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Neuroscience

केनोरहाब्डिस एलिगेंस में दो रसायनों को जोड़कर प्रतिकूल सहयोगी शिक्षा और स्मृति गठन

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64137
Automatic Translation
1, 1, 1
1Information Processing Biology Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

हमने पहले क्रमशः बड़े पैमाने पर और अंतरिक्ष प्रशिक्षण द्वारा लघु और दीर्घकालिक सहयोगी यादें बनाने के लिए केनोरहाब्डिस एलिगेंस के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं। यहां, प्रतिकूल सहयोगी स्मृति बनाने के लिए क्रमशः 1-प्रोपेनोल और हाइड्रोक्लोरिक एसिड को वातानुकूलित और वातानुकूलित उत्तेजनाओं के रूप में जोड़कर सी एलिगेंस की कंडीशनिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

Abstract

नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस अपने तंत्रिका तंत्र की सादगी के कारण आणविक और सेलुलर स्तरों पर सीखने और स्मृति का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल जीव है, जिसके रासायनिक और विद्युत वायरिंग आरेख पूरी तरह से पतले वर्गों के सीरियल इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ से पुनर्निर्मित किए गए थे। यहां, हम क्रमशः अल्पकालिक मेमोरी (एसटीएम) और दीर्घकालिक मेमोरी (एलटीएम) के गठन के लिए बड़े पैमाने पर और स्पेस्ड प्रशिक्षण द्वारा सी एलिगेंस की कंडीशनिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। क्रमशः वातानुकूलित और वातानुकूलित उत्तेजनाओं के रूप में 1-प्रोपेनोल और हाइड्रोक्लोरिक एसिड को जोड़कर, सी एलिगेंस को प्रतिकूल सहयोगी एसटीएम और एलटीएम बनाने के लिए सफलतापूर्वक प्रशिक्षित किया गया था। जबकि भोले जानवर 1-प्रोपेनोल के प्रति आकर्षित थे, प्रशिक्षित जानवर अब 1-प्रोपेनोल के प्रति आकर्षित नहीं थे या बहुत कमजोर रूप से आकर्षित नहीं थे। एप्लिसिया और ड्रोसोफिला जैसे अन्य जीवों की तरह, "सीखने और स्मृति जीन" स्मृति निर्माण में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। विशेष रूप से, एनएमडीए-प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर्स, सी एलिगेंस में इंटरन्यूरॉन के केवल छह जोड़े में व्यक्त किए जाते हैं, एसटीएम और एलटीएम दोनों के गठन के लिए आवश्यक हैं, संभवतः एक संयोग कारक के रूप में। इसलिए, मेमोरी ट्रेस इंटरन्यूरॉन के बीच रह सकता है।

Introduction

जानवरों के लिए सीखने और स्मृति महत्वपूर्ण हैं ताकि वे बदलते वातावरण को कुशलतापूर्वक नेविगेट करके जीवित रहें और प्रजनन करें। एलिगेंस अपने तंत्रिका तंत्र की सादगी के कारण आणविक और सेलुलर स्तरों पर सीखने और स्मृति का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल जीव है, जिसके रासायनिक और विद्युत तारों के आरेखों को पतले खंड 1,2,3 के सीरियल इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ से पूरी तरह से पुनर्निर्मित किया गया था।

एलिगेंस खेती के तापमान को भुखमरी के साथ जोड़ना सीखता है और कई घंटोंतक चलने वाली प्रतिकूल स्मृति के साथ इसके विकास तापमान से दूर चला जाता है। भोजन की अनुपस्थिति में सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) के साथ कंडीशनिंग सी एलिगेंस एनएसीएल 6,7,8 की ओर केमोटैक्सिस में कमी की ओर जाता है। जब भोजन के साथ जोड़ा जाता है, तो 9,10,11 सीखने के परिणामस्वरूप ब्यूटेनोन आकर्षण बढ़ जाता है। यद्यपि इन घटनाओं को सहयोगी सीखने और स्मृति10,12 के रूप में व्याख्या की जाती है, सहयोगी सीखने और गैर-सहयोगी संवेदीकरण, आदत और अनुकूलन के बीच अंतर सी एलिगेंस सीखने और स्मृति प्रतिमान13,14 में स्पष्ट नहीं है। दरअसल, ब्यूटानोन और भोजन की कमी (प्रतिकूल कंडीशनिंग) के साथ वातानुकूलित जानवरों ने एआईए इंटरन्यूरॉन सहित अन्य न्यूरॉन्स से इंसुलिन संकेतों द्वारा न्यूरॉन्स को लक्षित करने के लिए ब्यूटानोन संवेदी न्यूरॉन एडब्ल्यूसीओएन के उदास युग्मन को दिखाया, जबकि ब्यूटानोन और भोजन (एपेटिटिव कंडीशनिंग) के साथ वातानुकूलित जानवरों ने न्यूरॉन्सको लक्षित करने के लिए एडब्ल्यूसीओएन के बढ़े हुए युग्मन को दिखाया। . इंसुलिन सिग्नलिंग परमाणु ईजीएल -4 और अन्य ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों16,17 द्वारा प्रेरित जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का कारण बनता है। इस प्रकार, इस प्रतिकूल और क्षुधापूर्ण सीखने और स्मृति में क्रमशः गैर-सहयोगी आदत और संवेदीकरण के साथ समानताएं हैं, क्रमशः एप्लिसिया18,19 में गिल-विदड्रॉल रिफ्लेक्स में प्रीसिनेप्टिक संवेदी न्यूरॉन्स की।

