Den nuværende protokol beskriver oprettelsen af 3D ‘ovenpå ‘ kulturer af en ikke-transformeret brystepitelcellelinje, MCF10A, der er blevet modificeret til at studere blodpladeaktiveringsfaktor (PAF) induceret transformation. Immunfluorescens er blevet brugt til at vurdere transformationen og diskuteres detaljeret.
Flere modeller er blevet udviklet til at studere kræft, såsom gnavermodeller og etablerede cellelinjer. Værdifulde indsigter i carcinogenese er blevet tilvejebragt af undersøgelser ved hjælp af disse modeller. Cellelinjer har givet en forståelse af dereguleringen af molekylær signalering forbundet med brysttumorigenese, mens gnavermodeller i vid udstrækning anvendes til at studere cellulære og molekylære egenskaber ved brystkræft in vivo. Etableringen af 3D-kulturer af brystepitel- og kræftceller hjælper med at bygge bro over kløften mellem in vivo- og in vitro-modeller ved at efterligne in vivo-forholdene in vitro. Denne model kan bruges til at forstå dereguleringen af komplekse molekylære signalhændelser og de cellulære egenskaber under brystcarcinogenese. Her modificeres et 3D-kultursystem til at studere en fosfolipidmediatorinduceret (blodpladeaktiveringsfaktor, PAF) transformation. Immunmodulatorer og andre udskillede molekyler spiller en vigtig rolle i tumorinitiering og progression i brystet. I denne undersøgelse udsættes 3D-acinarkulturer af brystepitelceller for PAF-udviste transformationsegenskaber såsom tab af polaritet og ændrede cellulære egenskaber. Dette 3D-kultursystem vil hjælpe med at kaste lys over genetiske og / eller epigenetiske forstyrrelser induceret af forskellige små molekyleenheder i tumormikromiljøet. Derudover vil dette system også give en platform til identifikation af nye såvel som kendte gener, der kan være involveret i transformationsprocessen.
Et utal af modeller er tilgængelige for at studere udviklingen af kræft, hver af dem er unikke og repræsenterer en undertype af denne komplekse sygdom. Hver model giver unik og værdifuld indsigt i kræftbiologi og har forbedret midlerne til at efterligne den faktiske sygdomstilstand. Etablerede cellelinjer dyrket som et monolag har givet værdifuld indsigt i vitale processer in vitro, såsom spredning, invasivitet, migration og apoptose1. Selvom todimensionel (2D) cellekultur har været det traditionelle værktøj til at undersøge pattedyrcellernes reaktion på flere miljøforstyrrelser, synes ekstrapolering af disse fund for at forudsige responser på vævsniveau ikke tilstrækkelig overbevisende. Den største begrænsning ved 2D-kulturerne er, at det skabte mikromiljø adskiller sig stort set fra selve brystvævet2. 2D-kultur mangler cellernes interaktion med den ekstracellulære matrix, hvilket er afgørende for væksten af ethvert væv. Trækkræfter, som cellen oplever i monolagskulturer, hindrer også polariteten af disse celler og ændrer således cellesignalering og adfærd 3,4,5. Tredimensionelle (3D) kultursystemer har åbnet en ny vej inden for kræftforskning med deres evne til at efterligne in vivo-forholdene in vitro. Mange vigtige mikromiljømæssige signaler, der går tabt i 2D-cellekultur, kan genetableres ved hjælp af 3D-kulturer af lamininrig ekstracellulær matrix (lrECM)6.
Forskellige undersøgelser har identificeret betydningen af tumormikromiljøet i carcinogenese 7,8. Inflammationsrelaterede faktorer er en stor del af mikromiljøet. Platelet Activating Factor (PAF) er en phospholipid mediator udskilt af forskellige immunceller, der medierer flere immunresponser 9,10. Høje niveauer af PAF udskilles af forskellige brystkræftcellelinjer og er forbundet med forbedret spredning11. Undersøgelser fra vores laboratorium har vist, at den langvarige tilstedeværelse af PAF i acinarkulturer fører til transformation af brystepitelceller12. PAF aktiverer PAF-receptoren (PAFR) og aktiverer PI3K/Akt-signalaksen13. PAFR rapporteres også at være forbundet med EMT, invasion og metastase14.
Den nuværende protokol demonstrerer et modelsystem til at studere PAF-induceret transformation ved hjælp af 3D-kulturer af brystepitelceller, som det tidligere er blevet beskrevet af Chakravarty et al.12. Brystepitelcellerne dyrket på den ekstracellulære matrix (3D-kulturer) har tendens til at danne polariserede vækstarresterede sfæroider. Disse kaldes acini og ligner meget acini af brystvæv, den mindste funktionelle enhed i brystkirtlen, in vivo15. Disse sfæroider (figur 1A, B) består af et monolag af tætpakkede polariserede epitelceller, der omgiver et hult lumen og er fastgjort til kældermembranen (figur 1C). Denne morfogeneseproces er blevet godt beskrevet i litteratur16. Når cellerne sås på lrECM, gennemgår de opdeling og differentiering for at danne en klynge af celler, som derefter polariserer fra dag 4 og fremefter. På dag 8 består acini af en gruppe polariserede celler, der er i direkte kontakt med den ekstracellulære matrix og en klynge af upolariserede celler indesluttet i de ydre polariserede celler uden kontakt til matrixen. Disse upolariserede celler er kendt for at gennemgå apoptose ved dag 12 af kultur, der danner et hult lumen. På dag 16 dannes væksthæmmede strukturer16.
Figur 1: Kerner af celler i acini farvet med en nuklear plet . (A) 3D-konstruktion af acini. (B) Fasekontrastbillede af MCF10A acini dyrket på Matrigel i 20 dage. (C) Det midterste afsnit viser tilstedeværelsen af et hult lumen. Skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
I modsætning til 2D-kulturer hjælper acinarkulturer med at skelne mellem normale og transformerede celler gennem tilsyneladende morfologiændringer. Ikke-transformerede brystepitelceller danner acini med et hult lumen, der efterligner den normale menneskelige bryst acini. Disse sfæroider viser ved transformation en forstyrret morfologi karakteriseret ved et stort tab af polaritet (et af kendetegnene ved kræft), fravær af lumen eller forstyrrelse af det hule lumen (på grund af unddragelse af apoptose), der kan induceres på grund af deregulering af forskellige gener17,18,19,20 . Disse transformationer kan studeres ved hjælp af almindeligt anvendte teknikker såsom immunfluorescens. Således kan 3D-cellekulturmodellen fungere som en simpel metode til at undersøge processen med bryst acinarmorfogenese og brystcarcinogenese. Etablering af et 3D-kultursystem for at forstå effekten af en phospholipidmediator, PAF, vil hjælpe med præklinisk lægemiddelscreening med høj kapacitet.
Dette arbejde har tilpasset 3D ‘on top’ kulturprotokol16,21 til undersøgelse af transformation induceret af PAF22. De fænotypiske ændringer induceret ved eksponering af acini for phospholipidmediatoren blev undersøgt ved anvendelse af immunfluorescens. Forskellige polaritets- og epitel-til-mesenkymale overgangsmarkører (EMT) 12,16 blev anvendt i undersøgelsen. Tabel 1 nævner deres normale lokalisering og deres forventede fænotype ved transformation.
Antistoffer | Markerer | Normal lokalisering | Transformeret fænotype |
α6-Integrin | Basolateral | Basal med svag lateral plet | Stærk lateral / apikal plet |
β-Catenin | Celle-celle-kryds | Basolateral | Unormal / nuklear eller cytoplasmatisk lokalisering |
Vimentin | Emt | Fraværende / svag tilstedeværelse | Opregulering |
Tabel 1: Markører anvendt i undersøgelsen. Forskellige markører anvendes med deres lokalisering i nærvær og fravær af PAF-behandling.
Denne metode kan bedst bruges til at studere / screene plausible lægemidler og målrette gener for forskellige brystkræftundertyper. Dette kan give data om lægemiddelrespons tættere på in vivo-scenariet og bidrage til hurtigere og mere pålidelig lægemiddeludvikling. Dette system kan også bruges til at studere molekylær signalering forbundet med lægemiddelrespons og lægemiddelresistens.
Etablerede cellelinjebaserede modeller bruges i vid udstrækning til at studere processen med carcinogenese. Monolagskulturer af celler fortsætter med at give indsigt i de forskellige molekylære signalveje, der formidler karakteristiske ændringer i kræftceller32. Undersøgelser af rollen som velkendte onkogener som Ras, Myc og muteret p53 blev først rapporteret ved hjælp af monolagskulturer som modelsystem33,34,35,36<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker IISER Pune Microscopy Facility for adgang til udstyr og infrastruktur og støtte til eksperimenterne. Denne undersøgelse blev støttet af et tilskud fra Institut for Bioteknologi (DBT), Indiens regering (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013), Science and Engineering Research Board (SERB), Indiens regering (EMR / 2016 / 001974) og delvist af IISER, Pune Core-finansiering. A. K. blev finansieret af CSIR-SRF-stipendium, LA blev finansieret gennem DST-INSPIRE-stipendium, V.C blev finansieret af DBT (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013).
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
BSA | Sigma | A7030 | |
Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
DMEM | Gibco | 11965126 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
Image Processing Software | ImageJ | ||
Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
Tris Base | Sigma | B9754 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween 20 | Sigma | P9416 | |
Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |