Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro utvalg av aptamere for å skille smittsomme fra ikke-smittsomme virus

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin
* These authors contributed equally

Summary

Vi tilbyr en protokoll som generelt kan brukes til å velge aptamere som binder seg til smittsomme virus og ikke til virus som har blitt gjort ikke-smittsomme ved en desinfeksjonsmetode eller til andre lignende virus. Dette åpner muligheten for å bestemme smittsomhetsstatus i bærbare og raske tester.

Abstract

Virusinfeksjoner har stor innvirkning på samfunnet; De fleste metoder for påvisning har vanskeligheter med å avgjøre om et påvist virus er smittsomt, noe som forårsaker forsinkelser i behandling og videre spredning av viruset. Utvikling av nye sensorer som kan informere om smittbarheten til kliniske eller miljømessige prøver, vil møte denne uløste utfordringen. Imidlertid kan svært få metoder oppnå sensing molekyler som kan gjenkjenne et intakt smittsomt virus og skille det fra det samme viruset som har blitt gjort ikke-smittsomt ved desinfeksjonsmetoder. Her beskriver vi en protokoll for å velge aptamere som kan skille smittsomme virus vs ikke-smittsomme virus ved systematisk utvikling av ligander ved eksponentiell anrikning (SELEX). Vi drar nytte av to funksjoner i SELEX. For det første kan SELEX skreddersys for å fjerne konkurrerende mål, for eksempel ikke-smittsomme virus eller andre lignende virus, ved hjelp av tellervalg. I tillegg kan hele viruset brukes som mål for SELEX, i stedet for for for eksempel et viralt overflateprotein. Hele viruset SELEX tillater valg av aptamere som binder seg spesifikt til virusets opprinnelige tilstand, uten behov for å forstyrre viruset. Denne metoden gjør det dermed mulig å oppnå anerkjennelsesmidler basert på funksjonelle forskjeller i overflaten av patogener, som ikke trenger å være kjent på forhånd.

Introduction

Virusinfeksjoner har enorme økonomiske og samfunnsmessige konsekvenser rundt om i verden, som ble stadig tydeligere fra den nylige COVID-19-pandemien. Tidlig og nøyaktig diagnose er avgjørende for behandling av virusinfeksjoner samtidig som det forhindrer spredning av virus til friske mennesker. Mens mange virusdeteksjonsmetoder er utviklet, for eksempel PCR-tester1,2 og inmunoassays3, er de fleste av de for tiden brukte metodene ikke i stand til å avgjøre om det oppdagede viruset faktisk er smittsomt eller ikke. Dette skyldes at tilstedeværelsen av komponenter av viruset alene, som viral nukleinsyre eller proteiner, ikke indikerer at det intakte, smittsomme viruset er tilstede, og nivåer av disse biomarkørene har vist dårlig korrelasjon med smittsomhet 4,5,6. For eksempel har viralt RNA, som vanligvis brukes til de nåværende PCR-baserte COVID-19-testene, svært lave nivåer i de tidlige stadiene av infeksjon når pasienten er smittsom, mens RNA-nivået ofte fortsatt er veldig høyt når pasientene har kommet seg etter infeksjonen og ikke lenger er smittsomme 7,8. Det virale proteinet eller antigenbiomarkørene følger en lignende trend, men vises vanligvis enda senere enn det virale RNA og er dermed enda mindre prediktive for smittbarhet 6,9. For å løse denne begrensningen er det utviklet noen metoder som kan informere om virusets smittsomhetsstatus, men er basert på cellekulturmikrobiologiske teknikker som krever lang tid (dager eller uker) for å oppnå resultater 4,10. Dermed kan utvikling av nye sensorer som kan informere om smittbarheten av kliniske eller miljømessige prøver, unngå forsinkelser i behandling og videre spredning av viruset. Imidlertid kan svært få metoder oppnå sensing molekyler som kan gjenkjenne en intakt smittsom virion og skille den fra det samme viruset som har blitt gjort ikke-smittsom.

I denne sammenheng er aptamere spesielt godt egnet som et unikt biomolekylært verktøy11,12,13,14. Aptamerer er korte, enkeltstrengede DNA- eller RNA-molekyler med en spesifikk nukleotidsekvens som lar dem danne en spesifikk 3D-konformasjon for å gjenkjenne et mål med høy affinitet og selektivitet15,16. De oppnås ved en kombinatorisk utvelgelsesprosess kalt systematisk evolusjon av ligander ved eksponentiell anrikning (SELEX), også kjent som in vitro-seleksjon, som utføres i reagensrør med et stort tilfeldig DNA-prøvetakingsbibliotek på 10 14-1015 sekvenser17,18,19. I hver runde av denne iterative prosessen blir DNA-poolen først utsatt for et seleksjonstrykk gjennom inkubasjon med målet under de ønskede forholdene. Eventuelle sekvenser som ikke er bundet til målet blir deretter fjernet, og etterlater bare de få sekvensene som er i stand til å binde under de gitte forholdene. Til slutt forsterkes sekvensene som er valgt i forrige trinn av PCR, beriker befolkningen i bassenget med de ønskede funksjonelle sekvensene for neste valgrunde, og prosessen gjentas. Når aktiviteten til utvalgsbassenget når et platå (vanligvis etter 8-15 runder), analyseres biblioteket ved DNA-sekvensering for å identifisere de vinnende sekvensene som viser høyest affinitet.

SELEX har unike fortrinn som kan utnyttes til å få økt selektivitet mot andre lignende mål20,21, for eksempel for virusets smittsomhetsstatus 22. For det første kan et bredt utvalg av forskjellige typer mål brukes til utvelgelsen, fra små molekyler og proteiner til hele patogener og celler16. For å oppnå en aptamer som binder seg til et smittsomt virus, kan et intakt virus brukes som mål, i stedet for et viralt overflateprotein19. Hele viruset SELEX tillater valg av aptamere som binder seg spesifikt til virusets opprinnelige tilstand uten behov for forstyrrelse av viruset. For det andre kan SELEX skreddersys for å fjerne konkurrerende mål21,23, for eksempel andre lignende virus eller ikke-smittsomme inaktiverte virus, ved hjelp av tellerutvelgelsestrinn i hver runde av utvalg 22. Under tellerutvelgelsestrinnene blir DNA-poolen utsatt for mål som binding ikke er ønskelig for, og eventuelle sekvenser som binder blir forkastet.

