एलिगेंस गोनाड विच्छेदन के लिए यह आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है, जिसके बाद फ्रीज क्रैक होता है, जो एंटीबॉडी धुंधला होने के माध्यम से इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए जर्मलाइन नमूने पैदा करता है, या डीएनए की कल्पना करने के लिए सरल डीएपीआई धुंधला होता है। यह प्रोटोकॉल एक शोध प्रयोगशाला में स्नातक और पाठ्यक्रम-आधारित स्नातक अनुसंधान अनुभव में स्नातक के लिए सफल रहा है।
सी एलिगेंस जर्मलाइन अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाता है, आंशिक रूप से विच्छेदित जानवरों पर साइटोलॉजिकल विश्लेषण करने में आसानी के कारण। पूरे माउंट की तैयारी मियोटिक नाभिक की संरचना को संरक्षित करती है, और महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रत्येक गोनाड हाथ में अर्धसूत्रीविभाजन के सभी चरण होते हैं, जो एक अस्थायी-स्थानिक प्रगति में संगठित होते हैं जो विभिन्न चरणों में नाभिक की पहचान करना आसान बनाता है। वयस्क हेर्मैफ्रोडाइट्स में दो गोनाड भुजाएं होती हैं, जिनमें से प्रत्येक को एक बंद ट्यूब के रूप में व्यवस्थित किया जाता है, जिसमें डिस्टल बंद छोर पर जर्मलाइन स्टेम कोशिकाएं और समीपस्थ खुले छोर पर सेलुलर अंडाणु होते हैं, जो गर्भाशय के केंद्र में जुड़ते हैं। विच्छेदन शरीर की गुहा से एक या दोनों गोनैड बाहों को छोड़ता है, जिससे अर्धसूत्रीविभाजन की संपूर्णता की कल्पना की जा सकती है। यहां, रुचि के प्रोटीन के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, इसके बाद सभी गुणसूत्रों को चिह्नित करने के लिए डीएपीआई धुंधला हो जाता है। युवा वयस्कों को लेविसोल में स्थिर किया जाता है और दो सिरिंज सुइयों का उपयोग करके जल्दी से विच्छेदित किया जाता है। जर्मलाइन एक्सट्रूज़न के बाद, तरल नाइट्रोजन में फ्रीज दरार से गुजरने से पहले नमूना तय किया जाता है, जो छल्ली और अन्य ऊतकों को स्थिर करने में मदद करता है। नमूना तब इथेनॉल में निर्जलित किया जा सकता है, पुनर्जलीकृत किया जा सकता है, और प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया जा सकता है। DAPI को बढ़ते माध्यम में नमूने में जोड़ा जाता है, जो डीएनए के विश्वसनीय विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत जानवरों को छवि खोजने में आसान बनाता है। इस तकनीक को उन लोगों द्वारा आसानी से अपनाया जाता है जो सी एलिगेंस को संभालने से परिचित हैं, कुछ घंटों के बाद विच्छेदन विधि का अभ्यास करने में खर्च किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को एक शोध प्रयोगशाला में काम करने वाले हाई-स्कूलर्स और अंडरग्रेजुएट्स को पढ़ाया गया है और एक उदार कला कॉलेज में पाठ्यक्रम-आधारित स्नातक अनुसंधान अनुभव में शामिल किया गया है।
अर्धसूत्रीविभाजन एक विशेष कोशिका विभाजन है जिसका उपयोग सभी यौन प्रजनन करनेवाले जीवों में युग्मक (अंडे और शुक्राणु / पराग) बनाने के लिए किया जाता है। क्रॉसओवर पुनर्संयोजन समरूप गुणसूत्रों के बीच डीएनए का पारस्परिक आदान-प्रदान है; यह अर्धसूत्रीविभाजन के लिए आवश्यक है, दोनों आनुवंशिक विविधता का एक महत्वपूर्ण स्रोत प्रदान करते हैं और पीढ़ियों के माध्यम से जीनोम स्थिरता को बढ़ावा देते हैं। अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान कम से कम एक क्रॉसओवर बनाने में विफल रहने वाले गुणसूत्र बेतरतीब ढंग से अलग हो जाएंगे, जिसके परिणामस्वरूप क्रोमोसोम नॉनडिसजंक्शन हो सकता है, जिससे गुणसूत्रों