Summary
Le présent protocole décrit la mise en place de cultures 3D « on top » d’une lignée cellulaire épithéliale mammaire non transformée, MCF10A, qui a été modifiée pour étudier la transformation induite par le facteur d’activation plaquettaire (PAF). L’immunofluorescence a été utilisée pour évaluer la transformation et est discutée en détail.
Abstract
Plusieurs modèles ont été développés pour étudier le cancer, tels que des modèles de rongeurs et des lignées cellulaires établies. Des études utilisant ces modèles ont fourni des informations précieuses sur la cancérogenèse. Les lignées cellulaires ont permis de comprendre la dérégulation de la signalisation moléculaire associée à la tumorigenèse du sein, tandis que les modèles de rongeurs sont largement utilisés pour étudier les caractéristiques cellulaires et moléculaires du cancer du sein in vivo. L’établissement de cultures 3D de cellules épithéliales et cancéreuses du sein aide à combler le fossé entre les modèles in vivo et in vitro en imitant les conditions in vivo in vitro. Ce modèle peut être utilisé pour comprendre la dérégulation d’événements complexes de signalisation moléculaire et les caractéristiques cellulaires au cours de la cancérogenèse mammaire. Ici, un système de culture 3D est modifié pour étudier une transformation induite par un médiateur phospholipide (facteur d’activation plaquettaire, PAF). Les immunomodulateurs et autres molécules sécrétées jouent un rôle majeur dans l’initiation et la progression de la tumeur dans le sein. Dans la présente étude, des cultures acineuses 3D de cellules épithéliales mammaires exposées au PAF présentaient des caractéristiques de transformation telles que la perte de polarité et des caractéristiques cellulaires altérées. Ce système de culture 3D aidera à faire la lumière sur les perturbations génétiques et / ou épigénétiques induites par diverses petites entités moléculaires dans le microenvironnement tumoral. En outre, ce système fournira également une plate-forme pour l’identification de gènes nouveaux et connus qui peuvent être impliqués dans le processus de transformation.
Introduction
Une myriade de modèles sont disponibles pour étudier la progression du cancer, chacun d’eux étant unique et représentant un sous-type de cette maladie complexe. Chaque modèle fournit des informations uniques et précieuses sur la biologie du cancer et a amélioré les moyens d’imiter l’état réel de la maladie. Les lignées cellulaires établies cultivées en monocouche ont fourni des informations précieuses sur les processus vitaux in vitro, tels que la prolifération, l’invasivité, la migration et l’apoptose1. Bien que la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ait été l’outil traditionnel pour étudier la réponse des cellules de mammifères à plusieurs perturbations environnementales, l’extrapolation de ces résultats pour prédire les réponses au niveau tissulaire ne semble pas suffisamment convaincante. La principale limitation des cultures 2D est que le microenvironnement créé diffère largement de celui du tissu mammaire lui-même2. La culture 2D manque de l’interaction des cellules avec la matrice extracellulaire, ce qui est vital pour la croissance de tout tissu. De plus, les forces de traction subies par la cellule dans les cultures monocouches entravent la polarité de ces cellules, modifiant ainsi la signalisation et le comportementdes cellules 3,4,5. Les systèmes de culture tridimensionnels (3D) ont ouvert une nouvelle voie dans le domaine de la recherche sur le cancer avec leur capacité à imiter les conditions in vivo in vitro. De nombreux indices microenvironnementaux cruciaux qui sont perdus dans la culture cellulaire 2D pourraient être rétablis en utilisant des cultures 3D de matrice extracellulaire riche en laminine (lrECM)6.
Diverses études ont identifié l’importance du microenvironnement tumoral dans la cancérogenèse 7,8. Les facteurs associés à l’inflammation constituent une partie importante du microenvironnement. Le facteur d’activation plaquettaire (PAF) est un médiateur phospholipide sécrété par diverses cellules immunitaires qui médie les réponses immunitairesmultiples 9,10. Des niveaux élevés de FAP sont sécrétés par différentes lignées cellulaires de cancer du sein et sont associés à une prolifération accrue11. Des études de notre laboratoire ont montré que la présence prolongée de PAF dans les cultures acineuses entraîne la transformation des cellules épithéliales du sein12. PAF active le récepteur PAF (PAFR), activant l’axe de signalisation PI3K/Akt13. Le DPAP est également associé à l’EMT, à l’invasion et aux métastases14.
Le présent protocole démontre un système modèle pour étudier la transformation induite par le PAF, en utilisant des cultures 3D de cellules épithéliales du sein, comme cela a été décrit précédemment par Chakravarty et al.12. Les cellules épithéliales mammaires cultivées sur la matrice extracellulaire (cultures 3D) ont tendance à former des sphéroïdes polarisés arrêtés par croissance. Ceux-ci sont appelés acini et ressemblent étroitement aux acini du tissu mammaire, la plus petite unité fonctionnelle de la glande mammaire, in vivo15. Ces sphéroïdes (Figure 1A,B) sont constitués d’une monocouche de cellules épithéliales polarisées étroitement tassées entourant une lumière creuse et fixées à la membrane basale (Figure 1C). Ce processus de morphogenèse a été bien décrit dans la littérature16. Lorsqu’elles sont ensemencées sur lrECM, les cellules subissent une division et une différenciation pour former un groupe de cellules, qui se polarisent ensuite à partir du jour 4. Au jour 8, les acini sont constitués d’un groupe de cellules polarisées qui sont en contact direct avec la matrice extracellulaire et d’un groupe de cellules non polarisées enfermées dans les cellules polarisées externes, sans contact avec la matrice. Ces cellules non polarisées sont connues pour subir l’apoptose au jour 12 de la culture, formant une lumière creuse. Au jour 16, les structures arrêtées par la croissance sont formées16.
Figure 1 : Noyaux de cellules dans les acini colorés avec une coloration nucléaire. (A) Construction 3D des acini. (B) Image à contraste de phase de MCF10A acini cultivée sur Matrigel pendant 20 jours. (C) La section la plus centrale montre la présence d’une lumière creuse. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Contrairement aux cultures 2D, les cultures acineuses aident à distinguer les cellules normales et transformées par des changements morphologiques apparents. Les cellules épithéliales mammaires non transformées forment des acini avec une lumière creuse, imitant les acini mammaires humains normaux. Ces sphéroïdes, lors de la transformation, présentent une morphologie perturbée caractérisée par une perte importante de polarité (une des caractéristiques du cancer), l’absence de lumière ou une perturbation de la lumière creuse (due à l’évasion de l’apoptose) qui peut être induite en raison de la dérégulation de divers gènes17,18,19,20 . Ces transformations peuvent être étudiées à l’aide de techniques couramment utilisées telles que l’immunofluorescence. Ainsi, le modèle de culture cellulaire 3D peut fonctionner comme une méthode simple pour étudier le processus de morphogenèse acineuse du sein et de cancérogenèse mammaire. L’établissement d’un système de culture 3D pour comprendre l’effet d’un médiateur phospholipidique, PAF, aidera au criblage préclinique de médicaments à haut débit.
Ce travail a adapté le protocole de culture 3D 'on top' 16,21 pour étudier la transformation induite par PAF 22. Les changements phénotypiques induits par l’exposition des acini au médiateur phospholipide ont été étudiés par immunofluorescence. Divers marqueurs de polarité et de transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT)12,16 ont été utilisés dans l’étude. Le tableau 1 mentionne leur localisation normale et leur phénotype attendu lors de la transformation.
| Anticorps | Marques | Localisation normale | Phénotype transformé |
| α6-Intégrine | Basolatéral | Basal avec faible coloration latérale | Forte tache latérale / apicale |
| β-Caténine | Jonction cellule-cellule | Basolatéral | Localisation anormale / nucléaire ou cytoplasmique |
| Vimentin | Emt | Présence absente / faible | Réglementation à la hausse |
Tableau 1 : Marqueurs utilisés dans l’étude. Différents marqueurs utilisés avec leur localisation en présence et en l’absence de traitement PAF.
Cette méthode peut être mieux utilisée pour étudier / cribler des médicaments plausibles et des gènes cibles pour divers sous-types de cancer du sein. Cela peut fournir des données de réponse aux médicaments plus proches du scénario in vivo , ce qui contribue à un développement de médicaments plus rapide et plus fiable. En outre, ce système peut être utilisé pour étudier la signalisation moléculaire associée à la réponse aux médicaments et à la résistance aux médicaments.
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Protocol
1. Ensemencement des cellules MCF10A dans lrECM
- Maintenir les cellules MCF10A (cellules épithéliales mammaires adhérentes) dans le milieu de croissance. Passez les cellules tous les 4 jours.
NOTE: Composition du milieu de croissance: DMEM à haute teneur en glucose sans pyruvate de sodium contenant du sérum de cheval (5%), insuline (10 μg/mL), hydrocortisone (0,5 μg/mL), facteur de croissance épidermique, EGF (20 ng/mL), de toxine cholérique (100 ng/mL) et pénicilline-streptomycine (100 unités/mL) (voir le tableau des matières). - Décongeler lrECM (voir Tableau des matériaux) sur de la glace 20 min avant le début de l’expérience. Le jour de l’ensemencement des cellules est généralement considéré comme le jour 0.
- Pour trypsiniser les cellules, aspirer le milieu et laver avec 2 ml de PBS. Ajouter 900 μL de trypsine-EDTA à 0,05% et incuber à 37 °C pendant ~15 min ou jusqu’à ce que les cellules soient complètement trypsinisées.
- Préparer un lit de lrECM dans huit puits d’une lame de verre à couvercle chambré (voir le tableau des matériaux).
- Lorsque les cellules trypsinisantes, enduisez chaque puits de 60 μL de lrECM et placez-le dans un incubateur à 37 °C CO2 pendant un maximum de 15 minutes.
- Préparez la suspension cellulaire en suivant les étapes ci-dessous.
- Après le délogement complet des cellules, ajouter 5 mL de milieu de remise en suspension pour éteindre l’activité de la trypsine et faire tourner les cellules à 112 x g pendant 10 minutes à 25 °C.
NOTE: Composition du milieu de remise en suspension: DMEM à haute teneur en glucose sans pyruvate de sodium, complété par du sérum de cheval (20%) et de la pénicilline-streptomycine (100 unités / mL). - Aspirer le milieu usé et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu de dosage. Bien mélanger la suspension pour assurer la formation d’une suspension unicellulaire.
NOTE: Composition du milieu de dosage: DMEM glycémique élevé sans pyruvate de sodium, complété par du sérum de cheval (2%), de l’hydrocortisone (0,5 μg / mL), de la toxine cholérique (100 ng / mL), de l’insuline (10 μg / mL) et de la pénicilline-streptomycine (100 unités / mL). - Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour ensemencer 6 x 103 cellules dans chaque puits.
REMARQUE : Il est généralement préférable d’inclure un puits supplémentaire dans le calcul pour tenir compte de toute erreur de pipetage. - Selon le nombre de puits requis, diluer la suspension cellulaire dans un milieu de recouvrement.
REMARQUE : La composition du milieu superposé pour un seul puits est la suivante : 400 μL de milieu d’essai, 8 μL de lrECM (final à 2 %) et 0,02 μL de 100 μg/mL d’EGF (5 ng/mL final).
- Après le délogement complet des cellules, ajouter 5 mL de milieu de remise en suspension pour éteindre l’activité de la trypsine et faire tourner les cellules à 112 x g pendant 10 minutes à 25 °C.
- Effectuer l’ensemencement des cellules.
- Ajouter 400 μL de la suspension cellulaire diluée aux lits d’EClr préparés (étape 1.4), en veillant soigneusement à ne pas perturber le lit de lrECM. Incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 .
2. Traitement PAF
- Ajouter PAF 3 h après l’ensemencement des cellules. Préparer un stock de 100 μM de PAF dans le PBS et ajouter le volume requis de 0,2 μL dans chaque puits (ce qui correspond à 200 nM).
- Ajoutez la même concentration de PAF lors de chaque changement de média.
3. Réalimentation avec des milieux frais
- Reconstituez les cellules avec du milieu frais tous les 4 jours (c.-à-d. Jour 4, Jour 8, Jour 12 et Jour 16).
4. Étude d’immunofluorescence pour détecter les changements phénotypiques induits par une exposition prolongée au FPA
- Après 20 jours de culture, pipeter soigneusement le milieu de chaque puits et laver les puits avec 400 μL de PBS préchauffé.
- Fixer les structures acineuses en ajoutant 400 μL de paraformaldéhyde à 4% (fraîchement préparé en diluant 16% de paraformaldéhyde dans 1x PBS) et en incubant pendant 20 min à température ambiante.
- Rincer les puits une fois avec du PBS glacé et perméabiliser avec du PBS contenant 0,5 % de Triton X-100 pendant 10 min à 4 °C.
- Après 10 min, extraire immédiatement mais soigneusement la solution Triton-X 100 et rincer avec 400 μL de PBS-glycine (fraîchement préparée en ajoutant une pincée de glycine dans 1x PBS). Ceci est répété trois fois pendant 15 minutes chacun.
- Ajouter 400 μL de la solution de blocage primaire comprenant 10 % de sérum de chèvre (voir tableau des matières) dans un tampon d’immunofluorescence (IF) et incuber à température ambiante pendant 60 min.
NOTE: Composition du tampon IF: 0,05% d’azoture de sodium, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 et 0,05% Tween (20 dans 1 PBS). - Retirer la solution de blocage primaire, ajouter 200 μL d’anticorps bloquant secondaire à 2 % (fragment d’anticorps F(ab')2 élevé chez la chèvre contre l’antigène de souris, voir le tableau des matières) préparé dans une solution de blocage primaire, et laisser agir pendant 45 à 60 min à température ambiante.
- Préparer l’anticorps primaire (voir le tableau des matières) dans une solution d’anticorps bloquant secondaire à 2 % dans une dilution de 1:100. Après avoir retiré la solution de blocage secondaire, ajouter l’anticorps fraîchement préparé et incuber pendant une nuit à 4 °C.
- L’étape précédente peut provoquer la liquéfaction de la membrane basale. Avant de poursuivre l’expérience, attendez que la lame atteigne la température ambiante. Pipeter soigneusement la solution d’anticorps primaires et la laver trois fois avec 400 μL de tampon IF.
- Lors du dernier lavage avec un tampon IF, préparer une dilution 1:200 de l’anticorps secondaire conjugué au fluorophore (voir le tableau des matériaux) dans la solution de blocage primaire. Incuber les lames dans la solution d’anticorps secondaire pendant 40-60 min à température ambiante.
- Rincer les lames avec 400 μL de tampon IF pendant 20 min, suivies de deux lavages avec du PBS pendant 10 min chacun.
- Contre-colorer les noyaux avec du PBS contenant 0,5 ng/mL de coloration nucléaire (voir le tableau des matières) pendant 5-6 minutes à température ambiante. Lavez les lames trois fois avec 400 μL de PBS pour enlever l’excès de tache.
- Extraire soigneusement le PBS entier et assurer l’élimination de la solution résiduelle. Ajoutez une goutte de réactif de montage (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits et laissez-le reposer à température ambiante pendant la nuit.
- Conservez les lames à température ambiante et imagez-les dès que possible.
- Image sous grossissement 40x ou 63x sur un microscope confocal (voir Tableau des matériaux), en prenant des coupes Z optiques de 0,6 mm (NA = 1,4).
- Ouvrez les images acquises avec un logiciel de traitement d’image (voir Tableau des matériaux). Démontrer les différences morphologiques à l’aide de projections 3D.
REMARQUE: La section Z optique la plus centrale peut être mieux utilisée pour montrer les différences dans la localisation des marqueurs de polarité. Ceux-ci peuvent être quantifiés manuellement pour représenter le pourcentage de sphéroïdes montrant ce modèle de coloration spécifique. - Pour illustrer les différences dans l’expression des protéines, effectuer une analyse semi-quantitative mesurant la valeur grise moyenne ou calculant la fluorescence cellulaire totale corrigée (CTCF)23. Représenter les données sous forme de tracés de violon ou de points.
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Representative Results
Les cellules MCF10A, lorsqu’elles sont exposées au traitement PAF, forment des structures acineuses avec des phénotypes très distincts. L’α6-intégrine s’est avérée mal localisée avec plus de coloration apicale. Quelques acini ont également montré une coloration discontinue (Figure 2A). Ces deux phénotypes indiquent la perte de polarité basale, comme en témoigne la littérature24,25. Des rapports antérieurs indiquent le rôle controversé de l’α6-intégrine dans les métastases cancéreuses. L’α6-intégrine est présente sous forme de dimère avec la β1- ou la β4-intégrine. La sous-unité α6β4 joue un rôle important dans la formation d’hémidesmosomes dans les cellules épithéliales26. La régulation négative de cette intégrine a été trouvée dans la prostate et certains cas de cancers du sein, dans lesquels la perte d’α6β4-intégrine a été trouvée dans le carcinome canalaire du sein (grade III). Le phénotype de perte est observé dans les cellules qui métastasent au parenchyme et à la cavité pleurale27,28,29. GM130 est une protéine localisée cis-Golgi; Les corps de Golgi sont localisés apiquement dans les cultures acineuses MCF10A16,30. Le traitement par PAF a conduit à une mauvaise localisation du GM130, suggérant une perturbation de la polarité apicale (Figure 2B). La vimentine est un filament intermédiaire impliqué dans la migration cellulaire; il est régulé à la hausse lorsque les cellules épithéliales subissent une transition épithéliale vers mésenchymateuse (EMT)31. Le traitement par PAF des cultures acineuses MCF10A a conduit à des niveaux élevés de vimentine, comme observé par l’intensité de la coloration (Figure 2C), suggérant une EMT.
Figure 2 : Le FAP perturbe la polarité et induit des changements de type EMT dans les acini mammaires MCF10A. Les cellules MCF10A ont été cultivées en tant que cultures 3D « sur le dessus » dans lrECM. Les cultures ont été traitées avec PAF les jours 0, 4, 8, 12 et 16. Les cultures ont été maintenues pendant 20 jours, puis immunocolorées pour l’α6-intégrine (vert) et la coloration nucléaire (bleu) (A), (B) GM130 (vert), un marqueur de polarité apicale, et (C) Vimentin (rouge), un marqueur EMT. La pile la plus centrale des acini respectifs a été montrée. Les données représentatives concernent 40 à 50 acini provenant de trois expériences biologiquement indépendantes. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les modèles établis basés sur des lignées cellulaires sont largement utilisés pour étudier le processus de cancérogenèse. Les cultures monocouches de cellules continuent de fournir des informations sur les diverses voies de signalisation moléculaire qui interviennent dans les changements caractéristiques des cellules cancéreuses32. Des études sur le rôle d’oncogènes bien connus tels que Ras, Myc et p53 muté ont d’abord été rapportées en utilisant des cultures monocouches comme système modèle33,34,35,36. Cependant, le modèle de culture 2D manque de nombreux paramètres structurels et fonctionnels importants présents in vivo. Les études de dépistage de médicaments dans des cultures 2D montrent souvent une réponse significative (mort cellulaire ou inhibition de la cible), même à des concentrations plus faibles, tout en ne montrant aucun effet significatif lorsqu’elles sont admises chez la souris37. L’une des principales raisons en est la disponibilité et l’adoption variables des médicaments dans une culture monocouche 2D par rapport à la culture monocouche 2D. Culture3D 38.
Le concept de cultures 3D est apparu comme un outil puissant pour étudier la progression du cancer au cours de la dernière décennie. Les cultures 3D impliquent la croissance de cellules sur une matrice extracellulaire, ce qui entraîne la formation de structures qui ressemblent à des unités fonctionnelles présentes dans le tissu in vivo16. Les cultures 3D imitent dans une large mesure le microenvironnement in vivo et surmontent ainsi les limites des cultures2D 39. De plus, comme les cellules cultivées en 3D sont d’origine humaine et que le système est plus propice à l’étude des événements précoces, il est plus simple et plus élégant que les modèles de rongeurs.
À l’aide de cette plateforme, un modèle permettant d’étudier le processus de transformation suite à une exposition à un médiateur phospholipide tel que le PAF est démontré. Des études de notre laboratoire ont identifié que le traitement PAF peut transformer la lignée cellulaire épithéliale mammaire non tumorigénique, MCF10A12. Cette méthode est optimisée pour exposer continuellement les cellules au PAF, similaire au scénario in vivo , où le PAF est présent dans le microenvironnement.
Les cellules MCF10A, lorsqu’elles sont cultivées en 2D, doivent être passées tous les 4 jours. S’ils ne sont pas entretenus conformément au protocole, ils se comportent très différemment, ce qui n’est visible que lorsqu’ils sont cultivés sur ECM16. Le nombre de passages des cellules doit être maintenu aussi bas que possible. Cette méthode présente également des limites en raison de la variation de la concentration en protéines dans différents lots de lrECM. Cela peut être surmonté en testant les différents lots en plaquant simplement les cellules sur un lit lrECM et en observant la distribution granulométrique des acini. S’il n’y a pas de grande variabilité de taille, le lot lrECM peut être considéré comme approprié pour les expériences.
L’évaluation de la transformation se fait généralement par immunofluorescence, ce qui est démontré dans la vidéo. Lors de l’immunofluorescence, les étapes impliquant une incubation à 4 °C sont critiques; Le pipetage de la solution lorsque la couche lrECM est à l’état liquide rend la couche inégale, entraînant une perte de structures acineuses. L’un des moyens de résoudre le problème des irrégularités consiste à stocker les lames à 4 °C sur une plate-forme uniforme pendant la nuit ou à modifier le grossissement auquel l’imagerie est effectuée. Pour éviter de pipeter les structures acineuses, retirez délicatement la chambre du stockage à 4 °C et retirez les trois quarts du volume ajouté initialement, puis retirez le reste lors des lavages suivants.
Un autre problème majeur rencontré est le contexte élevé dû à lrECM. Pour surmonter ce problème, on peut utiliser un anticorps bloquant secondaire à 2% au lieu de 1%. Cependant, l’augmentation du blocage secondaire ne sert pas à colorer les marqueurs apical et E-cadhérin. Dans de tels cas, il est conseillé de soumettre le verre du couvercle de la chambre après le jour 20 au PBS-EDTA pendant 15 minutes à 4 °C, puis de fixer l’acini en suivant le même protocole que celui montré dans la vidéo. Le PBS-EDTA dissout partiellement le lrECM, réduisant ainsi le bruit de fond. Cependant, si le temps d’incubation est dépassé, ce traitement peut entraîner une perte de structures lors du pipetage de la solution. Par conséquent, le plus grand soin doit être pris lors de l’exécution de cette procédure. Il a également été observé que le stockage des diapositives pendant de plus longues périodes peut entraîner une augmentation du signal de fond. Par conséquent, l’imagerie doit être effectuée dès que possible. Il est conseillé d’imager un minimum de 15 acini par expérience pour déterminer un changement de phénotype.
Les cultures acineuses 3D ont certaines limites, telles que la difficulté à suivre des cellules uniques pendant l’imagerie de cellules vivantes. Certaines études, telles que les effets sur le cycle cellulaire, doivent être réalisées à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes pour maintenir l’information spatiale et temporelle. Cependant, en raison des changements constants de structure, il est difficile de suivre de tels paramètres dans les cultures acineuses 3D à l’aide de microscopes confocaux réguliers. Cela justifie l’utilisation de techniques microscopiques avancées telles que la microscopie à super-résolution ou la microscopie Airyscan. Cela nécessiterait également le délogement des structures acineuses pour certains tests de transformation tels que la cicatrisation des plaies, la croissance indépendante de l’ancrage et les tests de tumorigénicité in vivo . Ce délogement entraînerait la perte d’informations spatiales et temporelles importantes. Les lysats de protéines prélevés dans les cultures sont souvent dilués en raison de la présence d’IrECM, ce qui pose des problèmes avec le chargement d’une quantité suffisante de lysats. Cependant, cela peut être surmonté dans une plus grande mesure en délogeant les structures acini et en les collectant avant la lyse.
Ici, un système modèle a été démontré pour étudier la transformation induite par le médiateur phospholipidique / facteur immunoassocié. Ce modèle peut élucider les voies génétiques et/ou épigénétiques qui peuvent être dérégulées, entraînant des changements drastiques dans la morphologie. Cette méthode peut également être utilisée pour dépister des traitements potentiels. De telles études de dépistage de médicaments donneront un meilleur succès que les dépistages effectués dans des cultures2D 38. Un point fort majeur de cette méthode est l’adaptabilité selon les exigences de l’étude. Le schéma thérapeutique et les méthodes d’analyse peuvent être modifiés au besoin. De plus, cette méthode peut fournir des informations sur la signalisation moléculaire affectée lors du traitement40. La technique aidera également à prédire l’apparition possible d’une résistance aux médicaments. En outre, cela aidera également à élucider le mécanisme impliqué dans la résistance aux médicaments et à identifier des cibles plausibles pour la surmonter. Des études ont établi des possibilités de co-culture de plusieurs types de cellules en 3D, qui peuvent être modifiées pour s’adapter au schéma thérapeutique41. De telles possibilités permettront de mieux comprendre les caractéristiques et les changements moléculaires qui se produisent in vivo au cours de l’initiation et de la progression du cancer du sein.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Nous remercions l’installation de microscopie IISER Pune pour l’accès à l’équipement et à l’infrastructure et pour le soutien aux expériences. Cette étude a été financée par une subvention du Département de biotechnologie (DBT), du gouvernement de l’Inde (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013), du Science and Engineering Research Board (SERB), du gouvernement de l’Inde (EMR / 2016 / 001974) et en partie par IISER, Pune Core funding. A. K. a été financé par la bourse CSIR-SRF, L.A. a été financé par la bourse DST-INSPIRE, V.C a été financé par DBT (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
References
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