I dette arbeidet gir vi en protokoll som generelt kan brukes til å velge aptamere som binder seg til et smittsomt virus, men ikke til det samme viruset som har blitt gjort ikke-smittsomt ved en bestemt desinfeksjonsmetode eller til et annet relatert virus. Denne metoden gjør det mulig å oppnå anerkjennelsesmidler basert på funksjonelle forskjeller i virusoverflaten, som ikke trenger å være kjent på forhånd, og gir derfor en ekstra fordel for påvisning av nylig oppståtte patogener eller for understuderte sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av reagenser og buffere

  1. Forbered 10x Tris-borat EDTA (10x TBE) ved å tilsette 0,9 M Tris-base, 0,9 M borsyre, 20 mM EDTA (dinatriumsalt) og avionisert vann til et endelig volum på 1 L. Bland til alle komponentene er oppløst.
  2. Forbered en 10% denaturerende polyakrylamidoppløsning som følger. I en 250 ml glassflaske, tilsett 120 g urea (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% akrylamid/bisakrylamid (29:1) oppløsning og nok destillert vann til å nå det endelige volumet på 250 ml. Bland til alle komponentene er oppløst.
  3. Forbered 2x lastebuffer som følger. I et 50 ml rør, tilsett 21,636 g urea (8 M), 1,675 g EDTA (1 mM) og 4,5 ml 10x TBE. Fyll til 45 ml med destillert vann og bland til alle komponentene er oppløst.
  4. Klargjør ekstraksjonsbufferen ved å tilsette 100 mM natriumacetat og 1 mM EDTA (dinatriumsalt). Sett den endelige pH til 5.
  5. Forbered etanolutfellingsløsninger som følger. Tilbered 3 M natriumacetat, juster til pH 5,2 og oppbevares ved 4 °C. Tilbered 70 % etanol v/v og oppbevares ved -20 °C. Tilbered 100 % etanol og oppbevar ved -20 °C.
  6. Klargjør 500 ml SELEX buffer inneholdende 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2 og 0,5 mM CaCl2. Juster til pH 7,4. Forbered 100 ml SELEX-buffer med 8 M urea ved å tilsette 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2 og 8 M urea. Juster til pH 7,4.
    MERK: Valget av SELEX-buffer er avgjørende for å sikre at den valgte aptameren vil fungere på den endelige prøven der aptameren skal påføres. For eksempel vil aptamere som er spesifikke for SARS-CoV-2 bli brukt i biologiske prøver (f.eks. spytt eller nasopharynges vattpinner). Derfor er det viktig å velge ionkonsentrasjoner, pH og buffer som nøye etterligner disse forholdene i de tiltenkte biologiske prøvene.
  7. Forbered bindings- og vaskebufferen som følger. I et 50 ml rør, lag 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA (dinatriumsalt) og 2 M NaCl. Juster til pH 7,5.

2. Design og syntese av DNA-bibliotek og primere

  1. Design det opprinnelige ssDNA-biblioteket og primere med følgende kriterier (se tabell 1 for et eksempel på ssDNA-bibliotek og sett med primere, hvor N indikerer en tilfeldig nukleotidposisjon).
    1. Sørg for at biblioteket inneholder et sentralt tilfeldig område på 35 til 60 nukleotider flankert av to konstante sekvenser ved 3' og 5' endene som fungerer som primerregioner for forsterkning. En typisk biblioteklengde er 45 tilfeldige nukleotider.
    2. Forsikre deg om at omvendt primer inneholder en biotinmodifisering for å skille ssDNA fra forsterkede dobbeltstrengede PCR-produkter ved bruk av streptavidinbelagte perler under in vitro-utvelgelsesprosessen.
  2. Kjøp DNA-oligoene fra kommersielle kilder med standard avsaltingsrensing. Rens ssDNA-biblioteket og primere med 10% denaturerende polyakrylamidgelelektroforese (dPAGE), etterfulgt av etanolutfelling i henhold til standardprosedyrer24.
    FORSIKTIG: Akrylamidmonomer og ethidiumbromid er farlige kjemikalier (kreftfremkallende stoffer for mennesker), så bruk egnet personlig verneutstyr (laboratoriefrakker, hansker og øyevern) mens du utfører PAGE. Når det er mulig, unngå å bruke ethidiumbromid og erstatt det med et sikrere fargestoff.
    MERK: Det er mulig å bestille oligoene med HPLC-rensing for å unngå å utføre dette rensetrinnet, selv om dette ikke vil fjerne korte oligonukleotider like effektivt.
  3. Tilsett nukleasefritt vann for å resuspendere ssDNA etter etanolutfelling opp til ønsket konsentrasjon (100 μM). Bestem konsentrasjonen av ssDNA-biblioteket og primere ved UV-absorpsjon ved λ = 260 nm. Oppbevares ved -20 °C.
  4. Kjøp en umodifisert omvendt primer som skal brukes til klargjøring av sekvenseringsbibliotek med høy gjennomstrømning og qPCR-kvantifisering.

3. Smittsomme og ikke-smittsomme virusprøver

FORSIKTIG: De smittsomme og ikke-smittsomme virusprøvene er biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) prøver som krever ekstra forsiktighet for å håndtere trygt og hensiktsmessig. Alle trinn i prosedyren som inkluderer disse prøvene må utføres i et biosikkerhetsskap, eller virusoppløsningen må være i en forseglet beholder (f.eks. kappede plastrør).

  1. Få en stamløsning av smittsomme virus eller klargjør dem ved å følge den tilsvarende protokollen for hvert virus. SARS-CoV-2-, SARS-CoV-1- og H5N1-pseudovirusene som ble brukt her, ble levert av professor Lijun Rongs laboratorium (UIC) i PBS-buffer, og ble utarbeidet etter de rapporterte protokollene22,25,26.
    MERK: For virus som krever biosikkerhetsnivå 3-fasiliteter for å håndtere det intakte smittsomme viruset, er det mulig å arbeide med pseudovirus. Et pseudotypt virus genereres fra et lentivirus (HIV) som viser virusets overflateproteiner i den virale konvolutten, og dermed etterligner virusets overflate og inngangsmekanisme, men er defekt i kontinuerlig viral replikasjon.
  2. Skaff en ikke-smittsom virusoppløsning eller klargjør den ved å følge desinfeksjonsprosedyren. Den UV-inaktiverte SARS-CoV-2 pseudovirusstammen (p-SARS-CoV-2) som ble brukt her, ble levert av Prof. Rong lab (UIC) i PBS-buffer, og den tidligere rapporterte protokollen ble brukt for UV-inaktivering22.
    MERK: Hvis mulig, utfør en analyse for å teste virusets smittsomhet for å sikre at viruset er fullstendig inaktivert.
  3. Kvantifisere virusaksjene
    1. Kvantifiser viruset ved hjelp av en plakkanalyse i henhold til standard prosedyrer27,28,29. Denne analysen tillater ikke bare kvantifisering av viruset, men indikerer også virusets smittsomhetsstatus, og bekrefter konsentrasjonen av smittsomt virus.
    2. For pseudovirus eller virus der en plakkanalyse ikke er tilgjengelig, kvantifiser viruset ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig kvantitativt lentivirus ELISA-sett.
    3. Klargjøre 1 x 108 eksemplarer/ml stamløsning for p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 og p-H5N1. Hver stamoppløsning skal separeres i alikoter som inneholder 50 μL hver, og holdes ved -80 °C. Tine en ny aliquot før hvert eksperiment.

