Summary
Dette er en almindeligt anvendt metode til C. elegans gonaddissektion efterfulgt af frysecrack, som producerer kimlinjeprøver til immunfluorescens via antistoffarvning eller til simpel DAPI-farvning for at visualisere DNA. Denne protokol har været vellykket for studerende i et forskningslaboratorium og i en kursusbaseret bachelorforskningserfaring.
Abstract
C. elegans kimlinjen er en fremragende model til undersøgelse af meiose, dels på grund af den lette udførelse af cytologiske analyser på dissekerede dyr. Hele monteringspræparater bevarer strukturen af meiotiske kerner, og vigtigst af alt indeholder hver gonadarm alle stadier af meiose, organiseret i en tidsmæssig-rumlig progression, der gør det let at identificere kerner på forskellige stadier. Voksne hermafroditter har to gonadarme, hver organiseret som et lukket rør med prolifererende kimlinjestamceller i den distale lukkede ende og cellulariserede oocytter i den proksimale åbne ende, som slutter sig til midten ved livmoderen. Dissektion frigiver en eller begge gonadarme fra kropshulen, så hele meiosen kan visualiseres. Her præsenteres en fælles protokol for immunfluorescens mod et protein af interesse efterfulgt af DAPI-farvning for at markere alle kromosomer. Unge voksne immobiliseres i levamisol og dissekeres hurtigt ved hjælp af to sprøjtenåle. Efter ekstrudering af kimlinjer fastgøres prøven, inden den gennemgår en frysesprække i flydende nitrogen, som hjælper med at gennemtrænge neglebåndet og andre væv. Prøven kan derefter dehydreres i ethanol, rehydreres og inkuberes med primære og sekundære antistoffer. DAPI tilsættes til prøven i monteringsmediet, hvilket muliggør pålidelig visualisering af DNA og gør det nemt at finde dyr til billede under et fluorescerende mikroskop. Denne teknik anvendes let af dem, der er bekendt med håndtering af C. elegans efter et par timer brugt på at øve selve dissektionsmetoden. Denne protokol er blevet undervist til gymnasieelever og studerende, der arbejder i et forskningslaboratorium og indarbejdet i en kursusbaseret bachelorforskningserfaring på et liberal arts college.
Introduction
Meiose er den specialiserede celledeling, der bruges til at skabe kønsceller (æg og sæd / pollen) i alle seksuelt reproducerende organismer 1,2. Crossover-rekombination er den gensidige udveksling af DNA mellem homologe kromosomer; Det er afgørende for meiose, der både giver en vigtig kilde til genetisk mangfoldighed og fremmer genomstabilitet gennem generationer. Kromosomer, der ikke danner mindst en crossover under meiose, adskilles tilfældigt, hvilket kan resultere i kromosomikker, der ikke er disjunktion, hvilket skaber kønsceller med det forkerte antal kromosomer - en tilstand, der normalt er dødelig for resulterende afkom3. Under meiose induceres crossovers af programmerede dobbeltstrengede DNA-pauser4. En delmængde af disse pauser vil blive repareret som crossovers, der giver fysiske forbindelser af DNA, kaldet chiasmata, der hjælper med at orientere homologe kromosomer som forberedelse til celledeling5. Meiotiske stadier er stærkt bevaret på tværs af alle eukaryoter, og deres kromosomale konformation gør det let at identificere dem.
Som et grundlæggende koncept i biologi er meiose et emne, som eleverne støder på flere gange i forskellige biologikurser. De introduceres ofte til mekanikken i meiotisk kromosomadskillelse i gymnasiet, mens kurser på college-niveau fokuserer på segregerings cellebiologi og den genetiske virkning af crossover-rekombination. Meiose er dog et notorisk vanskeligt koncept for mange studerende1. En manglende forståelse af forholdet mellem gener, DNA, kromosomer og meiose kan generere studerendes misforståelser og huller i forståelsen, der hindrer en fuld forståelse af genetisk arv 6,7. En måde at forbedre elevernes forståelse af abstrakte emner på er at give konkrete, praktiske aktiviteter. For eksempel, når de underviser i meiose, kan instruktører vælge mellem aktiviteter, der efterligner molekylær analyse8, 3D-modeller, der giver eleverne mulighed for at manipulere molekyler9, eller rollespil, hvor eleverne selv udfører den molekylære koreografi1. Inkorporering af forskning med ukendte resultater er en særlig effektiv måde at forbedre elevernes forståelse på. Denne praksis er kendt som en kursusbaseret bachelorforskningserfaring (CURE) og har den ekstra fordel at styrke studerendes holdninger og agentur, især for dem, der tilhører grupper, der forbliver underrepræsenteret i STEM10,11. Nematodeormen Caenorhabditis elegans er særligt modtagelig for klasseværelsesstudier af adfærd, fertilitet og genetiske kryds og er en effektiv model til at introducere eleverne til biologisk forskning12.
C. elegans fremstiller en kraftfuld modelorganisme for cellebiologi ved at kombinere molekylær genetik med simpel cytologisk analyse. Det er også særligt velegnet til brug i et biologi klasseværelse 13,14,15. De er nemme og økonomiske at vedligeholde i et laboratorium og producerer hundredvis af afkom hver 3. dag, både ved standard stuetemperatur eller ved 20 °C, den mest almindelige inkubationstemperatur. Det er vigtigt, at de kan fryses som glycerollagre og opbevares i en -80 ° C fryser, hvilket betyder, at eventuelle husdyrbrugsfejl begået af nybegyndere let kan rettes16. Desuden giver dets godt kommenterede genom mulighed for fremadrettede og omvendte genetiske teknikker17,18, hvilket gør det muligt at bruge C. elegans til at løse biologiske spørgsmål lige fra molekylære til evolutionære. Endelig har C. elegans forskere skabt et støttende samfund, der ofte er villig til at yde hjælp og rådgivning til spirende forskere19. Disse fordele har ført til, at C. elegans er blevet indarbejdet i en række CURE'er på forskellige typer institutioner 12,19,20,21,22,23.
Ud over sine fordele for forskning og undervisning er C. elegans blevet en populær model til studier af meiose og kimlinjeudvikling24,25,26. Den optiske klarhed af disse dyr forenkler cytologiske tilgange27, og hos voksne repræsenterer gonader næsten halvdelen af dyret, hvilket giver hundredvis af meiotiske celler til at studere. I gonader er meiotiske kimlinjekerner arrangeret som et samlebånd (figur 1); Mitotisk replikation forekommer ved gonadens distale spids, hvor kerner udvikler sig gennem meiotiske stadier, når de migrerer mod den proksimale ende af gonaden, hvor befrugtede embryoner kommer ud af vulvaen. Fordi den stereotype rumlige organisation også repræsenterer en tidsmæssig progression gennem meiose, kan forskellige stadier let identificeres baseret på deres kromosomale organisation og placering i gonaden. Endelig skaber processer, der forstyrrer meiose og forårsager aneuploidi, fænotyper, der er ligetil at karakterisere, selv for nybegyndere: sterilitet, embryonal dødelighed eller en høj forekomst af mænd (Him fænotype)28.
Dette er en simpel protokol til visualisering af meiotiske kromosomer i C. elegans. Montering, dissektion, fastgørelse og antistoffarvning udføres alle på det samme mikroskopglas, hvilket forenkler protokollen og muliggør næsten perfekt prøvegendannelse. Denne metode fungerer til simpel DAPI-farvning for at visualisere kromosomer og kan bruges til immunfluorescens til at visualisere lokaliseringen af proteiner i gonaden. Studerende dissekerer gonader ved hjælp af grundlæggende dissekeringsmikroskoper, genererer helmonterede præparater til visualisering af DNA eller immunfluorescens og afbilder dem på et sammensat fluorescerende mikroskop. Denne protokol er blevet undervist til gymnasieelever og studerende, der arbejder i et C. elegans forskningslaboratorium og indarbejdet i en CURE på et liberal arts college12. Selv om CURE havde en relativt lille klassestørrelse, ville denne protokol være tilgængelig for klasser på en række institutioner på grund af de relativt lave omkostninger ved ormestammer og reagenser. Instruktører vil kun være begrænset af antallet af dissekerende mikroskoper, der er tilgængelige til brug. Den tidligere implementering fik eleverne til at arbejde i grupper på tre for at dele et enkelt mikroskop og fandt sted over tre 90-minutters sessioner: den første til at øve dissektion, den anden til at implementere dissektion og DAPI-farvning og den tredje til billeddias på et widefield fluorescensmikroskop. Deltagelse i bachelorforskning giver mange fordele for studerende11,29, både akademiske og personlige. Indlejring af forskning i kurser via CURE'er giver eleverne mulighed for at deltage i forskning i normal klassetid11,30,31, hvilket gør eksponering for disse fordele mere tilgængelig og retfærdig.
Protocol
1. C. elegans husdyrhold
BEMÆRK: Se C. elegans vedligeholdelsesprotokol16 og Elgin et al.32 for flere detaljer. C. elegans stammer kan let erhverves fra Caenorhabditis Genetics Center (https://cgc.umn.edu) og sendes via almindelig post til ethvert sted i USA. Hver stamme koster $ 10, og hvert laboratorium / bruger betaler et årligt gebyr på $ 30.
- Brug steril teknik til at forberede 6 cm nematodevækstmedium agarplader (NGM agarplader).
BEMÆRK: Hældte tallerkener kan opbevares på hovedet i deres originale plasthylstre eller lufttætte beholdere ved 4 °C i flere måneder.- For at fremstille NGM agarplader tilsættes 3 g NaCl, 2,5 g Bacto peptone, 20 g NGM agar og ddH2O til 1 L (~ 975 ml). Autoklave mediet ved hjælp af en væskecyklus, der holder ved 121 °C i 20 min. Lad afkøle til 55 ° C, og ved hjælp af steril teknik tilsættes 1 ml kolesterol, 0,5 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 og 25 ml 1 M kaliumphosphatbuffer (pH 6).
BEMÆRK: For at fremstille 1 M kaliumphosphatbuffer blandes 108,3 g KH 2 PO 4 (monobasisk)og 35,6 g K2HPO4 (dibasisk); juster om nødvendigt pH til 6 ved hjælp af KOH. Tilsæt ddH2O op til 1 L (normalt ~ 900 ml) og autoklave i 40 minutter ved 121 ° C. 1 L NGM gør ca. 100 plader indeholdende 10 ml hver.
- For at fremstille NGM agarplader tilsættes 3 g NaCl, 2,5 g Bacto peptone, 20 g NGM agar og ddH2O til 1 L (~ 975 ml). Autoklave mediet ved hjælp af en væskecyklus, der holder ved 121 °C i 20 min. Lad afkøle til 55 ° C, og ved hjælp af steril teknik tilsættes 1 ml kolesterol, 0,5 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 og 25 ml 1 M kaliumphosphatbuffer (pH 6).
- Ved hjælp af en serologisk eller overførselspipet kan du se pladerne med tre dråber E.coli OP50 bakteriekulturer (~ 150 μL). Prøv at få øje på i midten af pladen og undgå at placere pletter for tæt på pladekanterne; Dette vil afskrække dyrene fra at kravle op ad siderne af pladerne og tørre.
- Når bakterieplænen tørrer, skal du opbevare de plettede plader på hovedet ved stuetemperatur (RT) i op til 2 uger. Spotting plader mindst 1-2 dage før brug vil gøre det muligt for bakterieplænerne at vokse tykkere og understøtte en højere tæthed af dyr.
BEMÆRK: For at forberede OP50 bakteriekulturer kan OP50 bestilles fra Caenorhabditis Genetics Center. OP50-bakterier stryges fra en glycerolbestand på en LB-plade for at sikre enkeltkolonier og holdes ved 4 ° C i 4-6 uger. OP50 bakteriekulturer dyrkes i LB natten over ved 37 °C fra en enkelt koloni – ingen rystelser er nødvendige. For at forberede LB-medier tilsættes 10 g Tryptone, 10 g NaCl, 5 g gærekstrakt, 950 ml ddH 2 O, justeres pH til 7 med 10N NaOH og justeres det endelige volumen til 1 L med ddH2O. Aliquot i 100 ml mængder og autoklave i 20 minutter ved 121 °C. - For at skabe en arbejdsbestand for hver stamme skal du vælge tre L4-trins hermafroditter på en plettet NGM-plade. Pladerne opbevares ved 15-25 °C. Standarddyrkningsbetingelsen er 20 °C. Hvis der ikke er adgang til temperaturstyrede inkubatorer, skal du vedligeholde kulturerne på bordpladen på RT.
BEMÆRK: L4-trins hermafroditter kan let iscenesættes både efter størrelse (mindre end voksne) og tilstedeværelsen af en tydelig halvcirkel halvvejs gennem deres kroppe (den udviklende vulva). Ved 20 °C når dyrene L4-trinnet 34-46 timer efter udklækning (hvilket er ca. 40-52 timer, efter at embryoner er lagt). Se Corsi et al.14 for flere detaljer om tidspunktet for udviklingsstadier.- Skift kulturerne til forskellige temperaturer for at kontrollere udviklingshastigheden. Dyr vil vokse hurtigere ved højere temperaturer og langsommere ved lavere temperaturer. De vil begynde at blive sterile ved temperaturer over 25 °C.
BEMÆRK: Nogle mutante genotyper er temperaturfølsomme og vil vise forskellige fænotyper afhængigt af dyrkningstemperaturen.
- Skift kulturerne til forskellige temperaturer for at kontrollere udviklingshastigheden. Dyr vil vokse hurtigere ved højere temperaturer og langsommere ved lavere temperaturer. De vil begynde at blive sterile ved temperaturer over 25 °C.
- Vedligehold arbejdslagrene ved at plukke tre L4-trins hermafroditter til en ny plettet NGM-plade hver 4. dag. Dette vil sikre en konstant, velnæret befolkning med en bred vifte af udviklingsstadier.
2. Gonad dissektion
- Indsamling af aldersmatchede voksne: 12-24 timer før dissektion skal du vælge L4-trins hermafroditter til en ny plettet NGM-plade - disse vokser til unge voksne den følgende dag, hvilket er ideelt til dissektion. Antallet af L4-trins hermafroditter afhænger af den cytologiske analyse, der udføres; Normalt dissekeres 10-20 hermafroditter pr. dias, med to til fire dias genereret pr. Tilstand.
BEMÆRK: Gonader ekstruderes mest effektivt i velfodrede dyr. Sørg for at vælge L4 hermafroditter fra arbejdslagre, der ikke er sultet (dvs. stadig har en synlig bakterieplæne til stede på pladen). Udsultede dyr har tendens til at gennemgå ufuldstændige gonadekstruderinger, hvilket gør dem vanskelige at visualisere.- Hvis man vurderer senere stadier af meiose, som diakinese, dissekerer ældre voksne (48 timer efter L4), fordi de akkumulerer flere diakinesis-stadium kerner, hvilket forenkler analysen. Forskere bør dog bemærke muligheden for, at nogle virkninger kan være forårsaget af avanceret moderalder.
- Forbered dig på dissektion.
- Forbered M9: Tilsæt 3 g KH 2 PO 4 (monobasis), 6 g Na 2 HPO4 (dibasic), 5 g NaCl, og tilsæt ddH2O til 100 ml. Autoklave opløsningen i 20 minutter ved 121 °C, lad den køle af, og tilsæt derefter 1 ml 1 M MgSO4 ved hjælp af steril teknik.
- Forbered dissekeringsbuffer: Bland 1 μL af 10% Tween 20, 12 μL af 100 mM levamisol, 10 μL af 10x M9 og 77 μL ddH2O.
BEMÆRK: Tween 20 er inkluderet i dissekeringsbufferen for at reducere overfladespænding og yderligere gennemtrænge vævsmembraner. - Fix opløsning (2% PFA [100 μL]): Bland 12,5 μL 16% paraformaldehyd (PFA), 10 μL 10x M9 og 77,5 μL ddH2O; Sørg for at bruge en frisk ampul af PFA (åbnet i højst 2 uger).
FORSIGTIG: PFA er et farligt kemikalie, og der skal fremstilles fikseringsopløsning i røgemhætten. - Opsæt frysemetoden - flydende nitrogen er lettere at håndtere, men om nødvendigt kan en aluminiumsblok bruges oven på tøris.
- Flydende nitrogenmetode: Sæt et plastbægerglas eller en Coplin-krukke af plast i en polystyrenkasse. Fyld bægerglasset med flydende nitrogen (overløb i polystyrenbeholderen er fint). Indstil pincetten i nærheden. Ideelt set bør bægerglasset være smalt nok til at forhindre mikroskopglider i at falde helt vandret - dias skal ligge ved en hældning og være lette at få fat i med pincet.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge plastbeholdere, når du arbejder med flydende nitrogen i stedet for glas for at undgå at knuse på grund af hurtig afkøling. - Tøris metode:
- Anbring en flad aluminiumsblok på tøris i en polystyrenbeholder eller rektangulær isspand. Det er lettere at fryse diasene, hvis toppen af blokken sidder over toppen af beholderen.
- Brug handsker, tryk forsigtigt ned på aluminiumsblokken for at sikre god kontakt med tøris og fremskynde køleprocessen (det kan frigive et skrig, når metallet afkøles hurtigt). Sæt et barberblad i nærheden.
- Lad aluminiumsblokken stå på tøris i mindst 30 minutter før fryse-revnestop for at tillade fuld afkøling, hvilket er nødvendigt for en hurtig frysning.
BEMÆRK: Ideelt set bør der anvendes faste blokke af tøris, hvilket hjælper overfladen med at forblive plan. Om nødvendigt kan aluminiumsblok placeres på tørispiller, men man skal sørge for, at overfladen forbliver plan. - Overfladen på aluminiumsblokken samler frost, hvilket kan forhindre tæt kontakt mellem diasene og blokken. Brug barberbladet til at skrabe frost af overfladen og rydde et område for hvert dias. Dækning af polystyrenbeholderen med låg hjælper med at forhindre overdreven frostophobning.
- Flydende nitrogenmetode: Sæt et plastbægerglas eller en Coplin-krukke af plast i en polystyrenkasse. Fyld bægerglasset med flydende nitrogen (overløb i polystyrenbeholderen er fint). Indstil pincetten i nærheden. Ideelt set bør bægerglasset være smalt nok til at forhindre mikroskopglider i at falde helt vandret - dias skal ligge ved en hældning og være lette at få fat i med pincet.
- Fyld en Coplin-krukke med ~ 40 ml 95% ethanol.
- Fyld tre Coplin-krukker med ~40 ml PBS-T.
BEMÆRK: For at fremstille PBS-T blandes 100 ml 10x PBS, 5 ml Triton X-100 og 2 ml 0,5 M EDTA (pH 8). Tilføj 873 ml ddH2O. Ryst kraftigt for at opløse Triton X-100. For at fremstille 10x PBS blandes 25,6 g Na2HPO 4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl og 2 g KH2PO4. Tilsæt ddH2O for at bringe lydstyrken op til 1 L. Autoklave i 40 min ved 121 °C. Vaskemidlet Triton X-100 er inkluderet i vaskebufferen PBS-T for at reducere overfladespændingen og forbedre fastholdelsen af hele monterede dyr på rutsjebanen.
- Disseker dyrene på en 18 mm x 18 mm glasdæksel. Dette trin er tidsfølsomt på grund af fordampningen af dissekeringsbufferen. Det bør tage mindre end 5 minutter at afslutte dissektioner.
BEMÆRK: Levamisol bruges til at immobilisere dyr for at gøre dem lettere at dissekere, men at lade dem være i levamisol for længe vil resultere i dårlig gonadekstrudering. Det er nemmest at reducere antallet af dyr, der dissekeres pr. dias for at passe inden for tidsrammen på 5 minutter.- Placer et holdeglas på scenen i et dissekerende mikroskop - holderutsjebanen bruges til lettere at flytte dækslippet rundt og kan genbruges på ubestemt tid (figur 2A, venstre foto).
- Anbring dækslikket oven på holdeglasset og pipet 4 μL af dissekeringsopløsningen i midten af dækslippen. Flyt holdeobjektet til den ene side af scenen for at frigøre visningen.
- Vælg 10-20 hermafroditter i dråben af dissekeringsopløsning. Vælg nok dyr til at afbilde ~ 10 pr. dias, men ikke så mange, at de ikke kan dissekeres inden for 5 minutter.
- Dissekere dyrene ved hjælp af to sprøjtenåle, en til hver hånd (figur 2A).
- Kryds nålepunkterne for at lave en X-form, og brug bunden af X til at fastgøre en voksen ned til overfladen af dækslippet.
BEMÆRK: Det kan tage øvelse at finde den bedste måde at holde hver nål på med hensyn til vinkel og rotation. Start med at holde nålene med deres skråninger (skrå kant) nedad. Se diskussionen for forslag til første læring af dissekering i et større volumen (figur 2D). - Placer X-formen umiddelbart bag svælget, ca. 1/5 af kropslængden for en ung voksen eller lige under den klare del af hovedet (figur 2A, højre diagram).
- Afhug dyret med en saksebevægelse (som at skære mad med en kniv og gaffel). En god ekstrudering vil resultere i, at den ene arm af gonaden (eller nogle gange begge arme) frigives fuldt ud fra kropshulen sammen med en eller begge halvdele af tarmen (figur 2B, venstre billede). Tarmen vil fremstå mørkere og af ensartet bredde, mens gonaden vil fremstå klar med en distal tilspidset spids.
- Hvert dyr bør kun skæres én gang; Hvis gonaden ikke ekstruderer efter at have skåret det, skal du bare gå videre til det næste dyr. Det første snit reducerer det hydrostatiske tryk i kroppen betydeligt, hvilket gør det usandsynligt, at yderligere nedskæringer resulterer i en bedre ekstrudering. Ufuldstændige eller dårlige ekstruderinger er let synlige under billeddannelse og kan ignoreres (figur 2B, højre billede).
BEMÆRK: Forsøg ikke at adskille gonaden fra slagtekroppen - gør det normalt vil rive vævet og begrænse antallet af meiotiske stadier, der kan analyseres.
- Hvert dyr bør kun skæres én gang; Hvis gonaden ikke ekstruderer efter at have skåret det, skal du bare gå videre til det næste dyr. Det første snit reducerer det hydrostatiske tryk i kroppen betydeligt, hvilket gør det usandsynligt, at yderligere nedskæringer resulterer i en bedre ekstrudering. Ufuldstændige eller dårlige ekstruderinger er let synlige under billeddannelse og kan ignoreres (figur 2B, højre billede).
- Gentag dissektionen for de resterende dyr på dækslippen.
- Kryds nålepunkterne for at lave en X-form, og brug bunden af X til at fastgøre en voksen ned til overfladen af dækslippet.
- Fix prøven med formaldehyd.
- Arbejd forsigtigt, pipet 4 μL af fikseringsopløsningen på dækselslippen meget tæt på dråben med dyr. Ideelt set er dråberne tæt nok til at fusionere; undgå pipettering direkte ind i dissektionsdråben og forskydning af de dissekerede slagtekroppe.
- Fastgør dækslet til holdeglidet med en finger. Med den anden hånd skal du forsigtigt svirpe dækslikket et par gange for at blande dråberne. Den endelige fixkoncentration er 0,8% PFA.
- Hold et positivt ladet dias forfra nedad, brug det til at samle dækslikket op i midten af diaset. Rør forsigtigt ved prøvefaldet, og overfladespændingen af dråben vil samle dækslippet op.
BEMÆRK: Positivt ladede dias har en elektrostatisk belægning, der hjælper væv med at klæbe til overfladen for at forhindre tab af prøver.- Placer om ønsket dækslippet diagonalt, således at det ene hjørne hænger 1 mm ud for den øverste eller nederste kant af glideren. Hvis du efterlader et udhæng, bliver det lettere at knække dækslet af efter frysning (figur 2C).
- Sæt rutsjebanen på bænken og fix i præcis 5 min ved RT. I løbet af denne tid skal du mærke diaset med en blyant.
BEMÆRK: Det er almindeligt at overfiksere prøverne, som kan detekteres ved udelukkelse af antistof fra kerner eller endda alle væv. Derudover er nogle antistoffer særligt følsomme over for formaldehyd. I disse tilfælde reduceres fikseringstiden, eller den endelige koncentration af formaldehyd reduceres.
- Fryse-revne
- Umiddelbart efter rettelsen skal du fryse diasene.
- Hvis du bruger flydende nitrogen: Hold den mærkede kant af diaset med pincet og sænk den forsigtigt til flydende nitrogen. Slip glideren således, at den læner sig mod bægerglassets side med dæksiden opad. Dias fryses inden for 10 s (når væsken holder op med at koge).
- Hvis du bruger tøris: skrab frosten af overfladen af aluminiumsblokken med en barbermaskine. Hold godt fast i den mærkede kant af glideren, og sæt den på den ryddede overflade, og tryk lidt nedad for at sikre fuld kontakt med blokken. Dækslippet skal være helt på blokoverfladen. Frysning sker inden for 10 s og kan bekræftes visuelt, når prøven under dækslikket bliver til is.
- For begge metoder skal du lade diasene stå i mindst 5 minutter for at fryse helt.
BEMÆRK: Når de er frosne, kan diasene efterlades i flydende nitrogen eller på blokken i 15-20 minutter, så længe de forbliver frosne. Dette gør det muligt at indsamle flere dias på dette tidspunkt, inden du fortsætter til krakningstrinnet.
- Arbejd hurtigt, knæk dækslet af prøven. Dette trin er tidsfølsomt. Fjern dækslet, og nedsænk glideren i ethanol, før prøven begynder at tø op.
- Fjern det frosne dias (ved hjælp af pincet til flydende nitrogen).
- Tag godt fat i rutsjebanens mærkede korte kant, og støt den ene lange kant mod bænken.
- Med den anden hånd skal du tage godt fat i en barbermaskine og skubbe barbermaskinens kant ned ad rutsjebanen for at vippe dækslet af og væk fra prøven. Dette trin er lidt lettere, hvis dækslippet er placeret med et hjørneudhæng (figur 2C).
- Umiddelbart efter rettelsen skal du fryse diasene.
- Placer straks diaset i en Coplin-krukke, der indeholder 95% ethanol ved RT. Lad diasene stå i ethanol i mindst 5 minutter.
BEMÆRK: Dias kan efterlades i ethanol i et stykke tid - dette gør det muligt at samle flere dias på dette trin, før du fortsætter med at vaske. Slides kan også gemmes på dette trin i flere dage. Ved opbevaring skal Coplin-krukken med dias i ethanol flyttes til -20 °C. - Vask diasene i PBS-T tre gange i 5 minutter hver ved RT. Brug frisk PBS-T til hver vask.
- Hvis farvning med antistoffer, fortsæt til trin 3 (antistoffarvning). Hvis du kun pletter med DAPI for at visualisere kromosomer, skal du fortsætte til trin 4 (montering og billeddannelse).
3. Orientering af antistof
- Primær antistofinkubation
BEMÆRK: Når man udarbejder passende betingelser for nye antistoffer, er det vigtigt at inkludere følgende negative kontroller for at verificere specificiteten af det fluorescerende signal: 1) Et dias, der mangler et primært antistof og kun har et sekundært antistof; 2) et dias med et primært antistof, der kun mangler et sekundært antistof. Hver af disse negative kontroller bør producere en fuldstændig mangel på signal. Hvis fluorescens identificeres på det sekundære antistofdias, skal den sekundære antistoffortynding øges, eller der skal anvendes en anden sekundær. Hvis fluorescens identificeres på det primære antistof-kun dias, skyldes det sandsynligvis autofluorescens eller andre potentielle forurenende stoffer.- Fortynd det primære antistof i antistoffortyndingsbuffer (50 mg BSA + 50 μL 10% natriumazid + 10 ml PBS-T ) - forbered nok antistoffortynding til at bruge 20-30 μL pr. Dias.
- Forbered et fugtigt kammer: Beklæd bunden af en plastbeholder med et lufttæt låg med fugtige papirhåndklæder. Læg et enkelt lag pasteurpipetter i glas oven på køkkenrullerne. Disse pipets skaber en overflade, der gør det muligt for diasene at forblive jævne og holder dem hævet fra papirhåndklæderne.
BEMÆRK: Til fugtige kamre er det bedst at bruge plastbeholdere til opbevaring af mad med snaplåg, hvilket gør det lettere at åbne og lukke beholderen uden at forstyrre diasene indeni. Kig efter en, der er lang nok til Pasteur-pipeterne, men også har en relativt flad bund uden fordybninger, så diasene kan hvile helt vandret. - Fjern glideglasset fra den sidste PBS-T-vask. Arbejd hurtigt fra dette trin fremad for at holde prøven våd til enhver tid og undgå fordampning. Hvis prøven tørrer ud, vil antistoffarvning blive påvirket negativt.
- Tør hele overfladen af diaset ved hjælp af et aftørringsvæv foldet ind i et kompakt rektangel. Tør forsiden og bagsiden af diaset af, men efterlad masser af plads omkring prøven. Vær særlig forsigtig, når du tørrer overfladen nær prøven - undgå at komme for tæt på prøven, hvilket efterlader et område på størrelse med dækslet utørret. Sørg dog for, at prøvens omkreds er tør i det næste trin.
- Tegn en cirkel rundt om prøven ved hjælp af en hydrofob PAP-pen. Vær forsigtig med at omslutte hele prøveområdet, men undgå at forstyrre dyrekroppe, der er synlige på overfladen af diaset. Vent på ~ 5 s for at lade barrieren tørre helt.
BEMÆRK: En hydrofob barriere er nødvendig for at indeholde den primære antistofopløsning, fordi overfladen af diaset er belagt med PBS-T, som indeholder et vaskemiddel. PAP-pennen fungerer bedst på en tør glideflade, så det er vigtigt at skabe en tør omkreds omkring prøven. Hvis det område, der er tættest på prøven, forbliver utørret i løbet af dette trin - Arbejd hurtigt, brug hjørnet eller kanten af det foldede aftørringsvæv til at transportere væske væk fra prøven inden for den hydrofobe barriere. Pas på at undgå at forstyrre dyrekroppe.
- Umiddelbart pipetteres 20 μL af den primære antistofopløsning ind i ringen skabt af den hydrofobe barriere. Pas på at pipettere forsigtigt og i en vinkel for at forhindre forstyrrende slagtekroppe. Undgå pipettering direkte på kadaver.
- Vip glideren forsigtigt for at sikre, at hele overfladen inden for den hydrofobe barriere er dækket af opløsningen.
BEMÆRK: Det er bedst, hvis de hydrofobe barrierer har en indvendig omkreds på 1-1,5 cm, som er fuldt dækket af 20 μL af antistofopløsningen. Omkredsbredden afhænger af, hvordan slagtekroppene fordeles under fryserevnetrinnet. Bredere barrierer kan kræve en større mængde antistofopløsning. Hvis det ønskes, kan små firkanter af parafilm (skåret til størrelsen af 18 mm x 18 mm dækslip) forsigtigt placeres oven på prøven. Parafilm-firkanterne sikrer, at antistofopløsningen dækker hele prøven og hjælper også med at forhindre fordampning. - Gentag trin 3.1.3-3.1.8 for resten af slides.
- Overfør forsigtigt diasene til det fugtige kammer, og sørg for, at opløsningen forbliver indeholdt i den hydrofobe barriere, og at dias hviler helt plant.
- Inkubere diasene natten over ved RT. Afhængigt af antistoffet kan dette trin forkortes til 6 timer eller udføres natten over ved 4 ° C ved at holde det fugtige kammer i et koldt rum eller et køleskab.
BEMÆRK: Brug af et fugtigt kammer og hydrofobe barrierer er normalt tilstrækkeligt til at forhindre fordampning af antistofopløsningen, selv for lange inkubationer natten over. Men hvis fordampning viser sig at være et problem, kan små firkanter af parafilm placeres forsigtigt på hver prøve, hvilket vil hjælpe med at forhindre fordampning. Disse kan fjernes i det første vasketrin: nedsænk hvert dias i en Coplin-krukke fyldt med PBS-T (indeholder ingen andre dias), og lad parafilmen flyde væk fra prøven. Fjern parafilmen fra Coplin-krukken, før du bruger den samme krukke til at fjerne parafilmen fra det næste dias.
- Vask diasene i Coplin-krukker, der indeholder ~ 40 ml PBS-T tre gange i 5 minutter hver ved RT. Brug frisk PBS-T til hver vask.
- Under disse vasker fortyndes det sekundære antistof i antistoffortyndingsbuffer. Forbered nok antistoffortynding til at bruge 20-30 μL pr. Dias. Det er almindeligt at bruge Alexa Fluor konjugerede sekundære antistoffer fortyndet ved 1:200.
- Sekundær antistofinkubation
- Fjern glideglasset fra den sidste PBS-T-vask. Arbejd hurtigt fra dette trin fremad for at holde prøven våd til enhver tid og undgå fordampning.
- Tør diaset ved hjælp af et foldet aftørringsvæv. Undgå at tørre det område, der er indeholdt af den hydrofobe barriere.
- Arbejd hurtigt, brug hjørnet eller kanten af det foldede aftørringsvæv til at transportere væske væk fra prøven inden for den hydrofobe barriere. Pas på at undgå at forstyrre dyrekroppene.
- Umiddelbart pipetteres 20 μL af den sekundære antistofopløsning ind i ringen skabt af den hydrofobe barriere. Pas på at pipettere forsigtigt og i en vinkel for at forhindre afbrydelse af slagtekroppene.
- Undgå pipettering direkte på kadaver. Sørg for, at hele overfladen i den hydrofobe barriere er dækket af opløsningen. Bredere barriereomkredse kan kræve et større volumen antistofopløsning. Hvis det ønskes, skal prøven dækkes med en lille firkant parafilm (se bemærkningen nedenfor, trin 3.1.8).
- Overfør forsigtigt glideren til det fugtige kammer, og sørg for, at opløsningen forbliver indeholdt i den hydrofobe barriere, og at glideren hviler helt plant. Sæt låget på det fugtige kammer på igen for at holde rutsjebanen i mørke.
- Gentag trin 3.3.1-3.3.6 for resten af slides.
- Inkuber i mørket i 4 timer ved RT.
BEMÆRK: Afhængigt af antistoffet kan dette trin forkortes til 2 timer eller udvides til 6 timer. Hvis det fugtige kammer ikke er mørkt, skal du placere det i en skuffe eller dække det med en papkasse. Alternativt kan det fugtige kammer pakkes ind i aluminiumsfolie for at holde lysbillederne i mørke.
- Vask diasene i Coplin-krukker, der indeholder ~ 40 ml PBS-T tre gange i 5 minutter hver ved RT. Brug frisk PBS-T til hver vask.
4. Montering og billeddannelse
- Forbered montering af prøven ved at have monteringsmedium + DAPI (2 μg/ml), 18 mm x 18 mm glasdæksler og neglelak inden for rækkevidde.
- Fjern glasset fra den endelige vask og tør med et foldet aftørringsserviet. Undgå at tørre det område, der er indeholdt af den hydrofobe barriere.
- Brug hjørnet af det foldede aftørringsvæv til forsigtigt at transportere væske væk fra prøven inde i barrieren. Fjern det meste væske på dette trin, men uden at lade slagtekroppene tørre helt ud.
- Arbejd hurtigt, tilsæt 8 μL af monteringsmediet til prøven. Pipet forsigtigt og i en vinkel for at forhindre afbrydelse af slagtekroppene. Undgå pipettering direkte på slagtekroppene.
- Stadig arbejder hurtigt, sænk forsigtigt en glasdæksel på prøven.
- Luftbobler kan forstyrre billeddannelsen og føre til nedbrydning af prøver. For at minimere luftbobler skal du hvile den ene kant af dækslippet på glideren ved siden af prøven, så den holdes skråt over prøven. Det kan hjælpe med at hvile den højere kant af coverslip på en blyant eller pincet. Sænk derefter langsomt den højere kant af dækslet ned - denne bevægelse gør det muligt for monteringsmediet at skabe en flydende tætning, der skrider frem fra den ene kant til den modsatte kant.
- Gentag trin 4.2-4.5 for resten af slides.
- Forsegl dækslerne med neglelak. Pas på at undgå at trykke ned på dækslippet (som vil knuse prøven) eller løsne dækslippet vandret (som vil smøre prøven).
- Tilføj en lille prik neglelak til hvert hjørne af en dækslip (~ 1 mm bred). Disse hjælper med at holde dækslippet på plads. Lad prikkerne tørre helt.
- Når hjørnerne er helt tørre, forsegles kanterne med neglelak. Sørg for, at poleringen fuldstændigt udfylder hullet mellem dækslen og glideren, men undgå at dække dækslet for meget. Det er bedst at opretholde en 1 mm overlapning på dækslippen. Brug kun så meget neglelak, som det er nødvendigt. Undgå at bruge for meget eller have overskydende polering, som kan tage lang tid at tørre og risikerer at beskadige mikroskopmålet.
BEMÆRK: Det foretrækkes at bruge farvet neglelak i stedet for klar, hvilket gør det lettere at se sælens grænse og hjælper med at forhindre billeddannende dyr, der ligger under neglelakgrænsen. - Lad neglelakken tørre helt inden billeddannelse. Dette trin er vigtigt, da våd neglelak kan skade mikroskopmålene alvorligt.
BEMÆRK: Dias skal opbevares i mørke så meget som muligt herfra. Brug en flad papkasse til at dække dem, når de tørrer på bænken.
- Opbevar lysbillederne i mørke ved 4 °C i 1-2 uger før billeddannelse. Opbevar om nødvendigt diasene ved -20 °C i længere tid.
- Billede ved hjælp af standard fluorescensforbindelse lysmikroskopi.
- For hvert dias skal du først undersøge hele prøven ved 10x i DAPI-kanalen for at identificere godt ekstruderede gonader og notere deres placering. Til de fleste applikationer skal du undgå at afbilde gonader, der er afskåret, ufuldstændige eller delvist dækket af en anden del af dyret. For de fleste dyr vil kun en gonadarm være fuldt ekstruderet og synlig.
BEMÆRK: Det kan være nyttigt at tage et billede med lavere forstørrelse ved 10x af hele gonaden i DAPI-kanalen til brug for senere orientering eller identificere placeringen af specifikke kerner. - Afhængigt af applikationen kan billeder tages ved 40x, 63x eller 100x. Hvis hele gonaden skal fanges, skal du oprette en montage med overlappende grænser. Mens du forestiller dig, skal du huske, at gonaden er et hult rør med kerner mest tætte øverst og nederst.
- For hvert dias skal du først undersøge hele prøven ved 10x i DAPI-kanalen for at identificere godt ekstruderede gonader og notere deres placering. Til de fleste applikationer skal du undgå at afbilde gonader, der er afskåret, ufuldstændige eller delvist dækket af en anden del af dyret. For de fleste dyr vil kun en gonadarm være fuldt ekstruderet og synlig.
Representative Results
DAPI binder sig stærkt til DNA, og dets farvning er robust selv under en lang række forhold (figur 3A, B). Det skal være til stede i alle kerner og gør derfor en effektiv positiv kontrol for tilstedeværelsen af ethvert ormvæv på diaset og evnen til at detektere fluorescens på mikroskopet. Farvning er effektiv, når antistoffet er til stede i meiotiske kerner (figur 3A, B). For eksempel viser figur 3A, B mid-pachytenkerner farvet med DAPI og et antistof rettet mod RAD-51, en markør for dobbeltstrengsbrud. KLE-2 er en bestanddel af condensin, et stærkt konserveret proteinkompleks, der strukturerer kromosomer som forberedelse til mitose og meiose. kle-2/+ mutanter har mindre defekter i kromosomstrukturen, som det fremgår af let uordnet DAPI-farvning og en stigning i dobbeltstrengsbrudstallet afspejlet i det højere antal RAD-51 foci (figur 3B). En almindelig fejl for immunfluorescens er at lade prøven stå i fixopløsningen for længe. Overfiksering kan føre til mislykket farvning, fordi det normalt forhindrer antistoffer i at diffundere ind i kerner. Denne fejl kan identificeres, når antistoffet diffunderes i gonadens cytoplasmatiske områder, men synes at være udelukket fra kerner.
I kimlinjen (figur 1) spredes kerner mitotisk ved den distale spids, indtaster meiose under overgangszonen og skrider frem gennem pachyten (som ofte er opdelt i tre lige store trin med et antal kernerækker), inden de går ind i diploten og til sidst diakinese. Oocytter i diakinese nummereres baseret på deres nærhed til spermatheca, hvor -1 oocyten er mest proximal til spermatheca, -2 oocyt er den næste distal osv. C. elegans har seks kromosomer, som manifesterer sig som kompakte ovaler i diakinesiskerner. Hver af disse repræsenterer et homologt par af to søsterkromatider, der holdes sammen af en chiasma, også kaldet en bivalent (figur 3C). Mutanter, som spo-11, der forstyrrer crossover-dannelse, vil ikke danne chiasmata; derfor vil diakinesiskerner have 12 separate DAPI-legemer (også kaldet univalente), en for hver søsterkromatid (figur 3D).
Figur 1: Kimlinjekerner er opstillet på en rumlig-tidsmæssig måde, der repræsenterer deres progression gennem meiose . (A) Helmonteret ung voksen hermafrodit farvet med DAPI. Gonad og meiotiske stadier er skitseret, fra den distale spids (stjerne) til den proksimale region (-1 oocyten, angivet med en pil), som indeholder spermatheca (trekant). Skalabjælke repræsenterer 100 μm. (B) Projiceret fluorescensbillede af en dissekeret hermafroditgonad farvet med DAPI. Meiotiske stadier er betegnet, med repræsentative kerner vist i indsatser (alle indsatser er vist at skalere med hinanden). Kerner kan let iscenesættes baseret på deres placering i kimlinjen og karakteristisk kromosommorfologi, der udvikler sig fra den mitotiske zone ved den distale spids (stjerne) til overgangszonen gennem pachyten, diploten og diakinesis. Spermatheca er markeret med en trekant. Dette tal er tilpasset fra Hillers et al. under licens CC BY 3.028. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Demonstration af dissektionsopsætning . (A) Mikroskopfase under dissektion. Dyr dissekeres i 4 μL dissektionsopløsning på en dækslip placeret på holdeglasset, som bruges til at flytte dækslippet til syne. Diagrammet viser ideel nåleplacering. Nåle holdes med en skrå kant nedad, krydset over svælgområdet. Lyserøde pile viser en sakslignende bevægelse for nåle. Den lyserøde stiplede linje viser den ideelle snitplacering. (B) Billeder af dissekerede dyr med et eksempel på en fuld ekstrudering og en ufuldstændig ekstrudering. Sektioner af ekstruderede gonader og tarme er mærket. (C) Billede, der viser fryse-crack-trinnet. Glideren skal holdes fast i den ene hånd, med dæksiden vendt væk fra kroppen. Den modsatte kant er afstivet mod bænken. Barbermaskinen skal holdes i den anden hånd. Den lyserøde pil angiver bevægelsesretningen for barbermaskinen for at svirpe dækslikket af diaset med en let drejning, så dækslippet svirper væk fra kroppen. Bemærk, at dækslet er placeret således, at det ene hjørne hænger over den lange kant af rutsjebanen. (D) Billede af opsætningen til dissektionspraksis i en glasembryofarvningsskål. Dyr placeres i 50-200 μL dissektionsopløsning, hvilket negerer problemet med fordampning og forlænger tiden for dissektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative fluorescensresultater af kimlinjekerner. (A,B) Z-stack fremskrivninger af sene pachytenkerner farvet med RAD-51 antistof (grøn) og DAPI (rød) i (A) vildtype og (B) kle-2/+ heterozygoter. (C,D) Z-stack fremspring af en enkelt diakinesekerne farvet med DAPI i (C) vildtype (med seks DAPI-farvningslegemer) og (D) spo-11-mutanter (med 12 DAPI-farvningslegemer). Skalabjælker repræsenterer 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Seksuel reproduktion kræver oprettelse af haploide gameter, som produceres via den specialiserede celledeling af meiose. C. elegans er blevet en populær model for den cytologiske undersøgelse af meiose på grund af dens optiske gennemsigtighed, bekvemme kimlinjeanatomi og kraftfulde genetik28. Enkle organismeeksperimenter, der vurderer fertilitet og embryonal dødelighed, kan kombineres med molekylær genetik for at løse mange spørgsmål i laboratoriet eller klasseværelset. For eksempel, fordi crossovers er afgørende for korrekt kromosomadskillelse, vil processer, der forstyrrer deres dannelse eller opløsning, generere aneuploide gameter. Til gengæld fører aneuploidi til inviable afkom, som let kan vurderes ved at tælle afkom eller gennem den lidt mere komplicerede metode til bestemmelse af embryonal dødelighed. Cytologisk vil mangel på crossovers påvirke antallet af DAPI-farvningslegemer observeret under diakinese. Robustheden af DAPI-farvning og den lette scoring gør dette til et ideelt eksperiment til at undervise i cytologiske teknikker. Det tidsmæssige-rumlige layout af kerner i hermafroditkimlinjen giver et øjebliksbillede af hvert trin af meiose på et enkelt tidspunkt. Kerner tager cirka 54 timer at gå fra den distale mitotiske ende af kimlinjen til den proksimale ende (se eksempler Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 og Libuda et al.35). Denne veletablerede timing af meiotiske fremskridt giver mulighed for pulsjagtmærkning eller DNA-skadelige eksperimenter.
Fordi DAPI-farvning næsten altid virker, fungerer det som en nyttig teknisk kontrol til fluorescensmikroskopi (og kan give tilfredshed for mikroskopere under uddannelse). Antistoffarvning kan være mere variabel og er et godt mål for reproducerbarhed mellem replikater. C.elegans gonader kan være vanskelige at rette konsekvent, da dette trin kræver en balance mellem at bevare kromosomal struktur og samtidig tillade tilstrækkelig antistofdiffusion. Fastgørelse med formaldehyd bevarer bedst kromosomal morfologi og tilberedning af formaldehyd frisk fra paraformaldehydampuller har givet de mest reproducerbare resultater. Det er også muligt at anvende formaldehyd fremstillet af formalin (37% vandig formaldehyd og methanol). Fikseringsstyrke og timing skal muligvis bestemmes empirisk for hvert antistof. Alternative metoder involverer spring over formaldehydfikseringen i trin 2.4 og efter fryse-revne, nedsænkning i 100% ethanol ved -20 ° C eller nedsænkning i 100% methanol i 10 minutter efterfulgt af nedsænkning i 100% acetone i 10 minutter ved -20 ° C. Disse fikseringsbetingelser tillader bedre antistofpenetration, men vil påvirke vævsmorfologien negativt (kromosomer vil se blæste og puffere ud).
Timing er meget vigtig for dissektions- og rettelsestrinnene, der er beskrevet i trin 2. Fordi mængden af dissektionsopløsning er så lille, kan fordampning påvirke den endelige fikseringskoncentration, hvilket vil forårsage variabel antistoffarvning. En erfaren C. elegans-handler kan forberede et dias på mindre end 2 minutter fra starten (trin 2.3) for at rette (trin 2.4). Den vigtigste tekniske forhindring er evnen til at plukke dyr i dråben af dissektionsopløsning og hurtigt dissekere dem. Det kan være lettere at lære at dissekere i større mængder. Nye praktikanter starter først med at plukke dyr i 50-200 μL dissektionsopløsning i en glasembryofarvningsskål (figur 2D); Den bredere overflade giver mere manøvrerum, når man identificerer en ideel nåleposition til gode gonadekstruderinger, mens det større volumen væske gør fordampning mindre af et problem. Når eleverne er fortrolige med dissekeringsbevægelserne, begynder de at dissekere ved kun at bruge 50 μL i skålen og skifter derefter til dissekering i 20 μL på et dias. Når de har dissekeret på dias, kan praktikanter hurtigt begynde at reducere mængden af opløsning, indtil de er hurtige nok til at arbejde i 4 μL til at gøre fordampning ubetydelig.
Hvis tidspunktet for dissektion fortsat er et problem, kan praktikanter dissekere i 8 μL af dissektionsopløsningen under trin 2.3. Derefter kan de i trin 2.4 tilsætte 8 μL af fikseringsopløsningen, forsigtigt pipettere for at blande grundigt (se nøje for at sikre, at slagtekroppe ikke forstyrres eller pipetteres væk) og fjerne 8 μL fra den blandede opløsning. Denne alternative fremgangsmåde vil resultere i det samme endelige volumen på 8 μL og den samme endelige fikseringskoncentration; Dette volumen er vigtigt for at sikre, at slagtekroppen kommer i kontakt med både dækslen og glidefladen under fryserevnen i trin 2.5. Hvis tidspunktet for forberedelse af hvert dias forbliver et problem selv i større dissektionsvolumener, beskrives en suspensionsmetode til kimlinjeimmunfluorescensprotokol af Gervaise og Arur26.
Den største begrænsning ved at bruge immunfluorescens til at visualisere proteiner in situ er tilgængeligheden af primære antistoffer rettet mod et bestemt protein af interesse. Men hvis der er udviklet en mærket version af proteinet, kan denne protokol tilpasses til at visualisere proteinmærket. Antistoffer rettet mod almindelige tags, som FLAG, HA eller GFP, er almindeligt tilgængelige. Fluorescerende tags som GFP kan ofte slukkes ved fikseringstrin, så det anbefales at bruge et primært antistof rettet mod GFP i stedet for at stole på selve det oprindelige fluorescenssignal. En anden begrænsning af denne protokol er, at den fanger kimlinjen inden for en enkelt tidsramme (selvom alle stadier af oogenese vil være repræsenteret inden for kimlinjen). Derfor kan denne teknik gå glip af dynamiske ændringer, der kan opstå, når en oocyt skrider frem gennem oogenese. Imidlertid er tidspunktet for gametogenese blevet godt undersøgt i C. elegans; I en vildtype ung voksen tager en oocyt ca. 60 timer at udvikle sig fra den distale spids af kimlinjen (den mitotiske zone) til diakinese33. Derfor vil en pulsjagt eller specifik intervention som bestråling efterfulgt af et tidsforløb give mulighed for observation af virkninger på forskellige stadier af meiose.
Afslutningsvis beskriver denne protokol C. elegans gonaddissektion efterfulgt af DAPI og antistoffarvning til fluorescensmikroskopi. Dissektion og fastgørelse (trin 2) tager 60-90 min, afhængigt af antallet af genererede dias. Antistoffarvning (trin 3) er for det meste hands-off og kan variere fra 7 timer mindst til 1,5 dage afhængigt af antistofinkubationstider. Montering (trin 4.1-4.7) tager ca. 15 min. Denne generelle tilgang til visualisering af kimlinjekromosomer og gonaden kan bruges til cytologiske undersøgelser af ethvert protein, hvis der findes et antistof eller fluorescerende tagreagens. I sin enkleste form kan DAPI-farvning af diakinesekerner bruges til at screene for faktorer, der påvirker meiotisk rekombination. Når det kombineres med organismeanalyser af afkomsantal, forekomsten af mænd (Him-fænotype) og embryonal dødelighed, giver denne cytologiske tilgang et enkeltcelle-kontrapunkt til populationsbaserede analyser.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse. Indholdet i dette manuskript er udelukkende forfatternes ansvar. Det repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health eller National Science Foundation.
Acknowledgments
Arbejdet i Lee-laboratoriet blev støttet af National Institute of General Medical Sciences under tildelingsnummer 1R15GM144861 og National Institute for Child and Human Development under tildelingsnummer 1R15HD104115, begge af National Institutes of Health. DA blev støttet af UML Kennedy College of Sciences Science Scholars-programmet. NW blev støttet af et UML Honors College Fellowship og et UMLSAMP-stipendium (finansieret af National Science Foundation under tilskudsnummer HRD-1712771). Vi takker A. Gartner for RAD-51 antistof. Alle C. elegans stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som er finansieret af Office of Research Infrastructure Programs fra National Institutes of Health under tildelingsnummerP40 OD010440.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | Molecular Probes | 711-545-152 | |
| Aluminum heating/cooling block | Millipore Sigma | Z743497 | |
| Bacto Peptone | Gibco | DF0118 17 0 | |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches | Fisherbrand | 13 678 20B | Used to make worm picks |
| BSA, Bovine Serum Albumin | VWR | 97061 420 | |
| C. elegans wild type (ancestral) | Caenorhabditis Genetics Center | N2 (ancestral) | |
| C. elegans kle-2 (ok1151) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | VC768 | The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants. |
| C. elegans spo-11 (me44) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | TY4342 | The full genotype of this strains is: spo-11(me44) IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants. |
| Calcium Chloride Anhydrous | VWR | 97062 590 | |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | 501848300 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| EDTA, Disodium Dihydrate Salt | Apex Bioresearch Products | 20 147 | |
| Embryo Dish, glass, 30mm cavity | Electron Microscopy Services | 100492-980 | Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Food storage container, plastic | various | n/a | Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred |
| Glass Coplin Jar | DWK Life Sciences Wheaton | 08-813E | |
| Hydrophobic Barrier PAP Pen | ImmEdge | NC9545623 | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 06 666A | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma Aldrich | L0380000 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Fisher Chemical | M65 500 | |
| Needles, Single-use, 25 G | BD PrecisionGlide | 14 821 13D | blue, 1 inch |
| NGM Agar, Granulated | Apex Bioresearch Products | 20 249NGM | |
| Parafilm | Bemis | 16 101 | |
| Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 50 980 487 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) | Fisher BioReagents | BP399500 | |
| Petri Dishes, 60-mm | Tritech Research | NC9321999 | Non-vented, sharp edge |
| Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) | Tritech Research | PT 9010 | Used to make worm picks |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR BDH Chemicals | BDH9266 500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR BDH Chemicals | BDH9268 500G | |
| Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm | Fisherbrand | 12-548-AP | 0.13–0.17 mm thickness |
| Razor Blades, Single Edge | VWR | 55411 055 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | S36937 | Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging. |
| Sodium Azide | Fisher BioReagents | BP922I 500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Sigma Aldrich | 7558 79 4 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Sigma Aldrich | S9390 | |
| Styrofoam box | various | n/a | Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 22 037 246 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 500 | |
| Tryptone | Apex Bioresearch Products | 20 251 | |
| Tween 20 | Fisher Chemical | BP337 500 | |
| Yeast Extract | Apex Bioresearch Products | 20 254 |
References
- Newman, D. L., Wright, L. K. Meiosis: A play in three acts, starring DNA sequence. CourseSource. 4, (2017).
- Ohkura, H. Meiosis: An overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), 015859 (2015).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Keeney, S., Giroux, C. N., Kleckner, N. Meiosis-specific DNA double-strand breaks are catalyzed by Spo11, a member of a widely conserved protein family. Cell. 88 (3), 375-384 (1997).
- Rabitsch, K. P., et al. Kinetochore recruitment of two nucleolar proteins is required for homolog segregation in meiosis I. Developmental Cell. 4 (4), 535-548 (2003).
- Brown, C. R. Some misconceptions in meiosis shown by students responding to an advanced level practical examination question in biology. Journal of Biological Education. 24 (3), 182-186 (1990).
- Kalas, P., O'Neill, A., Pollock, C., Birol, G. Development of a meiosis concept inventory. CBE-Life Sciences Education. 12 (4), 655-664 (2013).
- McDonnel, L. M., Klenz, J. Teaching genetic linkage and recombination through mapping with molecular markers. CourseSource. 2, (2015).
- Wright, L. K., Cortez, P., Franzen, M. A., Newman, D. L. Teaching meiosis with the DNA triangle framework: A classroom activity that changes how students think about chromosomes. Biochemistry and Molecular Biology Education. 50 (1), 44-54 (2021).
- Shortlidge, E. E., Bangera, G., Brownell, S. E. Each to their own CURE: Faculty who teach course-based undergraduate research experiences report why you too should teach a CURE. Journal of Microbiology & Biology Education. 18 (2), 18 (2017).
- Auchincloss, L. C., et al. Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report. CBE-Life Sciences Education. 13 (1), 29-40 (2014).
- Lee, T. W., Carpenter, B. S., Birol, O., Katz, D. J., Schmeichel, K. L. The pipeline CURE: An iterative approach to introduce all students to research throughout a biology curriculum. CourseSource. 6, (2019).
- Lu, F. -M., Eliceiri, K. W., Stewart, J., White, J. G. WormClassroom.org: an inquiry-rich educational web portal for research resources of Caenorhabditis elegans. CBE Life Sciences Education. 6 (2), 98-108 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- JoVE Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- JoVE. Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. C. elegans Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- Lee, R. Web resources for C. elegans studies. WormBook. , (2005).
- JoVE. Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. RNAi in C. elegans. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35 (2019).
- Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 15 (1), 44-55 (2016).
- Kowalski, J. R., Hoops, G. C., Johnson, R. J. Implementation of a collaborative series of classroom-based undergraduate research experiences spanning chemical biology, biochemistry, and neurobiology. CBE-Life Sciences Education. 15 (4), 55 (2016).
- Mordacq, J., Drane, D., Swarat, S., Lo, S. Research and teaching: Development of course-based undergraduate research experiences using a design-based approach. Journal of College Science Teaching. 46 (4), (2017).
- Palmisano, N. J., et al. A laboratory module that explores RNA interference and codon optimization through fluorescence microscopy using Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 344069 (2021).
- Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. Analysis of meiotic recombination in Caenorhabditis elegans. Meiosis. 557, 77-97 (2009).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis. 558, 171-195 (2009).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and temporal analysis of active ERK in the C. elegans germline. Journal of Visualized Experiments. (117), e54901 (2016).
- Shakes, D. C., Miller, D. M., Nonet, M. L.
- Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L.
- Hunter, A. -B., Seymour, E., Laursen, S., Thiry, H., Melton, G. Undergraduate Research in the Sciences: Engaging Students in Real Science. , John Wiley & Sons. (2010).
- Wei, C. A., Woodin, T. Undergraduate research experiences in biology: Alternatives to the apprenticeship model. CBE-Life Sciences Education. 10 (2), 123-131 (2011).
- Elgin, S. C. R., et al. Insights from a convocation: Integrating discovery-based research into the undergraduate curriculum. CBE-Life Sciences Education. 15 (2), (2016).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. Elegant. WormBook. , ed. The C. elegans Research Community (2006).
- Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
- Stamper, E. L., et al. Identification of DSB-1, a protein required for initiation of meiotic recombination in Caenorhabditis elegans, illuminates a crossover assurance checkpoint. PLoS Genetics. 9 (8), 1003679 (2013).
- Libuda, D. E., Uzawa, S., Meyer, B. J., Villeneuve, A. M. Meiotic chromosome structures constrain and respond to designation of crossover sites. Nature. 502 (7473), 703-706 (2013).
