Summary
本プロトコルは、血小板活性化因子(PAF)誘導形質転換を研究するために改変された非形質転換乳房上皮細胞株MCF10Aの3D 「オントップ」培養のセットアップについて説明しています。免疫蛍光は形質転換を評価するために使用されており、詳細に議論されています。
Abstract
げっ歯類モデルや確立された細胞株など、癌を研究するためにいくつかのモデルが開発されています。発がんに関する貴重な洞察は、これらのモデルを使用した研究によって提供されています。細胞株は、乳房腫瘍形成に関連する分子シグナル伝達の調節解除の理解を提供し、げっ歯類モデルはin vivoでの乳がんの細胞および分子特性を研究するために広く使用されています。乳房上皮細胞と癌細胞の3D培養の確立は、in vitroでのin vivo条件を模倣することにより、in vivoモデルとin vitroモデルの間のギャップを埋めるのに役立ちます。このモデルは、複雑な分子シグナル伝達イベントの調節解除と乳房発がん中の細胞特性を理解するために使用できます。ここでは、リン脂質メディエーター誘発性(血小板活性化因子、PAF)形質転換を研究するために、3D培養システムを変更しています。免疫調節剤および他の分泌分子は、乳房における腫瘍の開始および進行において主要な役割を果たす。本研究では、乳房上皮細胞をPAFに曝露した3D腺房培養物は、極性の喪失や細胞特性の変化などの形質転換特性を示しました。この3D培養システムは、腫瘍微小環境における様々な低分子実体によって誘発される遺伝的および/またはエピジェネティックな摂動に光を当てるのに役立ちます。さらに、このシステムは、形質転換の過程に関与する可能性のある新規および既知の遺伝子を同定するためのプラットフォームも提供します。
Introduction
癌の進行を研究するために無数のモデルが利用可能であり、それらのそれぞれは独特であり、この複雑な疾患のサブタイプを表しています。各モデルは、がん生物学に関するユニークで貴重な洞察を提供し、実際の病状を模倣する手段を改善しました。単層として増殖した確立された細胞株は、増殖、侵襲性、遊走、アポトーシスなどのin vitroでの重要なプロセスに関する貴重な洞察を提供しました1。2次元(2D)細胞培養は、いくつかの環境摂動に対する哺乳類細胞の応答を調べるための従来のツールでしたが、組織レベルの応答を予測するためのこれらの発見の外挿は十分に説得力がないようです。2D培養の主な制限は、作成される微小環境が乳房組織自体の微小環境と大きく異なることです2。2D培養は、あらゆる組織の成長に不可欠な細胞外マトリックスとの細胞との相互作用を欠いています。また、単層培養で細胞が受ける引張力は、これらの細胞の極性を妨げ、したがって細胞のシグナル伝達と挙動を変化させます3,4,5。3次元(3D)培養システムは、in vitroでin vivo条件を模倣する能力により、癌研究の分野に新しい道を開きました。2D細胞培養で失われる多くの重要な微小環境手がかりは、ラミニンリッチ細胞外マトリックス(lrECM)6の3D培養を使用して再確立できます。
さまざまな研究により、発がんにおける腫瘍微小環境の重要性が確認されています7,8。炎症関連因子は微小環境の主要な部分です。血小板活性化因子(PAF)は、複数の免疫応答を媒介する様々な免疫細胞によって分泌されるリン脂質メディエーターである9,10。高レベルのPAFは、異なる乳癌細胞株によって分泌され、増殖の亢進と関連している11。私たちの研究室の研究は、腺房培養におけるPAFの長期存在が乳房上皮細胞の形質転換につながることを示しています12。PAFはPAF受容体(PAFR)を活性化し、PI3K/Aktシグナル伝達軸13を活性化します。PAFRはまた、EMT、浸潤、および転移に関連していると報告されています14。
本プロトコルは、Chakravartyらによって以前に記載されているように、乳房上皮細胞の3D培養物を使用して、PAF誘導形質転換を研究するためのモデルシステムを実証する12。細胞外マトリックス(3D培養)上で増殖した乳房上皮細胞は、分極成長停止スフェロイドを形成する傾向があります。これらは腺房と呼ばれ、in vivo15で乳腺の最小機能単位である乳房組織の腺房によく似ています。これらのスフェロイド(図1A、B)は、中空の内腔を取り囲み、基底膜に付着した密集した分極上皮細胞の単層で構成されています(図1C)。この形態形成の過程は文献16によく記載されている。lrECMに播種すると、細胞は分裂と分化を受けて細胞のクラスターを形成し、4日目以降に分極します。8日目までに、腺房は、細胞外マトリックスと直接接触している分極細胞のグループと、マトリックスに接触しない外側の分極細胞内に囲まれている非分極細胞のクラスターで構成されています。これらの非分極細胞は、培養12日目までにアポトーシスを起こし、中空の内腔を形成することが知られている。16日目までに、成長停止構造が形成されます16。
図1:核染色で染色された腺房内の細胞の核。 (A)腺房の3D構築。(B)マトリゲル上で20日間生育させたMCF10A腺房の位相差像。(C)最も中央のセクションは、中空の内腔の存在を示しています。スケールバー= 20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2D培養とは異なり、腺房培養は、明らかな形態変化を通じて正常細胞と形質転換細胞を区別するのに役立ちます。形質転換されていない乳房上皮細胞は、正常なヒト乳房腺房を模倣して、中空の内腔を有する腺房を形成する。これらのスフェロイドは、形質転換時に、極性の大きな喪失(癌の特徴の1つ)、内腔の欠如、または様々な遺伝子の調節解除のために誘発され得る中空管腔の破壊(アポトーシスの回避による)を特徴とする破壊された形態を示す17,18,19,20。.これらの形質転換は、免疫蛍光法などの一般的に使用される技術を用いて研究することができる。したがって、3D細胞培養モデルは、乳房腺房形態形成および乳房発がんの過程を調査するための簡便な方法として機能することができる。リン脂質メディエーターであるPAFの効果を理解するための3D培養システムを確立することで、ハイスループットの前臨床薬物スクリーニングに役立ちます。
この研究は、PAF22によって誘発される形質転換を研究するために、3D「オントップ」培養プロトコル16,21を適応させた。リン脂質メディエーターへの腺房の曝露によって誘発される表現型の変化を免疫蛍光を用いて研究した。さまざまな極性および上皮間葉転換(EMT)マーカー12,16が研究に使用されました。表1は、それらの正常な局在と形質転換時に予想される表現型について言及しています。
| 抗体 | マーク | 通常のローカリゼーション | 形質転換表現型 |
| α6-インテグリン | 基底外側 | 弱い横方向の汚れを伴う基礎 | 強い横方向/頂端染色 |
| β-カテニン | 細胞間接合 | 基底外側 | 異常/核または細胞質の局在 |
| ビメンチン | ティッカー | 不在/弱い存在 | アップレギュレーション |
表1:研究で使用されたマーカー。 PAF治療の存在下および非存在下でのそれらの局在化と共に使用される異なるマーカー。
この方法は、さまざまな乳がんサブタイプのもっともらしい薬や標的遺伝子の研究/スクリーニングに最適です。これにより、 in vivo シナリオに近い薬物応答データが提供され、より迅速で信頼性の高い医薬品開発に役立ちます。また、このシステムは、薬物応答および薬剤耐性に関連する分子シグナル伝達の研究に使用することができる。
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Protocol
1. MCF10A細胞の播種
- MCF10A細胞(接着性乳房上皮細胞)を増殖培地に維持する。4日ごとに細胞を継代する。
注:増殖培地の組成:馬血清(5%)、インスリン(10μg / mL)、ヒドロコルチゾン(0.5μg / mL)、上皮成長因子、EGF(20 ng / mL)、コレラ毒素(100 ng / mL)、およびペニシリン-ストレプトマイシン(100単位/ mL)を含むピルビン酸ナトリウムを含まない高グルコースDMEM( 材料の表を参照)。 - 実験開始の20分前にlrECM( 材料表を参照)を氷上で解凍します。細胞を播種する日は、一般に0日目と見なされます。
- 細胞をトリプシン処理するには、培地を吸引し、2 mLのPBSで洗浄します。900 μLの0.05%トリプシン-EDTAを加え、37°Cで~15分間、または細胞が完全にトリプシン処理されるまでインキュベートします。
- チャンバー付きカバーガラススライドの8つのウェルにlrECMのベッドを準備します(材料の表を参照)。
- 細胞がトリプシン処理されたら、各ウェルを60 μLのlrECMでコーティングし、37°CのCO2 インキュベーターに最大15分間入れます。
- 以下の手順に従って細胞懸濁液を調製します。
- 細胞が完全に脱落した後、5 mLの再懸濁培地を加えてトリプシン活性をクエンチし、細胞を112 x g で25°Cで10分間回転させます。
注:再懸濁培地の組成:ピルビン酸ナトリウムを含まない高グルコースDMEM、馬血清(20%)およびペニシリン-ストレプトマイシン(100単位/ mL)を補充。 - 使用済み培地を吸引し、細胞を2 mLのアッセイ培地に再懸濁します。懸濁液をよく混合して、単一細胞懸濁液を確実に形成する。
注:アッセイ培地の組成:ピルビン酸ナトリウムを含まない高グルコースDMEM、馬血清(2%)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ mL)、コレラ毒素(100 ng / mL)、インスリン(10 μg / mL)、およびペニシリン-ストレプトマイシン(100単位/ mL)。 - 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、各ウェルに6 x 103 細胞を播種するのに必要な細胞懸濁液の量を計算します。
注:一般的には、ピペッティングエラーを考慮して、計算に1つの追加のウェルを含めることをお勧めします。 - 必要なウェルの数に応じて、細胞懸濁液をオーバーレイ培地で希釈します。
注:単一ウェルのオーバーレイ培地組成は、アッセイ培地400 μL、lrECM8 μL(最終2%)、および100 μg/mL EGF(最終5 ng/mL)0.02 μLです。
- 細胞が完全に脱落した後、5 mLの再懸濁培地を加えてトリプシン活性をクエンチし、細胞を112 x g で25°Cで10分間回転させます。
- 細胞の播種を行います。
- 調製したlrECMベッドに400 μLの希釈細胞懸濁液を加え(ステップ1.4)、lrECMベッドを乱さないように注意します。加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。
2.PAF治療
- 細胞の播種から3時間後にPAFを追加します。PBSで100 μMのPAFストックを調製し、各ウェルに必要な量の0.2 μL(200 nMに相当)を追加します。
- メディア交換のたびに同じ濃度の PAF を追加します。
3.新鮮な培地で再給餌する
- 4日ごと(すなわち、4日目、8日目、12日目、および16日目)に細胞に新しい培地を補充する。
4.長期のPAF曝露によって誘発される表現型の変化を検出するための免疫蛍光研究
- 20日間の培養後、各ウェルから培地を注意深くピペットで取り出し、400 μLの予温PBSでウェルを洗浄します。
- 400 μLの4%パラホルムアルデヒド(16%パラホルムアルデヒドを1x PBSで希釈して新たに調製)を加え、室温で20分間インキュベートして、腺房構造を固定します。
- ウェルを氷冷したPBSで一度すすぎ、0.5%Triton X-100を含むPBSで4°Cで10分間透過処理します。
- 10分後、直ちに慎重にTriton-X 100溶液をピペットで取り出し、400 μLのPBS-グリシン(1x PBSにグリシンをピンチを加えて新たに調製)ですすいでください。これをそれぞれ15分間3回繰り返します。
- 10%ヤギ血清( 材料の表を参照)を含む一次ブロッキング溶液400 μLを免疫蛍光(IF)バッファーに加え、室温で60分間インキュベートします。
注:IFバッファーの組成:0.05%アジ化ナトリウム、0.1%BSA、0.2%トリトン-X 100、および0.05%トゥイーン(1 PBS中20)。 - 一次ブロッキング溶液を除去し、一次ブロッキング溶液で調製した2%二次ブロッキング抗体(ヤギでマウス抗原に対して産生された抗体のF(ab')2フラグメント、 材料の表を参照)を200 μL加え、室温で45〜60分間放置します。
- 一次抗体( 材料の表を参照)を1:100希釈の2%二次ブロッキング抗体溶液中で調製します。二次ブロッキング溶液を除去した後、新たに調製した抗体を加え、4°Cで一晩インキュベートします。
- 前工程は基底膜の液状化を惹起し得る。実験を進める前に、スライドが室温に達するまで待ちます。一次抗体溶液を慎重にピペットでピペットし、400 μLのIFバッファーで3回洗浄します。
- IFバッファーによる最後の洗浄中に、一次ブロッキング溶液中の蛍光色素標識二次抗体( 材料の表を参照)の1:200希釈液を調製します。スライドを二次抗体溶液中で室温で40〜60分間インキュベートします。
- スライドを400 μLのIFバッファーで20分間すすぎ、続いてPBSでそれぞれ10分間2回洗浄します。
- 0.5 ng/mLの核染色剤を含むPBSで室温で5〜6分間、核を対比染色します。スライドを400 μLのPBSで3回洗浄して、余分な汚れを取り除きます。
- PBS全体を慎重にピペットで取り出し、残留溶液を確実に除去します。各ウェルに1滴の封入試薬( 材料の表を参照)を加え、室温で一晩静置します。
- スライドを室温で保存し、できるだけ早くスライドを画像化してください。
- 共焦点顕微鏡( 材料表を参照)で40倍または63倍の倍率で、0.6mmステップサイズの光学Zセクション(NA = 1.4)を撮影した画像。
- 取得した画像を画像処理ソフトで開きます( 資料表参照)。3D投影を使用して形態の違いを示します。
注意: 最も中央の光学Zセクションは、極性マーカーの局在の違いを示すのに最適です。これらは、その特定の染色パターンを示すスフェロイドの割合を表すために手動で定量することができる。 - タンパク質の発現の違いを説明するために、平均グレー値を測定する半定量分析を実行するか、補正総細胞蛍光(CTCF)を計算します23。データをバイオリンプロットまたはドットプロットで表します。
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Representative Results
MCF10A細胞は、PAF処理に曝露されると、非常に異なる表現型を有する腺房構造を形成する。α6-インテグリンは、より頂端染色で誤局在することがわかった。いくつかの腺房も不連続染色を示した(図2A)。これらの表現型は両方とも、文献24,25から証明されるように、基底極性の喪失を示しています。以前の報告は、癌転移におけるα6-インテグリンの物議を醸す役割を示しています。α6-インテグリンは、β1-インテグリンまたはβ4-インテグリンのいずれかと二量体として存在します。α6β4サブユニットは、上皮細胞26においてヘミデスモソームを形成する上で重要な役割を果たすことが見出されている。このインテグリンのダウンレギュレーションは、前立腺および乳がんのいくつかの例で発見されており、α6β4-インテグリンの喪失は乳房の乳管がん(グレードIII)で発見されました。喪失表現型は、実質および胸膜腔に転移する細胞に見られる27、28、29。GM130はシスゴルジ体在タンパク質です。ゴルジ体は、MCF10A腺房培養物16,30に頂端に局在している。PAF処理はGM130の誤局在につながり、頂端極性の破壊を示唆しています(図2B)。ビメンチンは、細胞移動に関与する中間フィラメントです。上皮細胞が上皮から間葉転換(EMT)を受けるとアップレギュレーションされます31。MCF10A腺房培養物のPAF処理は、染色強度によって観察されるようにビメンチンレベルの上昇をもたらし(図2C)、EMTを示唆した。
図2:PAFは極性を破壊し、MCF10A乳房腺房にEMT様変化を誘発します。 MCF10A細胞は、lrECMで3D「オントップ」培養として増殖させた。培養物を0、4、8、12、および16日目にPAFで処理した。培養物を20日間維持した後、α6-インテグリン(緑)と核染色(青)(A)、(B)頂端極性マーカーであるGM130(緑)、および(C)EMTマーカーであるビメンチン(赤)について免疫染色しました。それぞれの腺房の最も中心的なスタックが示されています。代表的なデータは、3つの生物学的に独立した実験からの40〜50 aciniに関するものである。スケールバー= 20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
確立された細胞株ベースのモデルは、発がんのプロセスを研究するために広く使用されています。細胞の単層培養は、癌細胞32における特徴的な変化を媒介する様々な分子シグナル伝達経路への洞察を提供し続けている。Ras、Myc、変異p53などのよく知られた癌遺伝子の役割に関する研究は、単層培養をモデルシステムとして使用して最初に報告されました33、34、35、36。しかし、2D培養モデルには、生体内に存在する多くの重要な構造的および機能的パラメータが欠けています。2D培養での薬物スクリーニング研究は、低濃度であっても有意な反応(細胞死または標的阻害)を示すことが多いが、マウスで投与した場合、有意な効果を示さない37。これの主な理由は、2D単層培養における薬物の入手可能性と取り込みが異なることです。3D培養38.
3D培養の概念は、過去10年間で癌の進行を研究するための強力なツールとして浮上しています。3D培養は、細胞外マトリックス上で細胞を増殖させることを含み、その結果、インビボ16の組織に存在する機能単位に似た構造が形成される。3D培養は、インビボ微小環境を大部分模倣し、したがって2D培養の限界を克服する39。さらに、3Dで増殖した細胞は人間起源のものであり、システムは初期の出来事を研究するのにより適しているため、げっ歯類モデルよりも単純でエレガントです。
このプラットフォームを使用して、PAFなどのリン脂質メディエーターへの曝露後の形質転換プロセスを研究するためのモデルが実証されます。私たちの研究室からの研究は、PAF治療が非腫瘍原性乳房上皮細胞株、MCF10A12を形質転換できることを特定しました。この方法は、PAFが微小環境に存在する in vivo シナリオと同様に、細胞をPAFに継続的にさらすように最適化されています。
MCF10A細胞は、2Dで増殖する場合、4日ごとに継代する必要があります。プロトコルに従って維持されていない場合、動作は非常に異なり、ECM16で拡張された場合にのみ表示されます。細胞の継代数はできるだけ低く抑えなければならない。この方法には、lrECMの異なるバッチにおけるタンパク質濃度のばらつきによる制限もあります。これは、lrECMベッドで細胞をメッキし、腺房のサイズ分布を観察するだけで、さまざまなバッチをテストすることで克服できます。サイズに大きなばらつきがない場合、lrECMバッチは実験に適していると見なすことができます。
形質転換の評価は、一般に免疫蛍光によって行われ、これはビデオで実証されている。免疫蛍光を行う際には、4°Cでのインキュベーションを含むステップが重要です。lrECM層が液体状態のときに溶液をピペッティングすると、層が不均一になり、腺房構造が失われます。凹凸の問題に取り組む方法の1つは、スライドを4°Cで均一なプラットフォームに一晩保存するか、イメージングを行う倍率を変更することです。腺房構造のピペッティングを避けるために、チャンバーを4°Cの保管場所から慎重に取り外し、最初に追加された容量の4分の3を取り除き、その後の洗浄中に残りを取り出します。
直面するもう一つの大きな問題は、lrECMによる高いバックグラウンドです。この問題を克服するために、1%の代わりに2%の二次ブロッキング抗体を使用することができます。しかし、二次ブロッキングの増加は、頂端マーカーおよびE-カドヘリンを染色する目的には役立たない。このような場合、20日目以降にチャンバーカバーガラスをPBS-EDTAに4°Cで15分間さらし、ビデオに示されているのと同じプロトコルに従って腺房を固定することをお勧めします。PBS-EDTAはlrECMを部分的に溶解し、バックグラウンドを低減します。ただし、インキュベーション時間を超えると、この処理により、溶液のピペッティング中に構造が失われる可能性があります。したがって、この手順を実行する際には細心の注意を払う必要があります。また、スライドを長期間保存すると、バックグラウンド信号が増加する可能性があることも観察されています。したがって、イメージングはできるだけ早く行う必要があります。表現型の変化を決定するために、実験ごとに最低15の腺房を画像化することをお勧めします。
3D腺房培養には、生細胞イメージング中に単一細胞を追跡するのが難しいなど、特定の制限があります。細胞周期への影響などの特定の研究は、空間的および時間的情報を維持するためにライブセルイメージングを使用して実行する必要があります。しかし、構造は絶えず変化するため、通常の共焦点顕微鏡を使用して3D腺房培養でそのようなパラメータを追跡することは困難です。これは、超解像顕微鏡やエアリスカン顕微鏡などの高度な顕微鏡技術を使用することを保証します。また、創傷治癒、足場非依存性増殖、 in vivo 造腫瘍性アッセイなどの特定の形質転換アッセイでは、腺房構造の除去が必要になります。このずれは、重要な空間的および時間的情報の損失をもたらすでしょう。培養物から採取されたタンパク質ライセートは、IrECMの存在により希釈されることが多く、十分な量のライセートの負荷に問題が生じます。しかしながら、これは、腺房構造を取り除き、溶解前にそれらを集めることによって、より広い範囲で克服することができる。
ここでは、リン脂質メディエーター/免疫関連因子誘発形質転換を研究するためのモデルシステムが実証されています。このモデルは、制御が解除され、形態の劇的な変化につながる可能性のある遺伝的および/またはエピジェネティックな経路を解明することができます。この方法は、潜在的な治療法をスクリーニングするためにも使用できます。このような薬物スクリーニング研究は、2D培養で実施されるスクリーニングよりも優れた成功をもたらすであろう38。この方法の主なハイライトは、研究の要件に応じた適応性です。治療計画および分析方法は、必要に応じて変更することができる。さらに、この方法は、治療時に影響を受ける分子シグナル伝達に関する洞察を提供することができる40。この技術は、薬剤耐性の発生の可能性を予測するのにも役立ちます。さらに、薬剤耐性に関わるメカニズムの解明や、それを克服するためのもっともらしい標的の同定にも役立ちます。研究は、3Dで複数の細胞型を共培養する可能性を確立しており、これは治療レジメン41に対応するようにさらに改変することができる。このような機会は、乳がんの開始と進行の間に in vivo で起こる特性と分子変化についてのより大きな洞察を提供します。
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Disclosures
著者は、潜在的な利益相反を宣言していません。
Acknowledgments
IISERプネー顕微鏡施設が機器とインフラストラクチャにアクセスし、実験をサポートしてくれたことに感謝します。この研究は、インド政府バイオテクノロジー省(DBT)(BT/PR8699/MED/30/1018/2013)、インド政府科学技術研究委員会(SERB)(EMR/2016/001974)、および一部はIISER、プネーコア資金による助成金によって支援されました。A. K.はCSIR-SRFフェローシップ、L.A.はDST-INSPIREフェローシップ、V.C.はDBTから資金提供を受けた(BT/PR8699/MED/30/1018/2013)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
References
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