie. L’intero virus SELEX consente la selezione di aptameri che si legano specificamente allo stato nativo del virus, senza la necessità di interrompere il virus. Questo metodo consente quindi di ottenere agenti di riconoscimento sulla base di differenze funzionali nella superficie dei patogeni, che non devono essere conosciute in anticipo.

Introduction

Le infezioni da virus hanno enormi impatti economici e sociali in tutto il mondo, come è diventato sempre più evidente dalla recente pandemia di COVID-19. Una diagnosi tempestiva e accurata è fondamentale nel trattamento delle infezioni virali e nella prevenzione della diffusione di virus a persone sane. Mentre sono stati sviluppati molti metodi di rilevamento dei virus, come i test PCR1,2 e i saggi inmunoassays3, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati non sono in grado di determinare se il virus rilevato è effettivamente infettivo o meno. Questo perché la presenza di componenti del virus da solo, come l’acido nucleico virale o le proteine, non indica che il virus infettivo intatto sia presente e i livelli di questi biomarcatori hanno mostrato una scarsa correlazione con l’infettività 4,5,6. Ad esempio, l’RNA virale, comunemente usato per gli attuali test COVID-19 basati sulla PCR, ha livelli molto bassi nelle prime fasi dell’infezione quando il paziente è contagioso, mentre il livello di RNA è spesso ancora molto alto quando i pazienti sono guariti dall’infezione e non sono più contagiosi 7,8. I biomarcatori della proteina virale o dell’antigene seguono una tendenza simile, ma in genere appaiono anche più tardi dell’RNA virale e quindi sono ancora meno predittivi di infettività 6,9. Per ovviare a questa limitazione, sono stati sviluppati alcuni metodi che possono informare sullo stato di infettività del virus, ma si basano su tecniche di microbiologia di coltura cellulare che richiedono molto tempo (giorni o settimane) per ottenere risultati 4,10. Pertanto, lo sviluppo di nuovi sensori in grado di informare sull’infettività dei campioni clinici o ambientali può evitare ritardi nel trattamento e un’ulteriore diffusione del virus. Tuttavia, pochissimi metodi possono ottenere molecole di rilevamento in grado di riconoscere un virione infettivo intatto e differenziarlo dallo stesso virus che è stato reso non infettivo.

In questo contesto, gli aptameri sono particolarmente adatti come strumento biomolecolare unico11,12,13,14. Gli aptameri sono molecole corte di DNA o RNA a singolo filamento con una specifica sequenza nucleotidica che consente loro di formare una specifica conformazione 3D per riconoscere un bersaglio con elevata affinità e selettività15,16. Sono ottenuti mediante un processo di selezione combinatoria chiamato evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX), noto anche come selezione in vitro, che viene effettuato in provette con una grande libreria di campionamento casuale del DNA di 10 14-1015 sequenze17,18,19. In ogni ciclo di questo processo iterativo, il pool di DNA viene prima sottoposto a una pressione di selezione attraverso l’incubazione con il bersaglio nelle condizioni desiderate. Tutte le sequenze che non sono legate al bersaglio vengono quindi rimosse, lasciando dietro di sé solo quelle poche sequenze che sono in grado di legarsi nelle condizioni date. Infine, le sequenze che sono state selezionate nella fase precedente vengono amplificate dalla PCR, arricchendo la popolazione del pool con le sequenze funzionali desiderate per il prossimo round di selezione, e il processo viene ripetuto. Quando l’attività del pool di selezione raggiunge un plateau (tipicamente dopo 8-15 round), la biblioteca viene analizzata mediante sequenziamento del DNA per identificare le sequenze vincenti che mostrano la massima affinità.

