Summary
Nous avons déjà développé des protocoles pour Caenorhabditis elegans afin de former des souvenirs associatifs à court et à long terme par un entraînement massif et espacé, respectivement. Ici, des protocoles détaillés sont décrits pour le conditionnement de C. elegans en associant le 1-propanol et l’acide chlorhydrique comme stimuli conditionnés et non conditionnés, respectivement, pour former une mémoire associative aversive.
Abstract
Le nématode Caenorhabditis elegans est un organisme modèle attrayant pour étudier l’apprentissage et la mémoire aux niveaux moléculaire et cellulaire en raison de la simplicité de son système nerveux, dont les schémas de câblage chimique et électrique ont été entièrement reconstruits à partir de micrographies électroniques en série de sections minces. Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour le conditionnement de C. elegans par un entraînement massif et espacé pour la formation de la mémoire à court terme (STM) et de la mémoire à long terme (LTM), respectivement. En associant le 1-propanol et l’acide chlorhydrique comme stimuli conditionnés et non conditionnés, respectivement, C. elegans a été entraîné avec succès à former des STM et LTM associatifs aversifs. Alors que les animaux naïfs étaient attirés par le 1-propanol, les animaux dressés n’étaient plus ou très faiblement attirés par le 1-propanol. Comme chez d’autres organismes tels que l’aplysie et la drosophile, les « gènes d’apprentissage et de mémoire » jouent un rôle essentiel dans la formation de la mémoire. En particulier, les récepteurs du glutamate de type NMDA, exprimés en seulement six paires d’interneurones chez C. elegans, sont nécessaires à la formation de STM et de LTM, peut-être comme facteur de coïncidence. Par conséquent, la trace de mémoire peut résider parmi les interneurones.
Introduction
L’apprentissage et la mémoire sont essentiels à la survie et à la reproduction des animaux en naviguant efficacement dans des environnements changeants. C. elegans est un organisme modèle attrayant pour étudier l’apprentissage et la mémoire aux niveaux moléculaire et cellulaire en raison de la simplicité de son système nerveux, dont les schémas de câblage chimique et électrique ont été entièrement reconstruits à partir de micrographies électroniques en série de sections minces 1,2,3.
C. elegans apprend à associer la température de culture à la famine et migre loin de sa température de croissance avec un souvenir aversif qui dure plusieurs heures 4,5. Le conditionnement de C. elegans avec du chlorure de sodium (NaCl) en l’absence de nourriture entraîne une réduction de la chimiotaxie vers NaCl 6,7,8. Lorsqu’il est associé à de la nourriture, l’attraction du butanone est améliorée à la suite de l’apprentissage appétitif 9,10,11. Bien que ces phénomènes soient interprétés comme l’apprentissage associatif et la mémoire 10,12, la distinction entre l’apprentissage associatif et la sensibilisation, l’accoutumance et l’adaptation non associatives n’est pas claire dans le paradigme de l’apprentissage et de la mémoire de C. elegans 13,14. En effet, les animaux conditionnés au butanone et la privation de nourriture (conditionnement aversif) ont montré un couplage déprimé du neurone sensoriel de butanone AWC ON pour cibler les neurones par des signaux d’insuline provenant d’autres neurones, y compris les interneurones AIA, tandis que les animaux conditionnés avec du butanone et de la nourriture (conditionnement appétitif) ont montré un couplage accru de AWCON pour cibler les neurones15 . La signalisation de l’insuline provoque des changements d’expression génique induits par l’EGL-4 nucléaire et d’autres régulateurs transcriptionnels16,17. Ainsi, cet apprentissage et cette mémoire aversifs et appétitifs ont des analogies avec l’accoutumance non associative et la sensibilisation, respectivement, des neurones sensoriels présynaptiques dans le réflexe de retrait des branchies dans Aplysia18,19.
En associant deux produits chimiques comme stimulus conditionné (CS) et stimulus inconditionné (US), nous et d’autres avons développé des protocoles pour le conditionnement de C. elegans afin de former un apprentissage associatif et une mémoire sans utiliser de nourriture ou de famine comme les États-Unis20,21,22,23. Dans la présente étude, les protocoles sont modifiés pour conditionner les animaux avec du 1-propanol et de l’acide chlorhydrique (HCl, pH 4,0) comme le CS et les États-Unis, respectivement, pour l’apprentissage aversif et la mémoire à court terme (STM) et la mémoire à long terme (LTM). Naïve C. elegans est attiré par le 1-propanol24 et repoussé par l’acide25. Lorsqu’il était conditionné avec un mélange de 1-propanol et de HCl (pH 4,0), C. elegans n’était plus ou très faiblement attiré par le 1-propanol.
Protocol
1. Recettes
- Plaques de gélose NGM (étape 2.1.)
- Pour préparer des plaques NGM de 6 cm, dissoudre 2,5 g de peptone, 3 g de NaCl et 17 g de gélose dans 850 mL deH2Odoublement désionisé (ddH2O). Porter le volume total à 972 mL avec ddH2O.
- Après l’autoclavage, refroidir à ~65 °C et ajouter 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol dissous dans de l’éthanol, 1 mL de 1 M CaCl2 et 1 M MgSO4, et 25 mL de phosphate de potassium 1 M (pH 6,0). Après avoir bien mélangé, distribuer de 8 ml chacune à 6 cm (diamètre) des boîtes de Pétri.
- Conservez les assiettes avec couvercles sur un banc à température ambiante (RT) pendant 1 jour, puis conservez-les dans une pièce froide jusqu’à utilisation.
- Préparer le milieu Luria-Bertani (LB) (étape 2.1.) en dissolvant 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure et 10 g de NaCl dans 1 L deddH2O. Ajuster le pH à 7,0 avec 5 N NaOH (plusieurs gouttes) et stériliser à l’autoclavage.
- Préparer les plaques LB en ajoutant 15 g de gélose au milieu LB. Après autoclavage, refroidir à ~60 °C et distribuer de 12 ml chacune à 9 cm (diamètre) de boîtes de Petri. Conservez les assiettes dans des articles en plastique dans une chambre froide jusqu’à utilisation.
- Pour fabriquer un collecteur d’animaux (étape 2.4.), fixez un treillis en nylon (maille de 30 μm) au fond d’un tuyau cylindrique en acrylique transparent (3,5 cm de longueur, 3 cm de diamètre extérieur, 2 mm d’épaisseur de paroi) avec de la colle.
- Pour obtenir une solution aqueuse de gélatine à 0,25 % (étape 2.4.), dissoudre 0,25 g de gélatine dans 100 mL deddH2O. Stériliser par autoclavage.
- Plaques de dosage de chimiotaxie (étape 5.1.)
- Pour fabriquer des plaques de gélose pour le dosage de la chimiotaxie, dissoudre 15 g de gélose dans 993 mL deddH2Opar autoclavage et refroidir la solution à ~65 °C.
- Ensuite, ajouter 5 mL de phosphate de potassium 1 M autoclavé (pH 6,0), 1 mL de CaCl2 1 M et 1 mL de 1 M MgSO4 à la solution de gélose Toutes ces solutions sont stérilisées séparément par autoclavage.
- Verser 10 ml de la solution mélangée dans une boîte de Pétri de 6 cm. Placez ces assiettes avec couvercles sur un banc à RT pendant deux jours, puis mettez-les sur des serviettes en papier humides dans de la vaisselle en plastique à RT jusqu’à utilisation. Ces plaques peuvent être utilisées jusqu’à 10 jours.
- Pour fabriquer un tampon de dosage de chimiotaxie (étape 5.4.), mélanger 5 mL de phosphate de potassium 1 M (pH 6,0), 1 mL de CaCl2 1 M, 1 mL de1 M MgSO4 et 993 mL de ddH2O. Stériliser séparément toutes ces solutions par autoclavage.
- Pour obtenir une solution de mélange CS/US de 40 ml (1 % aqueux de 1-propanol et HCl [pH 4,0]) (étape 3.1. et étape 4.1.), ajouter 0,4 mL de 1-propanol absolu et 4 μL de HCl 5 M (0,1 mM à la concentration finale) à 39,6 mL deddH2O. Conserver la solution à TA.
- Pour faire du ddH 2O, traiter l’eau du robinet2xavec des systèmes de purification de l’eau (voir le tableau des matériaux).
- Préparer une culture liquide (DO600 = ~0,7) d’Escherichia coli OP50 en inoculant une colonie fraîche avec un cure-dent dans 10 ml de milieu LB et en incubant à 37 °C pendant 7-8 h. Les bactéries cultivées pendant une période plus longue peuvent affecter le résultat du conditionnement, peut-être en raison de métabolites secondaires.
2. Préparation de C. Elegans
- En utilisant les méthodes standard26, cultiver des animaux sur des plaques NGM de 6 cm (étape 1.1.). Les plaques de NGM sont préparées en étalant 0,2 mL d’une culture liquide d’E. coli OP50 dans un milieu LB (voir étape 1.9 .) et en incubant à TA pendant 24 heures au maximum (les vieilles bactéries peuvent affecter le résultat du conditionnement).
REMARQUE: L’apprentissage et la mémoire de C. elegans sont extrêmement sensibles aux contraintes mécaniques, chimiques et thermiques. Par conséquent, il est fortement recommandé d’élever des animaux, de maintenir tous les réactifs, y compris l’eau, et d’effectuer tous les tests à TR entre 17 ° C et 20 ° C. Les stimulations physiques et mécaniques telles que le vortex, le pipetage grossier et la centrifugation doivent être évitées. Le 1-propanol frais doit être utilisé tous les 3 mois au plus longtemps pour une raison inconnue. Il est important de noter que les animaux doivent être cultivés avec beaucoup de nourriture, car la famine peut sérieusement affecter le résultat du conditionnement. - Le jour 1, cueillez et placez cinq animaux gravides bien nourris (mettez plus d’animaux mutants qui pondent lentement) sur chacune des quatre plaques NGM de 6 cm avec un cueilleur de vers en platine, et laissez-les pondre ~50 œufs pendant 3 h à TA pour obtenir une population synchronisée d’animaux adultes. Arrêtez la ponte en retirant les animaux parents des assiettes à l’aide d’un cueilleur de vers en platine.
REMARQUE : Les plaques ensemencées doivent être conservées à RT afin de minimiser le stress pour les animaux. - Cultivez les animaux à RT pendant environ 5 jours, ce qui est le temps qu’il faut aux animaux pour atteindre leur stade adulte mature, pas le stade de jeune adulte.
REMARQUE : La période de culture entre 4,5 jours et 5,5 jours doit être ajustée en fonction des conditions, car les jeunes animaux adultes sont plus sensibles aux produits chimiques utilisés pour le conditionnement que les animaux adultes matures (figure supplémentaire 1). Après le conditionnement, les jeunes animaux adultes peuvent présenter des valeurs d’indice de chimiotaxie (IC) inférieures. - Recueillir ~200 animaux adultes dans un collecteur d’animaux (voir étape 1.4.) en lavant chaque assiette avec 1 mL de gélatine aqueuse à 0,25 % (étape 1.4.) Cette gélatine aqueuse empêche l’adhérence des animaux à la surface des plastiques tels que les pointes de pipettes.
- Lavez les animaux dans le collecteur avec ddH 2 O (étape 1.8.) en déplaçant très doucement le collecteur de haut en bas 2x dans ~10 mL de ddH 2O. Répétez ce processus 2x de plus (3x au total) avec ~10 mL de ddH2Ochacun pour éviter la contamination bactérienne.
REMARQUE: La contamination bactérienne affecte gravement la chimiotaxie des animaux.
3. Entraînement de masse pour l’apprentissage associatif à court terme et la mémoire
REMARQUE : reportez-vous à la figure 1 pour connaître le flux de travail de formation en masse.
- Introduire délicatement le collecteur d’animaux contenant ~200 animaux dans 40 mL d’un mélange de 1 % de 1-propanol et de HCl (pH 4,0 après mélange avec 1-propanol; voir étape 1.7.) dans une capsule de cristallisation pendant ~1 s.
NOTE: Pour les animaux témoins, faire de même, mais tremper seulement dans 1% aqueux 1-propanol. Il serait préférable de traiter les animaux avec HCl (pH 4,0) uniquement comme un autre témoin. - Laver les animaux dans le collecteur en immergeant très doucement le collecteur 1x dans 10 ml deddH2Odans un puits d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits.