वातानुकूलित उत्तेजना (सीएस) और वातानुकूलित उत्तेजना (यूएस) के रूप में दो रसायनों को जोड़कर, हमने और अन्य लोगों ने सी एलिगेंस की कंडीशनिंग के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैंताकि भोजन या भुखमरी का उपयोग किए बिना सहयोगी सीखने और स्मृति का निर्माण किया जा सके। वर्तमान अध्ययन में, प्रोटोकॉल को प्रतिकूल सीखने और अल्पकालिक स्मृति (एसटीएम) और दीर्घकालिक स्मृति (एलटीएम) के लिए क्रमशः सीएस और यूएस के रूप में 1-प्रोपेनोल और हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल, पीएच 4.0) के साथ जानवरों की स्थिति के लिए संशोधित किया गया है। एलिगेंस 1-प्रोपेनोल 24 द्वारा आकर्षित होता है और एसिड25 द्वारा पीछे हटा दिया जाता है। जब 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (पीएच 4.0) के मिश्रण के साथ वातानुकूलित किया जाता है, तो सी एलिगेंस अब 1-प्रोपेनोल के प्रति आकर्षित नहीं था।

Protocol

1. व्यंजनों

  1. एनजीएम आगर प्लेटें (चरण 2.1.)
    1. 6 सेमी एनजीएम प्लेटों को तैयार करने के लिए, 2.5 ग्राम पेप्टोन, 3 ग्राम एनएसीएल और 17 ग्राम आगर को 850 एमएल दोगुना विआयनीकृत एच2ओ (डीडीएच2ओ) में घोलें। डीडीएच 2 ओ के साथ कुल मात्रा को972एमएल तक लाएं।
    2. ऑटोक्लेविंग के बाद, ~ 65 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और इथेनॉल में घुले 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल के 1 एमएल, 1 एमसीएल2 और 1 एम एमजीएसओ4 के 1 एमएल और 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट (पीएच 6.0) के 25 एमएल जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के बाद, 8 एमएल से 6 सेमी (व्यास में) पेट्री व्यंजन वितरित करें।
    3. ढक्कन वाली प्लेटों को कमरे के तापमान (आरटी) पर एक बेंच पर 1 दिन के लिए रखें, और फिर उन्हें उपयोग होने तक ठंडे कमरे में प्लास्टिक के बर्तन में रखें।
  2. डीडीएच 2 ओ के 1 एल में 10 ग्राम ट्रिप्टोन, 5 ग्राम खमीर निकालने और 10 ग्राम एनएसीएल को घोलकर लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम (चरण2.1.) तैयार करें।
    1. एलबी माध्यम में 15 ग्राम आगर जोड़कर एलबी प्लेटें तैयार करें। आटोक्लेविंग के बाद, ~ 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और 12 एमएल से 9 सेमी (व्यास में) पेट्री व्यंजन वितरित करें। उपयोग होने तक ठंडे कमरे में प्लास्टिक के बर्तन में प्लेटें रखें।
  3. एक पशु कलेक्टर (चरण 2.4.) बनाने के लिए, गोंद के साथ एक स्पष्ट ऐक्रेलिक बेलनाकार पाइप (लंबाई में 3.5 सेमी, बाहरी व्यास में 3 सेमी, दीवार मोटाई में 2 मिमी) के तल पर नायलॉन जाल (30 μm जाल आकार) संलग्न करें।
  4. 0.25% जलीय जिलेटिन घोल (चरण 2.4.) बनाने के लिए, 0.25 ग्राम जिलेटिन को 100 एमएल डीडीएच2ओ में घोलें।
  5. केमोटैक्सिस परख प्लेटें (चरण 5.1.)
    1. केमोटैक्सिस परख के लिए एगर प्लेटें बनाने के लिए, ऑटोक्लेविंग द्वारा 993 एमएल डीडीएच2ओ में 15 ग्राम आगर घोलें, और घोल को ~ 65 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    2. फिर, आगर समाधान में 5 एमएल ऑटोक्लेव 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट (पीएच 6.0), 1 एमसीएल2 का 1 एमएल और 1 एम एमजीएसओ4 का 1 एमएल जोड़ें। इन सभी समाधानों को अलग से ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल किया जाता है।
    3. मिश्रित घोल के 10 एमएल को 6 सेमी पेट्री डिश में वितरित करें। इन प्लेटों को दो दिनों के लिए आरटी में एक बेंच पर ढक्कन के साथ रखें, और फिर उन्हें उपयोग होने तक आरटी पर प्लास्टिकवेयर में गीले पेपर तौलिए पर रखें। इन प्लेटों का उपयोग 10 दिनों तक किया जा सकता है।
  6. केमोटैक्सिस परख बफर (चरण 5.4.) बनाने के लिए, 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट (पीएच 6.0) के 5 एमएल, 1 एमसीएल 2 के 1 एमएल, 1 एम एमजीएसओ4 के 1 एमएल और डीडीएच2ओ के 993 एमएल को मिलाएं।
  7. 40 mL CS/US मिश्रण घोल (1% जलीय 1-प्रोपेनोल और HCl [pH 4.0]) (चरण 3.1. और चरण 4.1.) बनाने के लिए, 39.6 mL ddH2O में पूर्ण 1-प्रोपेनोल का 0.4 mL और 5 M HCl (अंतिम सांद्रता पर 0.1 mM) का 4° L जोड़ें।
  8. डीडीएच2ओ बनाने के लिए, जल शोधन प्रणालियों के साथ नल के पानी को 2 गुना उपचारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  9. एस्चेरिचिया कोलाई ओपी50 की एक तरल संस्कृति (ओडी 600 = ~ 0.7) तैयार करें, जिसमें टूथपिक के साथ एक ताजा कॉलोनी को एलबी माध्यम के 10 एमएल में इंजेक्ट किया जाए और 7-8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाए। लंबी अवधि के लिए खेती किए गए बैक्टीरिया कंडीशनिंग के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, शायद माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के कारण।

