Summary

Fosfolipidmediator induceret transformation i tredimensionelle kulturer

Published: July 27, 2022
doi:

Summary

Den nuværende protokol beskriver oprettelsen af 3D ‘ovenpå kulturer af en ikke-transformeret brystepitelcellelinje, MCF10A, der er blevet modificeret til at studere blodpladeaktiveringsfaktor (PAF) induceret transformation. Immunfluorescens er blevet brugt til at vurdere transformationen og diskuteres detaljeret.

Abstract

Flere modeller er blevet udviklet til at studere kræft, såsom gnavermodeller og etablerede cellelinjer. Værdifulde indsigter i carcinogenese er blevet tilvejebragt af undersøgelser ved hjælp af disse modeller. Cellelinjer har givet en forståelse af dereguleringen af molekylær signalering forbundet med brysttumorigenese, mens gnavermodeller i vid udstrækning anvendes til at studere cellulære og molekylære egenskaber ved brystkræft in vivo. Etableringen af 3D-kulturer af brystepitel- og kræftceller hjælper med at bygge bro over kløften mellem in vivo- og in vitro-modeller ved at efterligne in vivo-forholdene in vitro. Denne model kan bruges til at forstå dereguleringen af komplekse molekylære signalhændelser og de cellulære egenskaber under brystcarcinogenese. Her modificeres et 3D-kultursystem til at studere en fosfolipidmediatorinduceret (blodpladeaktiveringsfaktor, PAF) transformation. Immunmodulatorer og andre udskillede molekyler spiller en vigtig rolle i tumorinitiering og progression i brystet. I denne undersøgelse udsættes 3D-acinarkulturer af brystepitelceller for PAF-udviste transformationsegenskaber såsom tab af polaritet og ændrede cellulære egenskaber. Dette 3D-kultursystem vil hjælpe med at kaste lys over genetiske og / eller epigenetiske forstyrrelser induceret af forskellige små molekyleenheder i tumormikromiljøet. Derudover vil dette system også give en platform til identifikation af nye såvel som kendte gener, der kan være involveret i transformationsprocessen.

Introduction

Et utal af modeller er tilgængelige for at studere udviklingen af kræft, hver af dem er unikke og repræsenterer en undertype af denne komplekse sygdom. Hver model giver unik og værdifuld indsigt i kræftbiologi og har forbedret midlerne til at efterligne den faktiske sygdomstilstand. Etablerede cellelinjer dyrket som et monolag har givet værdifuld indsigt i vitale processer in vitro, såsom spredning, invasivitet, migration og apoptose1. Selvom todimensionel (2D) cellekultur har været det traditionelle værktøj til at undersøge pattedyrcellernes reaktion på flere miljøforstyrrelser, synes ekstrapolering af disse fund for at forudsige responser på vævsniveau ikke tilstrækkelig overbevisende. Den største begrænsning ved 2D-kulturerne er, at det skabte mikromiljø adskiller sig stort set fra selve brystvævet2. 2D-kultur mangler cellernes interaktion med den ekstracellulære matrix, hvilket er afgørende for væksten af ethvert væv. Trækkræfter, som cellen oplever i monolagskulturer, hindrer også polariteten af disse celler og ændrer således cellesignalering og adfærd 3,4,5. Tredimensionelle (3D) kultursystemer har åbnet en ny vej inden for kræftforskning med deres evne til at efterligne in vivo-forholdene in vitro. Mange vigtige mikromiljømæssige signaler, der går tabt i 2D-cellekultur, kan genetableres ved hjælp af 3D-kulturer af lamininrig ekstracellulær matrix (lrECM)6.

Forskellige undersøgelser har identificeret betydningen af tumormikromiljøet i carcinogenese 7,8. Inflammationsrelaterede faktorer er en stor del af mikromiljøet. Platelet Activating Factor (PAF) er en phospholipid mediator udskilt af forskellige immunceller, der medierer flere immunresponser 9,10. Høje niveauer af PAF udskilles af forskellige brystkræftcellelinjer og er forbundet med forbedret spredning11. Undersøgelser fra vores laboratorium har vist, at den langvarige tilstedeværelse af PAF i acinarkulturer fører til transformation af brystepitelceller12. PAF aktiverer PAF-receptoren (PAFR) og aktiverer PI3K/Akt-signalaksen13. PAFR rapporteres også at være forbundet med EMT, invasion og metastase14.