SELEX ha vantaggi unici che possono essere sfruttati per ottenere una maggiore selettività contro altri bersagli simili20,21, come ad esempio per lo stato di infettività del virus 22. In primo luogo, un’ampia varietà di diversi tipi di bersagli può essere utilizzata per la selezione, da piccole molecole e proteine a interi patogeni e cellule16. Pertanto, per ottenere un aptamero che si lega a un virus infettivo, un virus intatto può essere utilizzato come bersaglio, invece di una proteina di superficie virale19. L’intero virus SELEX consente la selezione di aptameri che si legano specificamente allo stato nativo del virus, senza la necessità di interrompere il virus. In secondo luogo, SELEX può essere personalizzato per rimuovere bersagli concorrenti 21,23, come altri virus simili o virus inattivati non infettivi, utilizzando fasi di selezione del contatore in ogni round di selezione22. Durante le fasi di selezione del contatore, il pool di DNA viene esposto a bersagli per i quali non è desiderato il legame e tutte le sequenze che si legano vengono scartate.

In questo lavoro, forniamo un protocollo che può essere generalmente applicato per selezionare gli aptameri che si legano a un virus infettivo ma non allo stesso virus che è stato reso non infettivo da un particolare metodo di disinfezione o da un altro virus correlato. Questo metodo consente di ottenere agenti di riconoscimento in base alle differenze funzionali della superficie del virus, che non devono essere conosciute in anticipo, e offre quindi un ulteriore vantaggio per l’individuazione di agenti patogeni di recente emersione o per malattie poco studiate.

Protocol

1. Preparazione di reagenti e tamponi Preparare 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) aggiungendo 0,9 M Tris-base, 0,9 M acido borico, 20 mM EDTA (sale disodico) e acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L. Mescolare fino a quando tutti i componenti sono sciolti. Preparare una soluzione madre di poliacrilammide denaturante al 10% come segue. In una bottiglia di vetro da 250 ml, aggiungere 120 g di urea (8 M), 25 ml di 10x TBE, 62,5 ml di soluzione al 40% di acrilammide/bisacrilammide (29:…

Representative Results

Poiché gli aptameri del DNA possono essere ottenuti utilizzando SELEX in una provetta15, questa strategia SELEX è stata attentamente progettata per includere sia le fasi di selezione positiva verso il virus infettivo intatto e intero (cioè, mantenere le molecole di DNA che si legano al virus infettivo), sia le fasi di controselezione per lo stesso virus che è stato reso non infettivo da un particolare metodo di disinfezione, in particolare il trattamento UV, scartando le sequenze di DNA che p…

Discussion

SELEX permette non solo l’identificazione di aptameri ad alta affinità, nell’intervallo pM-nM 22,43,44,45, ma anche con selettività elevata e sintonizzabile. Sfruttando la controselezione, è possibile ottenere aptameri con selettività impegnativa. Ad esempio, il gruppo Li ha dimostrato la capacità di ottenere sequenze in grado di differenziare i ceppi batterici patogeni dai ceppi non pato…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Desideriamo ringraziare la Sig.ra Laura M. Cooper e il Dr. Lijun Rong dell’Università dell’Illinois a Chicago per aver fornito i campioni di pseudovirus utilizzati in questo protocollo (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), così come il Dr. Alvaro Hernandez e il Dr. Chris Wright della struttura DNA Services del Roy J. Carver Biotechnology Center presso l’Università dell’Illinois a Urbana-Champaign per la loro assistenza con il sequenziamento ad alto rendimento, e molti membri del gruppo Lu che ci hanno aiutato con la selezione in vitro e le tecniche di caratterizzazione degli aptameri . Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione RAPID della National Science Foundation (CBET 20-29215) e da una sovvenzione seed dell’Istituto per la sostenibilità, l’energia e l’ambiente presso l’Università dell’Illinois a Urbana-Champaign e l’Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. ringrazia la PEW Latin American Fellowship per il sostegno finanziario. Ringraziamo anche la Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) per il sostegno al programma di ricerca del gruppo Lu presso l’Università del Texas ad Austin.

Materials

10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128

References

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA – Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -. F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678 (2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. . Babraham bioinformatics – FastQC a quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022)
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230 (2015).
  35. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  36. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070 (2017).
  37. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  38. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334 (2018).
  39. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  40. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  41. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  42. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  43. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  44. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  45. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  46. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  47. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  48. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  49. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  50. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966 (2022).
  51. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

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Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).

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