की गलत संख्या के साथ युग्मक बन सकते हैं – एक ऐसी स्थिति जो आमतौर पर परिणामी संतान3 के लिए घातक होती है। अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, क्रॉसओवर को प्रोग्राम किए गए डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक4 द्वारा प्रेरित किया जाता है। इन ब्रेकों के एक उप-समूह को क्रॉसओवर के रूप में मरम्मत की जाएगी जो डीएनए के भौतिक लिंकेज प्रदान करते हैं, जिसे चियास्माटा कहा जाता है, जो कोशिका विभाजन 5 की तैयारी में समरूप गुणसूत्रों को उन्मुख करने में मदद करताहै। सभी यूकेरियोट्स में मीओटिक चरण अत्यधिक संरक्षित होते हैं, और उनके क्रोमोसोमल अनुरूपण उन्हें आसानी से पहचानने की अनुमति देते हैं।
जीव विज्ञान में एक मौलिक अवधारणा के रूप में, अर्धसूत्रीविभाजन एक ऐसा विषय है जिसका छात्रों को विभिन्न जीव विज्ञान पाठ्यक्रमों में कई बार सामना करना पड़ता है। उन्हें अक्सर हाई स्कूल में मियोटिक गुणसूत्र अलगाव के यांत्रिकी से परिचित कराया जाता है, जबकि कॉलेज स्तर के पाठ्यक्रम अलगाव के सेल जीव विज्ञान और क्रॉसओवर पुनर्संयोजन के आनुवंशिक प्रभाव पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, अर्धसूत्रीविभाजनकई छात्रों के लिए एक कुख्यात मुश्किल अवधारणा है। जीन, डीएनए, क्रोमोसोम और अर्धसूत्रीविभाजन के बीच संबंधों को समझने में विफलता छात्र गलतफहमी और समझ में अंतराल उत्पन्न कर सकती है जो आनुवंशिक विरासत 6,7 की पूरी समझको बाधित करती है। अमूर्त विषयों की छात्र समझ में सुधार करने का एक तरीका ठोस, हाथों से गतिविधियां प्रदान करना है। उदाहरण के लिए, अर्धसूत्रीविभाजन सिखाते समय, प्रशिक्षक उन गतिविधियों से चुन सकते हैं जो आणविक विश्लेषण8, 3 डी मॉडल का अनुकरण करते हैं जो छात्रों को अणुओं9 में हेरफेर करने की अनुमति देते हैं, या रोल-प्ले जहां छात्र स्वयं आणविक कोरियोग्राफी1 का कार्य करते हैं। अज्ञात परिणामों के साथ अनुसंधान को शामिल करना छात्र की समझ में सुधार करने का एक विशेष रूप से प्रभावी तरीका है। इस अभ्यास को पाठ्यक्रम-आधारित स्नातक अनुसंधान अनुभव (CURE) के रूप में जाना जाता है और इसमें छात्र दृष्टिकोण और एजेंसी को मजबूत करने का अतिरिक्त लाभ है, विशेष रूप से उन समूहों से संबंधित लोगों के लिए जो STEM10,11 में कम प्रतिनिधित्व करते हैं। नेमाटोड वर्म केनोरहाब्डिस एलिगेंस विशेष रूप से व्यवहार, प्रजनन क्षमता और आनुवंशिक क्रॉस के कक्षा अध्ययन के लिए उत्तरदायी है, और छात्रों को जैविक अनुसंधानसे परिचित कराने के लिए एक प्रभावी मॉडल है।
एलिगेंस सरल साइटोलॉजिकल विश्लेषण के साथ आणविक आनुवंशिकी के संयोजन से कोशिका जीव विज्ञान के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव बनाता है। यह जीव विज्ञान कक्षा 13,14,15 में उपयोग के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। वे एक प्रयोगशाला में बनाए रखने के लिए आसान और किफायती हैं, हर 3 दिनों में सैकड़ों संतानों का उत्पादन करते हैं, दोनों मानक कमरे के तापमान पर या 20 डिग्री सेल्सियस पर, सबसे आम इनक्यूबेशन तापमान पर। महत्वपूर्ण रूप से, उन्हें ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में फ्रीज किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जा सकता है, जिसका अर्थ है कि नौसिखिए शोधकर्ताओं द्वारा की गई किसी भी पशुपालन गलतियों को आसानी से ठीक किया जा सकताहै। इसके अलावा, इसका अच्छी तरह से एनोटेट किया गया जीनोम आगे और रिवर्स आनुवंशिकतकनीकों 17,18 के लिए अनुमति देता है, जिससे सी एलिगेंस का उपयोग आणविक से विकासवादी तक जैविक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। एलिगेंस शोधकर्ताओं ने एक सहायक समुदाय बनाया है जो अक्सरनवोदित वैज्ञानिकों के लिए मदद और सलाह प्रदान करने के लिए तैयार है। इन लाभों के कारण सी एलिगेंस को विभिन्न प्रकार के संस्थानों 12,19,20,21,22,23 में कई सीयूआरई में शामिल किया गया है।
अनुसंधान और शिक्षण के लिए इसके लाभों के अलावा, सी एलिगेंस अर्धसूत्रीविभाजन और जर्मलाइन विकास 24,25,26 के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बन गया है। इन जानवरों की ऑप्टिकल स्पष्टता साइटोलॉजिकल दृष्टिकोण27 को सरल करती है, और वयस्कों में, गोनैड जानवर के लगभग आधे हिस्से का प्रतिनिधित्व करते हैं, अध्ययन करने के लिए सैकड़ों मिओटिक कोशिकाएं प्रदान करते हैं। गोनैड्स में, मियोटिक जर्मलाइन नाभिक को असेंबली लाइन की तरह व्यवस्थित किया जाता है (चित्रा 1); माइटोटिक प्रतिकृति गोनाड के बाहर के सिरे पर होती है, जिसमें नाभिक मियोटिक चरणों के माध्यम से प्रगति करते हैं क्योंकि वे गोनाड के समीपस्थ छोर की ओर पलायन करते हैं, जहां निषेचित भ्रूण वल्वा से निकलते हैं। क्योंकि रूढ़िबद्ध स्थानिक संगठन अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से एक अस्थायी प्रगति का भी प्रतिनिधित्व करता है, विभिन्न चरणों को उनके क्रोमोसोमल संगठन और गोनाड में स्थान के आधार पर आसानी से पहचाना जा सकता है। अंत में, प्रक्रियाएं जो अर्धसूत्रीविभाजन को बाधित करती हैं और एन्यूप्लोइडी का कारण बनती हैं, वे फेनोटाइप बनाती हैं जो नौसिखियों के लिए भी चिह्नित करने के लिए सरल हैं: बाँझपन, भ्रूण की घातकता, या पुरुषों की उच्च घटना (हिम फेनोटाइप) 28।
यह सी एलिगेंस में मायोटिक गुणसूत्रों की कल्पना करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल है। माउंटिंग, विच्छेदन, फिक्सिंग और एंटीबॉडी धुंधला होना सभी एक ही माइक्रोस्कोप स्लाइड पर किए जाते हैं, जो प्रोटोकॉल को सरल बनाता है और लगभग सही नमूना वसूली की अनुमति देता है। यह विधि क्रोमोसोम की कल्पना करने के लिए सरल डीएपीआई धुंधला करने के लिए काम करती है और इसका उपयोग गोनैड में प्रोटीन के स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए किया जा सकता है। छात्र बुनियादी विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गोनैड्स का विच्छेदन करते हैं, डीएनए या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए पूरे माउंट की तैयारी उत्पन्न करते हैं, और उन्हें एक यौगिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर चित्रित करते हैं। इस प्रोटोकॉल को सी एलिगेंस रिसर्च लैब में काम करने वाले हाई-स्कूल के छात्रों और अंडरग्रेजुएट्स को पढ़ाया गया है और एक उदार कला कॉलेज12 में क्योर में शामिल किया गया है। यद्यपि क्योर का अपेक्षाकृत छोटा वर्ग आकार था, यह प्रोटोकॉल कृमि उपभेदों और अभिकर्मकों की अपेक्षाकृत कम लागत के कारण संस्थानों की एक श्रृंखला में वर्गों के लिए उत्तरदायी होगा। प्रशिक्षकों को केवल उपयोग के लिए उपलब्ध विच्छेदन माइक्रोस्कोप की संख्या से सीमित किया जाएगा। पिछले कार्यान्वयन में छात्रों को एक माइक्रोस्कोप साझा करने के लिए तीन के समूहों में काम करना था और तीन 90 मिनट के सत्रों में हुआ था: पहला विच्छेदन का अभ्यास करने के लिए, दूसरा विच्छेदन और डीएपीआई धुंधला करने के लिए, और तीसरा वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर इमेज स्लाइड्स के लिए। स्नातक अनुसंधान में भागीदारी11,29, अकादमिक और व्यक्तिगत दोनों छात्रों के लिए कई लाभ प्रदान करती है। सीयूआरई के माध्यम से पाठ्यक्रमों में अनुसंधान एम्बेड करने से छात्रों को सामान्य कक्षा समय11,30,31 के दौरान अनुसंधान में भाग लेने की अनुमति मिलती है, जो इन लाभों के संपर्क को अधिक सुलभ और न्यायसंगत बनाता है।
यौन प्रजनन के लिए अगुणित युग्मकों के निर्माण की आवश्यकता होती है, जो अर्धसूत्रीविभाजन के विशेष कोशिका विभाजन के माध्यम से उत्पन्न होते हैं। एलिगेंस अपनी ऑप्टिकल पारदर्शिता, सुविधाजनक जर्मलाइन एनाटॉमी और शक्तिशाली आनुवंशिकी28 के कारण अर्धसूत्रीविभाजन के साइटोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बन गया है। प्रयोगशाला या कक्षा में कई सवालों को संबोधित करने के लिए प्रजनन क्षमता और भ्रूण की घातकता का आकलन करने वाले सरल जीव प्रयोगों को आणविक आनुवंशिकी के साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, क्योंकि क्रॉसओवर उचित गुणसूत्र अलगाव के लिए आवश्यक हैं, इसलिए उनके गठन या संकल्प को बाधित करने वाली प्रक्रियाएं एन्यूप्लोइड युग्मक उत्पन्न करेंगी। बदले में, एन्यूप्लोइडी अव्यवहार्य संतान की ओर जाता है, जिसे आसानी से संतान की गिनती करके, या भ्रूण की घातकता निर्धारित करने की थोड़ी अधिक जटिल विधि के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है। साइटोलॉजिकल रूप से, क्रॉसओवर की कमी डायकिनेसिस के दौरान देखे गए डीएपीआई-धुंधला निकायों की संख्या को प्रभावित करेगी। DAPI धुंधलापन की मजबूती और स्कोरिंग में आसानी इसे साइटोलॉजिकल तकनीकों को सिखाने के लिए एक आदर्श प्रयोग बनाती है। हेर्मैप्रोडाइट जर्मलाइन में नाभिक का अस्थायी-स्थानिक लेआउट समय में एक ही क्षण में अर्धसूत्रीविभाजन के प्रत्येक चरण का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है। नाभिक को जर्मलाइन के डिस्टल माइटोटिक छोर से समीपस्थ छोर तक आगे बढ़ने में लगभग 54 घंटे लगते हैं (उदाहरण के लिए, देखें जारामिलो-लैम्बर्ट एट अल.33, स्टैम्पर एट अल.34 और लिबुडा एट अल.35)। मियोटिक प्रगति का यह अच्छी तरह से स्थापित समय पल्स-चेज़ लेबलिंग या डीएनए हानिकारक प्रयोगों की अनुमति देता है।
क्योंकि DAPI धुंधला लगभग हमेशा काम करता है, यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एक उपयोगी तकनीकी नियंत्रण के रूप में कार्य करता है (और माइक्रोस्कोपी-इन-ट्रेनिंग के लिए संतुष्टि प्रदान कर सकता है)। एंटीबॉडी धुंधला अधिक परिवर्तनशील हो सकता है और प्रतिकृति के बीच प्रजनन क्षमता का एक अच्छा उपाय है। सी.एलिगेंस गोनाड को लगातार ठीक करना मुश्किल हो सकता है, क्योंकि इस कदम के लिए क्रोमोसोमल संरचना को संरक्षित करने के बीच संतुलन की आवश्यकता होती है, जबकि पर्याप्त एंटीबॉडी प्रसार की अनुमति भी होती है। फॉर्मलाडेहाइड के साथ फिक्सिंग क्रोमोसोमल आकृति विज्ञान को सबसे अच्छी तरह से संरक्षित करती है, और पैराफॉर्मलडिहाइड एम्प्यूल्स से फॉर्मलाडेहाइड को ताजा तैयार करने से सबसे अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान किए गए हैं। फॉर्मेलिन (37% जलीय फॉर्मलाडेहाइड और मेथनॉल) से तैयार फॉर्मलाडेहाइड का उपयोग करना भी संभव है। प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारण शक्ति और समय को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक तरीकों में चरण 2.4 में फॉर्मलाडेहाइड निर्धारण को छोड़ना और फ्रीज-क्रैक के बाद, -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% इथेनॉल में विसर्जन, या 10 मिनट के लिए 100% मेथनॉल में विसर्जन और इसके बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 100% एसीटोन में विसर्जन शामिल है। ये फिक्स स्थितियां बेहतर एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति देती हैं लेकिन ऊतक आकृति विज्ञान को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेंगी (क्रोमोसोम फटे हुए और फूले हुए दिखेंगे)।
चरण 2 में उल्लिखित चरणों को विच्छेदन और ठीक करने के लिए समय बहुत महत्वपूर्ण है। क्योंकि विच्छेदन समाधान की मात्रा इतनी कम है, वाष्पीकरण अंतिम फिक्स एकाग्रता को प्रभावित कर सकता है, जिससे परिवर्तनीय एंटीबॉडी धुंधला हो जाएगा। एलिगेंस हैंडलर शुरू (चरण 2.3) से 2 मिनट से भी कम समय में एक स्लाइड तैयार कर सकता है (चरण 2.4)। मुख्य तकनीकी बाधा जानवरों को विच्छेदन समाधान की बूंद में लेने और जल्दी से उन्हें विच्छेदित करने की क्षमता है। बड़ी मात्रा में विच्छेदन करना सीखना आसान हो सकता है। नए प्रशिक्षु पहले जानवरों को कांच के भ्रूण धुंधला डिश (चित्रा 2 डी) में विच्छेदन समाधान के 50-200 μL में चुनकर शुरू करते हैं; व्यापक सतह अच्छे गोनैड एक्सट्रूज़न के लिए एक आदर्श सुई की स्थिति की पहचान करते समय पैंतरेबाज़ी करने के लिए अधिक जगह प्रदान करती है, जबकि तरल की बड़ी मात्रा वाष्पीकरण को एक समस्या से कम बनाती है। एक बार विच्छेदन की गति के साथ सहज होने के बाद, प्रशिक्षु डिश में केवल 50 μL का उपयोग करके विच्छेदन शुरू करते हैं, फिर स्लाइड पर 20 μL में विच्छेदन पर स्विच करते हैं। एक बार स्लाइड पर विच्छेदन करने के बाद, प्रशिक्षु जल्दी से समाधान की मात्रा को कम करना शुरू कर सकते हैं जब तक कि वे वाष्पीकरण को नगण्य बनाने के लिए 4 μL में काम करने में पर्याप्त तेज न हों।
यदि विच्छेदन का समय एक मुद्दा बना रहता है, तो प्रशिक्षु चरण 2.3 के दौरान विच्छेदन समाधान के 8 μL में विच्छेदन कर सकते हैं। फिर, चरण 2.4 के दौरान, वे फिक्स समाधान के 8 μL जोड़ सकते हैं, धीरे-धीरे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए पाइप कर सकते हैं (यह सुनिश्चित करने के लिए बारीकी से देख रहे हैं कि शव बाधित या दूर नहीं हैं), और मिश्रित घोल से 8 μL हटा सकते हैं। इस वैकल्पिक दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप 8 μL की एक ही अंतिम मात्रा और एक ही अंतिम फिक्स एकाग्रता होगी; यह मात्रा यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि चरण 2.5 में फ्रीज-क्रैक के दौरान शव कवरस्लिप और स्लाइड सतह दोनों से संपर्क करते हैं। यदि प्रत्येक स्लाइड को तैयार करने का समय बड़े विच्छेदन खंडों में भी एक मुद्दा बना हुआ है, तो जर्मलाइन इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के लिए एक निलंबन विधि गेर्वाइस और अरूर26 द्वारा वर्णित है।
सीटू में प्रोटीन की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करने की प्रमुख सीमा एक विशेष प्रोटीन को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की उपलब्धता है। हालांकि, अगर प्रोटीन का टैग किया गया संस्करण इंजीनियर किया गया है, तो इस प्रोटोकॉल को प्रोटीन टैग की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। फ्लैग, एचए, या जीएफपी जैसे सामान्य टैग को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी आमतौर पर उपलब्ध होते हैं। जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट टैग को अक्सर निर्धारण चरणों द्वारा बुझाया जा सकता है, इसलिए देशी प्रतिदीप्ति संकेत पर भरोसा करने के बजाय जीएफपी को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि यह एक ही समय सीमा के भीतर जर्मलाइन को पकड़ता है (हालांकि ओजेनेसिस के सभी चरणों को जर्मलाइन के भीतर दर्शाया जाएगा)। इसलिए, यह तकनीक गतिशील परिवर्तनों को याद कर सकती है जो ओजेनेसिस के माध्यम से अंडाणु की प्रगति के रूप में हो सकते हैं। हालांकि, सी एलिगेंस में गैमेटोजेनेसिस के समय का अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है; एक जंगली प्रकार के युवा वयस्क में, एक अंडाणु को जर्मलाइन (माइटोटिक ज़ोन) के बाहर के सिरे से डायकिनेसिस33 तक प्रगति करने में लगभग 60 घंटे लगते हैं। इसलिए, एक पल्स चेज़ या विकिरण जैसे विशिष्ट हस्तक्षेप के बाद एक टाइम कोर्स अर्धसूत्रीविभाजन के विभिन्न चरणों में प्रभावों के अवलोकन की अनुमति देगा।
अंत में, यह प्रोटोकॉल सी एलिगेंस गोनाड विच्छेदन का वर्णन करता है जिसके बाद डीएपीआई और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एंटीबॉडी धुंधला होता है। उत्पन्न स्लाइडों की संख्या के आधार पर विच्छेदन और फिक्सिंग (चरण 2) में 60-90 मिनट लगते हैं। एंटीबॉडी धुंधला (चरण 3) ज्यादातर हाथों से बंद होता है और एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समय के आधार पर कम से कम 7 घंटे से 1.5 दिनों तक हो सकता है। माउंटिंग (चरण 4.1-4.7) में लगभग 15 मिनट लगते हैं। जर्मलाइन क्रोमोसोम और गोनैड की कल्पना करने के लिए इस सामान्य दृष्टिकोण का उपयोग किसी भी प्रोटीन के साइटोलॉजिकल अध्ययन के लिए किया जा सकता है यदि एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट टैग अभिकर्मक मौजूद है। अपने सरलतम रूप में, डायकिनेसिस नाभिक के DAPI धुंधला होने का उपयोग मायोटिक पुनर्संयोजन को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच के लिए किया जा सकता है। जब संतान संख्या, पुरुषों की घटनाओं (हिम फेनोटाइप), और भ्रूण की घातकता के जीव विश्लेषण के साथ जोड़ा जाता है, तो यह साइटोलॉजिकल दृष्टिकोण जनसंख्या-आधारित विश्लेषणों के लिए एक एकल-कोशिका काउंटरपॉइंट प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
ली लैब में काम को राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या 1R15GM144861 के तहत और राष्ट्रीय बाल और मानव विकास संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या 1R15HD104115 के तहत समर्थित किया गया था, दोनों राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान। डीए को यूएमएल कैनेडी कॉलेज ऑफ साइंसेज साइंस स्कॉलर्स प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। एनडब्ल्यू को एक यूएमएल ऑनर्स कॉलेज फैलोशिप और एक यूएमएलएसएएमपी फैलोशिप (अनुदान संख्या एचआरडी -1712771 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित) द्वारा समर्थित किया गया था। हम आरएडी -51 एंटीबॉडी के लिए ए गार्टनर को धन्यवाद देते हैं। एलिगेंस उपभेदों को केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे पुरस्कार संख्या पी 40 ओडी010440 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रमों के कार्यालय द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | Molecular Probes | 711-545-152 | |
Aluminum heating/cooling block | Millipore Sigma | Z743497 | |
Bacto Peptone | Gibco | DF0118 17 0 | |
Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches | Fisherbrand | 13 678 20B | Used to make worm picks |
BSA, Bovine Serum Albumin | VWR | 97061 420 | |
C. elegans wild type (ancestral) | Caenorhabditis Genetics Center | N2 (ancestral) | |
C. elegans kle-2 (ok1151) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | VC768 | The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants. |
C. elegans spo-11 (me44) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | TY4342 | The full genotype of this strains is: spo-11(me44) IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants. |
Calcium Chloride Anhydrous | VWR | 97062 590 | |
Cholesterol | Sigma Aldrich | 501848300 | |
DAPI | Life Technologies | D1306 | |
EDTA, Disodium Dihydrate Salt | Apex Bioresearch Products | 20 147 | |
Embryo Dish, glass, 30mm cavity | Electron Microscopy Services | 100492-980 | Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic |
Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
Food storage container, plastic | various | n/a | Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred |
Glass Coplin Jar | DWK Life Sciences Wheaton | 08-813E | |
Hydrophobic Barrier PAP Pen | ImmEdge | NC9545623 | |
Kimwipes | Kimtech Science | 06 666A | |
Levamisole Hydrochloride | Sigma Aldrich | L0380000 | |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Fisher Chemical | M65 500 | |
Needles, Single-use, 25 G | BD PrecisionGlide | 14 821 13D | blue, 1 inch |
NGM Agar, Granulated | Apex Bioresearch Products | 20 249NGM | |
Parafilm | Bemis | 16 101 | |
Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 50 980 487 | |
PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) | Fisher BioReagents | BP399500 | |
Petri Dishes, 60-mm | Tritech Research | NC9321999 | Non-vented, sharp edge |
Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) | Tritech Research | PT 9010 | Used to make worm picks |
Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
Potassium Phosphate Dibasic | VWR BDH Chemicals | BDH9266 500G | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR BDH Chemicals | BDH9268 500G | |
Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm | Fisherbrand | 12-548-AP | 0.13–0.17 mm thickness |
Razor Blades, Single Edge | VWR | 55411 055 | |
SlowFade Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | S36937 | Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging. |
Sodium Azide | Fisher BioReagents | BP922I 500 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Sigma Aldrich | 7558 79 4 | |
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Sigma Aldrich | S9390 | |
Styrofoam box | various | n/a | Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 22 037 246 | |
Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 500 | |
Tryptone | Apex Bioresearch Products | 20 251 | |
Tween 20 | Fisher Chemical | BP337 500 | |
Yeast Extract | Apex Bioresearch Products | 20 254 |