Summary
これは、 C.エレガンス 生殖腺解離とそれに続く凍結亀裂に一般的に使用される方法であり、抗体染色 による 免疫蛍光のための生殖細胞系列サンプルの生成、またはDNAを視覚化するための単純なDAPI染色に使用されます。このプロトコルは、研究室の学部生やコースベースの学部生の研究経験で成功しています。
Abstract
C. elegans生殖細胞系列は、解剖動物の細胞学的分析を容易に行うことができるため、減数分裂を研究するための優れたモデルとなります。ホールマウント調製物は減数分裂核の構造を保存し、重要なことに、各生殖腺アームには減数分裂のすべての段階が含まれており、さまざまな段階で核を簡単に識別できる時間空間進行で編成されています。成体の雌雄同体には2本の生殖腺腕があり、それぞれが遠位閉鎖端に増殖する生殖系列幹細胞と近位開放端に細胞化卵母細胞を備えた閉じた管として組織化されており、子宮の中心で結合しています。解剖は、片方または両方の生殖腺腕を体腔から解放し、減数分裂全体を視覚化できるようにします。ここでは、目的のタンパク質に対する免疫蛍光の一般的なプロトコルを提示し、続いてDAPI染色してすべての染色体をマークします。若年成人はレバミゾールに固定され、2本の注射針を使用して迅速に解剖されます。生殖細胞系列の押し出し後、液体窒素中で凍結亀裂を受ける前にサンプルを固定し、キューティクルおよび他の組織を透過させるのに役立ちます。その後、サンプルをエタノール中で脱水し、再水和し、一次抗体および二次抗体とともにインキュベートすることができます。DAPIは封入剤中のサンプルに添加されるため、DNAの信頼性の高い視覚化が可能になり、蛍光顕微鏡で画像化する動物を簡単に見つけることができます。この技術は、解剖方法自体の練習に数時間費やした後、C.エレガンスの取り扱いに精通している人によって容易に採用されます。このプロトコルは、研究室で働く高校生と学部生に教えられ、リベラルアーツカレッジでのコースベースの学部研究経験に組み込まれています。
Introduction
減数分裂は、すべての有性生殖生物において配偶子(卵子および精子/花粉)を作り出すために使用される特殊な細胞分裂です1,2。交叉組換えは、相同染色体間のDNAの相互交換です。減数分裂には不可欠であり、遺伝的多様性の重要な源を提供し、世代を超えてゲノムの安定性を促進します。減数分裂中に少なくとも1つの交叉を形成できない染色体はランダムに分離し、染色体の非分離をもたらし、染色体の数が正しくない配偶子を作成します–結果として生じる子孫3にとって通常致命的な状態です。減数分裂中、交叉はプログラムされた二本鎖DNA切断によって誘発されます4。これらの切断のサブセットは、細胞分裂5の準備として相同染色体の方向付けに役立つキアスマタと呼ばれるDNAの物理的結合を提供するクロスオーバーとして修復されます。減数分裂期はすべての真核生物にわたって高度に保存されており、それらの染色体立体配座はそれらを容易に識別することを可能にする。
生物学の基本的な概念として、減数分裂は学生がさまざまな生物学コースで何度も遭遇するトピックです。彼らはしばしば高校で減数分裂染色体分離のメカニズムに紹介されますが、大学レベルのコースは分離の細胞生物学と交叉組換えの遺伝的影響に焦点を当てています。ただし、減数分裂は多くの学生にとって悪名高いトリッキーな概念です1。遺伝子、DNA、染色体、減数分裂の関係を理解しないと、学生の誤解や理解のギャップが生じ、遺伝的遺伝の完全な理解が妨げられる可能性があります6,7。抽象的なトピックに対する学生の理解を深める1つの方法は、具体的で実践的な活動を提供することです。例えば、減数分裂を教える場合、教員は分子解析8を模倣するアクティビティ、分子9を操作できる3Dモデル、または生徒自身が分子振り付け1を演じるロールプレイから選択できます。成果が不明な研究を取り入れることは、学生の理解を深める上で特に効果的な方法です。この実践は、コースベースの学部研究経験(CURE)として知られており、特にSTEM10,11で過小評価されているグループに属する学生にとって、学生の態度とエージェンシーを強化するという追加の利点があります。線虫Caenorhabditis elegansは、行動、生殖能力、および遺伝的交配の教室での研究に特に適しており、学生に生物学的研究を紹介するための効果的なモデルです12。
C. elegansは、分子遺伝学と簡単な細胞学的解析を組み合わせることにより、細胞生物学の強力なモデル生物を作ります。また、生物学教室での使用にも特に適しています13、14、15。ラボでの維持は簡単で経済的であり、標準的な室温または最も一般的なインキュベーション温度である20°Cの両方で、3日ごとに数百の子孫を生産します。重要なことに、それらはグリセロールストックとして凍結し、-80°Cの冷凍庫に保管できるため、初心者の研究者が犯した飼育ミスを簡単に修正できます16。さらに、そのよく注釈されたゲノムは、順方向および逆方向の遺伝的手法を可能にし17,18、C.エレガンスを使用して、分子から進化に至るまでの生物学的問題に対処することを可能にします。最後に、C.エレガンスの研究者は、新進の科学者に助けやアドバイスを提供することをいとわない支援コミュニティを作成しました19。これらの利点により、C.エレガンスはさまざまなタイプの施設で多くのCUREに組み込まれています12、19、20、21、22、23。
研究と教育のためのその利点に加えて、C.エレガンスは減数分裂と生殖細胞系列の発達の研究のための人気のあるモデルになりました24,25,26。これらの動物の光学的透明度は細胞学的アプローチを簡素化し27、成人では生殖腺が動物のほぼ半分を占め、研究する数百の減数分裂細胞を提供します。生殖腺では、減数分裂生殖細胞核が組立ラインのように配置されています(図1)。有糸分裂複製は生殖腺の遠位端で起こり、核は生殖腺の近位端に向かって移動し、受精胚が外陰部から出現するにつれて減数分裂期を進行する。ステレオタイプの空間組織は減数分裂による時間的進行も表すため、染色体組織と生殖腺内の位置に基づいてさまざまな段階を簡単に識別できます。最後に、減数分裂を混乱させ、異数性を引き起こすプロセスは、不妊、胚致死、または男性の高い発生率(Him表現型)など、初心者でも簡単に特徴付けることができる表現型を作成します28。
これは、C.エレガンスの減数分裂染色体を視覚化するための簡単なプロトコルです。マウント、解剖、固定、抗体染色はすべて同じ顕微鏡スライド上で実行されるため、プロトコルが簡素化され、ほぼ完璧なサンプル回収が可能になります。この方法は、染色体を視覚化するための簡単なDAPI染色に機能し、生殖腺内のタンパク質の局在を視覚化するための免疫蛍光に使用できます。学生は、基本的な解剖顕微鏡を使用して生殖腺を解剖し、DNAまたは免疫蛍光を視覚化するためのホールマウント調製物を生成し、それらを複合蛍光顕微鏡でイメージングします。このプロトコルは、C.エレガンスの研究室で働く高校生と学部生に教えられ、リベラルアーツカレッジのCUREに組み込まれています12。CUREのクラスサイズは比較的小さかったが、このプロトコルは、ワーム株と試薬のコストが比較的低いため、さまざまな機関のクラスに適している。インストラクターは、使用できる解剖顕微鏡の数によってのみ制限されます。以前の実装では、学生が3人のグループで1つの顕微鏡を共有し、解剖の練習、解剖とDAPI染色の実施、広視野蛍光顕微鏡でのスライドの画像化の3つの90分のセッションにわたって行われました。学部研究への参加は、学生に多くの利益をもたらします11,29、学術的および個人的な両方。CUREを介してコースに研究を組み込むことで、学生は通常の授業時間11,30,31の間に研究に参加できるため、これらのメリットをより利用しやすく公平に利用できるようになります。
Protocol
1. C.エレガンス 畜産
注:詳細については、 C.エレガンス メンテナンスプロトコル16 およびElginら32 を参照してください。 C.エレガンス 株は、 カエノラブディティス 遺伝学センター(https://cgc.umn.edu)から簡単に入手でき、米国内の任意の場所に普通郵便で出荷されます。各菌株の費用は10ドルで、各ラボ/ユーザーは30ドルの年会費を支払います。
- 滅菌技術を用いて、6cm線虫増殖培地寒天プレート(NGM寒天プレート)を調製する。
注いだプレートは、元のプラスチックスリーブまたは密閉容器に4°Cで数か月間逆さまに保管できます。- NGM寒天プレートを作るには、3 gのNaCl、2.5 gのバクトペプトン、20 gのNGM寒天、およびddH2Oを1 L(~975 mL)に加えます。121°Cで20分間保持する液体サイクルを使用して培地をオートクレーブします。55°Cに冷却し、滅菌技術を使用して、コレステロール1 mL、1 M CaCl 20.5 mL、1 M MgSO4 1 mL、および1 M リン酸カリウムバッファー(pH 6)25 mLを加えます。
注:1 Mリン酸カリウムバッファーを作るには、108.3 gのKH 2 PO 4(一塩基性)と35.6 gのK2HPO4(二塩基性)を混合します。必要に応じて、KOHを使用してpHを6に調整します。ddH2Oを最大1 L(通常~900 mL)まで加え、オートクレーブを121°Cで40分間行います。 1 LのNGMは、それぞれ10 mLを含む約100枚のプレートを作ります。
- NGM寒天プレートを作るには、3 gのNaCl、2.5 gのバクトペプトン、20 gのNGM寒天、およびddH2Oを1 L(~975 mL)に加えます。121°Cで20分間保持する液体サイクルを使用して培地をオートクレーブします。55°Cに冷却し、滅菌技術を使用して、コレステロール1 mL、1 M CaCl 20.5 mL、1 M MgSO4 1 mL、および1 M リン酸カリウムバッファー(pH 6)25 mLを加えます。
- 血清学的ピペットまたはトランスファーピペットを使用して、大腸 菌 OP50細菌培養物(~150 μL)を3滴入れてプレートを見つけます。プレートの中央にスポットを配置し、スポットをプレートの端に近づけないようにしてください。これは動物がプレートの側面を這い上がって乾燥するのを思いとどまらせるでしょう。
- バクテリアの芝生が乾いたら、斑点を付けたプレートを室温(RT)で最大2週間逆さまに保管します。使用の少なくとも1〜2日前にプレートをスポッティングすると、バクテリアの芝生が厚くなり、より高密度の動物を支えることができます。
注:OP50細菌培養を準備するために、OP50はカエノラブディティス遺伝学センターから注文できます。OP50細菌は、グリセロールストックからLBプレートにストリークされ、単一のコロニーを確保し、4°Cで4〜6週間保持されます。OP50細菌培養物は、単一のコロニーから37°Cで一晩LBで増殖します–振とうは必要ありません。LB培地を調製するには、トリプトン10 g、NaCl10 g、酵母エキス5 g、ddH 2 O950 mLを加え、10 N NaOHでpHを7に調整し、ddH2Oで最終容量を1 Lに調整します。 100 mLの量に分注し、121°Cで20分間オートクレーブします。 - 各株の作業ストックを作成するには、斑点を付けられたNGMプレート上に3つのL4ステージ雌雄同体を選びます。プレートは15〜25°Cで保管してください。 標準的な培養条件は20°Cです。 温度管理されたインキュベーターにアクセスできない場合は、RTのベンチトップで培養物を維持します。
注:L4段階の雌雄同体は、サイズ(成体よりも小さい)と、体の途中に明確な半円(発達中の外陰部)が存在することの両方で簡単に病期分類できます。20°Cでは、動物は孵化後34〜46時間(胚が産卵されてから約40〜52時間後)にL4段階に達する。発達段階のタイミングの詳細については、Corsi et al.14 を参照してください。- 培養物をさまざまな温度にシフトして、発育速度を制御します。動物は高温でより速く成長し、低温で遅く成長します。それらは25°Cより高い温度で無菌になり始めます。
注:一部の変異遺伝子型は温度感受性であり、培養温度に応じて異なる表現型を示します。
- 培養物をさまざまな温度にシフトして、発育速度を制御します。動物は高温でより速く成長し、低温で遅く成長します。それらは25°Cより高い温度で無菌になり始めます。
- 4日ごとに3つのL4ステージ雌雄同体を新しい斑点のあるNGMプレートにピッキングして、作業ストックを維持します。そうすることで、幅広い発達段階を持つ一定の栄養のある人口を確保できます。
2.生殖腺解剖
- 年齢に合った成虫の収集:解剖の12〜24時間前に、L4段階の雌雄同体を新しい斑点のあるNGMプレートに選びます-これらは翌日若年成人に成長し、解剖に理想的です。L4段階の雌雄同体の数は、実施されている細胞学的分析によって異なります。通常、スライドごとに10〜20個の雌雄同体が解剖され、条件ごとに2〜4枚のスライドが生成されます。
注:生殖腺は、十分に給餌された動物で最も効率的に押し出されます。飢えていない(つまり、プレート上に目に見えるバクテリアの芝生がまだ残っている)作業株からL4雌雄同体を選ぶようにしてください。飢えた動物は不完全な生殖腺の押し出しを受ける傾向があり、視覚化が困難になります。- ジアキネシスのような減数分裂の後期を評価する場合は、ジアキネシス段階の核をより多く蓄積し、分析を簡素化するため、高齢者(L4の48時間後)を解剖します。ただし、研究者は、一部の影響が母親の高齢によって引き起こされる可能性があることに注意する必要があります。
- 解剖の準備をします。
- M9の調製:3gのKH 2 PO 4(一塩基性)、6gのNa 2 HPO4(二塩基性)、5gのNaClを加え、ddH2Oを100mLに加える。溶液を121°Cで20分間オートクレーブし、放冷した後、滅菌技術を使用して1 mLの1 M MgSO4を加えます。
- 解剖バッファーの調製:1 μLの10%トゥイーン20、12 μLの100 mMレバミゾール、10 μLの10x M9、および77 μLのddH2Oを混合します。
注:Tween 20は、表面張力を低下させ、組織膜をさらに透過するために解剖バッファーに含まれています。 - 固定溶液(2%PFA [100 μL])を調製する:12.5 μLの16%パラホルムアルデヒド(PFA)、10 μLの10x M9、および77.5 μLのddH2Oを混合します。必ずPFAの新しいアンプルを使用してください(2週間以内に開封)。
注意: PFAは危険な化学物質であるため、固定溶液はヒュームフードで準備する必要があります。 - 凍結方法を設定する-液体窒素は管理が簡単ですが、必要に応じて、ドライアイスの上にアルミニウムブロックを使用できます。
- 液体窒素法:プラスチック製のビーカーまたはプラスチック製のコプリンジャーをポリスチレンの箱に入れます。ビーカーに液体窒素を入れます(ポリスチレン容器へのオーバーフローは問題ありません)。ピンセットを近くに置きます。理想的には、ビーカーは顕微鏡のスライドが完全に水平に落ちるのを防ぐのに十分な幅でなければなりません-スライドは傾きがあり、ピンセットでつかみやすい必要があります。
注意: 急速な冷却による粉々を避けるために、ガラスではなく液体窒素で作業する場合はプラスチック容器を使用することが重要です。 - ドライアイス法:
- 平らなアルミニウムブロックをポリスチレン容器または長方形の氷バケツのドライアイスの上に置きます。ブロックの上部がコンテナの上部より上にあると、スライドをフリーズする方が簡単です。
- 手袋を着用し、アルミブロックをそっと押し下げてドライアイスとの良好な接触を確保し、冷却プロセスを早めます(金属が急速に冷えるときしむ音がすることがあります)。かみそりの刃を近くに置きます。
- 凍結クラックを停止する前に、アルミニウムブロックをドライアイスの上に少なくとも30分間放置して、急速凍結に必要な完全なクールダウンを可能にします。
注意: 理想的には、表面を水平に保つのに役立つドライアイスの固体ブロックを使用する必要があります。必要に応じて、ドライアイスペレットの上にアルミニウムブロックを置くことができますが、表面が水平に保たれるように注意する必要があります。 - アルミニウムブロックの表面は霜を集め、スライドとブロックの間の密接な接触を妨げる可能性があります。かみそりの刃を使用して表面から霜をこすり落とし、各スライドの領域をクリアします。ポリスチレン容器を蓋で覆うと、過度の霜の蓄積を防ぐのに役立ちます。
- 液体窒素法:プラスチック製のビーカーまたはプラスチック製のコプリンジャーをポリスチレンの箱に入れます。ビーカーに液体窒素を入れます(ポリスチレン容器へのオーバーフローは問題ありません)。ピンセットを近くに置きます。理想的には、ビーカーは顕微鏡のスライドが完全に水平に落ちるのを防ぐのに十分な幅でなければなりません-スライドは傾きがあり、ピンセットでつかみやすい必要があります。
- コプリンジャーに~40mLの95%エタノールを入れます。
- 3つのコプリンジャーに~40 mLのPBS-Tを入れます。
注:PBS-Tを作るには、100 mLの10x PBS、5 mLのトリトンX-100、および2 mLの0.5 M EDTA(pH 8)を混合します。873 mLのddH2Oを追加します。激しく振ってトリトンX-100を溶かします。10x PBSを作るには、25.6 gのNa 2 HPO4・7H 2 O、80 gのNaCl、2 gのKCl、および2 gのKH2PO4を混合します。ddH2Oを加えて容量を1 Lまで上げ、オートクレーブを121°Cで40分間行います。 洗剤Triton X-100は洗浄バッファーPBS-Tに含まれており、表面張力を低下させ、スライド上の動物全体の保持力を高めます。
- 18 mm x 18 mmのガラスカバーガラスで動物を解剖します。このステップは、解剖バッファーの蒸発により時間に敏感です。解剖を完了するのに5分もかかりません。
注:レバミゾールは、動物を解剖しやすくするために動物を固定するために使用されますが、レバミゾールに長時間放置すると、生殖腺の押し出しが悪くなります。5分の時間枠内に収まるように、スライドごとに解剖される動物の数を減らすのが最も簡単です。- 解剖顕微鏡のステージに保持スライドを置きます-保持スライドはカバーガラスをより簡単に動かすために使用され、無期限に再利用できます(図2A、左の写真)。
- カバーガラスを保持スライドの上に置き、4 μLの解剖液をカバーガラスの中央にピペッティングします。保持スライドをステージの片側に移動して、ビューを解放します。
- 解剖液の滴に10〜20個の雌雄同体を選びます。スライドごとに~10匹を画像化するのに十分な動物を選択しますが、5分以内に解剖できないほど多くはありません。
- 両手に1本ずつ、2本の注射針を使用して動物を解剖します(図2A)。
- 針の先端を交差させてX字型を作り、Xの底を使用して大人をカバーガラスの表面に固定します。
注意: 角度と回転の観点から各針を保持する最良の方法を見つけるには、練習が必要です。斜角(斜めのエッジ)を下に向けて針を保持することから始めます。より大きなボリュームで解剖することを最初に学ぶための提案については、ディスカッションを参照してください(図2D)。 - X字型を咽頭のすぐ後ろ、若年成人の体長の約1/5、または頭の透明な部分のすぐ下に配置します(図2A、右図)。
- 1回のはさみの動き(ナイフとフォークで食べ物をスライスするなど)で動物を斬首します。良好な押し出しにより、生殖腺の片方の腕(または場合によっては両腕)が、腸の片方または両方の半分とともに体腔から完全に解放されます(図2B、左の画像)。腸はより暗く、均一な幅で見えますが、生殖腺は遠位の先細りの先端ではっきりと見えます。
- 各動物は一度だけ切るべきです。カット後に生殖腺が押し出されない場合は、次の動物に移ります。最初のカットは体内の静水圧を大幅に低下させるため、それ以上カットしても押し出しが良くなる可能性は低くなります。不完全または不十分な押し出しは、イメージング中にすぐに表示され、無視できます(図2B、右の画像)。
注:生殖腺を死体から分離しようとしないでください-そうすると、通常、組織が裂け、分析できる減数分裂段階の数が制限されます。
- 各動物は一度だけ切るべきです。カット後に生殖腺が押し出されない場合は、次の動物に移ります。最初のカットは体内の静水圧を大幅に低下させるため、それ以上カットしても押し出しが良くなる可能性は低くなります。不完全または不十分な押し出しは、イメージング中にすぐに表示され、無視できます(図2B、右の画像)。
- カバースリップの残りの動物について解剖を繰り返します。
- 針の先端を交差させてX字型を作り、Xの底を使用して大人をカバーガラスの表面に固定します。
- サンプルをホルムアルデヒドで固定します。
- 穏やかに作業しながら、動物との滴に非常に近いカバーガラス上の固定溶液4μLをピペットで留めます。理想的には、液滴はマージするのに十分近いです。解剖ドロップに直接ピペッティングしたり、解剖された死骸を移動させたりしないでください。
- 1本の指でカバーガラスを保持スライドに固定します。もう一方の手で、カバーガラスを数回そっとフリックして、滴を混ぜます。最終的な固定濃度は0.8%PFAです。
- 正に帯電したスライドを前面に押し下げて、スライドの中央にあるカバーガラスを持ち上げます。サンプルドロップにそっと触れると、ドロップの表面張力がカバーガラスを拾います。
注意: 正に帯電したスライドには、組織が表面に付着してサンプルの損失を防ぐのに役立つ静電コーティングが施されています。- 必要に応じて、片方の角がスライドの上端または下端から1 mm垂れ下がるようにカバーガラスを斜めに配置します。オーバーハングを残すと、凍結後にカバーガラスを割るのが簡単になります(図2C)。
- スライドをベンチに置き、RTで正確に5分間固定します。この間、スライドに鉛筆でラベルを付けます。
注:サンプルを過剰に固定するのが一般的であり、核またはすべての組織から抗体を除外することによって検出できます。さらに、一部の抗体はホルムアルデヒドに特に敏感です。このような場合は、固定時間を短縮するか、使用するホルムアルデヒドの最終濃度を下げてください。
- フリーズクラック
- 修正の直後に、スライドをフリーズします。
- 液体窒素を使用する場合:スライドのラベルの付いた端をピンセットで持ち、液体窒素にそっと下げます。カバーガラス面を上にして、ビーカーの側面に寄りかかるようにスライドを解放します。スライドは10秒以内に凍結されます(液体が沸騰しなくなったら)。
- ドライアイスを使用する場合:かみそりでアルミニウムブロックの表面から霜をこすり落とします。スライドのラベルの付いた端をしっかりと持ち、透明な面に置き、下向きに圧力を加えてブロックと完全に接触させます。カバーガラスは完全にブロック表面にある必要があります。凍結は10秒以内に発生し、カバーガラスの下のサンプルが氷に変わるときに視覚的に確認できます。
- どちらの方法でも、スライドを少なくとも5分間放置して完全にフリーズさせます。
注意: 凍結したら、スライドは凍結したままである限り、液体窒素またはブロック上に15〜20分間放置できます。これにより、この段階で複数のスライドを収集してから、クラッキングステップに進むことができます。
- すばやく作業して、サンプルからカバーガラスを割ってください。この手順は時間に敏感です。カバーガラスを取り外し、サンプルが解凍を開始する前にスライドをエタノールに浸します。
- 凍結したスライドを取り外します(液体窒素用のピンセットを使用)。
- スライドのラベルの付いた短い端をしっかりとつかみ、一方の長い端をベンチに固定します。
- もう一方の手で、かみそりをしっかりと握り、かみそりの端をスライドの下にスライドさせて、カバーガラスをはじいてサンプルから遠ざけます。カバーガラスがコーナーオーバーハングで配置されている場合、この手順はわずかに簡単です(図2C)。
- 修正の直後に、スライドをフリーズします。
- すぐにスライドをRTの95%エタノールを含むCoplinジャーに入れます。 スライドをエタノールに少なくとも5分間放置します。
注:スライドはエタノールにしばらく置いておくことができます-これにより、洗浄に進む前に、このステップで複数のスライドを収集することができます。スライドは、このステップで数日間保存することもできます。保存する場合は、スライドのコプリンジャーをエタノール中-20°Cに移動します。 - PBS-TのスライドをRTでそれぞれ5分間3回洗浄します。
- 抗体で染色する場合は、ステップ3(抗体染色)に進みます。染色体を可視化するためにDAPIのみで染色する場合は、手順4(マウントとイメージング)に進みます。
3. 抗体染色
- 一次抗体インキュベーション
注:新しい抗体の適切な条件を作成する際には、蛍光シグナルの特異性を検証するために、次のネガティブコントロールを含めることが重要です:1)一次抗体がなく、二次抗体のみを含むスライド。2)二次抗体を欠く一次抗体のみのスライド。これらのネガティブコントロールのそれぞれは、信号の完全な欠如を生成するはずです。二次抗体のみのスライドで蛍光が確認された場合は、二次抗体の希釈率を上げるか、別の二次抗体を使用する必要があります。一次抗体のみのスライドで蛍光が確認された場合は、自家蛍光またはその他の潜在的な汚染物質が原因である可能性があります。- 一次抗体を抗体希釈バッファー(BSA50 mg + 10%アジ化ナトリウム50 μL+ PBS-T10 mL)で希釈します-スライドあたり20〜30 μLを使用するのに十分な抗体希釈液を調製します。
- 湿ったチャンバーを準備する:プラスチック容器の底を湿らせたペーパータオルで気密蓋で裏打ちします。ペーパータオルの上にガラスパスツールピペットの単層を置きます。これらのピペットは、スライドを水平に保ち、ペーパータオルから高く保つことができる表面を作成します。
注意: 湿気の多いチャンバーの場合は、スナップ蓋付きのプラスチック製の食品保存容器を使用するのが最適です。パスツールピペットに十分な長さであるが、スライドを完全に水平に休ませることができるようにくぼみのない比較的平らな底を持っているものを探してください。 - 最後のPBS-Tウォッシュからスライドを取り外します。このステップから迅速に作業して、サンプルを常に濡れたままにし、蒸発を防ぎます。サンプルが乾燥すると、抗体染色に悪影響を及ぼします。
- コンパクトな長方形に折り畳まれた拭き取りティッシュを使用して、スライドの表面全体を乾燥させます。スライドの前面と背面を拭きますが、サンプルの周りに十分なスペースを残します。サンプルの近くの表面を乾燥させるときは特に注意してください-カバーガラスのサイズほどの領域が乾燥しないままになるサンプルに近づきすぎないようにしてください。ただし、次のステップでは、サンプルの周囲が乾いていることを確認してください。
- 疎水性PAPペンを使用してサンプルの周りに円を描きます。サンプル領域全体を囲むように注意してくださいが、スライドの表面に見える動物の死骸を乱さないようにしてください。バリアが完全に乾くまで~5秒待ちます。
注:スライドの表面は界面活性剤を含むPBS-Tでコーティングされているため、一次抗体溶液を封じ込めるには疎水性バリアが必要です。PAPペンは乾燥したスライド面で最適に機能するため、サンプルの周囲に乾燥した周囲を作成することが重要です。サンプルに最も近い領域を乾燥させないままにしておくと、このステップ中にサンプルが保護されます - すばやく作業し、折りたたまれた拭き取り組織の角または端を使用して、疎水性バリア内のサンプルから液体を吸い取ります。動物の死骸を乱さないように注意してください。
- 直ちに20 μLの一次抗体溶液を疎水性バリアによって作成されたリングにピペットで入れます。死体が乱れないように、穏やかに斜めにピペットを打つように注意してください。死体に直接ピペッティングすることは避けてください。
- スライドを軽く傾けて、疎水性バリア内の表面全体が溶液で覆われていることを確認します。
注:疎水性バリアの内周が1〜1.5 cmで、20 μLの抗体溶液で完全に覆われている場合が最適です。円周幅は、凍結亀裂ステップ中に死骸がどのように分布するかによって異なります。障壁が広いほど、大量の抗体溶液が必要になる場合があります。必要に応じて、パラフィルムの小さな正方形(18 mm x 18 mmカバーガラスのサイズにカット)をサンプルの上にそっと配置できます。パラフィルムの正方形は、抗体溶液がサンプル全体をカバーすることを保証し、蒸発を防ぐのにも役立ちます。 - 残りのスライドについて、手順 3.1.3-3.1.8 を繰り返します。
- スライドを湿度の高いチャンバーに慎重に移し、溶液が疎水性バリア内に含まれたままで、スライドが完全に水平になっていることを確認します。
- 抗体に応じて、このステップを6時間に短縮するか、湿度の高いチャンバーを冷蔵室または冷蔵庫に保管することで4°Cで一晩実行することができます。
注:通常、長時間のインキュベーションであっても、抗体溶液の蒸発を防ぐには、湿度の高いチャンバーと疎水性バリアを使用するだけで十分です。ただし、蒸発が問題になることが判明した場合は、パラフィルムの小さな正方形を各サンプルにそっと配置して、蒸発を防ぐのに役立ちます。これらは最初の洗浄ステップで除去できます:PBS-Tで満たされたCoplinジャー(他のスライドを含まない)に各スライドを浸し、パラフィルムをサンプルから浮かせます。同じジャーを使用して次のスライドからパラフィルムを削除する前に、コプリンジャーからパラフィルムを取り外します。
- ~40 mLのPBS-Tが入ったコプリンジャーでスライドをRTでそれぞれ5分間3回洗浄します。
- これらの洗浄中に、二次抗体を抗体希釈バッファーで希釈します。スライドあたり20〜30 μLを使用するのに十分な抗体希釈液を調製します。1:200に希釈したAlexa Fluor結合二次抗体を使用するのが一般的です。
- 二次抗体インキュベーション
- 最後のPBS-Tウォッシュからスライドを取り外します。このステップから迅速に作業して、サンプルを常に濡れたままにし、蒸発を防ぎます。
- 折りたたんだ拭き取りティッシュを使用してスライドを乾かします。疎水性バリアに含まれる領域を乾燥させないでください。
- すばやく作業し、折りたたまれた拭き取り組織の角または端を使用して、疎水性バリア内のサンプルから液体を吸い取ります。動物の死骸を乱さないように注意してください。
- 直ちに20 μLの二次抗体溶液を疎水性バリアによって作成されたリングにピペットで入れます。死体が乱れないように、穏やかに斜めにピペットを打つように注意してください。
- 死体に直接ピペッティングすることは避けてください。疎水性バリア内の表面全体が溶液で覆われていることを確認してください。バリアの周囲が広いほど、より多くの抗体溶液が必要になる場合があります。必要に応じて、サンプルを小さな正方形のパラフィルムで覆います(手順3.1.8の下の注を参照)。
- スライドを湿度の高いチャンバーに慎重に移し、溶液が疎水性バリア内に収まり、スライドが完全に水平になっていることを確認します。湿気のあるチャンバーの蓋を元に戻して、スライドを暗所に保ちます。
- 残りのスライドについて、手順3.3.1〜3.3.6を繰り返します。
- RTで4時間暗闇でインキュベートします。
注:抗体に応じて、このステップは2時間に短縮することも、6時間に延長することもできます。湿気の多いチャンバーが暗くない場合は、引き出しに入れるか、段ボール箱で覆います。あるいは、湿ったチャンバーをアルミホイルで包んで、スライドを暗闇に保つこともできます。
- ~40 mLのPBS-Tが入ったコプリンジャーでスライドをRTでそれぞれ5分間3回洗浄します。
4.取り付けとイメージング
- 封入剤+ DAPI(2 μg/mL)、18 mm x 18 mmのガラスカバースリップ、マニキュアを手の届くところに置いて、サンプルをマウントする準備をします。
- 最後の洗浄からスライドを取り出し、折りたたんだ拭き取りティッシュを使用して乾かします。疎水性バリアに含まれる領域を乾燥させないでください。
- 折りたたまれた拭き取りティッシュの角を使用して、バリア内のサンプルから液体を注意深く吸い取ります。このステップでほとんどの液体を取り除きますが、死体を完全に乾かさずに取り除きます。
- すばやく作業し、8 μLの封入剤をサンプルに追加します。死体が乱れるのを防ぐために、ピペットを穏やかにそして斜めに。死体に直接ピペッティングすることは避けてください。
- それでもすばやく作業しながら、ガラスカバーガラスをサンプルに慎重に下げます。
- 気泡はイメージングを妨害し、サンプルの劣化につながる可能性があります。気泡を最小限に抑えるには、カバーガラスの片方の端をサンプルの隣のスライドに置き、サンプルの対角線上に保持します。カバーガラスの上端を鉛筆やピンセットの上に置くのに役立ちます。次に、カバーガラスの上端をゆっくりと下げます-この動きにより、封入媒体は一方の端からもう一方の端に進む液体シールを作成できます。
- 残りのスライドについて、手順4.2〜4.5を繰り返します。
- カバーガラスをマニキュアで密封します。カバーガラスを押し下げたり(サンプルを押しつぶしたり)、カバースリップを水平に外したり(サンプルを汚す)しないように注意してください。
- カバーガラスの各角(幅~1 mm)にマニキュアの小さなドットを追加します。これらは、カバーガラスを所定の位置に保持するのに役立ちます。ドットを完全に乾かします。
- 角が完全に乾いたら、マニキュアで端をシールします。ポリッシュがカバーガラスとスライドの間の隙間を完全に埋めることを確認しますが、カバーガラスをサンプルに覆いすぎないようにしてください。カバーガラスに1mmの重なりを維持するのが最善です。必要な量のマニキュアのみを使用してください。多すぎたり、研磨液が過剰になったりすると、乾燥に時間がかかり、顕微鏡の対物レンズが損傷するリスクがあります。
注意: 透明ではなく色付きのマニキュアを使用することをお勧めします, シールの境界を見やすくし、マニキュアの境界の下にある動物のイメージングを防ぐのに役立ちます. - イメージングする前に、マニキュアを完全に乾かしてください。濡れたマニキュアは顕微鏡の対物レンズに深刻な損傷を与える可能性があるため、このステップは重要です。
注:スライドは、今後はできるだけ暗闇に保つ必要があります。平らな段ボール箱を使用して、ベンチで乾くときに覆います。
- イメージングの前に、スライドを4°Cの暗所で1〜2週間保管します。必要に応じて、スライドを-20°Cで長期間保管します。
- 標準的な蛍光化合物光学顕微鏡を用いた画像。
- 各スライドについて、まず、DAPIチャネルの10倍でサンプル全体を調べて、よく押し出された生殖腺を特定し、それらの配置をメモします。ほとんどのアプリケーションでは、動物の別の部分によって切断された、不完全な、または部分的に覆われた生殖腺のイメージングは避けてください。ほとんどの動物では、生殖腺の腕が完全に押し出されて見えるようになります。
注:DAPIチャネルの生殖腺全体の10倍で低倍率の画像を撮影して、後の向きに使用したり、特定の核の位置を特定したりするのに役立つ場合があります。 - アプリケーションに応じて、画像は40倍、63倍、または100倍で撮影できます。生殖腺全体をキャプチャする場合は、境界が重なり合うモンタージュを作成します。イメージング中、生殖腺は中空の管であり、核は上部と下部で最も密集していることを忘れないでください。
- 各スライドについて、まず、DAPIチャネルの10倍でサンプル全体を調べて、よく押し出された生殖腺を特定し、それらの配置をメモします。ほとんどのアプリケーションでは、動物の別の部分によって切断された、不完全な、または部分的に覆われた生殖腺のイメージングは避けてください。ほとんどの動物では、生殖腺の腕が完全に押し出されて見えるようになります。
Representative Results
DAPIはDNAに強く結合し、その染色はさまざまな条件下でも堅牢です(図3A、B)。それはすべての核に存在するべきであり、したがってスライド上の任意の虫組織の存在および顕微鏡上で蛍光を検出する能力に対して効果的なポジティブコントロールを行う。抗体が減数分裂核内に存在する場合に染色が有効です(図3A、B)。例えば、図3A,Bは、DAPIで染色された中部パキテン核と、二本鎖切断のマーカーであるRAD-51を標的とする抗体を示しています。KLE-2は、有糸分裂および減数分裂の準備のために染色体を構築する高度に保存されたタンパク質複合体であるコンデンシンの成分です。kle-2/+変異体は、わずかに乱れたDAPI染色と、RAD-51病巣の数が多いことに反映される二本鎖切断数の増加によって示されるように、染色体構造に軽微な欠陥があります(図3B)。免疫蛍光法のよくある間違いは、サンプルを固定溶液に長時間放置することです。過剰固定は、通常、抗体が核に拡散するのを妨げるため、染色に失敗する可能性があります。この間違いは、抗体が生殖腺の細胞質領域に拡散しているが、核から除外されているように見える場合に識別できます。
生殖細胞系列(図1)では、核は遠位端で有糸分裂的に増殖し、移行帯の間に減数分裂に入り、パキテン(多くの場合、いくつかの核列によって3つの等しい段階に分割される)を経て、ジプロテンに入り、最後にジアキネシスに入ります。ダイアキネシスの卵母細胞は、精子への近さに基づいて番号が付けられ、-1卵母細胞は精母細胞に最も近位、-2卵母細胞は次の遠位です。 C.エレガンス には6つの染色体があり、ジアキネシス核にコンパクトな楕円形として現れます。これらはそれぞれ、二価とも呼ばれる交叉によって一緒に保持された2つの姉妹染色分体の相同ペアを表します(図3C)。交叉形成を妨害する spo-11のような変異体は、交叉を形成することができません。したがって、ジアキネシス核は、姉妹染色分体ごとに1つずつ、12個の別々のDAPI体(一価とも呼ばれます)を持ちます(図3D)。
図1:生殖系列の核は、減数分裂による進行を表す空間的-時間的に配列されています 。 (A)DAPIで染色されたホールマウントの若年成人雌雄同体。生殖腺と減数分裂の段階は、遠位先端(アスタリスク)から、スペルマテカ(三角形)を含む近位領域(矢印で示されている-1卵母細胞)まで概説されています。スケールバーは100μmを表す。 (B)DAPIで染色された解剖された雌雄同体の生殖巣の投影蛍光画像。減数分裂期が示され、代表的な核が挿入図で示されます(すべての挿入図は互いにスケーリングすることが示されています)。核は、生殖細胞系列におけるそれらの位置および特徴的な染色体形態に基づいて容易に病期分類することができ、遠位先端の有糸分裂帯(アスタリスク)から、パキテン、ジプロテン、およびジアキネシスを経て遷移帯へと進行する。スペルマテカは三角形でマークされています。この図は、ライセンスCC BY 3.028の下でHillersらから適応されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:解剖セットアップのデモンストレーション 。 (A)解剖中の顕微鏡ステージ。動物を4μLの解剖溶液中で、カバーガラスをビューに移動させるために使用される保持スライド上に置かれたカバーガラス上で解剖する。図は理想的な針の配置を示しています。針は斜めの縁を下に向けて保持され、咽頭領域を横切っています。ピンクの矢印は、針のはさみのような動きを示しています。ピンクの破線は、理想的なカット位置を示しています。(B)解剖された動物の画像、完全な押し出しと不完全な押し出しの例。押し出された生殖腺と内臓のセクションにラベルが付けられています。(C)凍結クラック工程を示す画像。スライドは片手でしっかりと持ち、カバーガラス側を体の反対側に向けてください。反対側の端はベンチに対して支えられています。かみそりはもう一方の手で持つ必要があります。ピンクの矢印は、かみそりがカバーガラスをスライドからはじく動きの方向を示し、カバーガラスが体から離れるようにわずかに回転します。カバーガラスは、1つの角がスライドの長辺にぶら下がるように配置されていることに注意してください。(D)ガラス胚染色皿での解剖練習用セットアップのイメージ。動物を50〜200μLの解剖溶液に入れると、蒸発の問題が打ち消され、解剖時間が延長されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生殖細胞系核の代表的な蛍光結果。 (A)野生型および(B)kle-2/+ヘテロ接合体におけるRAD-51抗体(緑)およびDAPI(赤)で染色された後期パキテン核のZスタック投影。(C,D)(C)野生型(6体のDAPI染色体)および(D)spo-11変異体(12個のDAPI染色体)におけるDAPIで染色された単一のジアキネシス核のZスタック投影。スケールバーは5μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
有性生殖は、減数分裂の特殊な細胞分裂を介して産生される一倍体配偶子の作成を必要とします。C.エレガンスは、その光透過性、便利な生殖細胞系の解剖学、および強力な遺伝学により、減数分裂の細胞学的研究の人気のあるモデルになりました28。生殖能力と胚の致死性を評価する簡単な生物実験を分子遺伝学と組み合わせて、実験室や教室での多くの質問に対処することができます。たとえば、クロスオーバーは適切な染色体分離に不可欠であるため、それらの形成または分解能を妨害するプロセスは異数性配偶子を生成します。次に、異数性は生存不可能な子孫をもたらし、それは子孫を数えることによって、または胚の致死性を決定するわずかに複雑な方法を通して容易に評価することができる。細胞学的には、クロスオーバーの欠如は、ジアキネシス中に観察されるDAPI染色体の数に影響を与えます。DAPI染色の堅牢性とスコアリングの容易さにより、これは細胞学的技術を教えるための理想的な実験になります。雌雄同体の生殖細胞系列における核の時間空間レイアウトは、ある瞬間における減数分裂の各段階のスナップショットを提供する。核は、生殖系列の遠位有糸分裂末端から近位端に進むのに約54時間かかる(例えば、Jaramillo-Lambert et al.33、Stamper et al.34およびLibuda et al.35を参照されたい)。減数分裂の進行のこの確立されたタイミングは、パルスチェイス標識またはDNA損傷実験を可能にします。
DAPI染色はほぼ常に機能するため、蛍光顕微鏡の有用な技術的コントロールとして機能します(そして、トレーニング中の顕微鏡医に満足を提供することができます)。抗体染色はより多様であり、反復間の再現性の優れた尺度です。 C.elegans 生殖腺は、染色体構造を維持しながら十分な抗体拡散を可能にすることのバランスを必要とするため、一貫して固定するのが難しい場合があります。ホルムアルデヒドで固定すると染色体の形態が最もよく保存され、パラホルムアルデヒドアンプルから新鮮なホルムアルデヒドを調製することが最も再現性のある結果をもたらしました。また、ホルマリン(37%ホルムアルデヒド水溶液及びメタノール)から調製したホルムアルデヒドを用いることもできる。固定強度およびタイミングは、各抗体について経験的に決定する必要があるかもしれない。別の方法としては、ステップ2.4のホルムアルデヒド固定をスキップし、凍結クラックに続いて、-20°Cの100%エタノールに浸漬するか、100%メタノールに10分間浸漬した後、-20°Cで100%アセトンに10分間浸漬します。 これらの固定条件は、より良い抗体浸透を可能にしますが、組織の形態に悪影響を及ぼします(染色体は吹き飛ばされてふくらんでいるように見えます)。
タイミングは、ステップ2で概説した解剖と修正の手順にとって非常に重要です。解剖液の量が非常に少ないため、蒸発は最終的な固定濃度に影響を与える可能性があり、抗体染色が変動します。経験豊富な C.エレガンス ハンドラーは、開始(ステップ2.3)から修正(ステップ2.4)まで2分以内にスライドを準備できます。主な技術的ハードルは、解剖液の滴に動物を選び、それらを素早く解剖する能力です。より大きなボリュームで解剖する方法を学ぶ方が簡単です。新しい研修生はまず、ガラス胚染色皿で50〜200 μLの解剖液に動物をピッキングすることから始めます(図2D)。表面が広いため、生殖腺の良好な押し出しに理想的な針の位置を特定する際に操作する余地が増えますが、液体の量が多いほど蒸発の問題が少なくなります。解剖の動きに慣れると、研修生は皿の中でわずか50μLを使用して解剖を開始し、スライド上で20μLで解剖に切り替えます。スライドで解剖すると、研修生は4 μLで蒸発を無視できるほど速く作業できるようになるまで、溶液の量をすばやく減らし始めることができます。
解剖のタイミングが依然として問題である場合、研修生はステップ2.3で8μLの解剖液で解剖することができます。次に、ステップ2.4中に、8 μLの固定溶液を追加し、穏やかにピペッティングして完全に混合し(死体が破壊されたりピペットで取り除かれたりしないように注意深く監視します)、混合溶液から8 μLを除去します。この代替アプローチにより、同じ最終容量8 μLと同じ最終固定濃度が得られます。このボリュームは、ステップ2.5のフリーズクラック中にカーカスがカバーガラスとスライド面の両方に接触するようにするために重要です。解剖量が大きくても各スライドを準備するタイミングが問題となる場合は、生殖細胞系列免疫蛍光プロトコルの懸濁方法がGervaiseとArur26によって説明されています。
免疫蛍光法を使用してタンパク質を その場 で可視化することの主な制限は、目的の特定のタンパク質を標的とする一次抗体が利用できることです。ただし、タンパク質のタグ付きバージョンが操作されている場合、このプロトコルをタンパク質タグを視覚化するように適合させることができます。FLAG、HA、GFPなどの一般的なタグを標的とする抗体が一般的に入手可能です。GFPのような蛍光タグは、固定ステップによって消光されることが多いため、ネイティブの蛍光シグナル自体に依存するのではなく、GFPを標的とする一次抗体を使用することをお勧めします。このプロトコルの別の制限は、単一の時間枠内で生殖細胞系列を捕捉することです(ただし、卵形成のすべての段階は生殖系列内で表されます)。したがって、この技術は、卵母細胞が卵形成によって進行するにつれて起こり得る動的変化を見逃す可能性がある。しかし、配偶子形成のタイミングは C.エレガンスでよく研究されています。野生型の若年成人では、卵母細胞が生殖系列の遠位端(有糸分裂帯)からジアキネシス33まで進行するのに約60時間かかります。したがって、パルスチェイスまたは照射のような特定の介入とそれに続く時間経過は、減数分裂の異なる段階での効果の観察を可能にするであろう。
結論として、このプロトコルは、 C.エレガンス 生殖腺解離とそれに続くDAPIおよび蛍光顕微鏡検査のための抗体染色について説明しています。解剖と固定(ステップ2)は、生成されるスライドの数に応じて、60〜90分かかります。抗体染色(ステップ3)はほとんどハンズオフで行われ、抗体のインキュベーション時間に応じて、最低7時間から1.5日の範囲です。取り付け(手順4.1〜4.7)には約15分かかります。生殖細胞系列の染色体と生殖腺を視覚化するためのこの一般的なアプローチは、抗体または蛍光タグ試薬が存在する場合、あらゆるタンパク質の細胞学的研究に使用できます。最も単純な形態では、ジアキネシス核のDAPI染色を使用して、減数分裂組換えに影響を与える因子をスクリーニングできます。子孫数、雄の発生率(Him表現型)、および胚致死率の生物分析と組み合わせると、この細胞学的アプローチは、集団ベースの分析に対する単一細胞の対比を提供します。
Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。この原稿の内容は、著者の責任です。これは必ずしも国立衛生研究所または国立科学財団の公式見解を表すものではありません。
Acknowledgments
リー研究室での作業は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所(賞番号1R15GM144861)および国立児童発達研究所(賞番号1R15HD104115)の支援を受けました。DAは、UMLケネディ科学大学科学奨学生プログラムによってサポートされていました。NWは、UMLオナーズカレッジフェローシップとUMLSAMPフェローシップ(助成金番号HRD-1712771で国立科学財団から資金提供)によってサポートされていました。RAD-51抗体を提供してくれたA.ガートナーに感謝します。すべての C.エレガンス 株は、国立衛生研究所の研究インフラストラクチャプログラム局によって賞番号P40 OD010440で資金提供されている Caenorhabditis Genetics Centerによって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | Molecular Probes | 711-545-152 | |
| Aluminum heating/cooling block | Millipore Sigma | Z743497 | |
| Bacto Peptone | Gibco | DF0118 17 0 | |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches | Fisherbrand | 13 678 20B | Used to make worm picks |
| BSA, Bovine Serum Albumin | VWR | 97061 420 | |
| C. elegans wild type (ancestral) | Caenorhabditis Genetics Center | N2 (ancestral) | |
| C. elegans kle-2 (ok1151) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | VC768 | The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants. |
| C. elegans spo-11 (me44) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | TY4342 | The full genotype of this strains is: spo-11(me44) IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants. |
| Calcium Chloride Anhydrous | VWR | 97062 590 | |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | 501848300 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| EDTA, Disodium Dihydrate Salt | Apex Bioresearch Products | 20 147 | |
| Embryo Dish, glass, 30mm cavity | Electron Microscopy Services | 100492-980 | Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Food storage container, plastic | various | n/a | Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred |
| Glass Coplin Jar | DWK Life Sciences Wheaton | 08-813E | |
| Hydrophobic Barrier PAP Pen | ImmEdge | NC9545623 | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 06 666A | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma Aldrich | L0380000 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Fisher Chemical | M65 500 | |
| Needles, Single-use, 25 G | BD PrecisionGlide | 14 821 13D | blue, 1 inch |
| NGM Agar, Granulated | Apex Bioresearch Products | 20 249NGM | |
| Parafilm | Bemis | 16 101 | |
| Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 50 980 487 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) | Fisher BioReagents | BP399500 | |
| Petri Dishes, 60-mm | Tritech Research | NC9321999 | Non-vented, sharp edge |
| Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) | Tritech Research | PT 9010 | Used to make worm picks |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR BDH Chemicals | BDH9266 500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR BDH Chemicals | BDH9268 500G | |
| Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm | Fisherbrand | 12-548-AP | 0.13–0.17 mm thickness |
| Razor Blades, Single Edge | VWR | 55411 055 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | S36937 | Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging. |
| Sodium Azide | Fisher BioReagents | BP922I 500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Sigma Aldrich | 7558 79 4 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Sigma Aldrich | S9390 | |
| Styrofoam box | various | n/a | Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 22 037 246 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 500 | |
| Tryptone | Apex Bioresearch Products | 20 251 | |
| Tween 20 | Fisher Chemical | BP337 500 | |
| Yeast Extract | Apex Bioresearch Products | 20 254 |
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