REMARQUE: Cette étape de lavage doit être très douce et ne doit être effectuée que 1x car un lavage intensif peut empêcher l’apprentissage. - Répétez les étapes 3.1. et 3.2. 10x sans interruption (intervalle inter-procès [ITI], 0 min).
REMARQUE: Utilisez ddH2O frais à chaque fois à RT. - Placer le collecteur sur une pelouse E. coli OP50 sur une plaque NGM de 6 cm pendant 10 min à TA afin que les animaux puissent se reposer.
- Lavez les animaux dans le collecteur avec ddH 2 O en déplaçant très doucement le collecteur de haut en bas 2x dans ~10 mL de ddH 2O. Répétez ce processus 2x de plus (3x au total) avec ~10 mL de ddH2Ochacun pour éviter la contamination bactérienne.
- Procéder au test de chimiotaxie comme décrit ci-dessous (étape 5).
4. Entraînement espacé pour l’apprentissage associatif et la mémoire à long terme
REMARQUE : reportez-vous à la figure 2 pour connaître le flux de travail d’entraînement espacé.
- Immerger délicatement un collecteur d’animaux contenant ~200 animaux dans 40 mL d’un mélange de 1 % de 1-propanol et de HCl (pH 4,0 après mélange avec 1-propanol; voir étape 1.7.) dans une boîte de cristallisation pendant ~1,0 s.
REMARQUE: Faites de même avec 1% aqueux 1-propanol seulement comme témoin. Il serait préférable de traiter les animaux avec HCl (pH 4,0) uniquement comme un autre témoin. - Laver les animaux dans le collecteur en immergeant très brièvement le collecteur 1x dans 10 mL deddH2Odans un puits d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits.
REMARQUE: Ce lavage doit être très bref car un lavage intensif peut empêcher l’apprentissage. - Placer le collecteur sur une pelouse à E. coli OP50 sur une plaque de gélose NGM dans une boîte de Petri de 6 cm (en diamètre) pendant 10 min à TA afin que les animaux se reposent.
NOTE: Ce repos pendant 10 minutes car ITI est crucial pour les animaux afin de consolider les souvenirs pour la formation de LTM. - Répétez les étapes 4.1.-4.3. 10x.
- Lavez les animaux dans le collecteur avec ddH 2 O en déplaçant très doucement le collecteur de haut en bas 2x dans ~10 mL de ddH 2O, qui est conservé à TA. Répétez ce processus 2x de plus (3x au total) avec ~10 mL de ddH2Ochacun pour éviter la contamination bactérienne.
- Passez au test de chimiotaxie comme décrit ci-dessous (étape 5.).
5. Dosage de chimiotaxie
- Préparer des plaques de gélose pour le dosage de chimiotaxie dans des boîtes de Petri en plastique de 6 cm (voir étape 1.5.).
- Transvaser les animaux dans le collecteur (étape 2.5.), qui est placé sur une surface plane d’un couvercle de boîte de Petri en plastique, dans un tube microcentrifuge de 2 ml contenant 1 mL de gélatine aqueuse à 0,25 % à l’aide d’un embout de pipette scié avec une ouverture de >1 mm (diamètre intérieur).
REMARQUE : Il est important d’utiliser une pointe de pipette à canon scié pour minimiser le stress de cisaillement sur les animaux. - Retirer le surnageant du tube une fois que les animaux se sont installés au fond du tube par gravité pendant ~1 min (ne pas centrifuger).
- Remettez doucement les animaux en suspension dans 1 mL de tampon de dosage de chimiotaxie (voir étape 1.6.) et laissez-les se déposer par gravité au fond du tube pendant ~1 min (ne pas centrifuger). Enlevez autant de surnageant que possible par pipetage.
- Pendant ce temps, repérer en diagonale 4 μL chacun de 1-propanol aqueux à 5% à deux endroits et 4 μL chacun de ddH2O à deux autres endroits de la même manière, comme le montre la figure 3A. Pour le dosage chimiotaxique des mutants qui ont une sensibilité plus faible au 1-propanol, repérer des concentrations plus élevées de 1-propanol aqueux qui donnent des valeurs d’indice de chimiotaxie (IC) de ~0,6 des mutants naïfs, comme indiqué dans le tableau supplémentaire 1.
REMARQUE: Il est important de compléter les procédures de repérage le plus rapidement possible. Repérez le 1-propanol aqueux à 5%, car le 1-propanol aqueux à 1% est trop faible pour attirer les animaux dans le test de chimiotaxie. En revanche, utiliser 1-1-propanol aqueux à 1% pour le conditionnement puisque les animaux traités avec des concentrations plus élevées de 1-propanol aqueux que 1% montrent des valeurs d’I.C. plus faibles. - Repérez les portions de 6 μL de la suspension animale dans un tampon de dosage de chimiotaxie (étape 5.4.) contenant ~60 animaux au centre de trois plaques pour le dosage de chimiotaxie à l’aide d’une pointe de pipette sciée avec une ouverture de ~1,0 mm (diamètre intérieur). Retirez le liquide autant que possible avec une mèche de mouchoir en tissu de laboratoire sans toucher les animaux et placez un couvercle sur l’assiette.
REMARQUE : Il est important de suivre ces procédures le plus rapidement possible. - Laissez les animaux se déplacer librement sur l’assiette pendant 10 min à TA, puis transférez l’assiette dans une boîte de Petri en verre sur glace pendant 3 min pour arrêter la chimiotaxie. Ensuite, conservez l’assiette au réfrigérateur jusqu’à compter le nombre d’animaux dans l’assiette.
- Comptez le nombre d’animaux en quatre sections, à l’exception de ceux du cercle central, au stéréomicroscope et calculez l’indice de chimiotaxie (C.I.) à l’aide de l’équation illustrée à la figure 3B. À partir des valeurs C.I., calculer les valeurs de l’indice d’apprentissage (L.I.) comme la différence entre la valeur C.I. des animaux de référence et la valeur C.I. des animaux conditionnés (L.I. = C.I.reference- C.I.conditioned).
NOTE: La valeur C.I. des animaux de référence (C.I.reference) est la valeur moyenne des valeurs C.I. des animaux conditionnés avec 1% aqueux 1-propanol seulement.
Representative Results
C. elegans a été conditionné par un entraînement de masse pour former une mémoire associative aversive à court terme en associant 1-propanol aqueux à 1% et HCl (pH 4,0) comme CS et US, respectivement. Selon le protocole décrit ci-dessus, les animaux synchronisés ont été élevés sur un banc à une RT de 18 °C pendant 5 jours et ont été très doucement lavés 2x avecddH2Oà un TR de 18 °C. Ensuite, les animaux ont été conditionnés avec un mélange de 1-propanol aqueux à 1% et de HCl (pH 4,0) pendant 1 s. Nous avons également entraîné des animaux avec du ddH2Ouniquement, du 1-propanol aqueux à 1% uniquement et du HCl (pH 4,0) uniquement comme références. Après le conditionnement, les animaux ont été lavés 1x avec ddH2O. Nous avons répété le conditionnement 10x sans interruption (pas d’ITI). Le conditionnement réussi a été obtenu en répétant la procédure plus de 7x jusqu’à 10x. Un conditionnement supérieur à 10 fois a entraîné un apprentissage moins efficace21. Après l’entraînement, les animaux se sont reposés sur de la nourriture bactérienne pendant 10 min à TA (18 °C). Après avoir été lavés avec du ddH2O 3x, les animaux ont été transférés dans un tube à microcentrifugeuses en suspension dans de la gélatine aqueuse à 0,25% et déposés au fond par gravité. Après avoir retiré le surnageant autant que possible, les animaux ont été doucement remis en suspension dans un tampon de dosage de chimiotaxie, puis laissés se déposer au fond du tube par gravité.
Après avoir retiré autant de surnageant que possible, la suspension animale a été repérée sur le cercle central d’une plaque d’essai de chimiotaxie, qui a été maintenue à une RT de 18 °C, puis les animaux ont été autorisés à se déplacer librement sur la plaque pendant 10 minutes à une TR de 18 °C. Les valeurs C.I. ont été calculées à l’aide de l’équation illustrée à la figure 3B. Comme le montre la figure 4A, les animaux conditionnés avec le mélange de 1 % de 1-propanol et de HCl n’étaient plus attirés par le 1-propanol à 5 % repéré sur des plaques de gélose pour le dosage de la chimiotaxie, tandis que les animaux naïfs et de référence étaient également attirés par le 1-propanol à 5 %. Après l’entraînement de masse (étape 3.), la mémoire n’était plus observée dans les 3 h20. De plus, la mémoire formée par l’entraînement de masse était sensible au choc froid20. Ces résultats démontrent que C. elegans a réussi à former une STM aversive par un entraînement massif.
Les animaux ont également été conditionnés par un entraînement espacé de 10x avec une ITI de 10 minutes entre les étapes de formation (étape 4.). Pendant l’ITI, le collecteur avec les animaux a été placé sur une pelouse bactérienne sur une plaque NGM de 6 cm à une RT de 18 °C. Les animaux conditionnés par l’entraînement espacé avec un mélange de 1-propanol aqueux à 1 % et de HCl (pH 4,0) n’étaient plus attirés par le 1-propanol à 5 % par rapport aux animaux traités avec 1 % de 1-propanol seulement, HCl (pH 4,0) seulement ouddH2Oseulement (figure 4B). Après l’entraînement espacé, les animaux ont conservé la mémoire pendant plus de 12 h20,21. De plus, la mémoire ne se formait pas lorsque les animaux étaient traités avec des inhibiteurs de translation ou de transcription et résistait aux chocs causés par le froid20,21. Par conséquent, C. elegans a réussi à former un LTM aversif par entraînement espacé.
Nous avons également examiné les effets des mutations dans les « gènes d’apprentissage et de mémoire » sur la formation de STM et LTM. Le gène crh-1 code pour la protéine de liaison aux éléments (CREB) omniprésente facteur de transcription cAMP, glr-1 et nmr-1 codent respectivement pour l’acide α-amino-3-hydroxyl-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) et le récepteur du glutamate de type N-méthyl-D-aspartate (NMDA), et stau-1 code pour l’isoforme Staufen de la protéine de liaison à l’ARN double brin. Ces gènes jouent un rôle essentiel dans le conditionnement classique chez C. elegans, Drosophila, Aplysia et les souris. En utilisant un mélange de 1-propanol aqueux à 1 % et de HCl (pH 4,0), la formation de STM et de LTM dépendait de tous les gènes (figures 5A, B).
Figure 1 : Schéma expérimental de l’entraînement de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma expérimental de l’entraînement espacé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Dosage de chimiotaxie et indice de chimiotaxie. (A) Représentation schématique d’une plaque de dosage de chimiotaxie. Des boîtes de Petri (6 cm de diamètre) ont été séparées en quatre zones, comme indiqué, et 4 μL chacun de 1-propanol aqueux à 5% ou deddH2Oont été repérés en diagonale à deux endroits chacun, à 2 cm du centre. (B) Les valeurs de l’indice de chimiotaxie ont été calculées à partir de l’équation montrée en comptant le nombre d’animaux dans les zones « a » et « b » après la fin de la chimiotaxie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Valeurs de l’indice de chimiotaxie des animaux conditionnés avec des produits chimiques. Les animaux N2 sauvages synchronisés ont été conditionnés avec des produits chimiques indiqués par (A) entraînement de masse 10x ou (B) entraînement espacé 10x. Les organigrammes des protocoles d’entraînement massés et espacés utilisés sont présentés à la figure 1 et à la figure 2, respectivement. Après le conditionnement, les animaux étaient libres de se déplacer pendant 10 min sur une gélose de 6 cm pour le dosage de chimiotaxie à une TR de 18 °C. Les valeurs C.I. ont été calculées à l’aide de l’équation illustrée à la figure 3B. Les données pour cette figure sont fournies dans le tableau supplémentaire 1. Les données des animaux naïfs ont été retracées dans les deux panneaux de figures. Le diagramme à barres montre le 1er quartile, la médiane et le 3e quartile. Les astérisques (*P < 0,05) indiquent des différences statistiquement significatives déterminées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Dunnett. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Valeurs de l’indice d’apprentissage des animaux mutants conditionnés. Les animaux N2 et mutants de type sauvage synchronisés indiqués ont été conditionnés avec un mélange de 1 % de 1-propanol aqueux et de HCl (pH 4,0) par (A) entraînement massé 10x ou (B) entraînement espacé 10x. Les organigrammes des protocoles d’entraînement massés et espacés utilisés sont présentés à la figure 1 et à la figure 2, respectivement. Après le conditionnement, les animaux étaient libres de se déplacer pendant 10 min sur une gélose de 6 cm pour le dosage de chimiotaxie à une TR de 18 °C. Les données pour cette figure sont fournies dans le tableau supplémentaire 2. Le diagramme à barres montre le 1er quartile, la médiane et le 3e quartile. Les astérisques (*P < 0,05) indiquent des différences statistiquement significatives déterminées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Dunnett. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Les jeunes animaux adultes sont sensibles au traitement chimique. Les animaux N2 de type sauvage du jour 4 et du jour 5 après l’éclosion ont été entraînés en masse 10x avec HCl, pH 4,0, sans interruption et ont ensuite été dosés pour la chimiotaxie à 5% aqueux 1-propanol. Les barres sont des moyennes ± S.E.M. (n = 19). Les astérisques (*P < 0,05) indiquent des différences statistiquement significatives déterminées par ANOVA bidirectionnelle suivie du test post-hoc de Tukey-Kramer. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Données correspondant à la figure 4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau supplémentaire 2 : Données correspondant à la figure 5. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Discussion
Dans la présente étude, tous les réactifs ont été maintenus à une RT de ~18 °C en moyenne, et les animaux ont été cultivés sur un banc à la RT pour éviter le stress des animaux. De plus, toutes les procédures expérimentales ont été réalisées au RT. Les animaux ont d’abord été élevés dans un incubateur à 20 °C, puis conditionnés sur un banc à ~24 °C à l’aide de réactifs au RT. Dans ces conditions, les résultats du conditionnement étaient très variables. À la faible RT, C. elegans pousse lentement et devrait être cultivé plus longtemps qu’à 20 °C jusqu’à ce que les animaux atteignent le stade adulte mature, car les jeunes animaux adultes sont plus sensibles aux produits chimiques utilisés pour le conditionnement que les animaux adultes matures et peuvent présenter des valeurs d’IC plus faibles.
L’étape la plus critique pour un conditionnement réussi est le lavage des animaux avec ddH2O immédiatement après chaque traitement chimique. Par conséquent, les contraintes mécaniques et thermiques doivent être minimisées en utilisant des embouts de pipettes sciés, en gardant les réactifs à TA et en lavant très doucement les animaux en déplaçant très lentement le collecteur d’animaux de haut en bas dans ddH2O. Un lavage complet des animaux à chaque fois après le conditionnement peut affecter l’apprentissage et la mémoire. Les conditions des plaques de dosage de chimiotaxie affectent également gravement les résultats. Des plaques trop sèches ou trop humides empêchent la locomotion fluide des animaux. Les plaques ont été préparées comme décrit à l’étape 1. une bonne plaque est une plaque pour laquelle les taches de 4 μL deddH2Oou 5% aqueux 1-propanol sont complètement absorbées par la gélose environ 5 minutes après la spotification. Comme décrit ci-dessus, l’âge des animaux est également essentiel pour un conditionnement réussi. Les jeunes animaux adultes sont sensibles aux traitements mécaniques et chimiques, ce qui entraîne des résultats variables, bien que les animaux très âgés puissent ne pas convenir au conditionnement non plus.
La durée de conservation du 1-propanol dépend des marques et des lots et est inférieure à 3 mois chez RT. Lorsque les valeurs de C.I. des animaux naïfs s’aggravent, il serait recommandé d’utiliser du 1-propanol frais pour le conditionnement et le test de chimiotaxie.
La formation de la mémoire par entraînement de masse n’a pas été affectée par le traitement des animaux avec des inhibiteurs de la traduction (cycloheximide et anisomycine) et un inhibiteur de la transcription (actinomycine D), tandis que la formation de la mémoire par l’entraînement espacé a été nettement inhibée par les inhibiteurs20,21. En outre, la mémoire de l’ancien s’est détériorée par le choc froid, tandis que le second a été conservé plus longtemps que le premier et a résisté au choc froid. Ces résultats démontrent que le premier est STM et le second est LTM, respectivement20,21. Cependant, la mémoire formée par l’entraînement massé peut être constituée de STM et de mémoire à moyen terme (moyen terme) puisque STM est faiblement dépendant du facteur de transcription CREB (Figure 5A). Cela concorde avec le résultat que la STM a été retenue pendant plus de 1 h20,21. La formation de STM et de LTM dépend fortement de la rmn-1, qui n’est exprimée que dans six paires de neurones (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG et PVC) chez C. elegans27,28. Dans ces neurones, par conséquent, les récepteurs NMDA peuvent agir comme un détecteur de coïncidence moléculaire de signaux aqueux 1-propanol et HCl (pH 4,0) pour la plasticité synaptique, où le renforcement synaptique requis pour STM et LTM peut résulter d’une décharge fortuite des neurones pré- et post-synaptiques 29,30,31,32,33. Par conséquent, la mémoire associative aversive peut se former parmi les interneurones.
Les méthodes décrites dans la présente étude devraient être applicables à l’apprentissage olfactif appétitif et à la mémoire associative à court et à long terme en utilisant le 1-nonanol comme CS et le chlorure de potassium comme US21. Il est intéressant de comparer les circuits neuronaux impliqués dans la formation des souvenirs appétitifs et aversifs.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang et Hitomi Ohtaki pour leur assistance technique et leurs commentaires sur le manuscrit. Les souches ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center, qui est financé par le NIH National Center for Research Resources (NCRR). Ce travail a été financé par l’Université supérieure de l’Institut des sciences et technologies d’Okinawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 mL beaker | HARIO | B-500-H32 | |
| 10 µL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-104-96RS-Q | |
| 0.2 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | TTW110RS-Q | |
| 1.0 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-111-R100NS-Q | |
| 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 10 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-04 | |
| 50 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-06 | |
| 6-well cell culture plate | Costar | 3516 | |
| Aron Alpha (Glue for plastic) | Toagosei | High Speed EX | |
| Autoclave | Tomy Digital Biology | SX-300 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bottle top 0.2 µm filter units | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Bunsen burner | EISCO | SKU CH0089A | |
| Calcium chloride dihydrate | Nacalai Tesque | 06730-15 | |
| C. elegans mutant strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Cholesterol | Wako Pure Chemical Industries | 034-03002 | |
| Clear acrylic cylindrical pipe | Asahi Kasei | 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness) | |
| Crystallizing dish | Pyrex | 3140-80 | |
| Dental burner | Phoenix-Dent | APT-3 | |
| Di-potassium hydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28726-05 | |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Electric pipetter | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Gelatin | Wako Pure Chemical Industries | 073-06295 | |
| Glass Petri dishes (10 cm in diameter) | As One | Trade FLAT Mark | |
| Heating magnetic stirrer | Thermo Fisher Scientific | SP131324 | |
| Hydrochloric acid | Nacalai Tesque | 37345-15 | |
| Incubator | SANYO | MIR-553 | |
| Kimwipes S-200 | Nippon Paper Crecia | 62011 | |
| Laboratory coat | TOYO LINT FREE | FH240C | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Nacalai Tesque | 21002-85 | |
| Magnetic stirrer bar | SANSYO | 93-5412 | |
| Metal spatula | FUJIFILM Wako | 647-06531 | |
| Nitrile gloves | Kimberly-Clark | KC100 | |
| Nylon mesh (mesh size: 30 μm) | SEFAR | NY30-HD | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P200 pipetman | Gilson | F123600 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| pH meter | HORIBA | Navi F-52 | |
| Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) | IWAKI | SH90-15E | |
| Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) | SARSTEDT | 82.1194.500 | |
| Plastic weighing boats | As One | 1-5233-01 | |
| Platinum wire for a worm pick | Nilaco | PT-351265 | |
| 1-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 279544 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28721-55 | |
| Safety goggles | Kimberly-Clark | #25646 | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tooth picks | |||
| Water purification sysytem | Merck | Elix Essential 10 UV | |
| Water urification sysytem | Merck | Milli-Q Synthesis A10 | |
| Weighing balance | METTLER | TOREDO | |
| Wild type C. elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center |
References
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