2. सिंक्रनाइज़ सी की तैयारी।  एलिगेंस

  1. मानक विधियों26 का उपयोग करके, 6 सेमी एनजीएम प्लेटों पर जानवरों की खेती करें (चरण 1.1.)। एनजीएम प्लेटों को एलबी माध्यम में ई कोलाई ओपी 50 तरल संस्कृति के 0.2 एमएल को फैलाकर तैयार किया जाता है (चरण 1.9 देखें) और आरटी में 24 घंटे से अधिक समय तक इनक्यूबेट नहीं किया जाता है (पुराने बैक्टीरिया कंडीशनिंग के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं)।
    एलिगेंस सीखने और स्मृति यांत्रिक, रासायनिक और तापमान तनाव के प्रति बेहद संवेदनशील हैं। इसलिए, जानवरों की खेती करने, पानी सहित सभी अभिकर्मकों को बनाए रखने और 17 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस के बीच आरटी पर सभी परख करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। शारीरिक और यांत्रिक उत्तेजना जैसे भंवर, खुरदरा पिपेटिंग और सेंट्रीफ्यूजेशन से बचा जाना चाहिए। ताजा 1-प्रोपेनोल का उपयोग हर 3 महीने में सबसे लंबे समय तक किसी अज्ञात कारण से किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, जानवरों को बहुत सारे भोजन के साथ खेती की जानी चाहिए क्योंकि भुखमरी कंडीशनिंग के परिणाम को गंभीरता से प्रभावित कर सकती है।
  2. पहले दिन, प्लेटिनम वर्म पिकर के साथ चार 6 सेमी एनजीएम प्लेटों में से प्रत्येक पर पांच अच्छी तरह से खिलाए गए ग्रेविड जानवरों (धीरे-धीरे अंडे देने वाले अधिक उत्परिवर्ती जानवरों को रखें) को चुनें और उन्हें वयस्क जानवरों की सिंक्रनाइज़ आबादी प्राप्त करने के लिए आरटी में 3 घंटे के लिए ~ 50 अंडे देने दें। प्लेटिनम वर्म पिकर के साथ प्लेटों से मूल जानवरों को हटाकर अंडे देना बंद करें।
    नोट: जानवरों को तनाव को कम करने के लिए बीज वाली प्लेटों को आरटी पर रखा जाना चाहिए।
  3. लगभग 5 दिनों के लिए आरटी में जानवरों की खेती करें, जो कि जानवरों को अपने परिपक्व वयस्क चरण तक पहुंचने में लगने वाला समय है, न कि युवा वयस्क चरण तक।
    नोट: 4.5 दिनों और 5.5 दिनों के बीच की खेती की अवधि को परिस्थितियों के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए क्योंकि युवा वयस्क जानवर परिपक्व वयस्क जानवरों की तुलना में कंडीशनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले रसायनों के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं (पूरक चित्रा 1)। कंडीशनिंग के बाद, युवा वयस्क जानवर कम केमोटैक्सिस इंडेक्स (सीआई) मान दिखा सकते हैं।
  4. एक पशु कलेक्टर में ~ 200 वयस्क जानवरों को इकट्ठा करें (चरण 1.4 देखें) प्रत्येक प्लेट को 0.25% जलीय जिलेटिन के 1 एमएल के साथ धोकर (चरण 1.4. यह जलीय जिलेटिन जानवरों को प्लास्टिक की सतह पर आसंजन को रोकता है जैसे कि पिपेट टिप्स।
  5. कलेक्टर में जानवरों को ddH2O (चरण 1.8.) के साथ धोएं, बहुत धीरे से कलेक्टर कोddH 2O के ~ 10 mL में ऊपर और नीचे ले जाकर धोएं। जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए प्रत्येक dH 2 O के ~ 10 mL के साथ इस प्रक्रिया को 2x अधिक (कुलमिलाकर3x) दोहराएं।
    नोट: बैक्टीरियल संदूषण जानवरों के केमोटैक्सिस को गंभीरता से प्रभावित करता है।

3. अल्पकालिक सहयोगी सीखने और स्मृति के लिए बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण

नोट: बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण वर्कफ़्लो के लिए चित्रा 1 देखें।

  1. 1% 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (1-प्रोपेनोल के साथ मिश्रण करने के बाद पीएच 4.0; चरण 1.7 देखें) के मिश्रण के 40 एमएल में ~ 200 जानवरों वाले पशु कलेक्टर को ~ 1 एस के लिए धीरे से डुबोएं।
    नोट: नियंत्रण जानवरों के लिए, ऐसा ही करें लेकिन केवल 1% जलीय 1-प्रोपेनोल में डुबकी लगाएं। एचसीएल (पीएच 4.0) के साथ जानवरों को केवल एक और नियंत्रण के रूप में मानना बेहतर होगा।
  2. कलेक्टर में जानवरों को बहुत धीरे से 6-वेल टिशू कल्चर प्लेट के कुएं में डीडीएच2ओ के 10 एमएल में कलेक्टर 1 एक्स डुबोकर धोएं।
    नोट: यह धोने का चरण बहुत कोमल होना चाहिए और केवल 1x किया जाना चाहिए क्योंकि व्यापक धोने से सीखने में रोक लग सकती है।
  3. चरण 3.1 दोहराएँ। और 3.2. रुकावट के बिना 10x (इंटर-ट्रायल अंतराल [आईटीआई], 0 मिनट)।
    नोट: आरटी पर हर बार ताजा डीडीएच2ओ का उपयोग करें।
  4. जानवरों को आराम करने के लिए आरटी में 10 मिनट के लिए 6 सेमी एनजीएम प्लेट पर ई कोलाई ओपी 50 लॉन पर कलेक्टर को रखें।
  5. कलेक्टर में जानवरों को ddH2O के साथ धोएं और बहुत धीरे-धीरे कलेक्टर को ddH 2 O के ~ 10 mL में2xऊपर और नीचे ले जाएं। जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए प्रत्येक ddH 2 O के ~ 10 एमएल के साथ इस प्रक्रिया को 2गुना अधिक (कुलमिलाकर3x) दोहराएं।
  6. नीचे वर्णित केमोटैक्सिस परख के लिए आगे बढ़ें (चरण 5)।

