Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro-udvælgelse af aptamerer til differentiering af infektiøse fra ikke-infektiøse vira

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin
* These authors contributed equally

Summary

Vi leverer en protokol, der generelt kan anvendes til udvalgte aptamerer, der kun binder til infektiøse vira og ikke til vira, der er gjort ikke-infektiøse ved en desinfektionsmetode eller til andre lignende vira. Dette åbner mulighed for at bestemme smittestatus i bærbare og hurtige test.

Abstract

Virusinfektioner har stor indvirkning på samfundet; De fleste metoder til påvisning har svært ved at afgøre, om en påvist virus er smitsom, hvilket forårsager forsinkelser i behandlingen og yderligere spredning af virussen. Udvikling af nye sensorer, der kan informere om inficerbarheden af kliniske eller miljømæssige prøver, vil imødekomme denne uopfyldte udfordring. Imidlertid kan meget få metoder opnå sensormolekyler, der kan genkende en intakt infektiøs virus og differentiere den fra den samme virus, der er gjort ikke-infektiøs ved desinfektionsmetoder. Her beskriver vi en protokol til udvælgelse af aptamerer, der kan skelne infektiøse vira vs ikke-infektiøse vira ved hjælp af systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX). Vi drager fordel af to funktioner i SELEX. For det første kan SELEX skræddersys til at fjerne konkurrerende mål, såsom ikke-infektiøse vira eller andre lignende vira, ved hjælp af modvalg. Derudover kan hele virussen bruges som mål for SELEX, i stedet for for eksempel et viralt overfladeprotein. Hele virus SELEX giver mulighed for udvælgelse af aptamerer, der binder specifikt til virusets oprindelige tilstand uden behov for at forstyrre virussen. Denne metode gør det således muligt at opnå genkendelsesmidler baseret på funktionelle forskelle i overfladen af patogener, som ikke behøver at være kendt på forhånd.

Introduction

Virusinfektioner har enorme økonomiske og samfundsmæssige konsekvenser rundt om i verden, hvilket blev stadig tydeligere af den nylige covid-19-pandemi. Tidlig og præcis diagnose er altafgørende i behandling af virusinfektioner, samtidig med at spredning af vira til raske mennesker forhindres. Mens der er udviklet mange virusdetektionsmetoder, såsom PCR-test1,2 og inmunoassays3, er de fleste af de aktuelt anvendte metoder ikke i stand til at bestemme, om den påviste virus faktisk er smitsom eller ej. Dette skyldes, at tilstedeværelsen af komponenter i virussen alene, såsom viral nukleinsyre eller proteiner, ikke indikerer, at den intakte, infektiøse virus er til stede, og niveauer af disse biomarkører har vist dårlig korrelation med infektivitet 4,5,6. For eksempel har viralt RNA, der almindeligvis anvendes til de nuværende PCR-baserede COVID-19-tests, meget lave niveauer i de tidlige stadier af infektion, når patienten er smitsom, mens RNA-niveauet ofte stadig er meget højt, når patienterne er kommet sig efter infektionen og ikke længere er smitsomme 7,8. De virale protein- eller antigenbiomarkører følger en lignende tendens, men optræder typisk endnu senere end det virale RNA og er dermed endnu mindre prædiktive for infektibilitet 6,9. For at imødegå denne begrænsning er der udviklet nogle metoder, der kan informere om virusets infektivitetsstatus, men er baseret på cellekulturmikrobiologiske teknikker, der kræver lang tid (dage eller uger) for at opnå resultater 4,10. Udvikling af nye sensorer, der kan informere om inficerbarheden af kliniske eller miljømæssige prøver, kan således undgå forsinkelser i behandlingen og yderligere spredning af virussen. Imidlertid kan meget få metoder opnå sensormolekyler, der kan genkende en intakt infektiøs virion og differentiere den fra den samme virus, der er blevet gjort ikke-smitsom.

I denne sammenhæng er aptamerer særligt velegnede som et unikt biomolekylært værktøj11,12,13,14. Aptamers er korte, enkeltstrengede DNA- eller RNA-molekyler med en specifik nukleotidsekvens, der giver dem mulighed for at danne en specifik 3D-konformation for at genkende et mål med høj affinitet og selektivitet15,16. De opnås ved en kombinatorisk udvælgelsesproces kaldet systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX), også kendt som in vitro-selektion, der udføres i reagensglas med et stort tilfældigt DNA-prøveudtagningsbibliotek på 10 14-1015 sekvenser17,18,19. I hver runde af denne iterative proces udsættes DNA-puljen først for et selektionstryk gennem inkubation med målet under de ønskede betingelser. Alle sekvenser, der ikke er bundet til målet, fjernes derefter og efterlader kun de få sekvenser, der er i stand til at binde under de givne betingelser. Endelig forstærkes de sekvenser, der er valgt i det foregående trin, af PCR, hvilket beriger poolens population med de ønskede funktionelle sekvenser til den næste udvælgelsesrunde, og processen gentages. Når udvælgelsespuljens aktivitet når et plateau (typisk efter 8-15 runder), analyseres biblioteket ved DNA-sekventering for at identificere de vindende sekvenser, der udviser den højeste affinitet.

SELEX har unikke fordele, der kan udnyttes til at opnå øget selektivitet i forhold til andre lignende mål20,21, f.eks. for virussens smittestatus 22. For det første kan en lang række forskellige typer mål anvendes til udvælgelsen, fra små molekyler og proteiner til hele patogener og celler16. For at opnå en aptamer, der binder til en infektiøs virus, kan en intakt virus således anvendes som mål i stedet for et viralt overfladeprotein19. Hele virus SELEX giver mulighed for udvælgelse af aptamerer, der binder specifikt til virusets oprindelige tilstand uden behov for forstyrrelse af virussen. For det andet kan SELEX skræddersys til at fjerne konkurrerende mål 21,23, såsom andre lignende vira eller ikke-infektiøse inaktiverede vira, ved hjælp af modudvælgelsestrin i hver udvælgelsesrunde22. Under modudvælgelsestrinnene udsættes DNA-puljen for mål, for hvilke binding ikke ønskes, og eventuelle sekvenser, der binder, kasseres.

I dette arbejde leverer vi en protokol, der generelt kan anvendes til udvælgelse af aptamerer, der binder til en infektiøs virus, men ikke til den samme virus, der er gjort ikke-infektiøs ved en bestemt desinfektionsmetode eller til andre relaterede vira. Denne metode gør det muligt at opnå genkendelsesmidler baseret på funktionelle forskelle i virusoverfladen, som ikke behøver at være kendt på forhånd, og giver således en yderligere fordel til påvisning af nyligt fremkomne patogener eller til underundersøgte sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af reagenser og buffere

  1. Forbered 10x Tris-borat EDTA (10x TBE) ved at tilsætte 0,9 M Tris-base, 0,9 M borsyre, 20 mM EDTA (dinatriumsalt) og deioniseret vand til et endeligt volumen på 1 L. Bland indtil alle komponenter er opløst.
  2. Der fremstilles en 10% denaturerende polyacrylamidstamopløsning som følger. I en 250 ml glasflaske tilsættes 120 g urinstof (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% acrylamid / bisacrylamid (29: 1) opløsning og nok destilleret vand til at nå det endelige volumen på 250 ml. Bland indtil alle komponenter er opløst.
  3. Forbered 2x belastningsbuffer som følger. I et 50 ml rør tilsættes 21.636 g urinstof (8 M), 1.675 g EDTA (1 mM) og 4.5 ml 10x TBE. Fyld til 45 ml med destilleret vand og bland, indtil alle komponenter er opløst.
  4. Ekstraktionsbufferen fremstilles ved tilsætning af 100 mM natriumacetat og 1 mM EDTA (dinatriumsalt). Indstil den endelige pH til 5.
  5. Forbered ethanoludfældningsopløsninger som følger. Forbered 3 M natriumacetat, juster til pH 5,2 og opbevar ved 4 °C. Der fremstilles 70 % ethanol v/v og opbevares ved -20 °C. Forbered 100% ethanol og opbevar ved -20 °C.
  6. Der fremstilles 500 ml SELEX-buffer indeholdende 1x PBS, 2,5 mM MgCl2 og 0,5 mMCaCl2. Juster til pH 7,4. Forbered 100 ml SELEX-buffer med 8 M urinstof ved at tilsætte 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2 og 8 M urea. Juster til pH 7,4.
    BEMÆRK: Valget af SELEX-buffer er afgørende for at sikre, at den valgte aptamer fungerer på den endelige prøve, hvor aptameren vil blive anvendt. For eksempel vil aptamerer, der er specifikke for SARS-CoV-2, blive brugt i biologiske prøver (f.eks. spyt eller nasopharynges vatpinde). Det er derfor vigtigt at vælge ionkoncentrationer, pH og buffer, der nøje efterligner disse betingelser i de tilsigtede biologiske prøver.
  7. Forbered bindings- og vaskebufferen som følger. I et 50 ml rør fremstilles 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA (dinatriumsalt) og 2 M NaCl. Juster til pH 7,5.

2. Design og syntese af DNA-bibliotek og primere

  1. Design det oprindelige ssDNA-bibliotek og primere med følgende kriterier (se tabel 1 for et eksempel ssDNA-bibliotek og sæt primere, hvor N angiver en tilfældig nukleotidposition).
    1. Sørg for, at biblioteket indeholder et centralt tilfældigt område på 35 til 60 nukleotider flankeret af to konstante sekvenser i 3'- og 5'-enderne, der fungerer som primerregioner til forstærkning. En typisk bibliotekslængde er 45 tilfældige nukleotider.
    2. Sørg for, at den omvendte primer indeholder en biotinmodifikation for at adskille ssDNA fra amplificerede dobbeltstrengede PCR-produkter ved hjælp af streptavidinbelagte perler under in vitro-udvælgelsesprocessen .
  2. Køb DNA-oligoerne fra kommercielle kilder med standard afsaltningsrensning. Oprens ssDNA-biblioteket og primerne med 10% denaturerende polyacrylamidgelelektroforese (dPAGE) efterfulgt af ethanoludfældning i henhold til standardprocedurer24.
    FORSIGTIG: Acrylamidmonomer og ethidiumbromid er farlige kemikalier (kræftfremkaldende stoffer hos mennesker), så brug passende personlige værnemidler (laboratoriefrakker, handsker og øjenbeskyttelse), mens du udfører PAGE. Når det er muligt, undgå at bruge ethidiumbromid og erstatte det med et sikrere farvestof.
    BEMÆRK: Det er muligt at bestille oligoerne med HPLC-oprensning for at undgå at udføre dette rensningstrin, selvom dette ikke fjerner korte oligonukleotider så effektivt.
  3. Der tilsættes nukleasefrit vand for at resuspendere ssDNA efter ethanoludfældning op til den ønskede koncentration (100 μM). Bestem koncentrationen af ssDNA-biblioteket og primerne ved UV-absorption ved λ = 260 nm. Opbevares ved -20 °C.
  4. Køb en umodificeret omvendt primer til brug til sekventering med høj kapacitet, biblioteksforberedelse og qPCR-kvantificering.

3. Infektiøse og ikke-infektiøse virusprøver

FORSIGTIG: De infektiøse og ikke-infektiøse virusprøver er prøver på biosikkerhedsniveau 2 (BSL2), der kræver ekstra omhu for at håndtere sikkert og korrekt. Alle trin i proceduren, der omfatter disse prøver, skal udføres i et biosikkerhedsskab, eller virusopløsningen skal være i en forseglet beholder (f.eks. Plastrør med låg).

  1. Få en stamopløsning af infektiøse vira eller forbered dem efter den tilsvarende protokol for hver virus. SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 og H5N1 pseudovira, der blev brugt her, blev leveret af professor Lijun Rongs laboratorium (UIC) i PBS-buffer og blev udarbejdet efter de rapporterede protokoller22,25,26.
    BEMÆRK: For vira, der kræver biosikkerhedsniveau 3-faciliteter for at håndtere den intakte infektiøse virus, er det muligt at arbejde med pseudovirus. En pseudotypet virus genereres fra et lentivirus (HIV), der viser virusets overfladeproteiner i virushylsteret og således nøje efterligner virusets overflade- og indgangsmekanisme, men er defekt i kontinuerlig viral replikation.
  2. Anskaf en ikke-infektiøs virusstamopløsning, eller forbered den ved at følge desinfektionsproceduren. Den UV-inaktiverede SARS-CoV-2 pseudovirus (p-SARS-CoV-2) bestand, der blev brugt her, blev leveret af Prof. Rong lab (UIC) i PBS-buffer, og den tidligere rapporterede protokol blev brugt til UV-inaktivering22.
    BEMÆRK: Udfør om muligt et assay for at teste virussens infektivitet for at sikre, at virussen er blevet fuldstændig inaktiveret.
  3. Kvantificer viruslagrene
    1. Kvantificer virussen ved hjælp af et plakassay i henhold til standardprocedure27,28,29. Dette assay tillader ikke kun kvantificering af virussen, men indikerer også virusets infektivitetsstatus, hvilket bekræfter koncentrationen af infektiøs virus.
    2. For pseudovira eller vira, hvor der ikke foreligger en plakanalyse, kvantificeres virusset ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kvantitativt ELISA-sæt med lentivirus.
    3. Forbered 1 x 108 kopier/ml stamopløsning til p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 og p-H5N1. Hver stamopløsning adskilles i delprøver indeholdende 50 μl hver og opbevares ved -80 °C. Optø en ny prøve før hvert forsøg.

4. In vitro-udvælgelse eller SELEX-proces: indledende runde

BEMÆRK: For alle trin ved hjælp af den infektiøse virus skal du arbejde i et BSL2-skab.

  1. Denaturer ssDNA-biblioteket. Tag 10 μL af 100 μM af ssDNA-biblioteket (1 nmol) og bland med 240 μL SELEX-buffer. Opvarm ved 95 °C i 15 minutter i et tørt bad, og læg derefter tuben på is i 15 minutter.
  2. Inkuber ssDNA-biblioteket med den infektiøse virus (positivt selektionstrin) som følger. Bland 250 μL ssDNA-bibliotek i SELEX-buffer fra trin 4.1 med 50 μL infektiøs virus (1 x 108 kopier/ml). Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.
  3. Bloker de uspecifikke steder i centrifugefiltre som følger. Mens du venter på trin 4.2, skal du forberede centrifugefiltrene til de næste trin.
    1. Der tilsættes 400 μL 1 mM T20-sekvens (tabel 1) til hvert 0,5 ml centrifugefilter, der skal anvendes - et centrifugefilter med en afskæring på 100 kDa og et med en afskæring på 10 kDa.
    2. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur og centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter for at fjerne T20-opløsningen i filteret. Vask 3x med SELEX-buffer for at fjerne overskydende T20-sekvenser.
  4. Vask ubundne sekvenser som følger. Blandingen inkuberet i trin 4.2 tilsættes til det blokerede 100 kDa centrifugefilter, og centrifuger ved 14.000 x g i 10 minutter. Der vaskes 3x, tilsættes 400 μL SELEX-buffer, og centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter. Opbevar fraktionen i filteret, og kassér gennemstrømningen.
  5. Eluer bundne sekvenser som beskrevet nedenfor.
    1. Udskift centrifugefilterets opsamlingsrør, og tilsæt 300 μL SELEX-buffer indeholdende 8 M urinstof til centrifugefilteret i trin 4.4. Centrifugefilteret opvarmes til 95 °C i 15 minutter i et tørt bad og centrifugeres derefter til 14.000 x g i 10 min.
    2. Opsaml den fraktion, der flød gennem filteret, der indeholder de eluerede sekvenser. Gentag yderligere tre gange. Arbejd i et BSL2-skab, og vask alle materialer med 10% blegemiddel for at inaktivere virussen, før materialerne kasseres.
  6. Koncentrer og afsalt som følger. Opløsningen opsamlet i 4.5 tilsættes til et blokeret 10 kDa centrifugefilter. Der centrifugeres ved 14.000 x g i 15 min. Kassér den fraktion, der flød gennem filteret.
    BEMÆRK: Da virusserne bevares og inaktiveres med 8 M urinstof i filteret i det foregående trin, behøver dette og følgende trin ikke udføres i biosikkerhedsskabet. Denne procedure skal gentages, hvis der anvendes et 0,5 ml centrifugerør, indtil al opløsningen er opsamlet, som i trin 4.5, strømmer 1,2 ml gennem filteret.
  7. Vask 3x med 300 μL SELEX-buffer for at fjerne urinstoffet ved centrifugering ved 14.000 x g i 15 min. Kassér den fraktion, der flød gennem filteret. Genvind opløsningen i filteret ved at vende den på hovedet i et rent opsamlingsrør og centrifugere i 5 minutter.
  8. Det endelige volumen af den genvundne opløsning måles fra 4.7 ved hjælp af en pipette i et plastrør. Denne løsning hedder R i a, hvor i svarer til det runde tal. Typisk opnås volumener mellem 30 μL og 50 μL. Tag 1 μL af det eluerede ssDNA for at kvantificere mængden af DNA ved qPCR.
    BEMÆRK: Dette er et muligt pausepunkt, hvor R1en prøve kan opbevares ved -20 °C for at fortsætte på et andet tidspunkt.
  9. Udfør PCR-forstærkning som beskrevet nedenfor.
    1. I første runde skal du tage 90% af R1en prøve som en PCR-skabelon. I de følgende runder skal du tage 60% af det samlede volumen i trin 4.8 for at udføre PCR og opbevare den anden fraktion ved -20 °C.
    2. Der opsættes en 50 μL PCR-reaktion med følgende med den specificerede slutkoncentration: 1x PCR-reaktionsbuffer, 200 μM dNTP'er, 10 μL DNA-skabelon (R1en prøve), 200 nM hver primer og 1,25 U-polymerase (2,5 U/μL lager).
    3. Optimer PCR-forholdene, herunder antal cyklusser og udglødningstemperatur for hvert sæt primere og ssDNA-bibliotek. Undgå at bruge for mange cyklusser, som vil producere uønskede PCR-underprodukter som os primer-dimers. Test forskellige udglødningstemperaturer baseret på primernes smeltetemperatur.
    4. Kør PCR ved hjælp af optimerede forhold ved 95 °C i 5 minutter efterfulgt af 18 cyklusser på 1 min ved 95 °C, 30 s ved 52 °C og 1 min ved 72 °C, med et sidste forlængelsestrin ved 72 °C i 10 minutter for at opnå dsDNA-puljen.
      BEMÆRK: Dette er et andet muligt pausepunkt, hvor PCR-produktet kan opbevares ved -20 °C for at fortsætte på et andet tidspunkt.
  10. Gendan ssDNA ved hjælp af streptavidin-modificerede magnetiske perler.
    1. Tag 80% af PCR-produktet. Den resterende fraktion opbevares ved -20 °C.
    2. PCR-produktet opdeles i prøver på 50 μL og tilsættes til mikrofugerør, der indeholder 50 μL streptavidinmodificerede magnetperler (MB). Der inkuberes i 30 minutter under let omrøring (brug f.eks. en roterende ryster) ved stuetemperatur. Derefter anbringes mikrofugerøret på magnetstativet for at isolere MB, og supernatanten fjernes ved pipettering (det skal være en klar opløsning).
    3. Der vaskes ved at tilsætte 200 μL binde- og vaskebuffer til røret. Fjern røret fra magnetstativet, bank på røret, og ophvirvl MB igen til en homogen opløsning ved pipettering. Mikrofugerøret anbringes tilbage på magnetstativet for at isolere MB og fjerne supernatanten ved pipettering. Gentag dette vasketrin to gange.
    4. Når vasken er afsluttet, resuspenderes MB i i alt 100 μL SELEX-buffer, og opløsningen opvarmes til 95 °C i 10 minutter. Anbring straks røret i magnetstativet, før røret køler af, og tag supernatanten indeholdende ssDNA-puljen. Dette gendannelsestrin gentages, idet der tilsættes 50 μL SELEX-buffer.
  11. Det endelige volumen af den genvundne fraktion fra 4,10 måles ved hjælp af en pipette. Denne brøk hedder R ix, hvor i svarer til det runde tal. Generelt opnås volumener mellem 140 og 150 μL. Tag 1 μL R1x for at kvantificere mængden af DNA ved qPCR.

5. Efterfølgende udvælgelsesrunder

  1. Denaturer ssDNA-puljen. Der udtages 60 % af prøve R1x og blandes med 50 μL SELEX-buffer. Opvarm ved 95 °C i 15 minutter i et tørt bad. Placer røret på is i 15 min.
  2. Inkuber ssDNA-puljen med den ikke-infektiøse virus og andre potentielle interfererende vira (modvalgstrin). Bland den denaturerede ssDNA-pulje i SELEX-buffer fra 5,1 med 50 μL af hver virus (5 x 109 kopier/ml; f.eks. ikke-infektiøs p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 og p-H5N1). Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  3. Bloker uspecifikke steder i centrifugefiltre. Mens du venter på trin 5.2., skal du forberede centrifugefiltrene til de næste trin. Brug typisk to centrifugefiltre, et med en afskæring på 100 kDa og et med en afskæring på 10 kDa. Følg samme procedure som i punkt 4.3.
  4. Vask sekvenserne væk, der er bundet til ikke-målvirus. Den blanding, der blev inkuberet i trin 5.2, tilsættes til et blokeret 100 kDa centrifugefilter. Der centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter, og den fraktion, der strømmer gennem centrifugefilteret, genvindes. Der vaskes 2x, tilsættes 100 μL SELEX-buffer, og centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter. Opbevar den fraktion, der flød gennem filteret.
  5. Inkuber ssDNA-puljen med den infektiøse virus (positivt selektionstrin). Udtag 300 μL fraktion fra trin 5.4 og bland med 50 μL infektiøs virus (1 x 108 kopier/ml). Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur. Følg trin 4.4 til 4.11.

6. Overvågning af SELEX-processen

BEMÆRK: For at overvåge berigelsen af poolen bruges qPCR på to måder. For det første er det ved absolut kvantificering muligt at teste berigelsen af puljerne (elueringsudbyttet). For det andet kan mangfoldigheden af puljer (konvergens af aptamerarterne) evalueres ved at overvåge smeltekurven30.

  1. Udfør alle qPCR-assays med et 10 μL reaktionsvolumen i plader med 96 brønde designet til qPCR.
  2. Forbered en standard qPCR-blanding indeholdende 5 μL masterblanding, 0,3 μL 500 nM af hver umærket primer, 3,4 μL H2O og 1 μL DNA-skabelon.
    1. Forbered fortyndinger af det oprensede ssDNA-bibliotek (trin 2.3) for at køre standardkurven.
    2. Fortynd DNA-prøverne for at få deres koncentration til at passe ind i standardkurven. For Ria-prøver tilsættes 1 μL af prøven uden fortynding og 1 μL 1:10 fortynding til qPCR-blandingen. For Rix-prøver skal der fortyndes 1:10 eller 1:100.
  3. Kør qPCR ved at indstille følgende protokol. Først indstilles et indledende denatureringstrin til 98 °C i 2 minutter. Derefter indstilles 40 denatureringscyklusser ved 98 °C i 5 sek. og udglødning og forlængelse ved 52 °C i 10 s. Til sidst indstilles en smeltekurveanalyse fra 65 til 95 °C. Bestem tærskelcyklusværdier (Ct) ved hjælp af automatiseret tærskelanalyse.
  4. Brug standardkurven til at kvantificere mængden af ssDNA iR i a og Rix prøver.
  5. Beregn elueringsudbyttet som mængden af bundet DNA (antal mol i R i a) divideret med mængden af indledende DNA (antal mol i Ri-1x). Elueringsudbyttet i forhold til det runde tal plottes for at se, om der observeres en berigelse over runderne.
  6. Plot smeltekurverne for forskellige runder. Der forventes et skift til højere smeltetemperaturer i toppen nær 75/85 °C, efterhånden som antallet af runder stiger. Det betyder, at poolens mangfoldighed falder.

7. Sekvensering med høj kapacitet

  1. Rådfør dig med sekventeringsfaciliteten med høj kapacitet om, hvilke sekventeringstyper og skalaer der er tilgængelige, hvilket bestemmer bibliotekets forberedelsesmetode.
    BEMÆRK: Denne beslutning vil tage hensyn til både længden af de puljer, der skal sekventeres (inklusive primerne), og antallet af puljer, der skal indsendes (generelt sigte mod mindst 1 x 105-10 6 sekvenser pr. pulje). Hvis en bestemt sekventeringsskala ikke kan læse hele poolens længde, kan parret sekvensering bruges til at læse fra begge ender af sekvensen i modsætning til single-end, der kun læser fra den ene ende.
  2. Vælg et passende kommercielt tilgængeligt kit baseret på sekventeringstypen i samråd med sekventeringsfaciliteten. Forbered flere puljer af udvælgelsesrunder, der repræsenterer høj, medium og lav berigelse, samt den endelige pulje ved hjælp af et andet par indekser i adapterne for hver pulje, der tillod prøveanalyse af alle runder ved hjælp af en bane.
    BEMÆRK: PCR-forstærkning kan også bruges til at inkorporere de adaptere og indekser, der kræves til high-throughput sekventering, men dette koster generelt svarende til de kommercielle kits og fungerer ikke bedre.
    1. Udfør biblioteksforberedelse ved at følge disse trin: afslutte reparation af fragmenteret DNA, adaptorligering og PCR-forstærkning for at producere de endelige biblioteker.
    2. Rens PCR-produktet med magnetiske DNA-oprydningsperler efter producentens anvisninger.
    3. Kvantificer DNA'et ved hjælp af et fluorescensbaseret kvantificeringssæt. Undgå at bruge mindre nøjagtige metoder, såsom UV-målinger med lille volumen.
    4. Bland omtrent lige store mængder (efter mængde DNA, ikke volumen) af hvert poolbibliotek, der indeholder specifikke indekser.
    5. Kontroller kvaliteten af det endelige bibliotek med qPCR-kvantificering og en DNA-fragmentanalysator. Dette trin udføres ofte af sekventeringsfaciliteten.
      BEMÆRK: Sekventeringsfacilitetspersonale kan give nyttige oplysninger om, hvordan biblioteket forberedes, og hvilke kvalitetskontroller der foreslås. Det er nødvendigt at diskutere med dem, før bibliotekerne forberedes.
  3. Send det forberedte endelige bibliotek til sekventeringsfaciliteten efter deres krav.

8. Sekventeringsanalyse

  1. Det meste software, der er tilgængeligt til sekventeringsanalyse, er designet til at blive kørt på kommandolinjen på et Linux-operativsystem. For små datasæt skal du konfigurere det ønskede Linux-operativsystem og installere nødvendige programmer på en pc; For større datasæt køres HTS-analyse på højtydende databehandlingsressourcer eller supercomputere (anbefales).
    BEMÆRK: Adgang og uddannelse vil være nødvendig for at bruge højtydende computerressourcer, hvilket kan tage noget tid at opnå. Derudover kræves grundlæggende kendskab til UNIX-kommandolinjebrug. Mange gratis ressourcer om grundlæggende kommandolinjebrug er tilgængelige online, og computerressourcerne vil sandsynligvis give yderligere oplysninger til brug af deres systemer.
  2. Få adgang til sekventeringsfilerne, normalt i et komprimeret FastQ-filformat, ved hjælp af oplysningerne fra sekventeringsfaciliteten.
    1. Brug en FTP-klient til at overføre filerne til din egen computer og/eller den højtydende computerressource. Mange sekvensanalyseprogrammer kan bruge komprimerede filer direkte, så hold filerne komprimeret, hvis det er muligt, for at begrænse deres filstørrelser (store sekvenslæsninger på 50 M+ sekvenser kan optage 100 Gb+ filplads, når de ikke komprimeres).
    2. Hvis sekvensfiler skal dekomprimeres, skal du bruge gzip-funktionen, som er standard på de fleste Linux-installationer. Få yderligere oplysninger om gzip og dens muligheder fra den installerede manual ved at skrive "man gzip" på kommandolinjen.
  3. Ryd op i sekvenserne før analyse ved at demultiplexere, fjerne sekventeringsadapterne, fjerne læsninger af lav kvalitet og inkludere både fremad- og bagretningslæsninger.
    1. Brug FastQC-programmet31 efter hvert af følgende trin for at få grundlæggende kvalitetskontroloplysninger om sekvenserne for at vurdere effektiviteten af hvert oprydningstrin.
    2. Demultiplex sekvenserne for at adskille alle sekvenser fra en enkelt læsefil i de forskellige puljer baseret på indekserne inkluderet i sekventeringsadapterne. Dette trin udføres ofte af sekventeringsfaciliteten, som bør konsulteres, da den nøjagtige procedure afhænger af den anvendte sekventeringsmaskine.
    3. Fjern sekventeringsadapterne ved hjælp af kommandolinjeprogrammet Cutadapt32. Brug markeringsgrunderne (i stedet for sekventeringsadaptere) som input i tilstanden Sammenkædet adapter. Brug indstillingen --discard-untrimmed til at kassere sekvenser, der ikke indeholder markeringsprimerne.
    4. Angiv indstillinger for den maksimale fejlfrekvens, der passer til adapterne, og den minimale og maksimale længde af sekvenser, der skal accepteres. Hvis du bruger parrede slutlæsninger, skal du indtaste specifikke tilgængelige parametre og give både Læs 1 og Læs 2 sekventeringsfiler. Indstil yderligere parametre efter behov ved at henvise til Cutadapt-manualen32.
      BEMÆRK: Ligeringen af sekventeringsadaptere til puljer er retningsuafhængig og vil inkorporere ca. 50% af sekvenserne i fremadgående retning og 50% i omvendt retning. For at undgå at miste de 50% af sekvenserne i modsat retning, kan Cutadapt køres en anden gang ved hjælp af det omvendte komplement af udvælgelsesprimerne som input.
    5. (Valgfrit) Hvis der bruges parret sekventering, skal du flette Read 1- og Read 2-filerne med programmet PEAR33.
    6. Brug FASTX-Toolkit-programmet34 til at fjerne sekvenser af lav kvalitet, der har en kvalitet under en bestemt tærskel ved ethvert nukleotid. En kvalitets cut-off score på 30 er et godt udgangspunkt. Hvis den overordnede kvalitet generelt er god, kan dette trin springes over.
    7. For at flette sekvensfilerne i omvendt retning med dem i fremadgående retning skal du bruge FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement-funktionen på filerne i omvendt retning. Brug derefter det indbyggede katteprogram (standard på de fleste Linux-installationer) til at flette fremad- og reverse-komplementet - omvendte filer til en enkelt fil.
  4. Hvis du vil analysere forbedringen af sekvenser på tværs af forskellige udvælgelsespuljer, skal du bruge FASTAptammer-analyseværktøjssæt35.
    1. Brug FASTAptamer-Count til at tælle antallet af gange, hver sekvens vises. Derefter rangordnes og sorteres sekvenserne efter overflod. Outputfilen til optælling kræves som input til alle andre FASTAptammer-programmer.
    2. Brug FASTAptamer-Clust til at gruppere alle sekvenser i en fil i klynger af nært beslægtede sekvenser. Brug parameteren "afstand" til at definere antallet af enkeltnukleotidmutationer eller indels, der er tilladt at gruppere i en klynge.
      BEMÆRK: FASTAptamer-Closs-programmet kan være meget beregningsmæssigt dyrt, hvis et stort antal unikke sekvenser er til stede (især for tidlige runder), hvilket kan tage dage eller endda uger at fuldføre helt. Afskæringsfilterparameteren kan bruges til at udelukke sekvenser med lav overflod fra klyngedannelse. Generelt er det godt at starte med en højere cut-off, såsom 10 eller 5 læsninger pr. Million (RPM) og mindske den, hvis programmet afsluttes hurtigt. Hvis puljerne er meget heterogene, er det muligvis ikke muligt at gruppere sekvenserne inden for en rimelig tidsramme.
    3. Brug FASTAptamer-Enrich til at beregne forbedringen af hver sekvens, der findes i mere end én runde af markeringen. Sammenlign omdrejningstallet for sekvensen fra en population med RPM i en anden. Brug programmet Enrich på enten Count- eller Cluster-filerne. Outputtet er en tabulatorsepareret værdifil (.tsv), der kan åbnes i ethvert regnearkssoftware til yderligere analyse og nem sortering.
      BEMÆRK: FASTAptamer-Enrich-programmet kan også være meget beregningsmæssigt dyrt, hvis der findes et stort antal unikke sekvenser. Afskæringsfilterparameteren kan bruges til at udelukke sekvenser med lav overflod fra outputtet for at undgå filer, der er for store til at åbne i regnearkssoftware.
    4. (Valgfrit) Hvis mange puljer er for heterogene (mange unikke sekvenser og få dublerede sekvenser), er det muligvis ikke muligt at bruge hverken Clust- eller Enrich-programmerne. I dette tilfælde skal du udføre en manuel berigelseskontrol ved hjælp af outputfilen Count, som sorterer sekvenser efter overflod (mest udbredt øverst) og omdøber sekvensidentifikatoren til at omfatte vigtige oplysninger såsom RPM.
      1. Brug standard Linux "head" -programmet på Count-filerne for at få en liste over de mest rigelige sekvenser. Brug derefter standard Linux "grep" -programmet til at søge i hver af de mest rigelige sekvenser i Count-filerne i alle de andre relevante puljer. Hvis der er matches, skal du bruge det ændrede sekvens-id til at bestemme RPM i den pågældende pulje for manuelt at konstruere forbedringsoplysningerne.
        BEMÆRK: Scripts til alle sekventeringsanalysetrin findes i de supplerende kodningsfiler 1-11.

9. Aptamer bindende validering og assays

  1. Ud fra de berigelsesoplysninger, der opnås gennem sekvensanalyse, identificeres kandidataptamersekvenser baseret på sekvenser, der har den største berigelse i efterfølgende udvælgelsesrunder og/eller de mest udbredte sekvenser i den endelige udvælgelsesrunde. Vælg flere forskellige kandidatsekvenser (mindst 10-20) til yderligere test, da de højest berigede ikke nødvendigvis er de bedst ydende aptamerer.
  2. Udfør indledende screening af kandidataptamerer ved hjælp af et bindingsassay, der kan udføres hurtigt for flere prøver. Et søjlebaseret ultrafiltreringsbindingsassay36 eller enzymbundet oligonukleotidassay (ELONA) er gode metoder til denne indledende screening.
  3. Analyser specificiteten og affiniteten af de sekvenser, der viser den bedste bindingsaktivitet fra den indledende screening, ved hjælp af mindst to uafhængige bindingsassays (f.eks. MicroScale Thermophoresis (MST)37,38, Enzyme-Linked Oligonukleotide Assay (ELONA)39, overfladeplasmonresonans 40 eller biolagsinterferometri (BLI)41).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Da DNA-aptamerer kan opnås ved hjælp af SELEX i et reagensglas15, blev denne SELEX-strategi omhyggeligt udformet til at omfatte både positive selektionstrin mod det intakte, hele infektiøse virus (dvs. tilbageholde de DNA-molekyler, der binder til det infektiøse virus) samt modudvælgelsestrin for det samme virus, der er gjort ikke-infektiøst ved en bestemt desinfektionsmetode. specifikt UV-behandling, ved at kassere de DNA-sekvenser, der kan binde til den ikke-infektiøse virus. Figur 1 viser en skematisk fremstilling af udvælgelsesprocessen.

Som repræsentative resultater af denne protokol valgte vi valget af en aptamer til infektiøs SARS-CoV-2. På grund af kravet om arbejdsforhold på biosikkerhedsniveau 3 (BSL3) for at håndtere den intakte, infektiøse SARS-CoV-2, har vi i stedet valgt at arbejde med en pseudotypet virus. Pseudotypede vira genereres fra en relativt harmløs rygradsvirus, i dette tilfælde en type lentivirus (HIV), der er blevet modificeret til at vise overfladeproteinet af en anden virus af interesse inden for dens virale kuvert, så den nøje kan efterligne overfladen og indgangsmekanismen for den ønskede virus uden de risici, der er forbundet med at arbejde med farlige humane patogener. Det er vigtigt, at disse pseudovira modificeres til at være defekte i kontinuerlig viral replikation25,42. I dette arbejde blev der anvendt tre forskellige pseudotypede vira: p-SARS-CoV-2, hvor SARS-CoV-2 spike (S) proteiner er inkorporeret i konvolutten; p-SARS-CoV-1, der indeholder SARS-CoV-1 spike (S) protein; og p-H5N1, der indeholder hæmagglutinin og neuraminidase isoleret fra den højpatogene aviær influenzavirus A/Goose/Qinghai/59/05 (H5N1)-stamme.

I de første to udvælgelsesrunder blev der ikke inkluderet noget modudvælgelsestrin for at minimere den uspecifikke fjernelse af DNA-bindemidler, der typisk kun er til stede som enkeltkopier i begyndelsesrunder. Efter de første to runder blev positive trin og modvalg inkluderet i hver runde for at nå en høj selektivitet. Til modvalg blev p-SARS-CoV-2, der var blevet gjort ikke-infektiøs ved UV-behandling, samt p-SARS-CoV-1 og p-H5N1 brugt til at opnå selektivitet mod andre vira.

For at overvåge selektionsforløbet blev kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) anvendt. Denne teknik repræsenterer en enkel metode, der ikke kræver mærkning af poolen og generelt kan anvendes på stort set ethvert mål30. Det drager fordel af to funktioner i qPCR-teknikken. For det første muligheden for absolut kvantificering ved hjælp af en standardkurve til beregning af elueringsudbyttet, defineret af ssDNA'et bundet til det infektiøse virus over det samlede tilsatte ssDNA. Vores resultater viste, at elueringsudbyttet oprindeligt steg med hver tidlig runde SELEX og fladede ud ved runde 8 og 9 (R8 og R9), hvilket tyder på en berigelse af puljerne i sekvenser, der binder til den infektiøse virus (figur 2A). For det andet giver smeltekurver for hver runde af DNA-puljen yderligere bevis for sekvensdiversiteten af puljerne30. Ved at sammenligne smeltekurverne kan der observeres et skift fra toppen ved høj smeltetemperatur (T m) fra 77 °C til 79 °C, hvilket tyder på, at DNA-puljen har konvergeret fra tilfældige sekvenser med lav T m til mere konserverede sekvenser med højere Tm (figur 2B). Desuden vises der i de sidste runder (R8 og R9) en top ved lav Tm (~ 70 ° C). Dette kan være relateret til produktionen af primer-dimerer under PCR. En mulig løsning for at undgå dette er at reducere antallet af cyklusser under PCR (for eksempel fra 18 cyklusser til 12 eller 15 cyklusser).