Den nuværende protokol demonstrerer et modelsystem til at studere PAF-induceret transformation ved hjælp af 3D-kulturer af brystepitelceller, som det tidligere er blevet beskrevet af Chakravarty et al.12. Brystepitelcellerne dyrket på den ekstracellulære matrix (3D-kulturer) har tendens til at danne polariserede vækstarresterede sfæroider. Disse kaldes acini og ligner meget acini af brystvæv, den mindste funktionelle enhed i brystkirtlen, in vivo15. Disse sfæroider (figur 1A, B) består af et monolag af tætpakkede polariserede epitelceller, der omgiver et hult lumen og er fastgjort til kældermembranen (figur 1C). Denne morfogeneseproces er blevet godt beskrevet i litteratur16. Når cellerne sås på lrECM, gennemgår de opdeling og differentiering for at danne en klynge af celler, som derefter polariserer fra dag 4 og fremefter. På dag 8 består acini af en gruppe polariserede celler, der er i direkte kontakt med den ekstracellulære matrix og en klynge af upolariserede celler indesluttet i de ydre polariserede celler uden kontakt til matrixen. Disse upolariserede celler er kendt for at gennemgå apoptose ved dag 12 af kultur, der danner et hult lumen. På dag 16 dannes væksthæmmede strukturer16.

Figure 1
Figur 1: Kerner af celler i acini farvet med en nuklear plet . (A) 3D-konstruktion af acini. (B) Fasekontrastbillede af MCF10A acini dyrket på Matrigel i 20 dage. (C) Det midterste afsnit viser tilstedeværelsen af et hult lumen. Skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

I modsætning til 2D-kulturer hjælper acinarkulturer med at skelne mellem normale og transformerede celler gennem tilsyneladende morfologiændringer. Ikke-transformerede brystepitelceller danner acini med et hult lumen, der efterligner den normale menneskelige bryst acini. Disse sfæroider viser ved transformation en forstyrret morfologi karakteriseret ved et stort tab af polaritet (et af kendetegnene ved kræft), fravær af lumen eller forstyrrelse af det hule lumen (på grund af unddragelse af apoptose), der kan induceres på grund af deregulering af forskellige gener17,18,19,20 . Disse transformationer kan studeres ved hjælp af almindeligt anvendte teknikker såsom immunfluorescens. Således kan 3D-cellekulturmodellen fungere som en simpel metode til at undersøge processen med bryst acinarmorfogenese og brystcarcinogenese. Etablering af et 3D-kultursystem for at forstå effekten af en phospholipidmediator, PAF, vil hjælpe med præklinisk lægemiddelscreening med høj kapacitet.

Dette arbejde har tilpasset 3D ‘on top’ kulturprotokol16,21 til undersøgelse af transformation induceret af PAF22. De fænotypiske ændringer induceret ved eksponering af acini for phospholipidmediatoren blev undersøgt ved anvendelse af immunfluorescens. Forskellige polaritets- og epitel-til-mesenkymale overgangsmarkører (EMT) 12,16 blev anvendt i undersøgelsen. Tabel 1 nævner deres normale lokalisering og deres forventede fænotype ved transformation.

Antistoffer Markerer Normal lokalisering Transformeret fænotype
α6-Integrin Basolateral Basal med svag lateral plet Stærk lateral / apikal plet
β-Catenin Celle-celle-kryds Basolateral Unormal / nuklear eller cytoplasmatisk lokalisering
Vimentin Emt Fraværende / svag tilstedeværelse Opregulering

Tabel 1: Markører anvendt i undersøgelsen. Forskellige markører anvendes med deres lokalisering i nærvær og fravær af PAF-behandling.

Denne metode kan bedst bruges til at studere / screene plausible lægemidler og målrette gener for forskellige brystkræftundertyper. Dette kan give data om lægemiddelrespons tættere på in vivo-scenariet og bidrage til hurtigere og mere pålidelig lægemiddeludvikling. Dette system kan også bruges til at studere molekylær signalering forbundet med lægemiddelrespons og lægemiddelresistens.

Protocol

1. Såning af MCF10A-celler i lrECM Vedligehold MCF10A-celler (klæbende brystepitelceller) i vækstmediet. Passage cellerne hver 4. dag.BEMÆRK: Sammensætning af vækstmedium: DMEM med høj glukose uden natriumpyruvat indeholdende hesteserum (5%), insulin (10 μg/ml), hydrocortison (0,5 μg/ml), epidermal vækstfaktor, EGF (20 ng/ml), koleratoksin (100 ng/ml) og penicillin-streptomycin (100 enheder/ml) (se materialetabel). Optøning lrECM (se Materialeta…

Representative Results

MCF10A-celler danner ved eksponering for PAF-behandling acinarstrukturer med meget forskellige fænotyper. α6-integrin viste sig at være fejllokaliseret med mere apikal farvning. Nogle få acini viste også diskontinuerlig farvning (figur 2A). Begge disse fænotyper indikerer tabet af basal polaritet, som det fremgår af litteratur24,25. Tidligere rapporter tyder på α6-integrins kontroversielle rolle i kræftmetastase. α6-integr…

Discussion

Etablerede cellelinjebaserede modeller bruges i vid udstrækning til at studere processen med carcinogenese. Monolagskulturer af celler fortsætter med at give indsigt i de forskellige molekylære signalveje, der formidler karakteristiske ændringer i kræftceller32. Undersøgelser af rollen som velkendte onkogener som Ras, Myc og muteret p53 blev først rapporteret ved hjælp af monolagskulturer som modelsystem33,34,35,36<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker IISER Pune Microscopy Facility for adgang til udstyr og infrastruktur og støtte til eksperimenterne. Denne undersøgelse blev støttet af et tilskud fra Institut for Bioteknologi (DBT), Indiens regering (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013), Science and Engineering Research Board (SERB), Indiens regering (EMR / 2016 / 001974) og delvist af IISER, Pune Core-finansiering. A. K. blev finansieret af CSIR-SRF-stipendium, LA blev finansieret gennem DST-INSPIRE-stipendium, V.C blev finansieret af DBT (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013).

Materials

0.05% Trypsin EDTA Invitrogen 25300062
16% paraformaldehyde Alfa Aesar AA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488 Invitrogen A11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488 Invitrogen A-11008
BSA Sigma A7030
Chamber Coverglass Nunc 155409
Cholera Toxin Sigma C8052-1MG 1 mg/mL in dH2O
Confocal Microscope Leica Leica SP8
DMEM Gibco 11965126
EDTA Sigma E6758
EGF Sigma E9644-0.2MG 100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen Jackson Immunoresearch 115-006-006
GM130 antibody Abcam ab52649
Goat Serum Abcam ab7481
Hoechst Invitrogen 33258
Horse Serum Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma H0888 1 mg/mL in ethanol
Image Processing Software ImageJ
Insulin Sigma I1882 10 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel) Corning 356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) Invitrogen S36937
Nuclear Stain  (Hoechst) Invitrogen 33258
PAF Cayman Chemicals 91575-58-5 Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-Streptomycin Lonza 17-602E
Sodium Azide Sigma S2002
Tris Base Sigma B9754
Triton X-100 Sigma T8787
Tween 20 Sigma P9416
Vimentin antibody Abcam ab92547
α6-integrin antibody Millipore MAB1378

References

  1. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
  2. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  3. Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  4. Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
  5. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  6. Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
  7. Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
  8. Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
  9. Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
  10. Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
  11. Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
  12. Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938 (2021).
  13. Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
  14. Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
  15. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  17. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  18. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  19. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
  20. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
  21. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  22. Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287 (2014).
  23. Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
  24. Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688 (2019).
  25. Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
  26. Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
  27. Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
  28. Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
  29. Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
  30. Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
  31. Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
  32. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  33. Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
  34. McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
  35. Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
  36. Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12 (2016).
  37. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  38. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  39. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  40. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  41. Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543 (2020).

Play Video

Cite This Article
Kuttanamkuzhi, A., Anandi, L., Chakravarty, V., Lahiri, M. Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (185), e64146, doi:10.3791/64146 (2022).

View Video