Dette er en almindeligt anvendt metode til C. elegans gonaddissektion efterfulgt af frysecrack, som producerer kimlinjeprøver til immunfluorescens via antistoffarvning eller til simpel DAPI-farvning for at visualisere DNA. Denne protokol har været vellykket for studerende i et forskningslaboratorium og i en kursusbaseret bachelorforskningserfaring.
C. elegans kimlinjen er en fremragende model til undersøgelse af meiose, dels på grund af den lette udførelse af cytologiske analyser på dissekerede dyr. Hele monteringspræparater bevarer strukturen af meiotiske kerner, og vigtigst af alt indeholder hver gonadarm alle stadier af meiose, organiseret i en tidsmæssig-rumlig progression, der gør det let at identificere kerner på forskellige stadier. Voksne hermafroditter har to gonadarme, hver organiseret som et lukket rør med prolifererende kimlinjestamceller i den distale lukkede ende og cellulariserede oocytter i den proksimale åbne ende, som slutter sig til midten ved livmoderen. Dissektion frigiver en eller begge gonadarme fra kropshulen, så hele meiosen kan visualiseres. Her præsenteres en fælles protokol for immunfluorescens mod et protein af interesse efterfulgt af DAPI-farvning for at markere alle kromosomer. Unge voksne immobiliseres i levamisol og dissekeres hurtigt ved hjælp af to sprøjtenåle. Efter ekstrudering af kimlinjer fastgøres prøven, inden den gennemgår en frysesprække i flydende nitrogen, som hjælper med at gennemtrænge neglebåndet og andre væv. Prøven kan derefter dehydreres i ethanol, rehydreres og inkuberes med primære og sekundære antistoffer. DAPI tilsættes til prøven i monteringsmediet, hvilket muliggør pålidelig visualisering af DNA og gør det nemt at finde dyr til billede under et fluorescerende mikroskop. Denne teknik anvendes let af dem, der er bekendt med håndtering af C. elegans efter et par timer brugt på at øve selve dissektionsmetoden. Denne protokol er blevet undervist til gymnasieelever og studerende, der arbejder i et forskningslaboratorium og indarbejdet i en kursusbaseret bachelorforskningserfaring på et liberal arts college.
Meiose er den specialiserede celledeling, der bruges til at skabe kønsceller (æg og sæd / pollen) i alle seksuelt reproducerende organismer 1,2. Crossover-rekombination er den gensidige udveksling af DNA mellem homologe kromosomer; Det er afgørende for meiose, der både giver en vigtig kilde til genetisk mangfoldighed og fremmer genomstabilitet gennem generationer. Kromosomer, der ikke danner mindst en crossover under meiose, adskilles tilfældigt, hvilket kan resultere i kromosomikker, der ikke er disjunktion, hvilket skaber kønsceller med det forkerte antal kromosomer – en tilstand, der normalt er dødelig for resulterende afkom3. Under meiose induceres crossovers af programmerede dobbeltstrengede DNA-pauser4. En delmængde af disse pauser vil blive repareret som crossovers, der giver fysiske forbindelser af DNA, kaldet chiasmata, der hjælper med at orientere homologe kromosomer som forberedelse til celledeling5. Meiotiske stadier er stærkt bevaret på tværs af alle eukaryoter, og deres kromosomale konformation gør det let at identificere dem.
Som et grundlæggende koncept i biologi er meiose et emne, som eleverne støder på flere gange i forskellige biologikurser. De introduceres ofte til mekanikken i meiotisk kromosomadskillelse i gymnasiet, mens kurser på college-niveau fokuserer på segregerings cellebiologi og den genetiske virkning af crossover-rekombination. Meiose er dog et notorisk vanskeligt koncept for mange studerende1. En manglende forståelse af forholdet mellem gener, DNA, kromosomer og meiose kan generere studerendes misforståelser og huller i forståelsen, der hindrer en fuld forståelse af genetisk arv 6,7. En måde at forbedre elevernes forståelse af abstrakte emner på er at give konkrete, praktiske aktiviteter. For eksempel, når de underviser i meiose, kan instruktører vælge mellem aktiviteter, der efterligner molekylær analyse8, 3D-modeller, der giver eleverne mulighed for at manipulere molekyler9, eller rollespil, hvor eleverne selv udfører den molekylære koreografi1. Inkorporering af forskning med ukendte resultater er en særlig effektiv måde at forbedre elevernes forståelse på. Denne praksis er kendt som en kursusbaseret bachelorforskningserfaring (CURE) og har den ekstra fordel at styrke studerendes holdninger og agentur, især for dem, der tilhører grupper, der forbliver underrepræsenteret i STEM10,11. Nematodeormen Caenorhabditis elegans er særligt modtagelig for klasseværelsesstudier af adfærd, fertilitet og genetiske kryds og er en effektiv model til at introducere eleverne til biologisk forskning12.
C. elegans fremstiller en kraftfuld modelorganisme for cellebiologi ved at kombinere molekylær genetik med simpel cytologisk analyse. Det er også særligt velegnet til brug i et biologi klasseværelse 13,14,15. De er nemme og økonomiske at vedligeholde i et laboratorium og producerer hundredvis af afkom hver 3. dag, både ved standard stuetemperatur eller ved 20 °C, den mest almindelige inkubationstemperatur. Det er vigtigt, at de kan fryses som glycerollagre og opbevares i en -80 ° C fryser, hvilket betyder, at eventuelle husdyrbrugsfejl begået af nybegyndere let kan rettes16. Desuden giver dets godt kommenterede genom mulighed for fremadrettede og omvendte genetiske teknikker17,18, hvilket gør det muligt at bruge C. elegans til at løse biologiske spørgsmål lige fra molekylære til evolutionære. Endelig har C. elegans forskere skabt et støttende samfund, der ofte er villig til at yde hjælp og rådgivning til spirende forskere19. Disse fordele har ført til, at C. elegans er blevet indarbejdet i en række CURE’er på forskellige typer institutioner 12,19,20,21,22,23.
Ud over sine fordele for forskning og undervisning er C. elegans blevet en populær model til studier af meiose og kimlinjeudvikling24,25,26. Den optiske klarhed af disse dyr forenkler cytologiske tilgange27, og hos voksne repræsenterer gonader næsten halvdelen af dyret, hvilket giver hundredvis af meiotiske celler til at studere. I gonader er meiotiske kimlinjekerner arrangeret som et samlebånd (figur 1); Mitotisk replikation forekommer ved gonadens distale spids, hvor kerner udvikler sig gennem meiotiske stadier, når de migrerer mod den proksimale ende af gonaden, hvor befrugtede embryoner kommer ud af vulvaen. Fordi den stereotype rumlige organisation også repræsenterer en tidsmæssig progression gennem meiose, kan forskellige stadier let identificeres baseret på deres kromosomale organisation og placering i gonaden. Endelig skaber processer, der forstyrrer meiose og forårsager aneuploidi, fænotyper, der er ligetil at karakterisere, selv for nybegyndere: sterilitet, embryonal dødelighed eller en høj forekomst af mænd (Him fænotype)28.
Dette er en simpel protokol til visualisering af meiotiske kromosomer i C. elegans. Montering, dissektion, fastgørelse og antistoffarvning udføres alle på det samme mikroskopglas, hvilket forenkler protokollen og muliggør næsten perfekt prøvegendannelse. Denne metode fungerer til simpel DAPI-farvning for at visualisere kromosomer og kan bruges til immunfluorescens til at visualisere lokaliseringen af proteiner i gonaden. Studerende dissekerer gonader ved hjælp af grundlæggende dissekeringsmikroskoper, genererer helmonterede præparater til visualisering af DNA eller immunfluorescens og afbilder dem på et sammensat fluorescerende mikroskop. Denne protokol er blevet undervist til gymnasieelever og studerende, der arbejder i et C. elegans forskningslaboratorium og indarbejdet i en CURE på et liberal arts college12. Selv om CURE havde en relativt lille klassestørrelse, ville denne protokol være tilgængelig for klasser på en række institutioner på grund af de relativt lave omkostninger ved ormestammer og reagenser. Instruktører vil kun være begrænset af antallet af dissekerende mikroskoper, der er tilgængelige til brug. Den tidligere implementering fik eleverne til at arbejde i grupper på tre for at dele et enkelt mikroskop og fandt sted over tre 90-minutters sessioner: den første til at øve dissektion, den anden til at implementere dissektion og DAPI-farvning og den tredje til billeddias på et widefield fluorescensmikroskop. Deltagelse i bachelorforskning giver mange fordele for studerende11,29, både akademiske og personlige. Indlejring af forskning i kurser via CURE’er giver eleverne mulighed for at deltage i forskning i normal klassetid11,30,31, hvilket gør eksponering for disse fordele mere tilgængelig og retfærdig.
Seksuel reproduktion kræver oprettelse af haploide gameter, som produceres via den specialiserede celledeling af meiose. C. elegans er blevet en populær model for den cytologiske undersøgelse af meiose på grund af dens optiske gennemsigtighed, bekvemme kimlinjeanatomi og kraftfulde genetik28. Enkle organismeeksperimenter, der vurderer fertilitet og embryonal dødelighed, kan kombineres med molekylær genetik for at løse mange spørgsmål i laboratoriet eller klasseværelset. For eksempel, fordi crossovers er afgørende for korrekt kromosomadskillelse, vil processer, der forstyrrer deres dannelse eller opløsning, generere aneuploide gameter. Til gengæld fører aneuploidi til inviable afkom, som let kan vurderes ved at tælle afkom eller gennem den lidt mere komplicerede metode til bestemmelse af embryonal dødelighed. Cytologisk vil mangel på crossovers påvirke antallet af DAPI-farvningslegemer observeret under diakinese. Robustheden af DAPI-farvning og den lette scoring gør dette til et ideelt eksperiment til at undervise i cytologiske teknikker. Det tidsmæssige-rumlige layout af kerner i hermafroditkimlinjen giver et øjebliksbillede af hvert trin af meiose på et enkelt tidspunkt. Kerner tager cirka 54 timer at gå fra den distale mitotiske ende af kimlinjen til den proksimale ende (se eksempler Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 og Libuda et al.35). Denne veletablerede timing af meiotiske fremskridt giver mulighed for pulsjagtmærkning eller DNA-skadelige eksperimenter.
Fordi DAPI-farvning næsten altid virker, fungerer det som en nyttig teknisk kontrol til fluorescensmikroskopi (og kan give tilfredshed for mikroskopere under uddannelse). Antistoffarvning kan være mere variabel og er et godt mål for reproducerbarhed mellem replikater. C.elegans gonader kan være vanskelige at rette konsekvent, da dette trin kræver en balance mellem at bevare kromosomal struktur og samtidig tillade tilstrækkelig antistofdiffusion. Fastgørelse med formaldehyd bevarer bedst kromosomal morfologi og tilberedning af formaldehyd frisk fra paraformaldehydampuller har givet de mest reproducerbare resultater. Det er også muligt at anvende formaldehyd fremstillet af formalin (37% vandig formaldehyd og methanol). Fikseringsstyrke og timing skal muligvis bestemmes empirisk for hvert antistof. Alternative metoder involverer spring over formaldehydfikseringen i trin 2.4 og efter fryse-revne, nedsænkning i 100% ethanol ved -20 ° C eller nedsænkning i 100% methanol i 10 minutter efterfulgt af nedsænkning i 100% acetone i 10 minutter ved -20 ° C. Disse fikseringsbetingelser tillader bedre antistofpenetration, men vil påvirke vævsmorfologien negativt (kromosomer vil se blæste og puffere ud).
Timing er meget vigtig for dissektions- og rettelsestrinnene, der er beskrevet i trin 2. Fordi mængden af dissektionsopløsning er så lille, kan fordampning påvirke den endelige fikseringskoncentration, hvilket vil forårsage variabel antistoffarvning. En erfaren C. elegans-handler kan forberede et dias på mindre end 2 minutter fra starten (trin 2.3) for at rette (trin 2.4). Den vigtigste tekniske forhindring er evnen til at plukke dyr i dråben af dissektionsopløsning og hurtigt dissekere dem. Det kan være lettere at lære at dissekere i større mængder. Nye praktikanter starter først med at plukke dyr i 50-200 μL dissektionsopløsning i en glasembryofarvningsskål (figur 2D); Den bredere overflade giver mere manøvrerum, når man identificerer en ideel nåleposition til gode gonadekstruderinger, mens det større volumen væske gør fordampning mindre af et problem. Når eleverne er fortrolige med dissekeringsbevægelserne, begynder de at dissekere ved kun at bruge 50 μL i skålen og skifter derefter til dissekering i 20 μL på et dias. Når de har dissekeret på dias, kan praktikanter hurtigt begynde at reducere mængden af opløsning, indtil de er hurtige nok til at arbejde i 4 μL til at gøre fordampning ubetydelig.
Hvis tidspunktet for dissektion fortsat er et problem, kan praktikanter dissekere i 8 μL af dissektionsopløsningen under trin 2.3. Derefter kan de i trin 2.4 tilsætte 8 μL af fikseringsopløsningen, forsigtigt pipettere for at blande grundigt (se nøje for at sikre, at slagtekroppe ikke forstyrres eller pipetteres væk) og fjerne 8 μL fra den blandede opløsning. Denne alternative fremgangsmåde vil resultere i det samme endelige volumen på 8 μL og den samme endelige fikseringskoncentration; Dette volumen er vigtigt for at sikre, at slagtekroppen kommer i kontakt med både dækslen og glidefladen under fryserevnen i trin 2.5. Hvis tidspunktet for forberedelse af hvert dias forbliver et problem selv i større dissektionsvolumener, beskrives en suspensionsmetode til kimlinjeimmunfluorescensprotokol af Gervaise og Arur26.
Den største begrænsning ved at bruge immunfluorescens til at visualisere proteiner in situ er tilgængeligheden af primære antistoffer rettet mod et bestemt protein af interesse. Men hvis der er udviklet en mærket version af proteinet, kan denne protokol tilpasses til at visualisere proteinmærket. Antistoffer rettet mod almindelige tags, som FLAG, HA eller GFP, er almindeligt tilgængelige. Fluorescerende tags som GFP kan ofte slukkes ved fikseringstrin, så det anbefales at bruge et primært antistof rettet mod GFP i stedet for at stole på selve det oprindelige fluorescenssignal. En anden begrænsning af denne protokol er, at den fanger kimlinjen inden for en enkelt tidsramme (selvom alle stadier af oogenese vil være repræsenteret inden for kimlinjen). Derfor kan denne teknik gå glip af dynamiske ændringer, der kan opstå, når en oocyt skrider frem gennem oogenese. Imidlertid er tidspunktet for gametogenese blevet godt undersøgt i C. elegans; I en vildtype ung voksen tager en oocyt ca. 60 timer at udvikle sig fra den distale spids af kimlinjen (den mitotiske zone) til diakinese33. Derfor vil en pulsjagt eller specifik intervention som bestråling efterfulgt af et tidsforløb give mulighed for observation af virkninger på forskellige stadier af meiose.
Afslutningsvis beskriver denne protokol C. elegans gonaddissektion efterfulgt af DAPI og antistoffarvning til fluorescensmikroskopi. Dissektion og fastgørelse (trin 2) tager 60-90 min, afhængigt af antallet af genererede dias. Antistoffarvning (trin 3) er for det meste hands-off og kan variere fra 7 timer mindst til 1,5 dage afhængigt af antistofinkubationstider. Montering (trin 4.1-4.7) tager ca. 15 min. Denne generelle tilgang til visualisering af kimlinjekromosomer og gonaden kan bruges til cytologiske undersøgelser af ethvert protein, hvis der findes et antistof eller fluorescerende tagreagens. I sin enkleste form kan DAPI-farvning af diakinesekerner bruges til at screene for faktorer, der påvirker meiotisk rekombination. Når det kombineres med organismeanalyser af afkomsantal, forekomsten af mænd (Him-fænotype) og embryonal dødelighed, giver denne cytologiske tilgang et enkeltcelle-kontrapunkt til populationsbaserede analyser.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet i Lee-laboratoriet blev støttet af National Institute of General Medical Sciences under tildelingsnummer 1R15GM144861 og National Institute for Child and Human Development under tildelingsnummer 1R15HD104115, begge af National Institutes of Health. DA blev støttet af UML Kennedy College of Sciences Science Scholars-programmet. NW blev støttet af et UML Honors College Fellowship og et UMLSAMP-stipendium (finansieret af National Science Foundation under tilskudsnummer HRD-1712771). Vi takker A. Gartner for RAD-51 antistof. Alle C. elegans stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som er finansieret af Office of Research Infrastructure Programs fra National Institutes of Health under tildelingsnummerP40 OD010440.
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | Molecular Probes | 711-545-152 | |
Aluminum heating/cooling block | Millipore Sigma | Z743497 | |
Bacto Peptone | Gibco | DF0118 17 0 | |
Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches | Fisherbrand | 13 678 20B | Used to make worm picks |
BSA, Bovine Serum Albumin | VWR | 97061 420 | |
C. elegans wild type (ancestral) | Caenorhabditis Genetics Center | N2 (ancestral) | |
C. elegans kle-2 (ok1151) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | VC768 | The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants. |
C. elegans spo-11 (me44) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | TY4342 | The full genotype of this strains is: spo-11(me44) IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants. |
Calcium Chloride Anhydrous | VWR | 97062 590 | |
Cholesterol | Sigma Aldrich | 501848300 | |
DAPI | Life Technologies | D1306 | |
EDTA, Disodium Dihydrate Salt | Apex Bioresearch Products | 20 147 | |
Embryo Dish, glass, 30mm cavity | Electron Microscopy Services | 100492-980 | Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic |
Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
Food storage container, plastic | various | n/a | Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred |
Glass Coplin Jar | DWK Life Sciences Wheaton | 08-813E | |
Hydrophobic Barrier PAP Pen | ImmEdge | NC9545623 | |
Kimwipes | Kimtech Science | 06 666A | |
Levamisole Hydrochloride | Sigma Aldrich | L0380000 | |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Fisher Chemical | M65 500 | |
Needles, Single-use, 25 G | BD PrecisionGlide | 14 821 13D | blue, 1 inch |
NGM Agar, Granulated | Apex Bioresearch Products | 20 249NGM | |
Parafilm | Bemis | 16 101 | |
Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 50 980 487 | |
PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) | Fisher BioReagents | BP399500 | |
Petri Dishes, 60-mm | Tritech Research | NC9321999 | Non-vented, sharp edge |
Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) | Tritech Research | PT 9010 | Used to make worm picks |
Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
Potassium Phosphate Dibasic | VWR BDH Chemicals | BDH9266 500G | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR BDH Chemicals | BDH9268 500G | |
Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm | Fisherbrand | 12-548-AP | 0.13–0.17 mm thickness |
Razor Blades, Single Edge | VWR | 55411 055 | |
SlowFade Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | S36937 | Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging. |
Sodium Azide | Fisher BioReagents | BP922I 500 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Sigma Aldrich | 7558 79 4 | |
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Sigma Aldrich | S9390 | |
Styrofoam box | various | n/a | Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 22 037 246 | |
Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 500 | |
Tryptone | Apex Bioresearch Products | 20 251 | |
Tween 20 | Fisher Chemical | BP337 500 | |
Yeast Extract | Apex Bioresearch Products | 20 254 |