4. दीर्घकालिक सहयोगी सीखने और स्मृति के लिए अंतरिक्ष प्रशिक्षण

नोट: स्पेस्ड प्रशिक्षण वर्कफ़्लो के लिए चित्रा 2 देखें।

  1. 1% 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (1-प्रोपेनोल के साथ मिश्रण करने के बाद पीएच 4.0; चरण 1.7 देखें) के मिश्रण के 40 एमएल में ~ 200 जानवरों वाले एक पशु कलेक्टर को ~ 1.0 सेकंड के लिए धीरे से डुबोएं।
    नोट: केवल नियंत्रण के रूप में 1% जलीय 1-प्रोपेनोल के साथ ऐसा ही करें। एचसीएल (पीएच 4.0) के साथ जानवरों को केवल एक और नियंत्रण के रूप में मानना बेहतर होगा।
  2. कलेक्टर में जानवरों को बहुत संक्षेप में कलेक्टर को 6-वेल टिशू कल्चर प्लेट के कुएं में डीडीएच2ओ के 10 एमएल में 1x डुबोकर धोएं।
    नोट: यह धुलाई बहुत संक्षिप्त होनी चाहिए क्योंकि व्यापक धोने से सीखने को रोका जा सकता है।
  3. जानवरों को आराम करने के लिए आरटी में 10 मिनट के लिए 6 सेमी (व्यास में) पेट्री डिश में एनजीएम आगर प्लेट पर ई कोलाई ओपी 50 लॉन पर कलेक्टर रखें।
    नोट: आईटीआई के रूप में यह 10 मिनट के लिए आराम करना जानवरों के लिए एलटीएम के गठन के लिए यादों को मजबूत करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. चरण 4.1.-4.3 दोहराएँ। 10x.
  5. कलेक्टर में जानवरों को ddH2O के साथ धोएं, बहुत धीरे सेDDH 2O के ~ 10 mL में कलेक्टर को ऊपर और नीचे ले जाएं, जिसे RT पर रखा जाता है। जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए इस प्रक्रिया को ~ 10 mL ddH 2 O के साथ 2x अधिक (कुलमिलाकर3x) दोहराएं।
  6. नीचे वर्णित केमोटैक्सिस परख के लिए आगे बढ़ें (चरण 5.)।

5. केमोटैक्सिस परख

  1. 6 सेमी प्लास्टिक पेट्री व्यंजनों में केमोटैक्सिस परख के लिए आगर प्लेटें तैयार करें (चरण 1.5 देखें)।
  2. कलेक्टर (चरण 2.5.) में जानवरों को स्थानांतरित करें, जिसे प्लास्टिक पेट्री डिश ढक्कन की सपाट सतह पर रखा जाता है, 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.25% जलीय जिलेटिन के 1 एमएल के साथ एक >1 मिमी (आंतरिक व्यास) खोलने के साथ एक सॉ-ऑफ पिपेट टिप का उपयोग करके।
    नोट: जानवरों पर कतरनी तनाव को कम करने के लिए एक सॉ-ऑफ पिपेट टिप का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
  3. जानवरों को ~ 1 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के तल पर बसने के बाद ट्यूब से सुपरनैटेंट को हटा दें (सेंट्रीफ्यूज न करें)।
  4. धीरे से जानवरों को 1 एमएल केमोटैक्सिस परख बफर (चरण 1.6 देखें) में फिर से निलंबित करें और उन्हें ~ 1 मिनट के लिए ट्यूब के तल पर गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसने दें (सेंट्रीफ्यूज न करें)। पाइपिंग द्वारा जितना संभव हो उतना सतह पर तैरने वाला निकालें।
  5. इस बीच, दो स्थानों पर विकर्ण रूप से 5% जलीय 1-प्रोपेनॉल में से प्रत्येक पर विकर्ण रूप से 4 μL और दो अन्य स्थानों पर ddH 2 O के प्रत्येक स्थान पर 4 μL स्पॉटकरें, जैसा कि चित्र 3A में दिखाया गया है। उत्परिवर्ती के केमोटैक्सिस परख के लिए, जिनमें 1-प्रोपेनोल के प्रति कम संवेदनशीलता होती है, जलीय 1-प्रोपेनोल की उच्च सांद्रता को देखते हैं जिसके परिणामस्वरूप भोले उत्परिवर्ती के ~ 0.6 केमोटैक्सिस इंडेक्स (सीआई) मान होते हैं, जैसा कि पूरक तालिका 1 में दिखाया गया है।
    नोट: स्पॉटिंग प्रक्रियाओं को जितनी जल्दी हो सके पूरा करना महत्वपूर्ण है। स्पॉट 5% जलीय 1-प्रोपेनॉल क्योंकि 1% जलीय 1-प्रोपेनॉल केमोटैक्सिस परख में जानवरों को आकर्षित करने के लिए बहुत कमजोर है। इसके विपरीत, कंडीशनिंग के लिए 1% जलीय 1-प्रोपेनोल का उपयोग करें क्योंकि 1% की तुलना में जलीय 1-प्रोपेनोल की उच्च सांद्रता के साथ इलाज किए गए जानवर कम सीआई मान दिखाते हैं।
  6. केमोटैक्सिस परख बफर (चरण 5.4.) में पशु निलंबन के स्पॉट 6 1 एल भाग जिसमें ~ 1.0 मिमी (आंतरिक व्यास) खोलने के साथ एक सॉ-ऑफ पिपेट टिप का उपयोग करके केमोटैक्सिस परख के लिए तीन प्लेटों के केंद्र में ~ 60 जानवर होते हैं। जानवरों को छूने के बिना प्रयोगशाला ऊतक बाती के साथ जितना संभव हो उतना तरल निकालें और प्लेट पर ढक्कन रखें।
    नोट: इन प्रक्रियाओं को जितनी जल्दी हो सके पूरा करना महत्वपूर्ण है।
  7. जानवरों को आरटी में 10 मिनट के लिए प्लेट पर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति दें, और फिर केमोटैक्सिस को रोकने के लिए 3 मिनट के लिए प्लेट को बर्फ पर ग्लास पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। फिर, प्लेट पर जानवरों की संख्या गिनने तक प्लेट को रेफ्रिजरेटर में रखें।
  8. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत केंद्र सर्कल में उन लोगों को छोड़कर चार वर्गों में जानवरों की संख्या की गणना करें और चित्रा 3 बी में दिखाए गए समीकरण का उपयोग करके केमोटैक्सिस इंडेक्स (सीआई) की गणना करें। सी.आई. मानों से, लर्निंग इंडेक्स (एल.आई.) मानों की गणना संदर्भ जानवरों के सीआई मान और वातानुकूलित जानवरों के सीआई मान (एल.आई. = सी.आई.संदर्भ- सी.आई.वातानुकूलित) के बीच अंतर के रूप में करें।
    नोट: संदर्भ जानवरों का सीआई मान (सीआई संदर्भ) केवल 1% जलीय 1-प्रोपेनोल के साथ वातानुकूलित जानवरों के सीआई मूल्यों का औसत मूल्य है।

Representative Results

एलिगेंस को क्रमशः सीएस और यूएस के रूप में 1% जलीय 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (पीएच 4.0) को जोड़कर अल्पकालिक प्रतिकूल सहयोगी स्मृति बनाने के लिए बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण द्वारा वातानुकूलित किया गया था। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार, सिंक्रनाइज़ जानवरों को 5 दिनों के लिए 18 डिग्री सेल्सियस की आरटी पर एक बेंच पर खेती की गई थी और 18 डिग्री सेल्सियस के आरटी पर डीडीएच2ओ के साथ बहुत धीरे से धोया गया था। फिर, जानवरों को 1 सेकंड के लिए 1% जलीय 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (पीएच 4.0) के मिश्रण के साथ वातानुकूलित किया गया था। हमने जानवरों को केवल डीडीएच2ओ के साथ प्रशिक्षित किया, केवल 1% जलीय 1-प्रोपेनॉल, और एचसीएल (पीएच 4.0) केवल संदर्भ के रूप में। कंडीशनिंग के बाद, जानवरों को डीडीएच2ओ के साथ 1 गुना धोया गया था। हमने बिना किसी रुकावट के कंडीशनिंग 10x दोहराया (कोई आईटीआई नहीं)। प्रक्रिया को 7 गुना से 10 गुना तक दोहराकर सफल कंडीशनिंग हासिल की गई थी। 10 गुना से अधिक कंडीशनिंग के परिणामस्वरूप कम कुशल सीखने मेंमदद मिली। प्रशिक्षण के बाद, जानवरों ने आरटी (18 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए जीवाणु भोजन पर आराम किया। डीडीएच2ओ 3 एक्स के साथ धोए जाने के बाद, जानवरों को 0.25% जलीय जिलेटिन में निलंबित करके एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया और गुरुत्वाकर्षण द्वारा नीचे तक बस गया। जितना संभव हो सके सतह पर तैरने वाले को हटाने के बाद, जानवरों को धीरे से केमोटैक्सिस परख बफर में फिर से निलंबित किया गया और फिर गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के तल पर बसने की अनुमति दी गई।

जितना संभव हो उतना सुपरनैटेंट हटाने के बाद, पशु निलंबन को एक केमोटैक्सिस परख प्लेट के केंद्र सर्कल पर देखा गया था, जिसे 18 डिग्री सेल्सियस के आरटी पर रखा गया था, और फिर जानवरों को 18 डिग्री सेल्सियस के आरटी पर 10 मिनट के लिए प्लेट पर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति दी गई थी। चित्र 3 बी में दिखाए गए समीकरण का उपयोग करके सीआई मानों की गणना की गई थी। जैसा कि चित्र 4 ए में दिखाया गया है, 1% 1-प्रोपेनोल और एचसीएल के मिश्रण के साथ वातानुकूलित जानवर अब केमोटैक्सिस परख के लिए आगर प्लेटों पर देखे गए 5% 1-प्रोपेनोल के प्रति आकर्षित नहीं थे, जबकि भोले और संदर्भ जानवर इसी तरह 5% 1-प्रोपेनोल के प्रति आकर्षित थे। बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण (चरण 3.) के बाद, स्मृति अब 3 घंटे20 के भीतर नहीं देखी गई थी। इसके अलावा, बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण द्वारा बनाई गई स्मृति कोल्ड शॉक20 के प्रति संवेदनशील थी। इन परिणामों से पता चलता है कि सी एलिगेंस ने बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण द्वारा प्रतिकूल एसटीएम का सफलतापूर्वक गठन किया।

प्रशिक्षण चरणों (चरण 4.) के बीच 10 मिनट आईटीआई के साथ 10x अंतरिक्ष प्रशिक्षण द्वारा जानवरों को भी वातानुकूलित किया गया था। आईटीआई के दौरान, जानवरों के साथ कलेक्टर को 18 डिग्री सेल्सियस के आरटी पर 6 सेमी एनजीएम प्लेट पर एक जीवाणु लॉन पर रखा गया था। 1% जलीय 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (पीएच 4.0) के मिश्रण के साथ स्पेस्ड प्रशिक्षण द्वारा वातानुकूलित जानवर अब केवल 1% 1-प्रोपेनोल, एचसीएल (पीएच 4.0) या केवल डीडीएच2ओ (चित्रा 4 बी) के साथ इलाज किए गए जानवरों की तुलना में 5% 1-प्रोपेनोल के प्रति आकर्षित नहीं थे। अंतरिक्ष प्रशिक्षण के बाद, जानवरों ने 12 घंटे20,21 से अधिक समय तक स्मृति को बनाए रखा। इसके अलावा, स्मृति तब नहीं बनी जब जानवरों को अनुवाद या प्रतिलेखन अवरोधकों के साथ इलाज किया गया था और कोल्ड शॉक20,21 के लिए प्रतिरोधी था। इसलिए, सी एलिगेंस ने अंतरिक्ष प्रशिक्षण द्वारा प्रतिकूल एलटीएम का सफलतापूर्वक गठन किया।

हमने एसटीएम और एलटीएम के गठन पर "सीखने और स्मृति जीन" में उत्परिवर्तन के प्रभावों की भी जांच की। सीआरएच -1 जीन सर्वव्यापी प्रतिलेखन कारक सीएएमपी-प्रतिक्रिया तत्व-बाध्यकारी प्रोटीन (सीआरईबी), जीएलआर -1 और एनएमआर -1 को क्रमशः α-एमिनो-3-हाइड्रॉक्सिल-5-मिथाइल-4-आइसोक्साज़ोलप्रोपियोनिक एसिड (एएमपीए)-प्रकार और एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट (एनएमडीए)-प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर सबयूनिट्स को एन्कोड करता है, और स्टॉ-1 डबल-फंसे आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन स्टॉफेन आइसोफॉर्म को एन्कोड करता है। ये जीन सी एलिगेंस, ड्रोसोफिला, एप्लिसिया और चूहों में शास्त्रीय कंडीशनिंग में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। 1% जलीय 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (पीएच 4.0) के मिश्रण का उपयोग करके, एसटीएम और एलटीएम का गठन सभी जीनों (आंकड़े 5 ए, बी) पर निर्भर था।

Figure 1
चित्र 1: बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण का प्रायोगिक योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: अंतरिक्ष प्रशिक्षण का प्रायोगिक योजनाबद्ध. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: केमोटैक्सिस परख और केमोटैक्सिस इंडेक्स। (ए) केमोटैक्सिस परख प्लेट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। पेट्री व्यंजन (व्यास में 6 सेमी) को चार क्षेत्रों में विभाजित किया गया था, और 5% जलीय 1-प्रोपेनोल या डीडीएच 2 ओ में से प्रत्येक को केंद्र से2सेमी दूर दो स्थानों पर विकर्ण रूप से देखा गया था। (बी) केमोटैक्सिस सूचकांक मूल्यों की गणना केमोटैक्सिस के पूरा होने के बाद "ए" और "बी" क्षेत्रों में जानवरों की संख्या की गणना करके दिखाए गए समीकरण से की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: रसायनों के साथ वातानुकूलित जानवरों के केमोटैक्सिस सूचकांक मूल्य। सिंक्रनाइज़ किए गए जंगली-प्रकार के एन 2 जानवरों को (ए) मास्ड ट्रेनिंग 10x या (B) स्पेस्ड ट्रेनिंग 10x द्वारा इंगित रसायनों के साथ वातानुकूलित किया गया था। उपयोग किए गए द्रव्यमान और अंतरिक्ष प्रशिक्षण प्रोटोकॉल के फ़्लोचार्ट क्रमशः चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाए गए हैं। कंडीशनिंग के बाद, जानवर 18 डिग्री सेल्सियस के आरटी पर केमोटैक्सिस परख के लिए 6 सेमी आगर प्लेट पर 10 मिनट के लिए स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र थे। चित्र 3 बी में दिखाए गए समीकरण का उपयोग करके सीआई मानों की गणना की गई थी। इस आंकड़े के लिए डेटा पूरक तालिका 1 में प्रदान किया गया है। भोले जानवरों के डेटा को दोनों आकृति पैनलों में फिर से प्लॉट किया गया था। बार प्लॉट पहले चतुर्थक, माध्य और तीसरे चतुर्थक को दर्शाता है। तारांकन (* पी < 0.05) सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर ों को इंगित करते हैं जो एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा निर्धारित किए जाते हैं, जिसके बाद डनेट के कई तुलना परीक्षण होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: वातानुकूलित उत्परिवर्ती जानवरों के सूचकांक मूल्य सीखना। सिंक्रनाइज़ किए गए जंगली-प्रकार एन 2 और उत्परिवर्ती जानवरों को 1% जलीय 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (पीएच 4.0) के मिश्रण के साथ (ए) मास्ड ट्रेनिंग 10x या (बी) स्पेस्ड ट्रेनिंग 10x द्वारा वातानुकूलित किया गया था। उपयोग किए गए द्रव्यमान और अंतरिक्ष प्रशिक्षण प्रोटोकॉल के फ़्लोचार्ट क्रमशः चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाए गए हैं। कंडीशनिंग के बाद, जानवर 18 डिग्री सेल्सियस के आरटी पर केमोटैक्सिस परख के लिए 6 सेमी आगर प्लेट पर 10 मिनट के लिए स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र थे। इस आंकड़े के लिए डेटा पूरक तालिका 2 में प्रदान किया गया है। बार प्लॉट पहले चतुर्थक, माध्य और तीसरे चतुर्थक को दर्शाता है। तारांकन (* पी < 0.05) सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर ों को इंगित करते हैं जो एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा निर्धारित किए जाते हैं, जिसके बाद डनेट के कई तुलना परीक्षण होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: युवा वयस्क जानवर रासायनिक उपचार के प्रति संवेदनशील हैं। अंडे सेने के बाद दिन 4 और दिन 5 जंगली-प्रकार के एन 2 जानवरों को बिना किसी रुकावट के एचसीएल, पीएच 4.0 के साथ 10 गुना प्रशिक्षित किया गया था और फिर केमोटैक्सिस के लिए 5% जलीय 1-प्रोपेनोल के लिए परख की गई थी। सलाखों का मतलब एसईएम (एन = 19) ± है। तारांकन (* पी < 0.05) सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर ों को इंगित करते हैं जो दो-तरफा एनोवा द्वारा निर्धारित किए जाते हैं, जिसके बाद टुकी-क्रेमर पोस्ट-हॉक परीक्षण होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: चित्रा 4 के अनुरूप डेटा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: चित्रा 5 के अनुरूप डेटा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

वर्तमान अध्ययन में, सभी अभिकर्मकों को औसतन ~ 18 डिग्री सेल्सियस के आरटी पर रखा गया था, और जानवरों को तनाव से बचने के लिए आरटी में एक बेंच पर जानवरों की खेती की गई थी। जानवरों को शुरू में 20 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में खेती की गई थी और फिर आरटी में अभिकर्मकों का उपयोग करके ~ 24 डिग्री सेल्सियस पर एक बेंच पर वातानुकूलित किया गया था। इन शर्तों के तहत, कंडीशनिंग के परिणाम बहुत परिवर्तनशील थे। एलिगेंस धीरे-धीरे बढ़ता है और 20 डिग्री सेल्सियस से अधिक समय तक खेती की जानी चाहिए जब तक कि जानवर परिपक्व वयस्कता चरण तक नहीं पहुंच जाते, क्योंकि युवा वयस्क जानवर परिपक्व वयस्क जानवरों की तुलना में कंडीशनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले रसायनों के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं और कम सीआई मान दिखा सकते हैं।

सफल कंडीशनिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रत्येक रासायनिक उपचार के तुरंत बाद डीडीएच2ओ के साथ जानवरों को धोना है। इसलिए, यांत्रिक और तापमान तनाव को कम से कम किया जाना चाहिए, आरईटी पर अभिकर्मकों को रखकर, और डीडीएच2ओ में पशु कलेक्टर को बहुत धीरे-धीरे ऊपर और नीचे ले जाकर जानवरों को बहुत धीरे से धोना चाहिए। कंडीशनिंग के बाद हर बार जानवरों को पूरी तरह से धोने से सीखने और स्मृति प्रभावित हो सकती है। केमोटैक्सिस परख प्लेटों की स्थितियां भी परिणामों को गंभीर रूप से प्रभावित करती हैं। बहुत सूखी या बहुत गीली प्लेटें जानवरों की चिकनी हरकत को रोकती हैं। चरण 1 में वर्णित प्लेटों को तैयार किया गया था; एक अच्छी प्लेट वह है जिसके लिए डीडीएच2ओ या 5% जलीय 1-प्रोपेनोल के 4 μL धब्बे स्पॉटिंग के लगभग 5 मिनट में एगर द्वारा पूरी तरह से अवशोषित हो जाते हैं। जैसा कि ऊपर वर्णित है, सफल कंडीशनिंग के लिए पशु आयु भी महत्वपूर्ण है। युवा वयस्क जानवर यांत्रिक और रासायनिक उपचार के प्रति संवेदनशील होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तनीय परिणाम होते हैं, हालांकि बहुत वृद्ध जानवर कंडीशनिंग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं।

1-प्रोपेनोल की शेल्फ लाइफ ब्रांडों और लॉट पर निर्भर करती है और आरटी में 3 महीने से कम है। जब भोले जानवरों के सीआई मान खराब हो जाते हैं, तो कंडीशनिंग और केमोटैक्सिस परख के लिए ताजा 1-प्रोपेनोल का उपयोग करने की सिफारिश की जाएगी।

बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण द्वारा स्मृति का गठन अनुवाद अवरोधकों (साइक्लोहेक्सिमाइड और एनिसोमाइसिन) और एक प्रतिलेखन अवरोधक (एक्टिनोमाइसिन डी) के साथ जानवरों के उपचार से प्रभावित नहीं था, जबकि स्पेस्ड प्रशिक्षण द्वारा स्मृति का गठन अवरोधक20,21 द्वारा स्पष्ट रूप से बाधित था। इसके अलावा, पूर्व स्मृति ठंड के झटके से क्षय हो गई, जबकि बाद वाले को पूर्व की तुलना में लंबे समय तक बनाए रखा गया था और ठंडे झटके के लिए प्रतिरोधी था। इन परिणामों से पता चलता है कि पूर्व एसटीएम है और बाद वाला एलटीएम है, क्रमशः20,21। हालांकि, बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण द्वारा बनाई गई स्मृति में एसटीएम और मध्य-अवधि (मध्यवर्ती-अवधि) स्मृति शामिल हो सकती है क्योंकि एसटीएम सीआरईबी प्रतिलेखन कारक (चित्रा 5 ए) पर कमजोर रूप से निर्भर है। यह इस परिणाम के अनुरूप है कि एसटीएम को 1 घंटे20,21 से अधिक समय तक बनाए रखा गया था। एसटीएम और एलटीएम दोनों का गठन एनएमआर -1 पर अत्यधिक निर्भर है, जो सी एलिगेंस27,28 में न्यूरॉन्स (एवीए, एवीडी, एवीई, आरआईएम, एवीजी और पीवीसी) के केवल छह जोड़े में व्यक्त किया जाता है। इन न्यूरॉन्स में, इसलिए, एनएमडीए रिसेप्टर्स सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के लिए 1% जलीय 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (पीएच 4.0) संकेतों के आणविक संयोग डिटेक्टर के रूप में कार्य कर सकते हैं, जहां एसटीएम और एलटीएम दोनों के लिए आवश्यक सिनैप्टिक मजबूती पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक न्यूरॉन्स 29,30,31,32,33 के संयोग फायरिंग के परिणामस्वरूप हो सकती है। इसलिए, प्रतिकूल सहयोगी स्मृति इंटरन्यूरॉन के बीच बन सकती है।

वर्तमान अध्ययन में वर्णित विधियों को सीएस के रूप में 1-नॉननोल और यूएस21 के रूप में पोटेशियम क्लोराइड का उपयोग करके क्षुधा घ्राण सीखने और अल्पकालिक और दीर्घकालिक सहयोगी स्मृति के लिए लागू होना चाहिए। न्यूरोनल सर्किट की तुलना करना दिलचस्प है जो क्षुधाऔर प्रतिकूल यादों के गठन में शामिल हैं।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर उनकी तकनीकी सहायता और टिप्पणियों के लिए ताकाशी मुरायामा, ई-इचिरो सैता, इउ वेन चांग और हितोमी ओहताकी के आभारी हैं। उपभेदों को केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च रिसोर्सेज (एनसीआरआर) द्वारा वित्त पोषित किया गया है। इस काम को ओकिनावा इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी ग्रेजुएट यूनिवर्सिटी से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL beaker HARIO B-500-H32
10 µL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-104-96RS-Q
0.2 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific TTW110RS-Q
1.0 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-111-R100NS-Q
1.5 mL plastic tubes Eppendorf 0030120086
2 mL plastic tubes Eppendorf 0030120094
10 mL Serological pipettes As One 2-5237-04
50 mL Serological pipettes As One 2-5237-06
6-well cell culture plate Costar 3516
Aron Alpha (Glue for plastic) Toagosei High Speed EX
Autoclave Tomy Digital Biology SX-300
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Bottle top 0.2 µm filter units Thermo Fisher Scientific 566-0020
Bunsen burner EISCO SKU CH0089A
Calcium chloride dihydrate Nacalai Tesque 06730-15
C. elegans mutant strains Caenorhabditis Genetics Center
Cholesterol Wako Pure Chemical Industries 034-03002
Clear acrylic cylindrical pipe Asahi Kasei 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness)
Crystallizing dish Pyrex 3140-80
Dental burner Phoenix-Dent APT-3
Di-potassium hydrogen phosphate Nacalai Tesque 28726-05
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Electric pipetter Drummond Scientific 4-000-101
Gelatin Wako Pure Chemical Industries 073-06295
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) As One  Trade FLAT Mark
Heating magnetic stirrer Thermo Fisher Scientific SP131324
Hydrochloric acid Nacalai Tesque 37345-15
Incubator SANYO MIR-553
Kimwipes S-200 Nippon Paper Crecia 62011
Laboratory coat TOYO LINT FREE FH240C
Magnesium sulfate heptahydrate Nacalai Tesque 21002-85
Magnetic stirrer bar SANSYO 93-5412
Metal spatula FUJIFILM Wako 647-06531
Nitrile gloves Kimberly-Clark KC100
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) SEFAR NY30-HD
P10 pipetman Gilson F144802
P200 pipetman Gilson F123600
P1000 pipetman Gilson F123602
pH meter HORIBA  Navi F-52
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) IWAKI SH90-15E
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) SARSTEDT 82.1194.500
Plastic weighing boats As One 1-5233-01
Platinum wire for a worm pick Nilaco PT-351265
1-Propanol SIGMA-ALDRICH 279544
Potassium dihydrogen phosphate Nacalai Tesque 28721-55
Safety goggles Kimberly-Clark #25646
Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-05
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tooth picks
Water purification sysytem Merck Elix Essential 10 UV
Water urification sysytem Merck Milli-Q Synthesis A10
Weighing balance METTLER  TOREDO
Wild type C. elegans strain N2 Caenorhabditis Genetics Center

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 184
<em>केनोरहाब्डिस एलिगेंस</em> में दो रसायनों को जोड़कर प्रतिकूल सहयोगी शिक्षा और स्मृति गठन
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Shibutani, M., Vibulyaseck, S.,… More

Shibutani, M., Vibulyaseck, S., Maruyama, I. N. Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (184), e64137, doi:10.3791/64137 (2022).

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