4. In vitro-valg eller SELEX-prosess: innledende runde

MERK: For alle trinnene som bruker det smittsomme viruset, arbeid i et BSL2-skap.

  1. Denaturere ssDNA-biblioteket. Ta 10 μL av 100 μM av ssDNA-biblioteket (1 nmol) og bland med 240 μL SELEX-buffer. Varm opp ved 95 °C i 15 minutter i tørt bad, og legg deretter tuben på is i 15 minutter.
  2. Inkuber ssDNA-biblioteket med det smittsomme viruset (positivt utvalgstrinn) som følger. Bland 250 μL ssDNA-bibliotek i SELEX buffer fra trinn 4.1 med 50 μL infeksiøst virus (1 x 10,8 kopier/ml). Inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
  3. Blokker de uspesifikke stedene i sentrifugefiltre som følger. Mens du venter på trinn 4.2, klargjør du sentrifugefiltrene for de neste trinnene.
    1. Tilsett 400 μL 1 mM T20-sekvens (tabell 1) til hvert 0,5 ml sentrifugefilter som skal brukes - ett sentrifugefilter med en grenseverdi på 100 kDa og ett med en grenseverdi på 10 kDa.
    2. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur og sentrifuge ved 14 000 x g i 10 minutter for å fjerne T20-løsningen i filteret. Vask 3x med SELEX-buffer for å fjerne overflødige T20-sekvenser.
  4. Vask ubundne sekvenser som følger. Tilsett blandingen inkubert i trinn 4.2 til det blokkerte 100 kDa sentrifugefilteret og sentrifuger ved 14 000 x g i 10 minutter. Vask 3x, tilsett 400 μL SELEX-buffer og sentrifuger ved 14 000 x g i 10 minutter. Hold brøkdelen i filteret og kast gjennomstrømningen.
  5. Elute bundne sekvenser som beskrevet nedenfor.
    1. Bytt oppsamlingsrøret til sentrifugefilteret og tilsett 300 μL SELEX-buffer inneholdende 8 M urea til sentrifugefilteret i trinn 4.4. Varm sentrifugefilteret ved 95 °C i 15 minutter i et tørt bad og sentrifuger deretter ved 14 000 x g i 10 minutter.
    2. Samle fraksjonen som strømmet gjennom filteret som inneholder de eluerte sekvensene. Gjenta ytterligere tre ganger. Arbeid i et BSL2-skap og vask alle materialer med 10% blekemiddel for å inaktivere viruset før du kaster materialene.
  6. Konsentrer deg og desalt som følger. Tilsett løsningen samlet i 4,5 til et blokkert 10 kDa sentrifugefilter. Sentrifuge ved 14 000 x g i 15 min. Kast brøkdelen som strømmet gjennom filteret.
    MERK: Siden virusene beholdes og inaktiveres med 8 M urea i filteret i forrige trinn, trenger ikke dette og følgende trinn utføres i biosikkerhetsskapet. Denne prosedyren må gjentas hvis et 0,5 ml sentrifugerør brukes til all oppløsningen er samlet opp som i trinn 4,5, 1,2 ml strømmer gjennom filteret.
  7. Vask 3x med 300 μL SELEX-buffer for å fjerne urea ved sentrifugering ved 14 000 x g i 15 minutter. Kast brøkdelen som strømmet gjennom filteret. Gjenvinn løsningen i filteret ved å snu den opp ned i et rent oppsamlingsrør og sentrifugere i 5 minutter.
  8. Mål det endelige volumet av den gjenvunnede løsningen fra 4,7 ved hjelp av en pipette i et plastrør. Denne løsningen kalles R i a, hvor i tilsvarer det runde tallet. Vanligvis oppnås volumer mellom 30 μL og 50 μL. Ta 1 μL av det eluerte ssDNA for å kvantifisere mengden DNA ved qPCR.
    MERK: Dette er et mulig pausepunkt, der R1a-prøven kan holdes ved -20 °C for å fortsette på et annet tidspunkt.
  9. Utfør PCR-forsterkning som beskrevet nedenfor.
    1. I første runde, ta 90% av R1en prøve som en PCR-mal. I de påfølgende rundene tar du 60 % av totalvolumet i trinn 4.8 for å utføre PCR og lagrer den andre fraksjonen ved -20 °C.
    2. Sett opp en 50 μL PCR-reaksjon med følgende som har den angitte endelige konsentrasjonen: 1x PCR-reaksjonsbuffer, 200 μM dNTP, 10 μL DNA-mal (R 1 en prøve),200 nM hver primer og 1,25 U-polymerase (2,5 U / μL-lager).
    3. Optimaliser PCR-forholdene, inkludert antall sykluser og glødetemperatur for hvert sett med primere og ssDNA-bibliotek. Unngå å bruke for mange sykluser, noe som vil produsere uønskede PCR-underprodukter som primer-dimerer. Test forskjellige glødetemperaturer basert på smeltetemperaturen til primerne.
    4. Kjør PCR ved hjelp av optimaliserte forhold ved 95 °C i 5 minutter etterfulgt av 18 sykluser på 1 min ved 95 °C, 30 s ved 52 °C og 1 min ved 72 °C, med et siste forlengelsestrinn ved 72 °C i 10 minutter, for å oppnå dsDNA-bassenget.
      MERK: Dette er et annet mulig pausepunkt, der PCR-produktet kan holdes ved -20 °C for å fortsette på et annet tidspunkt.
  10. Gjenopprett ssDNA ved hjelp av streptavidin-modifiserte magnetiske perler.
    1. Ta 80% av PCR-produktet. Oppbevar resten av fraksjonen ved -20 °C.
    2. Del PCR-produktet i alikoter på 50 μL og legg dem til mikrofugerør som inneholder 50 μL streptapavidinmodifiserte magnetiske perler (MB). Inkuber i 30 minutter med mild omrøring (bruk for eksempel en roterende shaker) ved romtemperatur. Plasser deretter mikrofugerøret på magnetstativet for å isolere MB og fjerne supernatanten ved pipettering (det må være en klar oppløsning).
    3. Vask ved å tilsette 200 μL bindings- og vaskebuffer til røret. Fjern røret fra magnetstativet, bank på røret og resuspender MB til en homogen løsning ved pipettering. Plasser mikrofugerøret tilbake på magnetstativet for å isolere MB og fjerne supernatanten ved pipettering. Gjenta dette vasketrinnet to ganger.
    4. Når vaskingen er fullført, resuspenderes MB i totalt 100 μL SELEX-buffer og varmer oppløsningen til 95 °C i 10 minutter. Plasser umiddelbart røret i magnetstativet før røret avkjøles og ta supernatanten som inneholder ssDNA-bassenget. Gjenta dette gjenopprettingstrinnet, og legg til 50 μL SELEX-buffer.
  11. Mål det endelige volumet av den gjenvunnede fraksjonen fra 4,10 ved hjelp av en pipette. Denne brøken heter R ix, hvor i tilsvarer det runde tallet. Generelt oppnås volumer mellom 140 og 150 μL. Ta 1 μLR1x for å kvantifisere mengden DNA ved qPCR.

5. Senere utvelgelsesrunder

  1. Denaturere ssDNA-bassenget. Ta 60% av prøven R1x og bland med 50 μL SELEX buffer. Varm opp ved 95 °C i 15 minutter i tørt bad. Legg røret på is i 15 min.
  2. Inkuber ssDNA-bassenget med det ikke-smittsomme viruset og andre potensielle forstyrrende virus (tellervalgstrinn). Bland det denaturerte ssDNA-bassenget i SELEX-buffer fra 5,1 med 50 μL av hvert virus (5 x 109 kopier/ml; f.eks. ikke-infeksiøs p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 og p-H5N1). Inkubere i 1 time ved romtemperatur.
  3. Blokker ikke-spesifikke steder i sentrifugefiltre. Mens du venter på trinn 5.2., klargjør du sentrifugefiltrene for de neste trinnene. Bruk vanligvis to sentrifugefiltre, ett med en grenseverdi på 100 kDa og ett med en grenseverdi på 10 kDa. Følg samme fremgangsmåte som i 4.3.
  4. Vask bort sekvensene som er bundet til ikke-målvirus. Legg blandingen inkubert i trinn 5.2 til et blokkert 100 kDa sentrifugefilter. Sentrifuge ved 14 000 x g i 10 min og gjenvinne fraksjonen som strømmer gjennom sentrifugefilteret. Vask 2x, tilsett 100 μL SELEX-buffer og sentrifuger ved 14 000 x g i 10 minutter. Behold brøkdelen som strømmet gjennom filteret.
  5. Inkuber ssDNA-bassenget med det smittsomme viruset (positivt utvalgstrinn). Ta 300 μL fraksjon fra trinn 5,4 og bland med 50 μL infeksjonsvirus (1 x 10,8 kopier/ml). Inkuber i 2 timer ved romtemperatur. Følg trinn 4.4 til 4.11.

6. Overvåking av SELEX-prosessen

MERK: For å overvåke anrikningen av bassenget brukes qPCR på to måter. For det første, ved absolutt kvantifisering, er det mulig å teste anrikningen av bassengene (elueringsutbytte). For det andre, ved å overvåke smeltekurven, kan mangfoldet av bassengene (konvergens av aptamerartene) evalueres30.

  1. Utfør alle qPCR-analysene med et 10 μL reaksjonsvolum i 96-brønnsplater designet for qPCR.
  2. Forbered en standard qPCR-blanding som inneholder 5 μL masterblanding, 0,3 μL 500 nM av hver umerket primer, 3,4 μLH2Oog 1 μL DNA-mal.
    1. Forbered fortynninger av renset ssDNA-bibliotek (trinn 2.3) for å kjøre standardkurven.
    2. Fortynn DNA-prøvene for å få konsentrasjonen til å passe i standardkurven. For Ria-prøver, tilsett 1 μL av prøven uten fortynning og 1 μL 1:10 fortynning til qPCR-blandingen. For Rix-prøver, inkluder 1:10 eller 1:100 fortynninger.
  3. Kjør qPCR ved å angi følgende protokoll. Sett først et innledende denatureringstrinn ved 98 °C i 2 minutter. Sett deretter 40 sykluser med denaturering ved 98 ° C i 5 s og glødning og forlengelse ved 52 ° C i 10 s. Sett til slutt en smeltekurveanalyse fra 65 til 95 °C. Bestem verdier for terskelsyklus (Ct) ved hjelp av automatisert terskelanalyse.
  4. Bruk standardkurven til å kvantifisere mengden ssDNA i Ri a og Rix prøver.
  5. Beregn elueringsutbyttet som mengden bundet DNA (antall mol i R i a) delt på mengden innledende DNA (antall mol i Ri-1x). Plott elueringsutbyttet vs det runde tallet for å se om en anrikning over rundene blir observert.
  6. Plott smeltekurvene for forskjellige runder. En overgang til høyere smeltetemperaturer i toppen nær 75/85 °C forventes etter hvert som antall runder øker. Dette betyr at mangfoldet i bassenget minker.

7. Sekvensering av høy gjennomstrømning

  1. Rådfør deg med høykapasitetssekvenseringsanlegget om hvilke sekvenseringstyper og skalaer som er tilgjengelige, som vil bestemme bibliotekets forberedelsesmetode.
    MERK: Denne avgjørelsen vil ta hensyn til både lengden på bassengene som skal sekvenseres (inkludert primerne) og antall bassenger som skal sendes inn (sikt generelt på minst 1 x 105-10 6 sekvenser per basseng). Hvis en bestemt sekvenseringsskala ikke kan lese hele lengden av bassenget, kan parret sekvensering brukes til å lese fra begge ender av sekvensen, i motsetning til enkeltender som leser fra bare den ene enden.
  2. Velg et passende kommersielt tilgjengelig sett basert på sekvenseringstypen, i samråd med sekvenseringsanlegget. Forbered flere puljer med utvalgsrunder som representerer høy, middels og lav berikelse, samt det endelige bassenget, ved hjelp av et annet par indekser i adapterne for hvert basseng som tillot prøveanalyse av alle runder ved hjelp av ett felt.
    MERK: PCR-forsterkning kan også brukes til å innlemme adaptere og indekser som kreves for sekvensering av høy gjennomstrømning, men dette koster generelt på samme måte som de kommersielle settene og fungerer ikke bedre.
    1. Utfør bibliotekklargjøring ved å følge disse trinnene: avslutte reparasjon av fragmentert DNA, adapterligering og PCR-amplifikasjon for å produsere de endelige bibliotekene.
    2. Rens PCR-produktet med magnetiske DNA-renseperler i henhold til produsentens instruksjoner.
    3. Kvantifiser DNA ved hjelp av et fluorescensbasert kvantifiseringssett. Unngå å bruke mindre nøyaktige metoder, for eksempel UV-målinger med lite volum.
    4. Bland omtrent like mengder (etter mengde DNA, ikke volum) av hvert bassengbibliotek som inneholder spesifikke indekser.
    5. Kontroller kvaliteten på det endelige biblioteket med qPCR-kvantifisering og en DNA-fragmentanalysator. Dette trinnet utføres ofte av sekvenseringsanlegget.
      MERK: Sekvenseringsanleggspersonell kan gi nyttig informasjon om hvordan man klargjør biblioteket og hvilke kvalitetskontroller som foreslås. Det er nødvendig å diskutere med dem før du forbereder bibliotekene.
  3. Send det forberedte endelige biblioteket til sekvenseringsanlegget etter deres krav.