Efter at have bekræftet en berigelse af puljen med qPCR brugte vi HTS (high-throughput sekventering) til runde 3, 5, 7, 8 og 9 i SELEX for at finde ud af, hvilke sekvenser der er ansvarlige for bindingen af virusmålet. Sammenlignet med traditionelle kloningssekventeringsprocedurer gør HTS det muligt at overvåge udviklingen af individuelle sekvenser over flere valgrunder for endelig at identificere aptamersekvenserne, der beriges over efterfølgende runder. Figur 3A viser den relative forekomst (i aflæsninger pr. million) for sekvensen SARS2-AR10, opnået over på hinanden følgende udvælgelsesrunder. Den sekundære struktur af SARS2-AR10 forudsiges af Mfold-software, og resultaterne (figur 3B) viser en struktureret sekundær struktur, der indeholder en stammesløjferegion, som kan være involveret i genkendelse af virussen. Yderligere karakterisering af affinitetsbindingen af denne sekvens er tidligere rapporteret22. Mikroskala termoforese (MST) og et enzymbundet oligonukleotidassay (ELONA) viste, at SARS2-AR10 aptamer binder til den infektiøse p-SARS-CoV-2 med en Kd = 79 ± 28 nM og binder ikke til den ikke-infektiøse p-SARS-CoV-2 eller til andre coronavirus såsom p-SARS-CoV-1 og 229E.

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af SELEX-processen for aptamerer, der skelner mellem infektiøse og ikke-infektiøse vira. Positive trin og modudvælgelsestrin blev tilføjet i hver runde efter anden runde for at nå høj specificitet over for den smitsomme virus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Overvågning af SELEX' fremskridt med infektiøse SARS-CoV-2-specifikke aptamerer. (A) Kvantificering af elueringsudbyttet (dvs. det bundne ssDNA over det tilsatte ssDNA) for hver runde SELEX ved hjælp af qPCR. B) Smeltekurve for de forskellige puljer under valg af SARS-CoV-2 aptamer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Berigelse og sekundær struktur af SARS2-AR10 aptamer. Aflæsninger pr. million (RPM) opnået ved analyse af HTS-dataene for SARS2-AR10-sekvensen som funktion af udvælgelsesrunderne ved hjælp af FASTAptamer-Count. Indsat: Den forudsagte mest stabile sekundære struktur af SARS2-AR10-sekvensen baseret på UNAFold-softwaren. Beregningerne blev foretaget ved 25 °C, 100 mM NaCl og 2 mM MgCl2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Navn DNA-sekvens (5′ til 3′)
T20 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
DNA-bibliotek ACCGTCAGTTACAATGCT- N45 -GGCTGGACTATCTGTGTA
Fremadgående primer (FwdP) ACCGTCAGTTACAATGCT
Omvendt primer (RevP) Biot-TACACAGATAGTCCCC
SARS-AR10 CCCGACCAGCCACCATCAGCAACTCTTCCGCGTCCATCCCTGCTG
N: repræsenterer et tilfældigt nukleotid; Biot: Biotin modifikation i 5'ende.

Tabel 1: Liste over DNA-sekvenser.

Supplerende kodningsfil 1: Cutadapt_script.txt identificerer alle sekvenser i en given inputfil, der har de angivne fremadgående og omvendte primere, kasserer dem, der ikke har primerne, og fjerner primerne fra de sekvenser, der havde dem. Se reference31 for mere information om Cutadapt. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 2: FASTAptamer_cluster_script.txt vil gruppere alle sekvenser fra en enkelt tællefil i familier / klynger af nært beslægtede / lignende sekvenser. Dette er nyttigt, hvis en kandidatsekvens identificeres, så andre lignende sekvenser i samme klynge også kan identificeres som potentielle kandidater. Se reference34 for yderligere oplysninger om FASTAptamer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 3: FASTAptamer_count_script.txt tæller antallet af forekomster af hver unik sekvens fra en given input FASTA/FASTQ-fil og producerer en outputfil for hver unik sekvens i faldende rækkefølge (højeste forekomst til laveste forekomst). Tæl outputfilerne kræves som input til alle andre FASTAptammer-programmer. Se reference34 for yderligere oplysninger om FASTAptamer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 4: FASTAptamer_enrich_script.txt sammenligner alle sekvenser fra to eller tre inputfiler, giver overflod af alle unikke sekvenser mellem alle filerne og giver alle kombinationer af parvis berigelsesværdier (i RPM) af alle sekvenser, der findes i flere filer. Se reference34 for yderligere oplysninger om FASTAptamer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 5: fastqc_script.txt er et kvalitetskontrolværktøj til FastQ-filer, der giver letlæselige kvalitetsoplysninger til sekventeringsdata med høj kapacitet, såsom duplikeringsniveauer, læselængder og kvalitetsresultater. Se reference30 for mere information om FastQC. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 6: FASTX_fwd_rev_merge_script.txt bruger FASTX-Toolkit til at udsende det omvendte komplement af alle sekvenser fra en given omvendt fil. Den bruger derefter kat-kommandoen (standard i de fleste UNIX-operativsystemer) til at flette denne omvendte komplementfil med en given fremadrettet fil med sekvenser for at give en enkelt fil med alle sekvenser. Se reference33 for yderligere oplysninger om FASTX-Toolkit. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 7: FASTX_quality_filter_script.txt bruger FASTX-Toolkit til at kontrollere kvaliteten af sekvenser i en given FastQ-fil og kan kassere alle sekvenser, der er af lav kvalitet. Denne metode er generelt bedre end trimningsmetoder til kvalitetsfiltrering til analyse af in vitro-selektionssekvenser . Beskæring indebærer fjernelse af baser (typisk nær enderne) af sekvenser baseret på lav kvalitet, hvilket er acceptabelt til genomisk sekventering, men fordi hele sekvensen er nødvendig for funktionelt DNA, er trimning af enderne ikke nyttig. I stedet, hvis for mange baser i en sekvens er af lav kvalitet, kasseres hele sekvensen. Se reference33 for yderligere oplysninger om FASTX-Toolkit. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 8: grep_searcher_script.txt bruges til at søge efter en bestemt inputsekvens i en bestemt inputfil og output både ID og sekvens i en outputfil (hvis den blev fundet i input). Dette script er nyttigt for puljer, der er meget heterogene (dvs. har mange unikke sekvenser), hvilket får FASTAptamer Clust til at tage for lang tid at køre korrekt og resultere i FASTAptamer Enrich-filer, der er for store til at åbne i typiske regnearksprogrammer til analyse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 9: gzip_compress_decompress_script.txt bruger Gzip til at komprimere eller dekomprimere filer. En komprimeret fil vil typisk have filtypenavnet .gz føjet til filnavnet. Det anbefales at komprimere store filer for at spare på filplads. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 10: PEAR_script.txt bruges kun til parrede sekventeringsfiler og fletter Read 1-filen med den tilsvarende Read 2-fil. Se reference32 for yderligere oplysninger om PEAR. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 11: tar_extraction_creation_script.txt vil udpakke eller oprette tjærearkiver, som bruges til at samle flere filer og / eller mapper i en enkelt fil. De komprimeres også ofte for at reducere filstørrelsen, såsom med bz2-komprimering, som inkluderet i dette script. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SELEX tillader ikke kun identifikation af aptamerer med høj affinitet i pM-nM-området 22,43,44,45, men også med høj og justerbar selektivitet. Ved at drage fordel af modvalg kan aptamerer med udfordrende selektivitet opnås. For eksempel har Li-gruppen demonstreret evnen til at opnå sekvenser, der kan differentiere patogene bakteriestammer fra ikke-patogene stammer21. Le et al. identificerede også en aptamer, der var i stand til at differentiere serotyper af Streptococcus pyogenes bakterier46. Dette åbner mulighed for at integrere aptamermolekyler med unik selektivitet i forskellige funktionelle DNA-sensorer 12,47,48,49,50 med nye nanoteknologier 22,51,52 for at konstruere sensorer til forskellige applikationer, såsom til bærbare og hurtige diagnostiske tests eller til miljødetektion.

Den protokol, der præsenteres her, gør det muligt at opnå aptamerer med høj selektivitet for en infektiøs virus over den samme virus, der er blevet inaktiveret og dermed ikke er smitsom. For at opnå en sådan selektivitet er SELEX-tilgangen i dette arbejde baseret på udformningen af tællervalgstrinnet. For det første skal der udføres et korrekt valg og karakterisering af ikke-målprøver for et vellykket modvalgstrin. Denne metode afhænger således af at starte med velkendte infektiøse og ikke-infektiøse intakte virusbestande. For det andet inkorporeres et modudvælgelsestrin i hver udvælgelsesrunde efter den første runde for at anvende strenge betingelser fra begyndelsen af udvælgelsen og for at maksimere sandsynligheden for at identificere aptamerer, der kan skelne mellem de små forskelle i viruspartiklens overflade fra den infektiøse og ikke-infektiøse tilstand af den samme virus.

I denne protokol er fokus på aptamerens selektivitet. Hvis der kræves stærkere aptamer-affiniteter, er det muligt at øge processens stringens efter visse SELEX-runder. For eksempel er det ved at reducere den infektiøse viruskoncentration og inkubationstid under den positive selektion muligt at opnå aptamerer med en stærkere bindingsaffinitet44.

En anden vigtig overvejelse ved udformningen af SELEX-protokollen er den endelige prøve, hvori aptameren vil blive anvendt. Aptamerer, der er specifikke for vira, inkorporeres normalt i komplekse prøver (f.eks. Serum-, spyt- og realvandsprøver), og dette skal overvejes under aptamerudvælgelsen for at øge chancen for at opnå funktionelle aptamerer i de endelige prøver. Derfor er det vigtigt at udføre SELEX i en buffer, der nøje efterligner disse prøver, især med hensyn til kationkoncentration og pH. For eksempel valgte vi til SARS-CoV-2 aptamer PBS-buffer (pH 7,4) indeholdende 2 mM MgCl2 og 0,5 mMCaCl2 til nøje at efterligne biologiske prøver. Derudover, hvis andre arter i prøverne, hvor aptameren vil blive anvendt, potentielt kan konkurrere med målet om at binde aptameren, er det muligt at minimere interferens fra disse arter ved at inkludere dem i modudvælgelsestrinnet for at eliminere sekvenser, der kan binde disse arter.

De vellykkede resultater af denne SELEX-proces22, som er blevet anvendt på forskellige vira (adenovirus og SARS-CoV-2) og forskellige inaktiveringsmetoder (UV-behandling og frit klor) indikerer, at denne metode kan anvendes bredt til andre vira og andre inaktiveringsmetoder, hvilket åbner en bred vifte af applikationer i fremtiden. Aptamerer, der adskiller infektiøse vira, har potentiale ikke kun i diagnostiske applikationer til at identificere patienter, der stadig er smitsomme, men også i miljøapplikationer, hvor prøven defineres som forurenet, hvis patogenerne i disse prøver stadig er aktive. Inkorporeringen af aptamerer med evnen til at identificere infektiøse vira i hurtige sensorer giver således muligheder for at overvåge desinfektionsbehandlinger.

Desuden var det muligt at differentiere virussens infektivitetsstatus uden nogen oplysninger om de strukturelle forskelle mellem de to infektivitetstilstande. Den eneste information, der kræves, er at vide, at forskellene mellem begge tilstande er relateret til forskelle i molekylernes struktur på overfladen af intakte virale partikler. Vi er således overbeviste om, at den samme tilgang kan bruges til at differentiere varianter og serotyper af den samme virus, hvor forskellene skyldes små mutationer i resterne af proteiner på overfladen af virale partikler, svarende til dem, der adskiller virusets infektivitetsstatus. For eksempel forestiller vi os, at det vil være muligt at få aptamerer, der er specifikke for varianter, der giver anledning til bekymring for SARS-CoV-2 eller andre vira, såsom influenza, hvilket åbner mulighed for hurtig overvågning af varianter, der er den største trussel mod samfundet.

Endelig, fordi SELEX-strategien for at opnå aptamerer, der kan skelne infektiøse fra ikke-infektiøse vira, ikke kræver nogen forhåndsviden om, hvilke specifikke strukturelle forskelle der er til stede mellem dem, kan det være muligt at bruge aptamerer med denne selektivitet til at identificere de specifikke overfladeændringer, der er ansvarlige for tabet af infektivitet fra forskellige desinfektionsmetoder ved en detaljeret karakterisering og identifikation af de bindende mål for vores aptamerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Laura M. Cooper og Dr. Lijun Rong fra University of Illinois i Chicago for at levere de pseudovirusprøver, der anvendes i denne protokol (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), samt Dr. Alvaro Hernandez og Dr. Chris Wright fra DNA Services-faciliteten i Roy J. Carver Biotechnology Center ved University of Illinois i Urbana-Champaign for deres hjælp med high-throughput sekventering, og mange medlemmer af Lu-gruppen, der har hjulpet os med in vitro-udvælgelse og aptamerkarakteriseringsteknikker. Dette arbejde blev støttet af et RAPID-tilskud fra National Science Foundation (CBET 20-29215) og et frøtilskud fra Institute for Sustainability, Energy and Environment ved University of Illinois i Urbana-Champaign og Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. takker PEW Latin American Fellowship for økonomisk støtte. Vi takker også Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) for støtte til Lu-gruppens forskningsprogram ved University of Texas i Austin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678 (2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230 (2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070 (2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334 (2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966 (2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Tags

Bioengineering udgave 187 in vitro-selektion aptamer virusinfektivitetsstatus modselektion intakt virus
In vitro-udvælgelse af aptamerer til differentiering af infektiøse fra ikke-infektiøse vira
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., … More

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter