Summary
Detta protokoll beskriver upprättandet av 3D "på toppen " -kulturer av en icke-transformerad bröstepitelcelllinje, MCF10A, som har modifierats för att studera trombocytaktiveringsfaktor (PAF) inducerad transformation. Immunofluorescens har använts för att bedöma transformationen och diskuteras i detalj.
Abstract
Flera modeller har utvecklats för att studera cancer, till exempel gnagarmodeller och etablerade cellinjer. Värdefulla insikter om cancerframkallande ämnen har getts genom studier med hjälp av dessa modeller. Cellinjer har gett en förståelse för avregleringen av molekylär signalering i samband med brösttumörigenes, medan gnagarmodeller används i stor utsträckning för att studera cellulära och molekylära egenskaper hos bröstcancer in vivo. Upprättandet av 3D-kulturer av bröstepitel- och cancerceller hjälper till att överbrygga klyftan mellan in vivo- och in vitro-modeller genom att efterlikna in vivo-förhållandena in vitro. Denna modell kan användas för att förstå avregleringen av komplexa molekylära signalhändelser och de cellulära egenskaperna under bröstcancer. Här modifieras ett 3D-odlingssystem för att studera en fosfolipidmediatorinducerad (trombocytaktiveringsfaktor, PAF) transformation. Immunmodulatorer och andra utsöndrade molekyler spelar en viktig roll i tumörinitiering och progression i bröstet. I den aktuella studien utsätts 3D-acinarkulturer av bröstepitelceller för PAF uppvisade transformationsegenskaper såsom förlust av polaritet och förändrade cellulära egenskaper. Detta 3D-odlingssystem kommer att hjälpa till att belysa genetiska och / eller epigenetiska störningar inducerade av olika småmolekylära enheter i tumörmikromiljön. Dessutom kommer detta system också att tillhandahålla en plattform för identifiering av nya såväl som kända gener som kan vara involverade i omvandlingsprocessen.
Introduction
En myriad av modeller finns tillgängliga för att studera utvecklingen av cancer, var och en av dem är unik och representerar en subtyp av denna komplexa sjukdom. Varje modell ger unika och värdefulla insikter i cancerbiologi och har förbättrat medlen för att efterlikna det faktiska sjukdomstillståndet. Etablerade cellinjer som odlas som ett monolager har gett värdefulla insikter i viktiga processer in vitro, såsom spridning, invasivitet, migration och apoptos1. Även om tvådimensionell (2D) cellodling har varit det traditionella verktyget för att undersöka däggdjurscellernas svar på flera miljöstörningar, verkar extrapolering av dessa fynd för att förutsäga vävnadsnivåsvar inte tillräckligt övertygande. Den största begränsningen av 2D-kulturerna är att den skapade mikromiljön skiljer sig till stor del från bröstvävnaden i sig2. 2D-kulturen saknar interaktionen mellan cellerna och den extracellulära matrisen, vilket är avgörande för tillväxten av vilken vävnad som helst. Dragkrafter som upplevs av cellen i monolagerkulturer hindrar också polariteten hos dessa celler, vilket förändrar cellsignalering och beteende 3,4,5. Tredimensionella (3D) odlingssystem har öppnat en ny väg inom cancerforskningen med sin förmåga att efterlikna in vivo-förhållandena in vitro. Många viktiga mikromiljösignaler som går förlorade i 2D-cellodling kan återupprättas med hjälp av 3D-kulturer av lamininrik extracellulär matris (lrECM)6.
Olika studier har identifierat betydelsen av tumörmikromiljön vid cancerframkallande 7,8. Inflammationsassocierade faktorer är en stor del av mikromiljön. Trombocytaktiveringsfaktor (PAF) är en fosfolipidmediator som utsöndras av olika immunceller som förmedlar flera immunsvar 9,10. Höga nivåer av PAF utsöndras av olika bröstcancercellinjer och är förknippade med förbättrad proliferation11. Studier från vårt laboratorium har visat att den långvariga närvaron av PAF i acinarkulturer leder till omvandling av bröstepitelceller12. PAF aktiverar PAF-receptorn (PAFR) och aktiverar PI3K/Akt-signalaxeln13. PAFR rapporteras också vara associerad med EMT, invasion och metastasering14.
Detta protokoll visar ett modellsystem för att studera PAF-inducerad transformation, med hjälp av 3D-kulturer av bröstepitelceller, som tidigare har beskrivits av Chakravarty et al.12. Bröstepitelcellerna som odlas på den extracellulära matrisen (3D-kulturer) tenderar att bilda polariserade tillväxtarresterade sfäroider. Dessa kallas acini och liknar acini i bröstvävnad, den minsta funktionella enheten i bröstkörteln, in vivo15. Dessa sfäroider (figur 1A,B) består av ett monolager av tätt packade polariserade epitelceller som omger en ihålig lumen och är fästa vid källarmembranet (figur 1C). Denna process av morfogenes har beskrivits väl i litteratur16. När de seedas på lrECM genomgår cellerna delning och differentiering för att bilda ett kluster av celler, som sedan polariseras från dag 4 och framåt. Vid dag 8 består acini av en grupp polariserade celler som är i direkt kontakt med den extracellulära matrisen och ett kluster av opolariserade celler inneslutna i de yttre polariserade cellerna, utan kontakt med matrisen. Dessa opolariserade celler är kända för att genomgå apoptos vid dag 12 av kulturen och bildar en ihålig lumen. Vid dag 16 bildas tillväxtarresterade strukturer16.
Figur 1: Kärnor av celler i acini färgade med en kärnfläck . (A) 3D-konstruktion av acini. (B) Faskontrastbild av MCF10A acini odlad på Matrigel i 20 dagar. (C) Den mittersta sektionen visar närvaron av en ihålig lumen. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Till skillnad från 2D-kulturer hjälper acinarkulturer att skilja normala och transformerade celler genom uppenbara morfologiska förändringar. Icke-transformerade bröstepitelceller bildar acini med en ihålig lumen som efterliknar den normala mänskliga bröstacini. Dessa sfäroider, vid transformation, visar en störd morfologi som kännetecknas av en stor förlust av polaritet (ett av kännetecknen för cancer), frånvaro av lumen eller störning av den ihåliga lumen (på grund av undvikande av apoptos) som kan induceras på grund av avreglering av olika gener17,18,19,20 . Dessa transformationer kan studeras med hjälp av vanliga tekniker såsom immunofluorescens. Således kan 3D-cellodlingsmodellen fungera som en enkel metod för att undersöka processen för bröstacinarmorfogenes och bröstcancer. Att etablera ett 3D-odlingssystem för att förstå effekten av en fosfolipidmediator, PAF, kommer att hjälpa till med preklinisk läkemedelsscreening med hög genomströmning.
Detta arbete har anpassat 3D 'on top' kulturprotokoll16,21 för att studera transformation inducerad av PAF 22. De fenotypiska förändringarna som inducerades av exponering av acini för fosfolipidmediatorn studerades med användning av immunofluorescens. Olika markörer för polaritet och epitelial till mesenkymal övergång (EMT)12,16 användes i studien. Tabell 1 nämner deras normala lokalisering och deras förväntade fenotyp vid transformation.
| Antikroppar | Markerar | Normal lokalisering | Transformerad fenotyp |
| α6-Integrin | Basolateral | Basal med svag lateral fläck | Stark lateral / apikal fläck |
| β-Catenin | Korsning mellan cell och cell | Basolateral | Onormal / nukleär eller cytoplasmatisk lokalisering |
| Vimentin | Emt | Frånvarande / svag närvaro | Uppreglering |
Tabell 1: Markörer som använts i studien. Olika markörer som används med deras lokalisering i närvaro och frånvaro av PAF-behandling.
Denna metod kan bäst användas för att studera / screena troliga läkemedel och målgener för olika bröstcancerundertyper. Detta kan ge en läkemedelsresponsdata närmare in vivo-scenariot , vilket hjälper till med snabbare och mer tillförlitlig läkemedelsutveckling. Detta system kan också användas för att studera molekylär signalering associerad med läkemedelssvar och läkemedelsresistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Såning av MCF10A-celler i lrECM
- Behåll MCF10A-celler (vidhäftande bröstepitelceller) i tillväxtmediet. Passera cellerna var 4: e dag.
OBS: Sammansättning av tillväxtmedium: DMEM med hög glukos utan natriumpyruvat innehållande hästserum (5%), insulin (10 μg / ml), hydrokortison (0,5 μg / ml), epidermal tillväxtfaktor, EGF (20 ng / ml), koleratoxin (100 ng / ml) och penicillin-streptomycin (100 enheter / ml) (se materialtabell). - Tina lrECM (se Materialförteckning) på is 20 min innan experimentet startar. Dagen för sådd av cellerna anses i allmänhet vara dag 0.
- För trypsinisering av cellerna, aspirera mediet och tvätta med 2 ml PBS. Tillsätt 900 μL 0,05% Trypsin-EDTA och inkubera vid 37 °C i ~ 15 min eller tills cellerna är helt trypsiniserade.
- Förbered en bädd av lrECM i åtta brunnar i en kammare täckt glasskiva (se Materialförteckning).
- När cellerna trypsiniserar, täck varje brunn med 60 μL lrECM och placera den i en 37 °C CO 2-inkubator i högst 15 minuter.
- Förbered cellsuspensionen enligt stegen nedan.
- Efter fullständig lossning av celler, tillsätt 5 ml resuspensionsmedium för att släcka trypsinaktiviteten och snurra cellerna vid 112 x g i 10 minuter vid 25 °C.
OBS: Sammansättning av resuspensionsmedium: DMEM med hög glukos utan natriumpyruvat, kompletterat med hästserum (20%) och penicillin-streptomycin (100 enheter/ml). - Aspirera det förbrukade mediet och suspendera cellerna igen i 2 ml analysmedium. Blanda suspensionen väl för att säkerställa bildandet av en enda cellsuspension.
OBS: Sammansättning av analysmedium: DMEM med hög glukos utan natriumpyruvat, kompletterat med hästserum (2%), hydrokortison (0,5 μg / ml), koleratoxin (100 ng / ml), insulin (10 μg / ml) och penicillin-streptomycin (100 enheter / ml). - Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och beräkna volymen cellsuspension som behövs för att fröa 6 x 103 celler i varje brunn.
OBS: Det är i allmänhet att föredra att inkludera en extra brunn i beräkningen för att ta hänsyn till eventuella pipetteringsfel. - Beroende på antalet brunnar som krävs, späd cellsuspensionen i överlagringsmedium.
OBS: Överlagringsmediumkompositionen för en enda brunn är följande: 400 μL analysmedium, 8 μL lrECM (2% final) och 0,02 μL 100 μg / ml EGF (5 ng / ml final).
- Efter fullständig lossning av celler, tillsätt 5 ml resuspensionsmedium för att släcka trypsinaktiviteten och snurra cellerna vid 112 x g i 10 minuter vid 25 °C.
- Utför sådd av cellerna.
- Tillsätt 400 μl av den utspädda cellsuspensionen till de förberedda lrECM-bäddarna (steg 1.4) och se till att lrECM-bädden inte störs. Inkubera vid 37 °C i en fuktad 5%CO2-inkubator .
2. PAF-behandling
- Tillsätt PAF 3 h efter sådd av celler. Förbered ett 100 μM-lager PAF i PBS och tillsätt den önskade volymen på 0,2 μL i varje brunn (vilket motsvarar 200 nM).
- Lägg till samma koncentration av PAF under varje medieförändring.
3. Återmatning med färska medier
- Fyll på cellerna med färskt medium var 4: e dag (dvs. dag 4, dag 8, dag 12 och dag 16).
4. Immunofluorescensstudie för att detektera fenotypiska förändringar inducerade av långvarig PAF-exponering
- Efter 20 dagars odling, pipettera försiktigt ut mediet från varje brunn och tvätta brunnarna med 400 μL förvärmd PBS.
- Fixera acinarstrukturerna genom att tillsätta 400 μl 4% paraformaldehyd (nyberedd genom utspädning av 16% paraformaldehyd i 1x PBS) och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Skölj brunnarna en gång med iskall PBS och permeabilisera med PBS innehållande 0,5% Triton X-100 i 10 min vid 4 °C.
- Efter 10 min, pipettera omedelbart men försiktigt ut Triton-X 100-lösningen och skölj med 400 μL PBS-glycin (nyberedd genom tillsats av en nypa glycin i 1x PBS). Detta upprepas tre gånger i 15 min vardera.
- Tillsätt 400 μl av den primära blockeringslösningen, bestående av 10 % getserum (se materialförteckning) i immunofluorescensbuffert (IF) och inkubera vid rumstemperatur i 60 minuter.
OBS: Sammansättning av IF-buffert: 0,05% natriumazid, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 och 0,05% Tween (20 i 1 PBS). - Ta bort den primära blockeringslösningen, tillsätt 200 μl 2% sekundärblockerande antikropp (F(ab')2 fragment av antikroppar uppfödda i get mot musantigen, se Materialförteckning) framställd i primär blockerande lösning och låt den stå i 45-60 min vid rumstemperatur.
- Bered den primära antikroppen (se materialförteckningen) i 2% sekundär blockerande antikroppslösning i en utspädning på 1:100. När den sekundära blockeringslösningen har avlägsnats, tillsätt den nyberedda antikroppen och inkubera över natten vid 4 °C.
- Det föregående steget kan framkalla kondensering av källarmembranet. Innan du fortsätter med experimentet, vänta tills bilden når rumstemperatur. Pipettera försiktigt den primära antikroppslösningen och tvätta den tre gånger med 400 μl IF-buffert.
- Under den sista tvätten med IF-buffert, förbered en utspädning på 1:200 av den fluoroforkonjugerade sekundära antikroppen (se materialförteckning) i den primära blockeringslösningen. Inkubera objektglasen i den sekundära antikroppslösningen i 40-60 minuter vid rumstemperatur.
- Skölj objektglasen med 400 μL IF-buffert i 20 min, följt av två tvättar med PBS i 10 min vardera.
- Motfläcka kärnorna med PBS som innehåller 0,5 ng/ml kärnfläck (se materialtabell) i 5-6 minuter vid rumstemperatur. Tvätta objektglasen tre gånger med 400 μL PBS för att ta bort överflödig fläck.
- Pipettera försiktigt ut hela PBS och se till att restlösningen tas bort. Tillsätt en droppe monteringsreagens (se materialtabell) i varje brunn och låt den stå i rumstemperatur över natten.
- Förvara bilderna i rumstemperatur och avbilda bilderna så snart som möjligt.
- Bild under 40x eller 63x förstoring på ett konfokalmikroskop (se materialtabell), med optiska Z-sektioner med 0,6 mm stegstorlek (NA = 1,4).
- Öppna de förvärvade bilderna med ett bildbehandlingsprogram (se Materialförteckning). Demonstrera de morfologiska skillnaderna med hjälp av 3D-projektioner.
OBS: Den mittersta optiska Z-sektionen kan bäst användas för att visa skillnader i lokaliseringen av polaritetsmarkörer. Dessa kan kvantifieras manuellt för att representera procentandelen sfäroider som visar det specifika färgningsmönstret. - För att illustrera skillnader i uttrycket av proteiner, utför en semikvantitativ analys som mäter det genomsnittliga gråvärdet eller beräknar korrigerad total cellfluorescens (CTCF)23. Representera data som fiol- eller punktdiagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MCF10A-celler, vid exponering för PAF-behandling, bildar acinarstrukturer med mycket distinkta fenotyper. α6-integrin visade sig vara fellokaliserat med mer apikal färgning. Några acini visade också diskontinuerlig färgning (figur 2A). Båda dessa fenotyper indikerar förlusten av basal polaritet, vilket framgår av litteraturen24,25. Tidigare rapporter indikerar den kontroversiella rollen av α6-integrin i cancermetastaser. α6-integrin finns som en dimer med antingen β1- eller β4-integrin. α6β4-underenheten har visat sig spela en viktig roll för att bilda hemidesmosomer i epitelceller26. Nedregleringen av detta integrin har hittats i prostata och vissa fall av bröstcancer, där förlust av α6β4-integrin hittades i duktalt karcinom i bröstet (grad III). Förlustfenotypen ses i cellerna som metastaserar till parenkymen och pleurhålan27,28,29. GM130 är ett cis-Golgi-lokaliserat protein; Golgi-kroppar är apikalt lokaliserade i MCF10A-acinarkulturer16,30. PAF-behandling ledde till fellokalisering av GM130, vilket tyder på apikal polaritetsstörning (figur 2B). Vimentin är ett mellanliggande filament som är involverat i cellmigration; det uppregleras när epitelceller genomgår epitelial till mesenkymal övergång (EMT)31. PAF-behandling av MCF10A-acinarkulturer ledde till förhöjda vimentinnivåer som observerats av färgningsintensiteten (figur 2C), vilket tyder på EMT.
Figur 2: PAF stör polariteten och inducerar EMT-liknande förändringar i MCF10A bröstacini. MCF10A-celler odlades som 3D "on top" -kulturer i lrECM. Kulturerna behandlades med PAF dag 0, 4, 8, 12 och 16. Kulturerna bibehölls i 20 dagar och immunbehandlades sedan för α6-integrin (grön) och kärnfläck (blå) (A), (B) GM130 (grön), en markör för apikal polaritet, och (C) Vimentin (röd), en EMT-markör. Den mittersta stacken av respektive acini har visats. De representativa uppgifterna är för 40-50 acini från tre biologiskt oberoende experiment. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etablerade cellinjebaserade modeller används ofta för att studera processen för cancerframkallande. Monolagerkulturer av celler fortsätter att ge insikter i de olika molekylära signalvägarna som förmedlar karakteristiska förändringar i cancerceller32. Studier av rollen av välkända onkogener som Ras, Myc och muterad p53 rapporterades först med monolagerkulturer som modellsystem33,34,35,36. 2D-kulturmodellen saknar dock många viktiga strukturella och funktionella parametrar som finns in vivo. Läkemedelsscreeningsstudier i 2D-kulturer visar ofta ett signifikant svar (celldöd eller målhämning), även vid lägre koncentrationer, samtidigt som de inte visar någon signifikant effekt när de admistereras hos möss37. En viktig anledning till detta är den varierande läkemedelstillgängligheten och upptaget i en 2D-monolagerkultur jämfört med 3D-kultur38.
Begreppet 3D-kulturer har framstått som ett kraftfullt verktyg för att studera utvecklingen av cancer under det senaste decenniet. 3D-kulturer involverar växande celler på en extracellulär matris, vilket resulterar i bildandet av strukturer som liknar funktionella enheter som finns i vävnaden in vivo16. 3D-kulturer efterliknar in vivo-mikromiljön i stor utsträckning och övervinner därmed begränsningarna för 2D-kulturer39. Eftersom cellerna som odlas i 3D är av mänskligt ursprung och systemet är mer mottagligt för att studera tidiga händelser är det enklare och mer elegant än gnagarmodellerna.
Med hjälp av denna plattform demonstreras en modell för att studera transformationsprocessen efter exponering för en fosfolipidmedlare såsom PAF. Studier från vårt laboratorium har identifierat att PAF-behandling kan omvandla den icke-tumorigena bröstepitelcelllinjen, MCF10A12. Denna metod är optimerad för att kontinuerligt exponera cellerna för PAF, liknande in vivo-scenariot, där PAF finns i mikromiljön.
MCF10A-celler, när de odlas i 2D, måste passeras var 4: e dag. Om de inte underhålls enligt protokollet beter de sig väldigt annorlunda, vilket endast syns när de odlas på ECM16. Passagenumret på cellerna måste hållas så lågt som möjligt. Denna metod har också begränsningar på grund av variationen i proteinkoncentrationen i olika satser av lrECM. Detta kan övervinnas genom att testa de olika partierna genom att helt enkelt plätera celler på en lrECM-säng och observera acinis storleksfördelning. Om det inte finns någon stor variation i storlek kan lrECM-satsen anses lämplig för experiment.
Bedömning av transformationen görs vanligtvis genom immunofluorescens, vilket demonstreras i videon. Vid utförande av immunofluorescens är stegen som involverar inkubation vid 4 °C kritiska; pipettering av lösningen när lrECM-skiktet är i flytande tillstånd gör skiktet ojämnt, vilket leder till förlust av acinarstrukturer. Ett av sätten att ta itu med ojämnhetsproblemet är att förvara bilderna vid 4 ° C på en jämn plattform över natten eller ändra förstoringen vid vilken avbildning görs. För att undvika pipettering ut acinarstrukturerna, ta försiktigt bort kammaren från 4 ° C-förvaringen och ta bort tre fjärdedelar av volymen som tillsattes initialt och ta sedan ut resten under de efterföljande tvättarna.
Ett annat stort problem som står inför är den höga bakgrunden på grund av lrECM. För att lösa detta problem kan man använda en 2% sekundär blockerande antikropp istället för 1%. Ökad sekundär blockering tjänar emellertid inte syftet att färga apikala markörer och E-cadherin. I sådana fall är det lämpligt att utsätta kammarhöljeglaset efter dag 20 för PBS-EDTA i 15 minuter vid 4 ° C och sedan fixa acini enligt samma protokoll som visas i videon. PBS-EDTA löser delvis upp lrECM, vilket minskar bakgrunden. Men om inkubationstiden överskrids kan denna behandling resultera i förlust av strukturer medan man pipetterar ut lösningen. Därför måste största försiktighet iakttas när denna procedur utförs. Det har också observerats att lagring av bilderna under längre perioder kan leda till en ökning av bakgrundssignalen. Därför måste avbildning göras så snart som möjligt. Det är lämpligt att avbilda minst 15 acini per experiment för att bestämma en förändring i fenotyp.
3D-acinarkulturer har vissa begränsningar, såsom svårigheter att spåra enskilda celler under levande cellavbildning. Vissa studier, såsom effekter på cellcykeln, måste utföras med hjälp av levande cellavbildning för att upprätthålla rumslig och tidsmässig information. På grund av ständiga strukturförändringar är det emellertid svårt att spåra sådana parametrar i 3D-acinarkulturer med hjälp av vanliga konfokalmikroskop. Detta motiverar användning av avancerade mikroskopiska tekniker som superupplösningsmikroskopi eller Airyscan-mikroskopi. Det skulle också kräva lossning av acinarstrukturerna för vissa transformationsanalyser såsom sårläkning, förankringsoberoende tillväxt och in vivo tumorigenicitetsanalyser. Denna lossning skulle leda till förlust av viktig rumslig och tidsmässig information. Proteinlysater som samlas in från kulturerna späds ofta ut på grund av närvaron av IrECM, vilket utgör problem med belastningen av tillräcklig mängd lysater. Detta kan emellertid övervinnas i större utsträckning genom att lossa acinistrukturerna och samla dem före lys.
Här har ett modellsystem demonstrerats för att studera fosfolipidmediator/immunassocierad faktorinducerad transformation. Denna modell kan belysa genetiska och / eller epigenetiska vägar som kan bli avreglerade, vilket leder till drastiska förändringar i morfologin. Denna metod kan också användas för att screena potentiella terapier. Sådana läkemedelsscreeningsstudier kommer att ge bättre framgång än screeningar som utförs i 2D-kulturer38. En viktig höjdpunkt med denna metod är adaptiviteten enligt studiens krav. Behandlingsregimen och analysmetoderna kan modifieras efter behov. Dessutom kan denna metod ge insikter i den molekylära signalering som påverkas vid behandling40. Tekniken kommer också att bidra till att förutsäga eventuell förekomst av läkemedelsresistens. Dessutom kommer det också att bidra till att belysa mekanismen för läkemedelsresistens och identifiera troliga mål för att övervinna detsamma. Studier har etablerat möjligheter att samodla flera celltyper i 3D, som ytterligare kan modifieras för att tillgodose behandlingsregimen41. Sådana möjligheter kommer att ge större insikter i de egenskaper och molekylära förändringar som sker in vivo under initiering och progression av bröstcancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga potentiella intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar IISER Pune Microscopy Facility för tillgång till utrustning och infrastruktur och stöd för experimenten. Denna studie stöddes av ett bidrag från Department of Biotechnology (DBT), Indiens regering (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), Science and Engineering Research Board (SERB), Indiens regering (EMR/2016/001974) och delvis av IISER, Pune Core funding. A. K. finansierades av CSIR-SRF-stipendiet, LA finansierades genom DST-INSPIRE-stipendium, V.C finansierades av DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
References
- Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
- Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
- Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
- Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
- Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
- Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
- Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938 (2021).
- Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
- Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287 (2014).
- Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
- Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688 (2019).
- Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
- Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
- Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
- Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
- Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
- Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
- McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
- Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
- Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12 (2016).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543 (2020).