8. Sekvensering analyse

  1. Det meste av programvare tilgjengelig for sekvenseringsanalyse er designet for å kjøres på kommandolinjen på et Linux-operativsystem. For små datasett, sett opp ønsket Linux-operativsystem og installer nødvendige programmer på en personlig datamaskin; for større datasett kjøres HTS-analyse på databehandlingsressurser med høy ytelse eller superdatamaskiner (anbefales).
    MERK: Tilgang og opplæring vil være nødvendig for å bruke databehandlingsressurser med høy ytelse, noe som kan ta litt tid å få tak i. I tillegg vil grunnleggende kunnskap om UNIX-kommandolinjebruk være nødvendig. Mange ledige ressurser på grunnleggende kommandolinjebruk er tilgjengelige online, og databehandlingsressursene vil sannsynligvis gi ytterligere informasjon for bruk av systemene sine.
  2. Få tilgang til sekvensfilene, vanligvis i et komprimert FastQ-filformat, ved hjelp av informasjonen fra sekvenseringsanlegget.
    1. Bruk en FTP-klient til å overføre filene til din egen datamaskin og/eller databehandlingsressursen med høy ytelse. Mange sekvensanalyseprogrammer kan bruke komprimerte filer direkte, så hold filene komprimert, om mulig, for å begrense filstørrelsene (store sekvensavlesninger på 50 M+ sekvenser kan ta opp 100 Gb+ filplass når de ikke komprimeres).
    2. Hvis sekvensfiler må dekomprimeres, bruk gzip-funksjonen som er standard på de fleste Linux-installasjoner. Få ytterligere informasjon om gzip og dets alternativer fra den installerte håndboken ved å skrive "man gzip" på kommandolinjen.
  3. Rydd opp sekvensene før analyse ved å demultiplekse, fjerne sekvenseringsadapterne, fjerne lavkvalitetsavlesninger og inkludere både fremover- og reversretningsavlesninger.
    1. Bruk FastQC-programmet31 etter hvert av følgende trinn for å få grunnleggende kvalitetskontrollinformasjon om sekvensene for å vurdere effektiviteten til hvert oppryddingstrinn.
    2. Demultiplekser sekvensene for å skille alle sekvenser fra en enkelt lesefil i de forskjellige utvalgene basert på indeksene som er inkludert i sekvenseringsadapterne. Dette trinnet utføres ofte av sekvenseringsanlegget, som bør konsulteres, da den nøyaktige prosedyren vil avhenge av sekvenseringsmaskinen som brukes.
    3. Fjern sekvenseringsadapterne ved hjelp av kommandolinjeprogrammet Cutadapt32. Bruk valgprimerne (i stedet for sekvenseringsadaptere) som inngang i koblet adaptermodus. Bruk alternativet --discard-untrimmed for å forkaste sekvenser som ikke inneholder de merkede primerne.
    4. Angi alternativer for maksimal feilfrekvens som skal samsvare med kortene, og minimum og maksimum lengde på sekvenser som skal godtas. Hvis du bruker sammenkoblede sluttavlesninger, legger du inn spesifikke parametere som er tilgjengelige og gir både Les 1- og Les 2-sekvenseringsfilene. Angi flere parametere etter behov ved å referere til Cutadapt manual32.
      MERK: Ligeringen av sekvenseringsadaptere til bassenger er retningsuavhengig og vil innlemme omtrent 50% av sekvensene i fremoverretningen og 50% i motsatt retning. For å unngå å miste 50% av sekvensene i motsatt retning, kan Cutadapt kjøres en gang til ved å bruke omvendt komplement av utvalgsprimerne som innganger.
    5. (Valgfritt) Hvis paret sekvensering brukes, slå sammen Les 1- og Les 2-filene med programmet PEAR33.
    6. Bruk FASTX-Toolkit-programmet34 for å fjerne sekvenser av lav kvalitet som har en kvalitet under en viss terskel ved ethvert nukleotid. En kvalitetscut-off score på 30 er et godt utgangspunkt. Hvis den generelle kvaliteten generelt er god, kan dette trinnet hoppes over.
    7. Hvis du vil slå sammen sekvensfilene i motsatt retning med filene i retning fremover, bruker du FASTX-Toolkit-funksjonen fastx_reverse_complement på filene i motsatt retning. Bruk deretter det innebygde kattprogrammet (standard på de fleste Linux-installasjoner) for å slå sammen filer med fremover og omvendt komplement til en enkelt fil.
  4. For å analysere berikelsen av sekvenser på tvers av forskjellige utvalgsutvalg, bruk FASTAptamer analyseverktøysett35.
    1. Bruk FASTAptamer-Count til å telle antall ganger hver sekvens vises. Deretter rangerer og sorterer du sekvensene etter overflod. Telleutdatafilen kreves som inndata for alle andre FASTAptamer programmer.
    2. Bruk FASTAptamer-Clust til å gruppere alle sekvenser i en fil i klynger med nært beslektede sekvenser. Bruk parameteren "avstand" for å definere antall enkeltnukleotidmutasjoner eller indels som er tillatt å gruppere i en klynge.
      MERK: FASTAptamer-Clust-programmet kan være veldig beregningsmessig dyrt hvis et høyt antall unike sekvenser er til stede (spesielt for tidlige runder), som kan ta dager eller uker å fullføre. Filterparameteren cut-off kan brukes til å ekskludere sekvenser med lav overflod fra klynger. Generelt er det godt å starte med en høyere cut-off, for eksempel 10 eller 5 leser per million (RPM) og redusere den hvis programmet fullfører raskt. Hvis bassengene er svært heterogene, kan det ikke være mulig å gruppere sekvensene i en rimelig tidsramme.
    3. Bruk FASTAptamer-Enrich til å beregne anrikningen av hver sekvens som finnes i mer enn én runde av utvalget. Sammenlign RPM for sekvensen fra en populasjon med RPM i en annen. Bruk Enrich-programmet på enten telle- eller klyngefilene. Utdataene er en tabulatordelt fil (.tsv) som kan åpnes i hvilken som helst regnearkprogramvare for videre analyse og enkel sortering.
      MERK: FASTAptamer-Berich-programmet kan også være veldig beregningsmessig dyrt hvis et høyt antall unike sekvenser er til stede. Avskjæringsfilterparameteren kan brukes til å ekskludere sekvenser med lav overflod fra utdataene for å unngå filer som er for store til å åpnes i regnearkprogramvare.
    4. (Valgfritt) Hvis mange bassenger er for heterogene (mange unike sekvenser og få dupliserte sekvenser), er det kanskje ikke mulig å bruke verken Clust- eller Enrich-programmene. I dette tilfellet utfører du en manuell berikelseskontroll ved hjelp av utdatafilen Count som sorterer sekvenser etter overflod (mest tallrike øverst) og gir nytt navn til sekvensidentifikatoren for å inkludere viktig informasjon som RPM.
      1. Bruk standard Linux "head" -programmet på tellefilene for å få en liste over de mest omfattende sekvensene. Bruk deretter standard Linux "grep"-program for å søke i hver av de mest tallrike sekvensene i tellefilene til alle de andre relevante utvalgene. Hvis det er noen treff, bruker du den endrede sekvensidentifikatoren til å bestemme RPM i det utvalget, for å konstruere berikelsesinformasjonen manuelt.
        MERK: Skript for alle sekvenseringsanalysetrinnene finner du i tilleggskonteringsfilene 1-11.

9. Validering og analyser av aptamerbinding

  1. Fra berikelsesinformasjonen oppnådd gjennom sekvensanalyse, identifiser kandidataptamersekvenser basert på sekvenser som har mest berikelse over påfølgende utvalgsrunder og / eller de mest tallrike sekvensene i den endelige utvelgelsesrunden. Velg flere forskjellige kandidatsekvenser (minst 10-20) for videre testing, da de mest berikede ikke nødvendigvis er de beste aptamerne.
  2. Utfør innledende screening av kandidataptamere ved hjelp av en bindingsanalyse som kan utføres raskt for flere prøver. En kolonnebasert ultrafiltreringsbindingsanalyse36 eller enzymbundet oligonukleotidanalyse (ELONA) er gode metoder for denne første screeningen.
  3. Analyser spesifisiteten og affiniteten til sekvensene som viser den beste bindingsaktiviteten fra den første screeningen, ved å bruke minst to uavhengige bindingsanalyser (f.eks. MicroScale Thermophoresis (MST) 37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay (ELONA) 39, overflateplasmonresonans 40 eller biolagsinterferometri (BLI)41).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Siden DNA-aptamere kan oppnås ved bruk av SELEX i et reagensrør15, ble denne SELEX-strategien nøye utformet for å inkludere både positive seleksjonstrinn mot det intakte, hele smittsomme viruset (dvs. beholde DNA-molekylene som binder seg til det smittsomme viruset), samt motvalgstrinn for det samme viruset som har blitt gjort ikke-smittsomt ved en bestemt desinfeksjonsmetode, nærmere bestemt UV-behandling, ved å forkaste DNA-sekvensene som kan binde seg til det ikke-smittsomme viruset. En skjematisk fremstilling av utvelgelsesprosessen er vist i figur 1.

Som representative resultater av denne protokollen valgte vi valg av aptamer for infeksiøs sars-CoV-2. På grunn av kravet om biosikkerhetsnivå 3 (BSL3) arbeidsforhold for å håndtere den intakte, smittsomme SARS-CoV-2, har vi i stedet valgt å jobbe med et pseudotypt virus. Pseudotypede virus genereres fra et relativt ufarlig ryggradsvirus, i dette tilfellet en type lentivirus (HIV), som har blitt modifisert for å vise overflateproteinet til et annet virus av interesse i sin virale konvolutt, slik at det kan etterligne overflaten og inngangsmekanismen til det ønskede viruset uten risikoen forbundet med å arbeide med farlige humane patogener. Det er viktig at disse pseudovirusene er modifisert for å være defekte i kontinuerlig viral replikasjon25,42. I dette arbeidet ble det brukt tre forskjellige pseudotypede virus: p-SARS-CoV-2, hvor SARS-CoV-2 piggproteiner (S) er inkorporert i konvolutten; p-SARS-CoV-1, som inneholder SARS-CoV-1 pigg (S) protein; og p-H5N1, som inneholder hemagglutinin og neuraminidase isolert fra det høypatogene fugleinfluensaviruset A/Goose/Qinghai/59/05 (H5N1)-stammen.

I de to første utvelgelsesrundene ble det ikke inkludert noe tellerutvelgelsestrinn for å minimere den uspesifikke fjerningen av DNA-bindemidler som vanligvis bare er til stede som enkeltkopier i startrundene. Etter de to første rundene ble positive og motvalgstrinn inkludert i hver runde for å oppnå en høy selektivitet. For motseleksjon ble p-SARS-CoV-2 som var gjort ikke-infeksiøs ved UV-behandling, samt p-SARS-CoV-1 og p-H5N1 brukt for å oppnå selektivitet mot andre virus.

For å overvåke seleksjonsfremdriften ble kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) brukt. Denne teknikken representerer en enkel metode som ikke krever merking av bassenget og kan generelt brukes på praktisk talt alle mål30. Den utnytter to funksjoner i qPCR-teknikken. For det første muligheten for absolutt kvantifisering ved hjelp av en standardkurve for å beregne elueringsutbyttet, definert av ssDNA bundet til det smittsomme viruset over det totale tilsatte ssDNA. Våre resultater viste at elueringsutbyttet i utgangspunktet økte med hver tidlige runde av SELEX og flatet ut i runde 8 og 9 (R8 og R9), noe som tyder på en anrikning av bassengene i sekvenser som binder seg til det smittsomme viruset (figur 2A). For det andre gir smeltekurver for hver runde av DNA-bassenget ytterligere bevis på sekvensdiversiteten til bassengene30. Ved å sammenligne smeltekurvene kan man observere et skifte fra toppen ved høy smeltetemperatur (T m) fra 77 °C til 79 °C, noe som tyder på at DNA-poolen har konvergert fra tilfeldige sekvenser med lav T m til mer konserverte sekvenser med høyere T m (figur 2B). Videre, i de siste rundene (R8 og R9), vises en topp ved lav Tm (~ 70 ° C). Dette kan være relatert til produksjon av primer-dimerer under PCR. En mulig løsning for å unngå dette er å redusere antall sykluser under PCR (for eksempel fra 18 sykluser til 12 eller 15 sykluser).

Etter å ha bekreftet en anrikning av bassenget ved qPCR, brukte vi høykapasitetssekvensering (HTS) for runde 3, 5, 7, 8 og 9 av SELEX for å finne ut hvilke sekvenser som er ansvarlige for bindingen av virusmålet. Sammenlignet med tradisjonelle kloning-sekvenseringsprosedyrer, tillater HTS utviklingen av individuelle sekvenser over flere valgrunder som skal overvåkes, for endelig å identifisere aptamersekvensene som er beriket over påfølgende runder. Figur 3A viser relativ tallrikhet (i avlesninger per million) for sekvensen SARS2-AR10, oppnådd over påfølgende utvalgsrunder. Den sekundære strukturen til SARS2-AR10 forutsies av Mfold-programvaren, og resultatene (figur 3B) viser en strukturert sekundærstruktur som inneholder en stammesløyferegion som kan være involvert i å gjenkjenne viruset. Ytterligere karakterisering av affinitetsbindingen av denne sekvensen er rapportert tidligere22. Mikroskalatermoforese (MST) og en enzymbundet oligonukleotidanalyse (ELONA) viste at SARS2-AR10-aptameren binder seg til den infeksiøse p-SARS-CoV-2 med Kd = 79 ± 28 nM, og binder seg ikke til den ikke-infeksiøse p-SARS-CoV-2 eller til andre koronavirus som p-SARS-CoV-1 og 229E.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av SELEX-prosessen hos aptamere som skiller smittsomme fra ikke-smittsomme virus. Positive og motvalgstrinn ble lagt til i hver runde etter andre runde for å oppnå høy spesifisitet mot det smittsomme viruset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Overvåking av fremdriften av SELEX av infeksiøse SARS-CoV-2-spesifikke aptamere. (A) Kvantifisering av elueringsutbyttet (dvs. det bundne ssDNA over det tilsatte ssDNA) for hver runde av SELEX ved bruk av qPCR. (B) Smeltekurve for de forskjellige bassengene under valg av SARS-CoV-2 aptamer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Anrikning og sekundærstruktur av SARS2-AR10 aptamer. Avlesninger per million (RPM) oppnådd ved analyse av HTS-dataene for SARS2-AR10-sekvensen som en funksjon av utvalgsrundene, ved bruk av FASTAptamer-Count. Innfelt: Den anslåtte mest stabile sekundærstrukturen til SARS2-AR10-sekvensen basert på UNAFold-programvaren. Beregningene ble gjort ved 25 °C, 100 mM NaCl og 2 mM MgCl2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Navn DNA-sekvens (5 'til 3')
T20 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
DNA-bibliotek ACCGTCAGTTACAATGCT- N45 -GGCTGGACTATCTGTGTA
Forovergrunning (FwdP) ACCGTCAGTTACAATGCT
Omvendt primer (RevP) Biot-TACACAGATAGTCCAGCC
SARS-AR10 CCCGACCAGCCACCATCAGCAACTCTTCCGCGTCCATCCCTGCTG
N: representerer et tilfeldig nukleotid; Biot: Biotin modifikasjon i 5'end.

Tabell 1: Liste over DNA-sekvenser.

Supplerende kodefil 1: Cutadapt_script.txt identifiserer eventuelle sekvenser i en gitt inndatafil som har de angitte forover- og bakoverprimerne, forkaster alle som ikke har primerne, og fjerner primerne fra sekvensene som hadde dem. Se referanse31 for mer informasjon om Cutadapt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 2: FASTAptamer_cluster_script.txt vil gruppere alle sekvenser fra en enkelt tellefil i familier / klynger av nært beslektede / lignende sekvenser. Dette er nyttig hvis en kandidatsekvens identifiseres, slik at andre lignende sekvenser i samme klynge også kan identifiseres som potensielle kandidater. Se referanse34 for mer informasjon om FASTAptamer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 3: FASTAptamer_count_script.txt vil telle antall forekomster av hver unike sekvens fra en gitt inndata FASTA / FASTQ-fil og produsere en utdatafil av hver unike sekvens i synkende rekkefølge (høyeste overflod til laveste overflod). Count-utdatafilene kreves som innganger for alle andre FASTAptamer programmer. Se referanse34 for mer informasjon om FASTAptamer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 4: FASTAptamer_enrich_script.txt sammenligner alle sekvenser fra to eller tre inndatafiler, gir overflod av alle unike sekvenser mellom alle filene, og gir alle kombinasjoner av parvise berikelsesverdier (i RPM) av alle sekvenser som finnes i flere filer. Se referanse34 for mer informasjon om FASTAptamer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 5: fastqc_script.txt er et kvalitetskontrollverktøy for FastQ-filer som gir lettlest kvalitetsinformasjon for sekvenseringsdata med høy gjennomstrømning, for eksempel dupliseringsnivåer, leselengder og kvalitetspoeng. Se referanse30 for mer informasjon om FastQC. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 6: FASTX_fwd_rev_merge_script.txt bruker FASTX-Toolkit til å sende ut omvendt komplement av alle sekvenser fra en gitt omvendt fil. Den bruker deretter cat-kommandoen (standard i de fleste UNIX-operativsystemer) for å slå sammen denne omvendte omvendte komplementfilen med en gitt fremoverfil med sekvenser, for å gi en enkelt fil med alle sekvenser. Se referanse33 for mer informasjon om FASTX-Toolkit. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 7: FASTX_quality_filter_script.txt bruker FASTX-Toolkit til å kontrollere kvaliteten på sekvenser i en gitt FastQ-fil og kan forkaste alle sekvenser som er av lav kvalitet. Denne metoden er generelt bedre enn trimmemetoder for kvalitetsfiltrering for analyse av in vitro seleksjonssekvenser. Trimming innebærer å fjerne baser (vanligvis nær endene) av sekvenser basert på lav kvalitet, noe som er akseptabelt for genomisk sekvensering, men fordi hele sekvensen er nødvendig for funksjonelt DNA, er trimming av endene ikke nyttig. I stedet, hvis for mange baser av en sekvens er av lav kvalitet, forkastes hele sekvensen. Se referanse33 for mer informasjon om FASTX-Toolkit. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 8: grep_searcher_script.txt brukes til å søke etter en bestemt inndatasekvens i en bestemt inndatafil, og sende ut både IDen og sekvensen i en utdatafil (hvis den ble funnet i inngangen). Dette skriptet er nyttig for bassenger som er svært heterogene (dvs. har mange unike sekvenser), noe som gjør at FASTAptamer Clust tar for lang tid å kjøre ordentlig og resulterer i FASTAptamer Berik filer som er for store til å åpnes i typiske regnearkprogrammer for analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 9: gzip_compress_decompress_script.txt bruker Gzip til å komprimere eller dekomprimere filer. En komprimert fil vil vanligvis ha en .gz utvidelse lagt til filnavnet. Det anbefales å komprimere store filer for å spare filplass. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 10: PEAR_script.txt brukes bare til sammenkoblede sekvenseringsfiler og vil slå sammen Read 1-filen med den tilsvarende Read 2-filen. Se referanse32 for mer informasjon om PEAR. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 11: tar_extraction_creation_script.txt vil trekke ut eller opprette Tar-arkiver, som brukes til å samle flere filer og / eller kataloger i en enkelt fil. De komprimeres også ofte for å redusere filstørrelsen, for eksempel med bz2-komprimering, som inkludert i dette skriptet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SELEX tillater ikke bare identifisering av aptamerer med høy affinitet, i pM-nM-området 22,43,44,45, men også med høy og justerbar selektivitet. Ved å dra nytte av tellervalg kan aptamere med utfordrende selektivitet oppnås. For eksempel har Li-gruppen vist evnen til å oppnå sekvenser som kan skille patogene bakteriestammer fra ikke-patogene stammer21. Le et al. identifiserte også en aptamer som kunne skille serotyper av Streptococcus pyogenes bakterier46. Dette åpner muligheten for å integrere aptamermolekyler med unik selektivitet i forskjellige funksjonelle DNA-sensorer 12,47,48,49,50 med ny nanoteknologi22,51,52 for å konstruere sensorer for forskjellige applikasjoner, for eksempel for bærbare og raske diagnostiske tester eller for miljødeteksjon.

Protokollen som presenteres her tillater aptamere å bli oppnådd med høy selektivitet for et smittsomt virus over det samme viruset som har blitt inaktivert og dermed er ikke-smittsomt. For å oppnå slik selektivitet er SELEX-tilnærmingen i dette arbeidet basert på utformingen av tellerutvelgelsestrinnet. For det første, for et vellykket tellervalgstrinn, må et riktig valg og karakterisering av ikke-målprøver utføres. Dermed er denne metoden avhengig av å starte med kjente smittsomme og ikke-smittsomme intakte virusbestander. For det andre er et tellerutvelgelsestrinn innlemmet i hver runde av utvalget etter første runde, for å anvende strenge betingelser fra begynnelsen av utvelgelsen og for å maksimere sannsynligheten for å identifisere aptamere som kan skille mellom de små forskjellene i overflaten av viruspartikkelen fra den smittsomme og ikke-smittsomme tilstanden til det samme viruset.

I denne protokollen er fokuset på aptamerens selektivitet. Hvis det kreves sterkere aptameraffiniteter, er det mulig å øke strengheten i prosessen etter visse SELEX-runder. For eksempel, ved å redusere den smittsomme viruskonsentrasjonen og inkubasjonstiden under den positive seleksjonen, er det mulig å oppnå aptamerer med en sterkere bindingsaffinitet44.

En annen viktig faktor ved utforming av SELEX-protokollen er den endelige prøven der aptameren skal brukes. Aptamere som er spesifikke for virus, er vanligvis innlemmet i komplekse prøver (f.eks. serum-, spytt- og realvannsprøver), og dette må vurderes under aptamervalget for å øke sjansen for å oppnå funksjonelle aptamere i de endelige prøvene. Derfor er det viktig å utføre SELEX i en buffer som etterligner disse prøvene, spesielt med hensyn til kationkonsentrasjon og pH. For SARS-CoV-2-aptameren valgte vi for eksempel PBS-buffer (pH 7,4) inneholdende 2 mM MgCl 2 og 0,5 mM CaCl2 for å etterligne biologiske prøver. I tillegg, hvis andre arter i prøvene der aptameren skal påføres potensielt kan konkurrere med målet om å binde aptameren, er det mulig å minimere forstyrrelser fra disse artene ved å inkludere dem i tellerutvelgelsestrinnet, for å eliminere sekvenser som kan binde disse artene.

De vellykkede resultatene av denne SELEX-prosessen22, som har blitt brukt på forskjellige virus (adenovirus og SARS-CoV-2) og forskjellige inaktiveringsmetoder (UV-behandling og fritt klor), indikerer at denne metoden kan brukes mye for andre virus og andre inaktiveringsmetoder, og åpner et bredt spekter av applikasjoner i fremtiden. Aptamere som skiller smittsomme virus har potensial ikke bare i diagnostiske applikasjoner for å identifisere pasienter som fortsatt er smittsomme, men også i miljøapplikasjoner der prøven er definert som forurenset hvis patogenene i disse prøvene fortsatt er aktive. Dermed gir inkorporering av aptamere med evnen til å identifisere smittsomme virus i raske sensorer muligheter til å overvåke desinfeksjonsbehandlinger.

Videre var det mulig å differensiere virusets smittsomhetsstatus uten informasjon om de strukturelle forskjellene mellom de to smittsomhetstilstandene. Den eneste informasjonen som kreves er å vite at forskjellene mellom begge tilstandene er relatert til forskjeller i strukturen av molekyler på overflaten av intakte viruspartikler. Dermed er vi sikre på at samme tilnærming kan brukes til å skille varianter og serotyper av det samme viruset, hvor forskjellene skyldes små mutasjoner i rester av proteiner på overflaten av virale partikler, som ligner de som skiller virusets smittsomhetsstatus. For eksempel ser vi for oss at det vil være mulig å skaffe aptamere som er spesifikke for varianter av bekymring for SARS-CoV-2 eller andre virus, som influensa, og åpner muligheten for rask overvåking av varianter som er den største trusselen for samfunnet.

Til slutt, fordi SELEX-strategien for å skaffe aptamere som kan skille smittsomme fra ikke-smittsomme virus ikke krever noen forkunnskap om hvilke spesifikke strukturelle forskjeller som er tilstede mellom dem, kan det være mulig å bruke aptamere med denne selektiviteten for å identifisere de spesifikke overflateendringene som er ansvarlige for tap av smittsomhet fra forskjellige desinfeksjonsmetoder ved en detaljert karakterisering og identifisering av bindingsmålene til våre aptamere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke Laura M. Cooper og Dr. Lijun Rong fra University of Illinois i Chicago for å ha gitt pseudovirusprøvene som brukes i denne protokollen (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), samt Dr. Alvaro Hernandez og Dr. Chris Wright fra DNA Services-anlegget til Roy J. Carver Biotechnology Center ved University of Illinois i Urbana-Champaign for deres hjelp med høykapasitetssekvensering, og mange medlemmer av Lu-gruppen som har hjulpet oss med in vitro-seleksjon og aptamer-karakteriseringsteknikker. Dette arbeidet ble støttet av et RAPID-stipend fra National Science Foundation (CBET 20-29215) og et frøstipend fra Institute for Sustainability, Energy and Environment ved University of Illinois i Urbana-Champaign og Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). ASP takker PEW Latin American Fellowship for økonomisk støtte. Vi takker også Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) for støtte til Lu-gruppens forskningsprogram ved University of Texas i Austin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678 (2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230 (2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070 (2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334 (2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966 (2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Tags

Bioteknologi utgave 187 in vitro seleksjon aptamer viral smittsomhetsstatus tellervalg intakt virus
In vitro utvalg av aptamere for å skille smittsomme fra ikke-smittsomme virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., … More

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter