Summary
본 프로토콜은 혈소판 활성화 인자(PAF) 유도 형질전환을 연구하기 위해 변형된 형질전환되지 않은 유방 상피 세포주인 MCF10A의 3D '온탑 ' 배양의 설정을 설명합니다. 면역-형광은 형질전환을 평가하기 위해 사용되었으며 상세히 논의된다.
Abstract
설치류 모델 및 확립 된 세포주와 같은 암을 연구하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. 발암에 대한 귀중한 통찰력은 이러한 모델을 사용한 연구에 의해 제공되었습니다. 세포주는 유방 종양 발생과 관련된 분자 신호 전달의 조절 완화에 대한 이해를 제공하는 반면, 설치류 모델은 생체 내에서 유방암의 세포 및 분자 특성을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 유방 상피 및 암세포의 3D 배양의 확립은 in vivo 조건을 모방하여 in vivo 모델과 in vitro 모델 사이의 격차를 해소하는 데 도움이 됩니다. 이 모델은 복잡한 분자 신호 전달 이벤트의 조절 완화와 유방 발암 중 세포 특성을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, 인지질 매개체-유도(혈소판 활성화 인자, PAF) 형질전환을 연구하기 위해 3D 배양 시스템을 변형한다. 면역 조절제 및 기타 분비 된 분자는 유방에서 종양 시작 및 진행에 중요한 역할을합니다. 본 연구에서, PAF에 노출된 유방 상피 세포의 3D acinar 배양물은 극성 손실 및 변경된 세포 특성과 같은 형질전환 특성을 나타내었다. 이 3D 배양 시스템은 종양 미세 환경에서 다양한 소분자 개체에 의해 유도된 유전적 및/또는 후성유전학적 섭동을 밝히는 데 도움이 됩니다. 또한, 이 시스템은 또한 형질전환 과정에 관여할 수 있는 신규한 유전자뿐만 아니라 알려진 유전자의 식별을 위한 플랫폼을 제공할 것이다.
Introduction
암의 진행을 연구하기 위해 수많은 모델을 사용할 수 있으며, 각 모델은 고유하며이 복잡한 질병의 하위 유형을 나타냅니다. 각 모델은 암 생물학에 대한 독특하고 가치 있는 통찰력을 제공하며 실제 질병 상태를 모방하는 수단을 개선했습니다. 단일층으로 성장한 확립된 세포주는 증식, 침습성, 이동 및 세포자멸사와 같은 시험관 내 중요한 과정에 대한 귀중한 통찰력을제공했습니다1. 2차원(2D) 세포 배양이 여러 환경 섭동에 대한 포유류 세포의 반응을 조사하는 전통적인 도구였지만 조직 수준 반응을 예측하기 위한 이러한 발견의 외삽은 충분히 설득력이 없어 보입니다. 2D 배양의 주요 한계는 생성 된 미세 환경이 유방 조직 자체의 미세 환경과 크게 다르다는 것입니다2. 2D 배양은 세포와 세포 외 기질의 상호 작용이 부족하며, 이는 모든 조직의 성장에 필수적입니다. 또한 단층 배양에서 세포가 경험하는 인장력은 이러한 세포의 극성을 방해하여 세포 신호 전달 및 거동 3,4,5를 변경합니다. 3차원(3D) 배양 시스템은 체외 조건을 모방할 수 있는 능력으로 암 연구 분야의 새로운 길을 열었습니다. 2D 세포 배양에서 손실되는 많은 중요한 미세환경 신호는 라미닌이 풍부한 세포외 기질(lrECM)의 3D 배양을 사용하여 재설정할 수 있습니다6.
다양한 연구에서 발암 7,8에서 종양 미세 환경의 중요성이 확인되었습니다. 염증 관련 요인은 미세 환경의 주요 부분입니다. 혈소판 활성화 인자 (PAF)는 다중 면역 반응 9,10을 매개하는 다양한 면역 세포에 의해 분비되는 인지질 매개체입니다. 높은 수준의 PAF는 상이한 유방암 세포주에 의해 분비되며 향상된 증식과 관련이 있습니다11. 우리 연구실의 연구에 따르면 아시나 배양에서 PAF가 장기간 존재하면 유방 상피 세포가 변형되는 것으로 나타났습니다12. PAF는 PAF 수용체 (PAFR)를 활성화시켜 PI3K / Akt 신호 전달 축13을 활성화시킵니다. PAFR은 또한 EMT, 침습 및 전이14와 관련이있는 것으로보고되었습니다.
본 프로토콜은 Chakravarty et al.12에 의해 이전에 기술된 바와 같이, 유방 상피 세포의 3D 배양을 사용하여 PAF-유도된 형질전환을 연구하기 위한 모델 시스템을 입증한다. 세포외 기질(3D 배양)에서 성장한 유방 상피 세포는 편광된 성장 정지 스페로이드를 형성하는 경향이 있습니다. 이들은 acini라고 불리며 생체내 15에서 유선의 가장 작은 기능 단위 인 유방 조직의 acini와 매우 유사합니다. 이러한 스페로이드(그림 1A,B)는 속이 빈 내강을 둘러싸고 기저막에 부착된 밀접하게 채워진 편광 상피 세포의 단층으로 구성됩니다(그림 1C). 이러한 형태 형성 과정은 문헌16에 잘 설명되어 있습니다. lrECM에 파종하면 세포가 분열과 분화를 거쳐 세포 클러스터를 형성한 다음 4일째부터 분극화됩니다. 8일차까지 acini는 세포외 기질과 직접 접촉하는 편광 세포 그룹과 기질에 접촉하지 않고 외부 편광 세포 내에 둘러싸인 분극되지 않은 세포 클러스터로 구성됩니다. 이러한 분극되지 않은 세포는 배양 12일째까지 세포사멸을 거쳐 속이 빈 내강을 형성하는 것으로 알려져 있습니다. 16 일째까지, 성장 정지 구조가 형성됩니다16.
그림 1: 핵 염색으로 염색된 acini의 세포핵 . (A) acini의 3D 구성. (B) 20일 동안 마트리겔에서 성장한 MCF10A 아시니의 위상차 이미지. (C) 가장 중앙 부분은 중공 루멘의 존재를 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2D 배양과 달리 acinar 배양은 명백한 형태 변화를 통해 정상 세포와 형질전환 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다. 형질전환되지 않은 유방 상피 세포는 속이 빈 내강을 가진 acini를 형성하여 정상적인 인간 유방 acini를 모방합니다. 이러한 스페로이드는 변형시 다양한 유전자의 조절 완화로 인해 유도 될 수있는 극성의 주요 손실 (암의 특징 중 하나), 내강의 부재 또는 중공 내강의 파괴 (세포 사멸의 회피로 인한)를 특징으로하는 분열 된 형태를 보여줍니다17,18,19,20 . 이러한 형질전환은 면역형광법과 같이 일반적으로 사용되는 기술을 사용하여 연구할 수 있습니다. 따라서, 3D 세포 배양 모델은 유방 무시나르 형태형성 및 유방 발암 과정을 조사하는 간단한 방법으로 기능할 수 있다. 인지질 매개체인 PAF의 효과를 이해하기 위한 3D 배양 시스템을 구축하면 고처리량 전임상 약물 스크리닝에 도움이 됩니다.
이 연구는 PAF 22에 의해 유도 된 형질 전환을 연구하기 위해 3D '상단'배양 프로토콜16,21을 채택했습니다. 인지질 매개체에 대한 acini의 노출에 의해 유도 된 표현형 변화는 면역 형광법을 사용하여 연구되었다. 다양한 극성 및 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT) 마커12,16이 연구에 사용되었습니다. 표 1은 이들의 정상적인 국소화와 형질전환 시 예상되는 표현형을 언급한다.
| 항 체 | 표시 | 일반 현지화 | 형질 전환 된 표현형 |
| α6-인테그린 | 기저측 | 약한 측면 얼룩이있는 기초 | 강한 측면 / 정점 얼룩 |
| β-카테닌 | 세포-세포 접합 | 기저측 | 비정상/핵 또는 세포질 국소화 |
| 비 멘틴 | 증권 시세 표시기 | 부재 / 약한 존재 | 상향 규제 |
표 1: 연구에 사용된 마커. PAF 치료의 유무에 따라 국소화와 함께 사용되는 다른 마커.
이 방법은 다양한 유방암 아형에 대한 그럴듯한 약물 및 표적 유전자를 연구/스크리닝하는 데 가장 잘 활용될 수 있습니다. 이는 생체 내 시나리오에 더 가까운 약물 반응 데이터를 제공하여 더 빠르고 신뢰할 수 있는 약물 개발을 지원할 수 있습니다. 또한이 시스템은 약물 반응 및 약물 내성과 관련된 분자 신호 전달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lrECM에 MCF10A 세포 파종
- MCF10A 세포(부착성 유방 상피 세포)를 성장 배지에 유지합니다. 4 일마다 세포를 계대하십시오.
참고: 성장 배지의 구성: 말 혈청(5%), 인슐린(10μg/mL), 하이드로코르티손(0.5μg/mL), 표피 성장 인자, EGF(20ng/mL), 콜레라 독소(100ng/mL) 및 페니실린-스트렙토마이신(100단위/mL)을 포함하는 나트륨 피루브산이 없는 고포도당 DMEM( 재료 표 참조). - 실험 시작 20분 전에 얼음에서 lrECM( 재료 표 참조)을 해동합니다. 세포를 파종하는 날은 일반적으로 Day 0으로 간주됩니다.
- 세포를 트립신화하기 위해, 배지를 흡인하고, 2 mL의 PBS로 세척한다. 900 μL의 0.05 % 트립신 -EDTA를 추가하고 ~ 15 분 동안 또는 세포가 완전히 트립신 화 될 때까지 37 ° C에서 배양합니다.
- 챔버 커버 유리 슬라이드의 8 개 웰에 lrECM 베드를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
- 세포가 트립시니징 중일 때, 각 웰을 60 μL의 lrECM으로 코팅하고 최대 15분 동안 37°CCO2 인큐베이터에 둔다.
- 아래 단계에 따라 세포 현탁액을 준비합니다.
- 세포를 완전히 제거한 후 5mL의 재현탁 배지를 추가하여 트립신 활성을 소멸시키고 세포를 112 x g 에서 25°C에서 10분 동안 회전시킵니다.
참고: 재현탁 배지의 구성: 피루브산 나트륨이 없는 고포도당 DMEM, 말 혈청(20%) 및 페니실린-스트렙토마이신(100단위/mL)이 보충됨. - 사용한 배지를 흡인하고 2mL의 분석 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 단일 세포 현탁액의 형성을 보장하기 위해 현탁액을 잘 혼합하십시오.
참고: 분석 배지의 구성: 피루브산 나트륨이 없는 고포도당 DMEM, 말 혈청(2%), 하이드로코르티손(0.5μg/mL), 콜레라 독소(100ng/mL), 인슐린(10μg/mL) 및 페니실린-스트렙토마이신(100단위/mL). - 혈구계를 사용하여 세포를 세고 각 웰에 6 x 103 세포를 시드하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산합니다.
참고: 일반적으로 파이펫팅 오류를 설명하기 위해 계산에 웰을 하나 더 포함하는 것이 좋습니다. - 필요한 웰의 수에 따라, 세포 현탁액을 오버레이 배지에서 희석한다.
참고: 단일 웰의 오버레이 배지 조성은 분석 배지 400μL, lrECM 8μL(최종 2%), EGF 100μg/mL 0.02μL(최종 5ng/mL)입니다.
- 세포를 완전히 제거한 후 5mL의 재현탁 배지를 추가하여 트립신 활성을 소멸시키고 세포를 112 x g 에서 25°C에서 10분 동안 회전시킵니다.
- 세포의 시드를 수행하십시오.
- 준비된 lrECM 베드에 희석된 세포 현탁액 400μL를 추가하여(단계 1.4), lrECM 베드를 방해하지 않도록 조심스럽게 확인합니다. 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.
2. PAF 치료
- 세포의 파종 후에 PAF 3 h를 첨가하십시오. PBS 중 PAF의 100 μM 스톡을 준비하고, 각 웰에 0.2 μL의 필요한 부피를 첨가한다(이는 200 nM에 해당).
- 모든 배지 교체 중에 동일한 농도의 PAF를 추가하십시오.
3. 신선한 미디어로 다시 먹이기
- 세포를 4일마다(즉, 4일, 8일, 12일, 및 16일) 새로운 배지로 보충한다.
4. 장기간 PAF 노출로 인한 표현형 변화를 검출하기 위한 면역형광 연구
- 배양 20일 후, 각 웰에서 배지를 조심스럽게 피펫팅하고 400μL의 예열된 PBS로 웰을 세척합니다.
- 400μL의 4% 파라포름알데히드(1x PBS에서 16% 파라포름알데히드를 희석하여 새로 제조)를 추가하고 실온에서 20분 동안 배양하여 acinar 구조를 고정합니다.
- 얼음처럼 차가운 PBS로 웰을 한 번 헹구고 0.5% 트리톤 X-100을 함유한 PBS로 4°C에서 10분 동안 투과화합니다.
- 10분 후, 즉시 그러나 조심스럽게 Triton-X 100 용액을 피펫팅하고 400μL의 PBS-글리신으로 헹굽니다(1x PBS에 글리신 한 꼬집을 추가하여 새로 준비). 이것은 각각 15 분 동안 세 번 반복됩니다.
- 면역형광(IF) 완충액에 10% 염소 혈청( 재료 표 참조)을 포함하는 1차 차단 용액 400μL를 추가하고 실온에서 60분 동안 배양합니다.
참고 : IF 완충액의 조성 : 0.05 % 아지드 화 나트륨, 0.1 % BSA, 0.2 % 트리톤 -X 100 및 0.05 % 트윈 (20 in 1 PBS). - 1차 블로킹 용액을 제거하고 1차 블로킹 용액에 준비된 2% 2차 블로킹 항체(마우스 항원에 대해 염소에서 자란 항체의 F(ab')2 단편, 재료 표 참조) 200μL를 추가하고 실온에서 45-60분 동안 그대로 둡니다.
- 1차 항체( 재료 표 참조)를 1:100 희석액의 2% 2차 차단 항체 용액에 준비합니다. 2차 블로킹 용액을 제거한 후, 새로 제조된 항체를 첨가하고 4°C에서 밤새 배양한다.
- 이전 단계는 기저막의 액화를 유도 할 수 있습니다. 실험을 진행하기 전에 슬라이드가 실온에 도달 할 때까지 기다리십시오. 1차 항체 용액을 조심스럽게 피펫팅하고 400μL의 IF 완충액으로 3회 세척합니다.
- IF 완충액으로 마지막으로 세척하는 동안, 1차 블로킹 용액에서 형광단-접합된 2차 항체 ( 물질 표 참조)의 1:200 희석물을 준비한다. 슬라이드를 실온에서 40-60분 동안 2차 항체 용액에서 인큐베이션한다.
- 슬라이드를 400μL의 IF 완충액으로 20분 동안 헹구고, 이어서 PBS로 각각 10분 동안 2회 세척한다.
- 실온에서 5-6분 동안 0.5ng/mL의 핵 염색( 재료 표 참조)이 포함된 PBS로 핵을 반대 염색합니다. 슬라이드를 400μL의 PBS로 세 번 세척하여 과도한 얼룩을 제거합니다.
- 전체 PBS를 조심스럽게 피펫팅하고 잔류 용액을 제거하십시오. 각 웰에 장착 시약 한 방울( 재료 표 참조)을 넣고 실온에서 밤새 방치합니다.
- 슬라이드를 실온에 보관하고 가능한 한 빨리 슬라이드를 이미지화합니다.
- 컨포칼 현미경에서 40x 또는 63x 배율 아래의 이미지( 재료 표 참조), 0.6mm 스텝 크기(NA = 1.4)의 광학 Z 절편 촬영.
- 이미지 처리 소프트웨어로 획득한 이미지를 엽니다( 재료 표 참조). 3D 투영을 사용하여 형태학적 차이를 보여줍니다.
알림: 가장 중앙 광학 Z 섹션은 극성 마커의 위치 차이를 표시하는 데 가장 잘 사용할 수 있습니다. 이들은 특정 염색 패턴을 보여주는 스페로이드의 백분율을 나타내기 위해 수동으로 정량화될 수 있습니다. - 단백질 발현의 차이를 설명하기 위해 평균 회색 값을 측정하거나 보정된 총 세포 형광(CTCF)23을 계산하는 반정량 분석을 수행합니다. 데이터를 바이올린 또는 점도표로 표현합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MCF10A 세포는 PAF 치료에 노출되면 매우 뚜렷한 표현형을 가진 아시나 구조를 형성합니다. α6-인테그린은 더 많은 정점 염색으로 잘못 국소화된 것으로 밝혀졌습니다. 몇몇 acini는 또한 불연속 염색을 나타내었다 (도 2A). 이 두 표현형은 문헌24,25에서 입증 된 바와 같이 기저 극성의 상실을 나타냅니다. 이전 보고서는 암 전이에서 α6-인테그린의 논란의 여지가 있는 역할을 나타냅니다. α6- 인테그린은 β1- 또는 β4- 인테그린과 함께 이량 체로 존재합니다. α6β4 서브유닛은 상피 세포에서 헤미데스모솜을 형성하는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다26. 이 인테그린의 하향 조절은 전립선 및 유방암의 일부 사례에서 발견되었으며, 여기서 α6β4- 인테그린의 손실은 유방의 유관 암종 (등급 III)에서 발견되었습니다. 손실 표현형은 실질 및 흉막 강27,28,29로 전이하는 세포에서 볼 수 있습니다. GM130은 시스-골지체 단백질; 골지체는 MCF10A 아시나 배양물16,30에 정점으로 국한되어 있다. PAF 처리는 GM130의 오국소화로 이어져 정점 극성 파괴를 시사합니다(그림 2B). Vimentin은 세포 이동에 관여하는 중간 필라멘트입니다. 상피 세포가 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)를 겪을 때 상향 조절됩니다.31. MCF10A 아시나 배양의 PAF 처리는 염색 강도에 의해 관찰된 바와 같이 비멘틴 수준을 상승시켰으며(도 2C), 이는 EMT를 시사한다.
그림 2: PAF는 극성을 방해하고 MCF10A 유방 아시니에서 EMT와 유사한 변화를 유도합니다. MCF10A 세포는 lrECM에서 3D '온탑' 배양물로서 성장시켰다. 배양물을 0, 4, 8, 12, 및 16일에 PAF로 처리하였다. 배양물을 20일 동안 유지한 다음, α6-인테그린(녹색) 및 핵염색(청색)(A), (B) 정점 극성 마커인 GM130(녹색) 및 (C) EMT 마커인 비멘틴(적색)에 대해 면역염색하였다. 각 acini의 가장 중앙 스택이 표시되었습니다. 대표적인 데이터는 생물학적으로 독립적 인 3 가지 실험에서 40-50 acini에 대한 것입니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
확립 된 세포주 기반 모델은 발암 과정을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 세포의 단일층 배양은 암세포의 특징적인 변화를 매개하는 다양한 분자 신호전달 경로에 대한 통찰력을 지속적으로 제공한다32. Ras, Myc 및 돌연변이 된 p53과 같은 잘 알려진 종양 유전자의 역할에 대한 연구는 단층 배양을 모델 시스템33,34,35,36으로 사용하여 처음보고되었습니다. 그러나, 2D 배양 모델은 생체 내에 존재하는 많은 중요한 구조적 및 기능적 파라미터가 결여되어 있다. 2D 배양에서 약물 스크리닝 연구는 종종 낮은 농도에서도 유의미한 반응(세포 사멸 또는 표적 억제)을 보인 반면, 마우스37에서 관찰했을 때 유의미한 효과를 나타내지 못했습니다. 이에 대한 주요 이유는 2D 단층 배양에서 다양한 약물 가용성 및 흡수 때문입니다. 3D 문화38.
3D 배양의 개념은 지난 10년 동안 암의 진행을 연구하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다. 3D 배양은 세포외 매트릭스 상에서 성장하는 세포를 포함하여, 생체내조직 16에 존재하는 기능 단위와 유사한 구조의 형성을 초래한다. 3D 배양은 생체 내 미세 환경을 상당 부분 모방하여 2D 배양의 한계를 극복합니다39. 또한 3D로 성장한 세포는 인간 기원이며 시스템은 초기 사건을 연구하는 데 더 적합하기 때문에 설치류 모델보다 간단하고 우아합니다.
이 플랫폼을 사용하여 PAF와 같은 인지질 매개체에 노출 된 후 변형 과정을 연구하는 모델이 시연됩니다. 우리 연구실의 연구에 따르면 PAF 치료가 비종양성 유방 상피 세포주인 MCF10A12를 변형시킬 수 있습니다. 이 방법은 PAF가 미세환경에 존재하는 생체내 시나리오와 유사하게, 세포를 PAF에 연속적으로 노출시키도록 최적화된다.
MCF10A 세포는 2D로 성장할 때 4일마다 계대배양해야 합니다. 프로토콜에 따라 유지 관리되지 않으면 매우 다르게 동작하며 ECM16에서 성장할 때만 볼 수 있습니다. 세포의 통과 번호는 가능한 한 낮게 유지되어야합니다. 이 방법은 또한 lrECM의 다양한 배치에서 단백질 농도의 변화로 인해 한계가 있습니다. 이는 단순히 lrECM 베드에 셀을 도금하고 acini의 크기 분포를 관찰하여 다양한 배치를 테스트함으로써 극복할 수 있습니다. 크기에 큰 변동성이 없으면 lrECM 배치가 실험에 적합한 것으로 간주 될 수 있습니다.
형질전환의 평가는 일반적으로 비디오에서 입증되는 면역형광법에 의해 수행됩니다. 면역형광법을 수행하는 동안 4°C에서 배양하는 단계가 중요합니다. lrECM 층이 액체 상태일 때 용액을 피펫팅하면 층이 고르지 않게 되어 acinar 구조가 손실됩니다. 불균일성 문제를 해결하는 방법 중 하나는 슬라이드를 4°C의 균일한 플랫폼에 밤새 보관하거나 이미징이 수행되는 배율을 변경하는 것입니다. acinar 구조를 피펫팅하는 것을 방지하려면 4°C 저장소에서 챔버를 조심스럽게 제거하고 처음에 추가된 부피의 3/4을 제거한 다음 후속 세척 중에 나머지를 꺼냅니다.
직면 한 또 다른 주요 문제는 lrECM으로 인한 높은 배경입니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 1% 대신 2% 2차 차단 항체를 사용할 수 있다. 그러나 2 차 차단을 증가시키는 것은 정점 마커 및 E- 카드 헤린을 염색하는 목적에 도움이되지 않습니다. 이러한 경우 20일 후 챔버 커버 유리를 4°C에서 15분 동안 PBS-EDTA에 적용한 다음 비디오에 표시된 것과 동일한 프로토콜에 따라 acini를 고정하는 것이 좋습니다. PBS-EDTA는 lrECM을 부분적으로 용해시켜 배경을 줄입니다. 그러나 배양 시간을 초과하면 이 처리로 인해 용액을 피펫팅하는 동안 구조가 손실될 수 있습니다. 따라서 이 절차를 수행하는 동안 최대한의주의를 기울여야합니다. 또한 슬라이드를 장기간 보관하면 배경 신호가 증가 할 수 있음이 관찰되었습니다. 따라서 가능한 한 빨리 이미징을 수행해야합니다. 표현형의 변화를 결정하기 위해 실험 당 최소 15 개의 acini를 이미지화하는 것이 좋습니다.
3D acinar 배양에는 살아있는 세포 이미징 중에 단일 세포를 추적하기 어려운 것과 같은 특정 제한 사항이 있습니다. 세포주기에 미치는 영향과 같은 특정 연구는 공간 및 시간 정보를 유지하기 위해 라이브 셀 이미징을 사용하여 수행해야합니다. 그러나 구조의 지속적인 변화로 인해 일반 컨포칼 현미경을 사용하여 3D acinar 배양에서 이러한 매개 변수를 추적하기가 어렵습니다. 이는 초고해상도 현미경 또는 Airyscan 현미경과 같은 고급 현미경 기술을 사용해야 합니다. 또한 상처 치유, 앵커리지 독립적 성장 및 생체 내 종양 원성 분석과 같은 특정 형질 전환 분석을 위해 acinar 구조의 제거가 필요합니다. 이러한 이탈은 중요한 공간 및 시간 정보의 손실을 초래할 것입니다. 배양물에서 수집된 단백질 용해물은 IrECM의 존재로 인해 종종 희석되어 충분한 양의 용해물을 로딩하는 데 문제가 있습니다. 그러나 이것은 acini 구조를 제거하고 용해 전에 수집함으로써 더 많이 극복 할 수 있습니다.
여기서, 모델 시스템은 인지질 매개체/면역 관련 인자-유도 형질전환을 연구하는 것으로 입증되었다. 이 모델은 규제가 완화되어 형태학의 급격한 변화를 초래할 수 있는 유전적 및/또는 후성유전학적 경로를 해명할 수 있습니다. 이 방법은 잠재적 치료제를 스크리닝하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이러한 약물 스크리닝 연구는 2D 배양물에서 수행된 스크리닝보다 더 나은 성공을 제공할 것이다(38). 이 방법의 주요 하이라이트는 연구 요구 사항에 따른 적응력입니다. 치료 요법 및 분석 방법은 필요에 따라 변형될 수 있다. 더욱이, 이 방법은 치료(40)시 영향을 받는 분자신호전달에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 이 기술은 또한 약물 내성의 발생 가능성을 예측하는 데 도움이됩니다. 또한 약물 내성과 관련된 메커니즘을 설명하고 이를 극복하기 위한 그럴듯한 목표를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 연구는 3D에서 다수의 세포 유형을 공동 배양할 가능성을 확립했으며, 이는 치료 요법(41)을 수용하도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 기회는 유방암의 시작 및 진행 동안 생체 내에서 발생하는 특성 및 분자 변화에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 잠재적 인 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
장비 및 인프라에 대한 접근과 실험 지원에 대해 IISER Pune 현미경 시설에 감사드립니다. 이 연구는 생명 공학부 (DBT), 인도 정부 (BT / PR8699 / MED / 30 / 1018 / 2013), 과학 및 공학 연구위원회 (SERB), 인도 정부 (EMR / 2016 / 001974) 및 부분적으로 IISER, Pune Core 자금. AK는 CSIR-SRF 펠로우십, LA는 DST-INSPIRE 펠로우십, V.C.는 DBT(BT/PR8699/MED/30/1018/2013)에서 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
References
- Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
- Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
- Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
- Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
- Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
- Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
- Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938 (2021).
- Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
- Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287 (2014).
- Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
- Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688 (2019).
- Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
- Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
- Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
- Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
- Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
- Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
- McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
- Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
- Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12 (2016).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543 (2020).
